CN101560515A - 一种小麦矮腥黑粉菌的特异基因序列、特异性scar标记及pcr检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及“一种小麦矮腥黑粉菌特异基因序列、特异性SCAR标记及其应用”，小麦矮腥黑粉菌特异性基因序列，如Seq No.1，Seq No.2，Seq No.3所示，根据这些特异性片段的核苷酸序列获得的高特异性和高灵敏度的SCAR标记如Seq No.4，Seq No.5或Seq No.6所示的核苷酸序列，可为PCR技术检测小麦矮腥黑穗病提供多种引物选择。根据SCAR标记序列设计的高特异性引物TCKSF(1－2)/TCKSR(1－2)的检测灵敏度可达到1ng/25μl，可将小麦矮腥黒粉菌从众多相似菌株鉴别出来。

Description

一种小麦矮腥黑粉菌的特异基因序列、特异性SCAR标记及PCR检测方法

技术领域：

本发明属生物技术领域，涉及一种小麦矮腥黑粉菌的特异性基因片段、特异性SCAR标记及PCR检测方法。

技术背景

小麦矮腥黑粉菌(Tilletia controversa Kühn，简称TCK)引起的小麦矮腥黑穗病是一种重要的国际检疫性病害，对小麦生产具有毁灭性危害，也是我国外来生物入侵研究的主要物种之一(王圆.小麦矮腥黑穗病菌[M].中国进境植物检疫有害生物选编，中华人民共和国动植物检疫局和农业部植物检疫实验所编，北京：中国农业出版社，1997，95～98)。在小麦矮腥黑穗病流行年份引起的产量损失一般为20～50％，严重时可达75～90％，甚至绝产。病菌抗逆性极强，其冬孢子在土中可存活3～7年，包裹在菌瘿中的冬孢子甚至可保持活力长达10年以上。此病害一旦发生，很难防治或根除，所以国际上有15个国家将其列为检疫对象加以防范。我国从20世纪60年代开始一直将此病害列为一类对外检疫对象。在腥黑粉菌中，TCK与其近缘种小麦网腥黑粉菌、小麦光腥黑粉菌等在形态学上极为相似，难于区别。

传统的病害诊断、检测方法主要是依据病原形态学、生理学和生物化学的特性，不但过程繁琐、时间周期长，而且准确性差、精度不高。因此，利用分子生物学手段快速、准确地鉴别小麦矮腥黑粉菌具有重要的理论意义和实用价值。1996年Ferreira等(Ferreira M.A.，TooleyP.W.，Hatziloukas E.etc.Isolation of a species specific mitochondrial DNA sequence foridentification of Tilletia indica，the Karnal bunt of wheat fungus[J].Application EnvironmentMicrobiology，1996，62：87～93)首次将PCR技术引进到印度腥黑穗病(Tilletia indicaMitra)的鉴定中来，他们选择了印度腥黑粉菌线粒体DNA的一个2.3kb的EcoR I片段进行了克隆和测序，设计的特异性引物Ti1/Ti4从25种腥黑穗病菌菌株中鉴定出了印腥。另外，Smith等(Smith O.P.，Peterson G.L.Beck R.J.etc.Development of a PCR-based method foridentification of Tilletia indica，causal agent of karnal bunt of wheat[J].Phytopathology，1996，86：115～122)通过克隆印度腥黑粉菌线粒体DNA的Dra I片段，进行了序列分析，设计了两套寡核苷酸引物对Ti17/M1和Ti17/M2，能分别从印度腥黑粉菌中扩增出大小为825bp和118bp特异性片段，也实现了对印度腥黑穗病的检测鉴定工作。2000年Frederic等(FrederickR.D.，Snyder K.E.，Tooley P.W.Identification and Differentiation of Tilletia indica and T.walkeri using the Polymerase Chain Reaction[J].Phytopathology，2000，90：951-960.)根据线粒体的差异设计了5对针对印度腥黑粉菌的特异性引物和3对针对黑麦草腥黑粉菌的特异性引物，分别能将印度腥黑粉菌菌株和黑麦草腥粉菌病菌株从其近缘属种中鉴别出来。张竞宇等(张竞宇，张正光，郑小波，等.小麦印度腥黑穗病菌的分子检测[J].高技术通讯，2004，1：31～36)利用核糖体ITS序列上的差异在Tilletia属20个种中设计了一对特异性引物T1/T2，能将T.indica和T.walkeri从其它种中区分开来，而后又根据T.indica和T.walkeri线粒体之间的差异设计了一对特异性引物M1/M2，可以将二者区分开来，为了使反应更为灵敏，建立了套式PCR技术，以便于提供更简单的鉴定方法。梁宏等(梁宏，彭友良，张国珍，等.腥黑粉菌属3种检疫性真菌rDNA 2IGS区的扩增及其序列分析[J]植物病理学报，2006，36(5)：407-412)依据核糖体的IGS1区特性，设计了一对特异性引物，可以将小麦光腥黑粉菌菌株从其近缘属种中鉴别出来。2004年高强(高强.小麦矮腥黑穗病的分子检测[D].长沙，湖南农业大学，2004)利用RAPD技术找到了一条可以将小麦网腥黑粉菌菌株和小麦矮腥黑粉菌菌株区别于其它黑粉菌株的条带，但是很遗憾在矮腥黑粉菌和网腥黑粉菌之间没有找到有差异的条带，没能将二者分开。2006年周业琴，刘素萍等(周业琴，刘素萍，周国梁，等.水稻腥黑粉病菌的单孢检测[J]。植物检疫，2006，20：38～41)应用核糖体ITS序列的通用引物Til1/Til4和两对特异性引物(Hor2/Hor9；Hm1/Hm5)结合建立了套式PCR技术，可以将水稻腥黑粉菌标定出来。本实验室陈万权、刘太国、刘建华利用AFLP技术，找到了小麦矮腥黑粉菌的特异性片段，能将小麦矮腥黑粉菌从其近缘属种中区分开来，该技术已经获得国家发明专利，专利号为：200510080073.7，但未报道其检测的灵敏度，尚未在海关检疫中应用。

ISSR是指利用基于SSR而设计的寡核苷酸引物来检测2个SSR之间的一段短DNA序列差异，其优点是可在没有任何分子生物学研究基础的情况下，进行基因组指纹图构建；可同时检测多个SSR座位；DNA用量少；显性或共显性。ISSR标记可以用来填充遗传图谱中一些RFLP标记稀少间断或空白区，因此，在QTL定位中也逐渐得到较多的应用。目前国内外尚未见基于ISSR方法获得特异性引物检测小麦矮腥黑粉菌的报道。

发明内容：

本发明根据目前分子生物学方法检测小麦矮腥黑粉菌的方法单一、灵敏度不高、检测样本范围较窄的现状，提供一种小麦矮腥黑粉菌的特异性SCAR标记及其引物，用于检测小麦腥黑粉菌，具有特异性好、灵敏度高、操作简便快速的优点。

一种小麦矮腥黑粉菌的特异基因序列，其特征是具有Seq No.1、Seq No.2或Seq No.3所示的核苷酸序列。

一种小麦矮腥黑粉菌的特异性SCAR标记，其核苷酸序列是根据Seq No.1、Seq No.2或Seq No.3所示的核苷酸序列设计的特异性引物扩增而来。

所述的SCAR标记，具有如Seq No.4、Seq No.5或Seq No.6所示的核苷酸序列。

一种检测小麦矮腥黑穗病的PCR方法，其特征在于根据Seq No.4、Seq No.5或Seq No.6所示的核苷酸序列设计引物来扩增待测模板。

所述引物为：

正向引物TCKSF1：5’-TGG TGG TCG GGA AAG ATT AGA-3’，

反向引物TCKSR1：5’-GGG ACG AAG GCA TCA AGA AG-3’；

正向引物TCKSF2：5’-TTG CTG GCT CTT CGC CCT GA-3，

反向引物TCKSR2：5’-TTG CCC GTC TTG CGG TTG AT-3’；或者，

正向引物TCKSF3：5’-CACACACACACAGGAAGCA-3’，

反向引物TCKSR3：5’-CGAGGAAGCAGACAAGGCAT-3’。

本发明基于ISSR获得的小麦矮腥黑粉菌的特异性基因序列，所采用的黑粉菌样本来源广泛，共计51个菌株：14个小麦矮腥黑粉菌(T.controversa Kühn，TCK)菌株；6个小麦光腥黑粉菌(T.foetidaLiro，TFL)菌株，其中1个来自于捷克(TFL 6)，其余5个来源国内不同地区；24个小麦网腥黑粉菌(T.cariesTul.，TCT)菌株，大部分来自于美国，1个来自于捷克(TCT24)，以及另外5种不同种的真菌菌株。这51个样本来源基本涵盖了目前黑粉菌盛行的地域，用加拿大哥伦比亚大学公布的100个ISSR引物对这些菌株进行特异性引物筛选，其中引物ISSR859能在小麦矮腥黑粉菌中稳定地扩增出670bp的片段，ISSR818能在小麦矮腥黑粉菌中稳定地扩增出952bp以及867bp的片段，而在其余两种近缘的腥黑粉菌的37个菌株和其它对照的病原真菌中中没有发现该条带。因此，确定其为小麦矮腥黑粉菌特有的核苷酸序列。通过回收测序上述3个特异性DNA片段，获得这些片段的核苷酸序列信息，如Seq No.1，No.2，No.3所示。

由于本发明获得的Seq No.1，No.2，No.3所示的核苷酸序列是小麦矮腥黑粉菌所特有的基因片段，因此，根据该序列设计的特异性引物，能将小麦矮腥黑粉菌从其近缘种中区别开来。这些引物所扩增出来的基因片段可用作小麦矮腥黑粉菌的SCAR标记。

本发明所设计的特异性引物TCKSF(1-3)/TCKSR(1-3)，其核苷酸序列如Seq No.(7-12)所示，能高灵敏度、高特异性地将小麦矮腥黑粉菌鉴别出来，该对引物所扩增出来的基因片段具有Seq No.4，No.5，No.6所示的核苷酸序列，其大小分别为372bp、496bp和419bp，可作为小麦矮腥黑粉菌的优选SCAR标记。

本发明检测小麦矮腥黑粉菌的PCR方法中，由于检测潜伏期的种子或者幼苗时，其携带的菌量非常少，与种子或者幼苗共同提取的DNA中，病菌的DNA比例极低，对引物的特异性、灵敏性要求非常高。因此，PCR反应体系采用高特异性SCAR标记如Seq No.4，No.5，No.6所示的核苷酸序列设计高特异性、高灵敏度识别的引物，这些引物扩增出来的基因片段只要方便于琼脂糖凝胶检测即可。本发明优选TCKSF(1-2)/TCKSR(1-2)作为检测引物，其检测灵敏度均可达到1ng/25μl。

本发明提供的小麦矮腥黑粉菌特异性DNA片段Seq No.1，No.2，No.3以及根据这些特异性片段的核苷酸序列获得的高特异性和高灵敏度的SCAR标记如Seq No.4，No.5，No.6所示的核苷酸序列，可为PCR技术检测小麦矮腥黑穗病提供多种引物选择。根据SCAR标记序列设计的一对高特异性引物TCKSF(1-2)/TCKSR(1-2)的检测灵敏度可达到1ng/25μl。因此，本发明提供的PCR方法用于检测小麦腥黑粉菌具有省时、准确、灵敏的优点，相对于本实验室以前利用AFLP技术研发的“一种小麦矮腥黑粉菌检测的PCR方法”(专利号：200510080073.7；发明人：陈万权等，2007)，具有更高的检测灵敏度和可靠性。该方法可应用于对小麦矮腥黑粉菌带菌麦种样品的检测以及小麦矮腥黑穗病的诊断，具有更高的实际应用价值。

附图说明

图1：ISSR859引物筛选

其中M为标准DNA分子标记(DNA marker DL2000)；1-8分别为小麦矮腥黑粉菌(编码为TCK1，TCK2，TCK3，TCK4，TCK5，TCK6，TCK7，TCK8)，9-12分别为小麦光腥黑粉菌(编码为TFL1，TFL2，TFL3，TFL4)，13-16分别为小麦网腥黑粉菌(编码为TCT1，TCT2，TCT3，TCT4)。

图2：特异性SCAR标记的验证

其中M为标准DNA分子标记(DNA marker DL 2000)；1-14分别为小麦矮腥黑粉菌14个菌株(编码为TCK1，TCK2，TCK3，TCK4，TCK5，TCK6，TCK7，TCK8，TCK9，TCK10，TCK11，TCK12，TCK13，TCK14)，15-38分别为小麦网腥黑粉菌24个菌株(编码为TCT1，TCT2，TCT3，TCT4，TCT5，TCT6，TCT7，TCT8，TCT9，TCT10，TCT11，TCT12，TCT13，TCT14，TCT15，TCT16，TCT17，TCT18，TCT19，TCT20，TCT21，TCT22，TCT23，TCT24)，39-44别为小麦光腥黑粉菌(编码为TFL1，TFL2，TFL3，TFL4，TFL5，TFL6)，45为小麦散黑黑粉菌，46为稻粒黑粉菌，47为甘蔗黑粉菌，48为高粱黑粉菌，49，50为玉米丝黑穗病菌，51为小麦条锈菌，52为双蒸水。

图3：特异性引物TCKSF1/TCKSR1的灵敏度检测

其中M为标准DNA分子标记(DNA marker DL 2,000)；1-10分别为小麦矮腥黑粉菌(TCK9)不同浓度梯度，分别为100ng、50ng、20ng、10ng、5ng、1ng、100pg、10pg、1pg、0.1pg(25μl)。

图4：ISSR818引物筛选

其中1为标准DNA分子标记(DNA marker DL2000)；2-5分别为小麦矮腥黑粉菌(编码为TCK2，TCK6，TCK7，TCK10)，6-9分别为小麦光腥黑粉菌(编码为TFL1，TFL2，TFL3，TFL4)，10-12分别为小麦网腥黑粉菌(编码为TCT1，TCT2，TCT3)。

图5：特异性SCAR标记的验证

其中1、25、26、50为标准DNA分子标记(DNA marker DL2000)；2-9分别为小麦矮腥黑粉菌8个菌株(编码为TCK1，TCK2，TCK5，TCK6，TCK7，TCK8，TCK9，TCK10)，10-17分别为小麦网腥黑粉菌8个菌株(编码为TCT1，TCT2，TCT3，TCT4，TCT5，TCT6，TCT7，TCT8)，18-23别为小麦光腥黑粉菌6个菌株(编码为TFL1，TFL2，TFL3，TFL4，TFL5，TFL6)，24，27-28为小麦散黑粉菌，29-33为甘蔗黑粉菌，34-36为高粱黑粉菌，37-40为玉米丝黑穗病菌，41-42为小麦条锈菌，43-44为小麦叶锈菌，45-46为小麦秆锈菌，47为小麦白粉菌，48为小麦赤霉菌，49为双蒸水。

图6：特异性引物TCKSF2/TCKSR2的灵敏度检测

其中M为标准DNA分子标记(DNA marker DL 2,000)；2-12分别为小麦矮腥黑粉菌(TCK6)不同浓度的梯度，分别为60ng、50ng、30ng、20ng、10ng、5ng、1ng、100pg、10pg、1pg、0pg(25μl)。

图7：特异性SCAR标记的验证

其中1、25、26、50为标准DNA分子标记(DNA marker DL 2000)；2-9分别为小麦矮腥黑粉菌8个菌株(编码为TCK1，TCK2，TCK5，TCK6，TCK7，TCK8，TCK9，TCK10)，10-17分别为小麦网腥黑粉菌8个菌株(编码为TCT1，TCT2，TCT3，TCT4，TCT5，TCT6，TCT7，TCT8)，18-23别为小麦光腥黑粉菌6个菌株(编码为TFL1，TFL2，TFL3，TFL4，TFL5，TFL6)，24，27-28为小麦散黑粉菌，29-33为甘蔗黑粉菌，34-36为高粱黑粉菌，37-40为玉米丝黑穗病菌，41-42为小麦条锈菌，43-44为小麦叶锈菌，45-46为小麦秆锈菌，47为小麦白粉菌，48为小麦赤霉菌，49为双蒸水。

图8：特异性引物TCKSF3/TCKSR3的灵敏度检测

其中M为标准DNA分子标记(DNA marker DL 2,000)；1-10分别为小麦矮腥黑粉菌(TCK7)不同浓度的梯度，分别为100ng、90ng、80ng、70ng、60ng、50ng、40ng、30ng、20ng、10ng、5ng、1ng、100pg、10pg(25μl)。

具体实施方式

下面结合实例对本发明作进一步的详细说明。

本发明的实验材料：

小麦矮腥黑粉菌(T.controversa Kühn，TCK)共14个菌株，其中12个菌株来源于美国，2个菌株由重庆大学王中康教授提供；小麦光腥黑粉菌(T.foetida Liro，TFL)共6个菌株，其中1个来源自捷克，其余5个来源国内不同地区，均由中国农业科学院植物保护研究所麦病组收存；小麦网腥黑粉菌(T.caries Tul.，TCT)共24个菌株，除1个来自捷克外，其余均由重庆大学王中康教授提供；小麦散黑粉菌(Ustilago tritici)、稻粒黑粉菌(Neovossia horrida)、甘蔗黑粉菌(U.scitaminea)、高粱轴黑粉菌(Sphacelotheca crueuta)、玉米丝黑穗病菌(S.reiliana)、小麦条锈菌(Puccnia striiformis)、小麦叶锈菌(P.triticina)、小麦秆锈菌(P.graminis)、小麦白粉菌(Erysiphe graminis)、小麦赤霉菌(Fusarium graminearum)等由中国农业科学院植物保护研究所麦病组收存，可向公众发放作为非商业性实验用(见表1)。

表1本实验所使用的菌株材料

主要试剂：

Taq DNA Polymerase、dNTP、Mg²⁺、质粒提取试剂盒购于天根生化科技公司；克隆载体pMD18-T、IPTG、X-Gal购于宝生物工程有限公司；琼脂糖凝胶试剂盒购于AXYGEN；ISSR引物根据加拿大哥伦比亚大学公布的ISSR序列由上海生物工程公司合成。

实施例1：筛选小麦矮腥黑粉菌特异性的ISSR特异性引物

1.1小麦矮腥黑粉菌DNA的提取

应用改进的CTAB/SDS方法提取小麦矮腥黑粉菌的DNA。

(1)样品的预处理：取黑粉菌菌瘿一个(大约10mg)压碎加入到2ml的灭菌螺口离心管中，加入25mg硅藻土、250mg直径1mm灭菌玻璃珠，涡旋仪震荡混匀。置于-20℃过夜。

(2)水浴：离心管中加入预热的660μl SDS/CTAB提取缓冲液和5μl蛋白酶K溶液，涡旋仪混匀，65℃恒温水浴1h

(3)研磨：置离心管于快速核酸提取仪MP FastPrep-24中，设6.5M/s，10s处理1次。

(4)抽提：取上清液，加入等体积氯仿/异戊醇混合溶液(24∶1)，4℃，15493×g离心10min。转上清液至新离心管，再重复抽提操作2次

(5)去除RNA：取上清液至新离心管，加入5μl 10mg/ml RNA酶，37℃恒温水浴1-2h后，按抽提的步骤再抽提一次。

(6)沉淀：转上清液至新离心管，加入0.6倍体积预冷异丙醇轻轻混匀，4℃保存1小时。15493×g离心10min。弃上清液。

(7)洗涤：为加入200μl预冷70％乙醇，用移液枪冲洗，洗涤2次。

15493×g离心5min，沉淀DNA。

(8)溶解：真空干燥10min后，将DNA溶于20μl TE溶液，-20℃保存。

1.2小麦矮腥黑粉菌特异性ISSR标记引物的(SCAR标记)的筛选

从加拿大哥伦比亚大学公布的100个ISSR引物中挑选其中的40个，按优化好的反应体系及各引物的最佳退火温度对所有的小麦矮腥黑粉菌、小麦网腥黑粉菌、小麦光腥黑粉菌进行筛选。筛选到引物UBC859能稳定的扩增出小麦矮腥黑粉菌的特异片段(图1)。

ISSR-PCR反应体系：采用25μl的PCR反应体系，配比如下：10×PCR-buffer 2.5μl，Mg²⁺2μl(25mM)，dNTPs 0.25μl(10mM)，3μl(10μM)引物(ISSR859：5’-TGT GTG TGT GTG TGTGRC-3’；ISSR818：5’-TGT GTG TGT GTG TGT GRC-3’)Taq DNA多聚酶0.4μl(2.5U/μl)，模板DNA 1.5μl(20ng/μl)，灭菌双蒸水补足25μl。在MJ research PCR扩增仪上进行扩增。

PCR扩增条件为94℃1min；94℃1min，48℃(退火温度按不同引物的最佳温度选取)1min，72℃2min，40个循环；72℃延伸5min；4℃forever。PCR扩增后，取5μl扩增产物加1μl加样缓冲液在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，用1×TAE作为电泳缓冲液，100V下电泳2小时，用EB染色，在紫外灯下观测并照相。如图1。

用引物ISSR859及ISSR818经过多次扩增确定多态性较稳定，从图1和图4中可以看出引物ISSR859，ISSR818扩增小麦矮腥黑粉菌群体获得670bp、952bp和867bp的特异性DNA片段。将该片段从琼脂糖凝胶上切割下来，使用AXYGEN公司的DNA回收试剂盒对特异性片段进行回收和纯化后，纯化后的产物连接到pMD18-T载体上，PCR产物与载体连接后，转化到E.coli中进行克隆，分别用载体上的测序引物和限制性内切酶对质粒进行检测。将表现为阳性克隆的重组质粒交由上海生物工程公司进行序列测定。

测定的670bp、952bp和867bp小麦矮腥黑粉菌特异性片段的全序列如Seq No.1、Seq No.2和SeqNo.3所示.

实施例2小麦矮腥黑粉菌特异性片段序列测定及获得特异性SCAR标记

根据实施例1获得的小麦矮腥黑粉菌特异性片段的序列测序结果，用DNAMAN 5.2.2软件对序列进行分析比较，并分别设计三对TCK的专化SCAR引物TCKSF(1-3)/TCKSR(1-3)。这些引物可在所有TCK菌株中分别扩增出372bp、496bp和419bp的条带，而在小麦光腥黑粉菌、小麦网腥黑粉菌中没有任何扩增产物如图2、5、7。因此，上述3个片段是小麦腥黑粉菌的特异性SCAR标记。

引物TCKSF(1-3)和TCKSR(1-3)序列如下：

TCKSF1(5’-TGG TGG TCG GGA AAG ATT AGA-3’)

TCKSR1(5’-GGG ACG AAG GCA TCA AGA AG-3’)

TCKSF2(5’-TTG CTG GCT CTT CGC CCT GA-3’)

TCKSR2(5’-TTG CCC GTC TTG CGG TTG AT-3’)

TCKSF3(5’-CACACACACACAGGAAGCA-3’)

TCKSR3(5’-CGAGGAAGCAGACAAGGCAT-3’)

实施例3：小麦矮腥黑粉菌特异性SCAR标记的验证

本发明构建的小麦矮腥黑粉菌特异性SCAR标记引物TCKSF(1-3)/TCKSR(1-3)由上海生物工程公司合成，特异性SCAR标记的扩增反应体系总体积为25μl，其中含有10×PCR-buffer 2.5μl，Mg²⁺ 2μl(25mM)，dNTPs 0.3μl(10mM)，TCKSF(1-3)/TCKSR(1-3)各1μl(10μM)，Taq DNA多聚酶0.3μl(2.5U/μl)，模板DNA(小麦矮腥黑粉菌及小麦光腥黑粉菌、小麦网腥黑粉菌提取的DNA)1μl(20ng/μl)，灭菌双蒸水补足25μl。

PCR扩增条件为94℃5min；94℃30Sec，TCKSF1，3/TCKSR1，3 55℃30Sec(TCKSF2/TCKSR2 60℃30Sec)，72℃1min，30个循环；72℃延伸10min；4℃forever。PCR扩增后，取5μl扩增产物加1μl加样缓冲液在1.0％琼脂糖凝胶上电泳，100V下电泳1小时，用EB染色，采用Bio-Rad公司的凝胶分析系统进行照相分析。

如图2，用引物TCKSF1/TCKSR1可在所有小麦矮腥黑粉菌中获得372bp的特异性SCAR标记片段，如图2中1-14泳道，而小麦网腥黑粉菌，图2中15-38泳道)、小麦光腥黑粉菌，图2中39-44泳道，小麦散黑穗病菌、稻粒黑粉菌、甘蔗黑粉菌、高粱黑粉菌、玉米丝黑穗、小麦条锈菌的45-51泳道中没有获得相应的扩增片段。如图5及图7，小麦矮腥黑粉菌分别可获得496bp以及419bp的特异性SCAR标记片段，如图5中2-9泳道，图7中2-8泳道。说明本发明所构建的SCAR标记是小麦矮腥黑粉菌的高特异性SCAR标记。根据该SCAR标记设计的特异性引物可用于检测小麦矮腥黑粉菌。

实施例4：特异性引物的灵敏度检测

由于特异性SCAR标记设计的特异性引物具有高特异性和高灵敏度，本发明直接选用扩增该SCAR标记的引物作为PCR检测小麦腥黑粉菌的特异性引物。通过如下实验检测其灵敏度。

将TCK模板DNA分别稀释成100ng/μl、50ng/μl、20ng/μl、10ng/μl、5ng/μl、1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、0.1pg/μl，在每个反应体系中加入1μl稀释好的DNA模板进行PCR。PCR体系同实施例3，PCR后用琼脂糖凝胶电泳进行检测。结果显示，TCKSF1/TCKSR1在模板量1～100ng的范围内均可扩增出372bp的条带，如图3所示；TCKSF2/TCKSR2在模板量1～60ng的范围内均可扩增出496bp的条带，如图6所示，TCKSF3/TCKSR3在模板量5～100ng的范围内均可扩增出419bp的条带，如图8所示。

本发明通过ISSR分子标记的方法筛选出TCK独有的特异片段，并成功的转化成稳定的特异性SCAR标记，其中TCKSF(1-2)/TCKSR(1-2)在最低模板含量1ng时即可有效的检测出TCK，而在小麦光腥黑粉菌、小麦网腥黑粉菌上没有扩增。说明本发明构建的小麦矮腥黑粉菌特异性SCAR标记具有较高的准确性及可靠性，根据其设计的引物可以用于小麦矮腥黑粉菌的快速分子检测。

附录

序列表

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>670

<212>DNA

<213>小麦矮腥黑粉菌特异性序列

<400>1

tgtgtgtgac attacataag ccgtcatcac acatcatcca tgtgtccggt gcgacggaga     60

tatccgatac gagcgccggc gattgtggat catgtgatga ttgccagaag gaagtgggga    120

acagaaccac atggtggtcg ggaaagatta gataagataa ggagaattat caccaccacc    180

accgccgccg ctgtcagtct acgcagcagc agagacggat gcagctgttg cgctttgtgc    240

gctgccctgc tgtggtctcc gtcgtccatt ccgctgctac gttgggctgc gcgccccgcc    300

cgtcgaacgg ccaccaccaa cacctgcacc atcataccac caccgcgcat cagcccgccc    360

gtcctctcgc gcgtgctgct ctgcctacaa gtcgcacgac cgactttccg agagcctgcc    420

tctccctacc atggaccccg gcttcaagaa cgacttgcgg tccctccaca cggatacctc    480

ggccttcttg atgccttcgt cccacaccac agcccggaca attcgatagt ctttcaacac    540

gattgtccgg cataaccacg ctcctcggag acacccatcg gctaagaacc gacacacctc    600

ggctaacaac cgaccaccaa ggcgtgggcg ccctggatct tctactcccg ccgccacaca    660

cacacacaca    670

<210>2

<211>952

<212>DNA

<213>小麦矮腥黑粉菌特异性片段

<400>2

cacacacaca cacacaggct gccctctccg ccgtcacgtc cgggtccaag tcagcatggg     60

agctgcccac ctcccgtcgt gccactgacc gcctccctcc acgcccgcca ggccgaagtc    120

gccgaccaac acatcttcaa cacccgcatc ccggacgaag gtcggccgtt tgctggctct    180

tcgccctgac gaattgtatc cggctggagg tcatgaagaa gtctgggttg gatctctttg    240

agctcagtta agcgtatccc ctgtcaacga ttggaggtca gttccctcgc ttcctctcta    300

tctctcgctt ctcatgcctc tccctttctt gctcacacct ttacctctgc aggaccatgg    360

ctgacaagct gggccggatc agcaatcatg gagggcatcg gctacgtcct cgctgccgat    420

cccgcccaga tcctgctcaa ccgcggcgga cgcgtcgtct ttctggtcct ctggcccttt    480

atctgctccg tcgctgcatt cgtctgcatc accgccattc aggcctcgcc ctcggctgga    540

ttttcctcgc cttcctcgcc tttgcttcgt acttgtgagt ctctttctgt gttcctgcac    600

tcgttaaatt tctactgatc acgcgttccc ggcgcagtgc tctccatcaa ccgcaagacg    660

ggcaacgtcg ccaccaaggt caagatggac gtccacctca ctgttcggga gcgcaccatg    720

gaaatctacg gtgagtcatg ccgccctctc ctatttatct tatcatgtaa tcatgtctcc    780

tcactctctc tctcctccga gctcgcatcg cttttagtgc aaccagtcac aaactcacac    840

tactcccatc agttccgatg ccccacctca tcagtcaata gtcatcatgc accctccatc    900

tgaccatcac ccataggtca catcgctctc tctttctgtg tgtgtgtgtg tg            952

<210>3

<211>867

<212>DNA

<213>小麦矮腥黒粉菌特异序列

<400>3

cacacacaca cacacaggaa gcaaggcgtg gggccagctc cgggcaaaac tagaatcggc     60

tcggggcaaa actttttgct agggacaaaa ctccaaagcg ccgaggtggt gtggaagatg    120

ggaaggtggt ggtgaaagag ttggacgagc agaacacgtc gagctctttt gagcagcaca    180

ggaaggcagc acatatgaga aaaggatact ggataatgca gagattcatg tcatgagaaa    240

gaaaggtaat gcatacatat gagagttgag accgaagaca agccgcagcg ctcatatgtc    300

atcataaaag acatgagttg accttgtgtt cgacggactt gcatcggccg caaggctgtg    360

gacagcggct gcaattatgc ccggcttgca tgcagttgct acaatgcctt gtctgcttcc    420

tcgctttagc ctttgccaat tctgccgccg tgagaagacg gccggttgcc ttggtggcgg    480

cagcgacctt gcgctgctcc gggtttagag ggtccaaaag acgagggaaa cggacatcct    540

ggaggccctc atccgtgcgc cactgaggat gtatgctgga gagcggaatc ggctgactgc    600

tcgcgcgtag ttgacagagg gtgtgcgagc aaggaagacc catggtgacc gtgataatgc    660

aggtgcatgt aatcaccccg gtctcatttg atctccgtgc cgcttccaca gtctgccgtc    720

ccatttcgtc ctgcgcctgg atgagccgaa gcgcatatct ggagacggta ttggcgacct    780

cgacgtaaaa tcgatcccct agaatattga tggggacttt gttgtgatcg tttgcaatgt    840

cgctttcaat ctgtgtgtgt gtgtgtg                                        867

<210>4

<211>372

<212>DNA

<213>小麦矮腥黒粉菌特异性SCAR标记

<400>4

tggtggtcgg gaaagattag ataagataag gagaattatc accaccacca ccgccgccgc     60

tgtcagtcta cgcagcagca gagacggatg cagctgttgc gctttgtgcg ctgccctgct    120

gtggtctccg tcgtccattc cgctgctacg ttgggctgcg cgccccgccc gtcgaacggc    180

caccaccaac acctgcacca tcataccacc accgcgcatc agcccgcccg tcctctcgcg    240

cgtgctgctc tgcctacaag tcgcacgacc gactttccga gagcctgcct ctccctacca    300

tggaccccgg cttcaagaac gacttgcggt ccctccacac ggatacctcg gccttcttga    360

tgccttcgtc cc                                                        372

<210>5

<211>496

<212>DNA

<213>小麦矮腥黒粉菌特异性SCAR标记

<400>5

ttgctggctc ttcgccctga cgaattgtat ccggctggag gtcatgaaga agtctgggtt     60

ggatctcttt gagctcagtt aagcgtatcc cctgtcaacg attggaggtc agttccctcg    120

cttcctctct atctctcgct tctcatgcct ctccctttct tgctcacacc tttacctctg    180

caggaccatg gctgacaagc tgggccggat cagcaatcat ggagggcatc ggctacgtcc    240

cgctgccga  tcccgcccag atcctgctca accgcggcgg acgcgtcgtc tttctggtcc    300

tctggccctt tatctgctcc gtcgctgcat tcgtctgcat caccgccatt caggcctcgc    360

cctcggctgg attttcctcg ccttcctcgc ctttgcttcg tacttgtgag tctctttctg    420

tgttcctgca ctcgttaaat ttctactgat cacgcgttcc cggcgcagtg ctctccatca    480

accgcaagac gggcaa                                                    496

<210>6

<211>419

<212>DNA

<213>小麦矮腥黒粉菌特异性SCAR标记

<400>6

cacacacaca caggaagcaa ggcgtggggc cagctccggg caaaactaga atcggctcgg     60

ggcaaaactt tttgctaggg acaaaactcc aaagcgccga ggtggtgtgg aagatgggaa    120

ggtggtggtg aaagagttgg acgagcagaa cacgtcgagc tcttttgagc agcacaggaa    180

ggcagcacat atgagaaaag gatactggat aatgcagaga ttcatgtcat gagaaagaaa    240

ggtaatgcat acatatgaga gttgagaccg aagacaagcc gcagcgctca tatgtcatca    300

taaaagacat gagttgacct tgtgttcgac ggacttgcat cggccgcaag gctgtggaca    360

gcggctgcaa ttatgcccgg cttgcatgca gttgctacaa tgccttgtct gcttcctcg     419

<210>7

<211>22

<212>DNA

<213>特异性引物TCKSF1

<400>7

tggtggtcgg gaaagatta ga

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>特异性引物TCKSR1

<400>8

gggacgaagg catcaagaag                                                 20

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>特异性引物TCKSF2

<400>9

ttgctggctc ttcgccctga                                                 20

<210>10

<211>20

<212>DNA

<213>特异性引物TCKSR2

<400>10

ttgcccgtct tgcggttgat                                                 20

<210>11

<211>19

<212>DNA

<213>特异性引物TCKSF3

<400>11

cacacacaca caggaagca                                                  19

<210>12

<211>20

<212>DNA

<213>特异性引物TCKSR3

<400>12

cgaggaagca gacaaggcat                                                 20

Claims (5)

1.一种小麦矮腥黑粉菌的特异基因序列，其特征是具有Seq No.1、Seq No.2或Seq No.3所示的核苷酸序列。

2.一种小麦矮腥黑粉菌的特异性SCAR标记，其核苷酸序列是根据Seq No.1、Seq No.2或Seq No.3所示的核苷酸序列设计的特异性引物扩增而来。

3.根据权利要求2所述的SCAR标记，其特征在于具有如Seq No.4、Seq No.5或Seq No.6所示的核苷酸序列。

4.一种检测小麦矮腥黑穗病的PCR方法，其特征在于根据Seq No.4、Seq No.5或Seq No.6所示的核苷酸序列设计引物来扩增待测模板。

5.根据权利要求4所述的PCR方法，所述引物为：

正向引物TCKSF1：5’-TGG TGG TCG GGA AAG ATT AGA-3’，

反向引物TCKSR1：5’-GGG ACG AAG GCA TCA AGA AG-3’；

正向引物TCKSF2：5’-TTG CTG GCT CTT CGC CCT GA-3，

反向引物TCKSR2：5’-TTG CCC GTC TTG CGG TTG AT-3’；

或者，正向引物TCKSF3：5’-CACACACACACAGGAAGCA-3’，

反向引物TCKSR3：5’-CGAGGAAGCAGACAAGGCAT-3’。

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