CN112961935B - 用于检测小麦网腥黑粉菌的scar标记引物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及小麦腥黑穗病的病原菌检测，具体涉及用于检测小麦网腥黑粉菌的SCAR标记引物及其应用。本发明提供一种用于鉴定小麦网腥黑粉菌(Tilletia tritici)的SCAR标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。还提供用于鉴定小麦网腥黑粉菌(Tilletia tritici)的SCAR标记引物，其核苷酸序列为：Erc19F：5’‑CTTGTCCAAGCACGTACC‑3’；Erc19R：5’‑CTGCGCAGCGAGAGTAG‑3’。所述SCAR标记引物特异性好、灵敏度高，可准确鉴定小麦网腥黑粉菌。

Description

用于检测小麦网腥黑粉菌的SCAR标记引物及其应用

技术领域

本发明涉及小麦腥黑穗病的病原菌检测，具体涉及用于检测小麦网腥黑粉菌的SCAR标记引物及其应用。

背景技术

小麦腥黑穗病(Common bunt)主要由小麦网腥黑粉菌(Tilletia tritici)、小麦光腥黑粉菌(Tilletia laevis)、小麦矮腥黑粉菌(Tilletia controversa)引起。小麦腥黑粉菌萌发的适温为16-20℃，侵入麦苗的适温为5-20℃。病原菌在小麦苗期侵染，待小麦成熟后黑粉菌孢子替代穗部中的小麦粒。感染了小麦腥黑粉菌的小麦，分蘖增多，矮小直立，成熟后小麦病穗变为黑褐色，粉末呈鱼腥味，即病菌厚垣孢子。病菌孢子含三甲胺物质，对人体有害。在我国，除北纬25℃以南、年平均气温高于20℃以上的少数地区外，小麦腥黑穗病在全国各地都有发生。在20世纪60至70年代，随着拌种处理和抗性品种的推广，小麦腥黑穗病在全国得到有效控制，但近几年农民自发留种，外调种源的情况变多，拌种处理减少，特效防治药剂缺失，特别是抗性品种的减少，导致腥黑穗病发病的情况逐年增加。

小麦腥黑粉菌在小麦苗期侵染后，受侵染的小麦与正常小麦并无过多区别，在麦穗成熟后才会有明显的穗部病症，所以极其需要前期就能准确鉴定腥黑粉菌的方法。引起小麦腥黑穗病的三种病原菌的肉眼差别不大，可通过光学显微镜观察冬孢子，通过有无网脊，及网脊大小来区分不同腥黑粉菌。小麦腥黑穗病的前期鉴定难度大且费时费力，使该病的预防变得很困难，造成了农户的巨大损失。近些年来，分子标记技术在小麦真菌检测中得到了推广和发展。

ISSR(Inter-simple sequence repeat，简单序列间重复)，是用锚定的微卫星DNA为引物，在SSR序列的3’或5’端加上2-4个随机核苷酸，在PCR反应中，锚定引物可以引起特定位点退火，导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间DNA片段进行PCR扩增。ISSR标记作为分子标记中基于微卫星开发出来的标记技术，拥有RPLF标记的高敏感性和高特异性，同时克服了RPLF的难重复性的缺点，PCR扩增使用的引物更长，退火温度更高。与RAPD一样，ISSR几乎不需要事先的靶序列知识，因此可以轻松地应用于非模型物种。基因组中微卫星的丰富性及其在同一物种以及不同物种之间的高变异性确保了ISSR标记的实用性。

近几年，SCAR(Sequence characterized amplified regions特定序列扩增)标记开始成为育种鉴定的主要标记。SCAR标记通常是由RAPD、SRAP、SSR标记转化而来。SCAR标记引物是基于特异标记片段的碱基序列开发的一对特异引物，其扩增产物为单一条带。实验只需观察扩增片段的有无即可鉴定病原菌，使检测更方便快捷并可一次性检测大量样品。由于SCAR标记引物的序列较长且可以直接与模板DNA互补，退火温度可以自行设计，因此SCAR标记比ISSR标记具有更好的稳定性和重复性。目前，引起小麦腥黑穗病的小麦光腥黑粉菌和小麦矮腥黑粉菌都已建立成熟的SCAR标记引物，但还没有对小麦网腥黑粉菌特异的引物可用。

发明内容

为弥补上述领域存在的不足，本发明针对小麦网腥黑粉菌筛选出特异的ISSR引物，并进一步开发出特异性强、灵敏度高的SCAR标记引物和QPCR引物，解决了鉴定小麦网腥黑粉菌的问题。

本发明请求保护的技术方案如下：

用于鉴定小麦网腥黑粉菌(Tilletia tritici)的SCAR标记，其核苷酸序列如SEQID NO:1所示。

用于鉴定小麦网腥黑粉菌(Tilletia tritici)的SCAR标记引物，其核苷酸序列为：

Erc19F：5’-CTTGTCCAAGCACGTACC-3’；

Erc19R：5’-CTGCGCAGCGAGAGTAG-3’。

用于鉴定小麦网腥黑粉菌(Tilletia tritici)的试剂盒，其包含所述的SCAR标记引物。

优选地，所述试剂盒还包含PCR通用试剂。

一种鉴定小麦网腥黑粉菌(Tilletia tritici)的方法，包括如下步骤：

(1)提取待测样品的DNA；

(2)以待测样品的DNA为模板，使用所述的SCAR标记引物进行PCR，得到扩增产物；

(3)通过凝胶电泳检测扩增产物，若扩增产物中出现大小为266bp的条带，则待测样品中含有小麦网腥黑粉菌；若扩增产物中没有出现大小为266bp的条带，则待测样品中不含有小麦网腥黑粉菌。

优选地，所述待测样品为小麦。

优选地，所述PCR的反应体系为：2×Pro Taq Master Mix，12.5μl；ddH₂O，9.5μl；正向引物Erc19F，1μl；反向引物Erc19R，1μl；DNA模板，1μl；反应条件为：94℃30s；98℃10s，61.5℃30s，72℃1min，35个循环；72℃2min。

用于检测小麦网腥黑粉菌(Tilletia tritici)的QPCR引物，其核苷酸序列如下：

Qerc19F：5’-GCTTTCTGTTGTTTGCTGTTGA-3’；

Qerc19R：5’-ATCGGCTGGCTGATGTCTATA-3’。

用于检测小麦网腥黑粉菌(Tilletia tritici)的QPCR试剂盒，其包含所述的QPCR引物。

所述的SCAR标记引物或所述的QPCR引物在鉴定小麦网腥黑粉菌(Tilletiatritici)中的应用。

在小麦网腥黑粉菌(Tilletia tritici)的鉴定过程中，通常避不开另外两种黑粉菌的干扰，即小麦光腥黑粉菌(Tilletia laevis)和小麦矮腥黑粉菌(Tilletiacontroversa)。三种菌的形态通过肉眼很难分辨，需借助显微镜进行区分。我们在利用小麦网腥黑粉菌DNA对ISSR引物进行筛选时，成功筛选出ISSR827引物，该引物对小麦网腥黑粉菌的扩增产物中出现一条区别于小麦光腥黑粉菌和小麦矮腥黑粉菌的特征条带，其大小为515bp，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。对515bp特征条带进行切胶回收、连接载体、转入大肠杆菌、提取质粒并测序。根据515bp片段的测序结果，我们设计出小麦网腥黑粉菌的SCAR标记引物Erc19F/R。特异性检测结果显示，该SCAR标记引物仅从小麦网腥黑粉菌中扩增出266bp的特征条带，在小麦光腥黑粉菌和小麦矮腥黑粉菌中没有扩增条带，在其他可能存在于小麦种植环境中的常见病原菌(玉米黑粉菌、散黑粉菌、大麦坚黑粉菌、小麦条锈菌、小麦叶锈菌、小麦杆锈菌、禾本科布氏白粉菌和禾谷镰孢菌)中也没有扩增条带。灵敏度测试结果表明，该SCAR标记引物在小麦网腥黑粉菌DNA浓度低至50pg/μl时仍然扩增出266bp的特征条带。然后我们在SCAR标记的基础上设计出QPCR引物Qerc19F/R并测试其灵敏度。结果显示，该QPCR引物对小麦网腥黑粉菌DNA具有很强的特异性，且最低可检测到2.4fg/μl的质粒。标准曲线显示在质粒稀释浓度范围内具有良好的线性关系。

综上，本发明提供的SCAR标记引物和QPCR引物都可以准确鉴定小麦网腥黑粉菌，为小麦腥黑穗病的防治提供了更精准的鉴定工具。

附图说明

图1.引物ISSR827的扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果。图中，泳道从左到右分别是：(1)DL2000 DNA Marker(Takara)，(2)以小麦矮腥黑粉菌DNA为模板的PCR产物，(3)以小麦光腥黑粉菌DNA为模板的PCR产物，(4-5)以小麦网腥黑粉菌DNA为模板的PCR产物，(6)以ddH₂O为模板的PCR产物。DL2000 DNA Marker(Takara)条带从上到下分别是2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。

图2.ISSR827引物从小麦网腥黑粉菌中扩增的515bp特异条带的核苷酸序列。

图3.SCAR标记引物Erc19F/R的扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。图中泳道从左到右依次为：(1)DL2000 DNA Marker(Takara)，(2-4)以小麦网腥黑粉菌DNA为模板的PCR产物，(5-6)以小麦矮腥黑粉菌DNA为模板的PCR产物，(7-9)以小麦光腥黑粉菌DNA为模板的PCR产物。DL2000 DNA Marker(Takara)条带从上到下分别是2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。

图4.引物Erc19F/R特异性琼脂糖凝胶电泳结果。图中上面那排泳道从左到右依次是：(1)DL2000 DNA Marker(Takara)，(2-5)以小麦网腥黑粉菌DNA为模板的PCR产物，(6-9)以小麦矮腥黑粉菌DNA为模板的PCR产物，(10-13)以小麦光腥黑粉菌DNA为模板的PCR产物，(14-17)以玉米黑粉菌DNA为模板的PCR产物，(18-21)以散黑粉菌DNA为模板的PCR产物，(22-25)以大麦坚黑粉菌DNA为模板的PCR产物。图中下面那排泳道从左到右依次是：(26)DL2000 DNA Marker(Takara)，(27-30)以小麦条锈菌DNA为模板的PCR产物，(31-34)以小麦叶锈菌DNA为模板的PCR产物，(35-38)以小麦杆锈菌DNA为模板的PCR产物，(39-42)以禾本科布氏白粉菌DNA为模板的PCR产物，(43-46)以禾谷镰孢菌DNA为模板的PCR产物，(47-50)以ddH₂O为模板的PCR产物。

图5.引物Erc19F/R灵敏度检测的琼脂糖凝胶电泳结果。图中泳道从左到右依次是(1)DL2000 DNA Marker(Takara)，(2)100ng/μl，(3)50ng/μl，(4)25ng/μl，(5)10ng/μl，(6)5ng/μl，(7)1ng/μl，(8)0.5ng/μl，(9)0.1ng/μl，(10)50pg/μl，(11)25pg/μl，(12)10pg/μl，(13)1pg/μl。

图6.使用引物Qerc19F/R对小麦网腥黑粉菌进行QPCR的扩增曲线。

图7.使用引物Qerc19F/R对小麦网腥黑粉菌进行QPCR的溶解曲线。

图8.使用引物Qerc19F/R对小麦网腥黑粉菌进行QPCR的标准曲线。

具体实施方式

下面结合实施例进一步描述本发明，需要理解的是，下述实施例仅作为对本发明的解释和说明，不以任何方式限制本发明的范围。

若未特别说明，以下实施例中使用的试剂均为本领域常规试剂，可商购获得或按照本领域常规方法配制而得，规格为实验室纯级即可；使用的实验方法和实验条件均为本领域常规的实验方法和实验条件，可参考相关实验手册(例如《分子克隆实验指南》)、公知文献或厂商说明书。除非另有定义，本文使用的所有科学技术用语的含义与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同。

实施例1.ISSR引物筛选

我们分别对小麦网腥黑粉菌、小麦光腥黑粉菌和小麦矮腥黑粉菌这三种病菌进行培养，提取DNA。用三种病菌对ISSR引物进行筛选，获得具有对小麦网腥黑粉菌特异性的ISSR引物及目标条带大小。

1.1实验材料

1.1.1供试菌株

小麦网腥黑粉菌(Tilletia tritici)：从中国新疆采样，本实验室保存。小麦矮腥黑粉菌(Tilletia controversa)：由美国农业部农业研究局(United States Departmentof Agriculture,Agricultural Research Service)提供，本实验室保存。小麦光腥黑粉菌(Tilletia laevis)：从中国新疆采样，本实验室保存。以上生物材料本实验室亦有保存，申请人声明可自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。

1.1.2供试小麦品种

小麦(Triticum aestivum L.)品种：冬选三号，本实验室保存，申请人声明可自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。

1.1.3供试试剂

Tris-HCl(PH 8)、EDTA、20％SDS、β巯基乙醇、无水乙醇、异丙醇、DNA提取液、10×TAE，以上试剂均采购自生工生物科技(上海)有限公司(http://www.sangon.com)。2×ProTaq Master Mix(dye plus)购自湖南艾科瑞生物工程有限公司，产品编号AG11110。

1.1.4供试培养基

水琼脂培养基：琼脂粉6.68g，加蒸馏水定容至300ml。土壤培养基：新鲜上层土壤500g加入1000ml煮沸蒸馏水，通过6层纱布过滤，得到土壤析出液；在另一锥形瓶中加入6.68g琼脂，使用土壤析出液定容到300ml。以上培养基都在121℃，20min条件下湿热灭菌。

1.1.5测试引物

以下ISSR引物序列由加拿大哥伦比亚大学(UBC)设计，由北京擎科新业生物技术有限公司合成。

表1

1.1.6实验仪器

致微(厦门)仪器有限公司GI-54DS自动压力蒸汽灭菌器。上海精宏实验设备有限公司DHG-9240A电热恒温鼓风干燥箱，DNP-90-52电热恒温培养箱。台苏州安泰空气技术有限公司SW-CJ-2FD超净工作台。北京赛多利斯科学仪器有限公司SQP电子分析天平。BackmanOptima L-XP制备型超速离心机。北京鼎昊源科技有限公司HR220 MiniSmart迷你离心机。Eppendorf Centrifuge-54188冷冻离心机。MX-S可调式和固定式混匀仪。卡尤迪生物科技H203-100C加热制冷型金属浴。BIO-RAD Thermal Cycler PCR仪。Milli-Q超纯水系统Millipore。上海医用分析仪器厂TGL-16G制冰机。北京大龙兴创实验仪器有限公司，Bandelin Sonopuls HD 2070超声破碎仪。北京六一仪器厂DYY-12电泳仪。Alliance 4.7Chroma Uvitec凝胶成像仪。上海知信ZX-S22双孔不锈钢恒温水浴锅。

1.2实验方法

1.2.1活化、培养黑粉菌

将实验室保存的小麦网腥黑粉菌、小麦光腥黑粉菌、小麦矮腥黑粉菌的病粒从病穗摘下。剥开颖壳将病粒碾碎后放入装有灭菌蒸馏水的2ml离心管中浸泡1天。浸泡结束后，用2％次氯酸钠溶液浸泡五分钟，然后用离心机于12000rpm离心2min，弃上清，重复两遍。取1ml灭菌蒸馏水重悬底部孢子，12000rpm离心1min，重复3次，直到没有异味。再将离心管中加入1ml灭菌蒸馏水，混匀孢子后吸出200μl孢子液放在光学显微镜下观察。确保孢子正确后，利用血球计数板查得视野中孢子20-25个为适宜浓度，然后将孢子悬浮液重新分装并确保每个管中孢子数量大概为20-25。然后将孢子悬浮液加入提前灭菌好的且加入了抗生素(青霉素100units/ml，链霉素100μg/m)的培养基中。将小麦网腥黑粉菌、小麦矮腥黑粉菌滴入土壤培养基后划匀，将小麦光腥黑粉菌加入水琼脂培养基后划匀。将小麦光腥黑粉菌、小麦网腥黑粉菌放入15℃培养箱中，培养小麦光腥黑粉菌10-15天，培养小麦网腥黑粉菌7-10天。将小麦矮腥黑粉菌放入4℃培养箱中培养30-45天。

1.2.2小麦的春化和培养

将实验室保存好的冬选三号小麦种子放入大号培养皿中，用蒸馏水洗去种子上的杂质后，加入2％次氯酸钠溶液浸泡5分钟，再用蒸馏水洗2-3遍，清洗至无异味后加入少量蒸馏水浸湿，然后盖上五层纱布。盖好纱布后再用锡纸进行避光，然后放入4℃冰箱。30天后选取长势较好的苗种入土壤中，15℃培养麦苗。

1.2.3小麦接种黑粉菌

待45天后小麦抽穗期前，旗叶下第二节呈现中空的情况时，将提前准备好的三种黑粉菌的培养板从培养箱中拿出。在显微镜下观察到次生担孢子及侵染丝后，在超净工作台里将培养皿打开，加入2ml灭菌蒸馏水，用涂布棒划匀后倒入50ml离心管中收集。混匀菌液后用1ml注射器吸取1ml菌液，注入小麦旗叶下第二节中空部。一天注射两次菌液，连续一周。待成熟后观察小麦穗部变粗，穗粒畸形变大，采下穗粒并在显微镜下观察，确定正确性后保存备用。

1.2.4提取DNA

称取10mg病粒(患病穗粒)，剥下颖壳后捏碎，放入2.5ml螺纹管中，加入25mg硅藻土、250+/-10mg的1mm灭菌玻璃珠，放入液氮中。30分钟后取出螺纹管，放入upFast细胞破碎仪中，设定5m/s，60s，然后拿出螺纹管，放入液氮中1分钟，然后重复破碎一次。观察到孢子都被打碎后，将螺纹管拿出，加入600μl提前65℃预热好的CTAB缓冲液，60μl 20％SDS缓冲液和10μl 10mg/ml蛋白酶K，上下颠倒混匀3-5min，在65℃恒温水浴1小时，期间每15分钟轻轻上下颠倒混匀一次。加入等体积DNA提取液(酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1)上下颠倒充分混匀2-3分钟，在4℃，12000rpm下离心10分钟后取上清液至新的1.5ml离心管中。加入10μl10mg/ml RNA酶，37℃恒温水浴2小时。加入等体积DNA提取液，上下颠倒混匀后12000rpm下离心10分钟。取上清液到新的离心管中，加入0.6倍体积预冷的异丙醇，轻轻混匀，-20℃放置2小时，然后于4℃，12000rpm下离心10min，弃去上清液。加入1ml预冷的70％乙醇，用移液枪重复吹起沉淀，于4℃，12000rpm下离心5分钟，弃掉上清，洗涤两遍。用枪头吸取残余酒精后风干20分钟，待离心管中酒精完全干燥后，加入50μl双蒸水，放入4℃保存待溶解。

1.2.5 ISSR引物筛选

用设计好的ISSR引物，分别以小麦网腥黑粉菌、小麦光腥黑粉菌、小麦矮腥黑粉菌的DNA为模板进行PCR。

PCR体系如下：

PCR程序如下：

其中，退火温度根据引物自身温度调整。然后将PCR产物取出，用2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。

1.3实验结果

分别用小麦网腥黑粉菌、小麦光腥黑粉菌和小麦矮腥黑粉菌对表1中所列的801-900的ISSR引物进行筛选。结果如图1所示，泳道从左到右分别是：(1)DL2000 DNA Marker(Takara)，(2)以小麦矮腥黑粉菌DNA为模板的PCR产物，(3)以小麦光腥黑粉菌DNA为模板的PCR产物，(4-5)以小麦网腥黑粉菌DNA为模板的PCR产物，(6)以ddH₂O为模板的PCR产物。DL2000 DNA Marker(Takara)条带从上到下分别是2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。我们发现ISSR827对小麦网腥黑粉菌的特异性最好，能够从小麦网腥黑粉菌的基因组DNA中扩增出一条515bp的特异性条带(其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示)，且在退火温度为55℃时扩增效果最好。

实施例2.SCAR标记引物的设计

SCAR标记引物与任意引物相比，它仅检测单个基因定义的基因座，其扩增对反应的敏感性较低。就结果而言，SCAR标记引物扩增出来的显性单条带，更加直接单一。本实验切取回收实施例1中筛选出的ISSR827引物扩增出的小麦网腥黑粉菌特异条带，将其导入DH5α大肠杆菌中，提取质粒并测序，使用Primer Premier 6软件对序列设计SCAR标记引物。然后用三种黑粉菌筛选出针对小麦网腥黑粉菌的特异SCAR标记引物。

2.1实验材料

2.1.1供试菌株

同实施例1中1.1.1记载的供试菌株。

2.1.2供试小麦品种

同实施例1中1.1.2记载的供试小麦品种。

2.1.3供试试剂

pClone007 Simple Vector Kit，购买自北京擎科新业生物技术有限公司。DH5α感受态细胞、普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒提取试剂盒，均购买自北京天根生化科技有限公司。胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl、琼脂粉、Tris-HCl(PH 8)、EDTA、20％SDS、无水乙醇、异丙醇、β巯基乙醇、DNA提取液、10×TAE，以上试剂均采购自生工生物科技(上海)有限公司(http://www.sangon.com)。2×Pro Taq Master Mix(dye plus)购自湖南艾科瑞生物工程有限公司，产品编号AG11110。

2.1.4供试培养基

Amp(氨苄青霉素)LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂粉12g加入蒸馏水，溶解后定容到1000ml。121℃湿热灭菌20min，待到培养基温度恢复室温后加入氨苄青霉素使其终浓度为50μg/ml。LB液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，加入蒸馏水定容到1000ml，121℃湿热灭菌20min。

2.1.5实验仪器

同实施例1中1.1.6记载的实验仪器。

2.2实验方法

2.2.1活化、培养黑粉菌

方法和步骤同实施例1中1.2.1。

2.2.2小麦的春化和培养

方法和步骤同实施例1中1.2.2。

2.2.3小麦接种黑粉菌

方法和步骤同实施例1中1.2.3。

2.2.4提取DNA

方法和步骤实施例1中1.2.4。

2.2.5目标条带的切胶回收提纯

将ISSR827引物分别与小麦网腥黑粉菌、小麦光腥黑粉菌和小麦矮腥黑粉菌的DNA进行PCR扩增。

PCR体系如下：

PCR程序如下：

扩增结束后，将反应液进行2％琼脂糖凝胶电泳，100v，30min。然后将琼脂糖凝胶放入紫外线灯箱下用手术刀切取515bp条带并放入2ml离心管中。使用天根普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(DP209)回收提纯。将放入目标条带琼脂糖的2ml离心管称重，并加入提前预热的与胶块等体积的PN溶液，50℃恒温水浴10min，期间不断上下翻转直至胶块完全溶解。同时将试剂盒吸附柱CA2放入收集管中，加入500μl平衡液BL，12000rpm离心1min后倒掉废液。把水浴好融化的胶液加入处理好的CA2吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心1min，倒掉废液。向吸附柱CA2中加入600μl提前加入无水乙醇的漂洗液PW，12000rpm离心1min，倒掉废液，重复此步骤两次。再将吸附柱CA2放入空的收集管中，12000rpm离心2分钟，除尽漂洗液。后将吸附柱CA2放于超净工作台中吹干(3min)。最后将吸附柱CA2放入新的无菌1.5ml离心管中，在吸附膜中间加入30μl ddH₂O，静置两分钟，12000rpm离心五分钟收集DNA液体。

2.2.6载体连接并转入大肠杆菌

将回收纯化的DNA使用擎科生物pClone007 Simple Vector Kit转入DH5α大肠杆菌感受态中。具体如下：取纯化的DNA液体2μl放入PCR管中，加入1μl pClone007 SimpleVector，1μl 10×Topo Mix后吹打混匀，放入金属浴25℃反应5min，再加入提前冰上融化的DH5α感受态(北京天根生化)轻轻混匀，冰上静置25min。然后放入金属浴42℃热激45s，迅速转移至冰浴中静置2min。再向离心管中加入500μl无抗性LB液体培养基，混匀后放入培养箱中37℃，200rpm培养1小时。然后吸取200μl菌液，均匀涂布在Amp培养基平板上。37℃培养16h后挑取单菌落进行菌落PCR验证条带大小，PCR体系和程序同2.2.5。

2.2.7提取质粒

使用北京天根生化科技有限公司的质粒小提试剂盒(DP103)提取阳性克隆的质粒。菌落PCR确定阳性克隆后，在超净工作台中用牙签挑取阳性克隆并放入50ml离心管中，加入含Amp(50μg/ml)的LB液体培养基5ml，37℃，200rpm培养16h。过夜后将菌液分次倒入事先灭菌好的2ml离心管中，12000rpm离心1min。同时在CP3吸附柱中加入500μl的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉废液。向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl提前加入RNase A的P1溶液，涡旋振荡器混匀。加入250μl溶液P2，温和上下颠倒6-8次充分裂解菌体，加入350μl溶液P3并立即上下翻转6-8次充分混匀，然后离心10min。将上一步收集的上清液放入吸附柱CP3中，12000rpm离心1min弃废液。加入600μl漂洗液PW到吸附柱CP3中，12000rpm离心1min，重复操作两次后空离心2min以彻底除去漂洗液。将处理好的吸附柱CP3放置于新的1.5ml离心管中，加入50μl ddH₂O静置2min，12000rpm离心2min收集DNA液体，送往北京擎科新业生物技术有限公司进行测序。

2.2.8设计筛选引物

根据质粒测序结果(图2，SEQ ID NO:2)，用Primer Premier 6设计引物，利用小麦网腥黑粉菌、小麦光腥黑粉菌和小麦矮腥黑粉菌DNA对设计的引物进行筛选，筛选出只对小麦网腥黑粉菌特异的引物。

2.3实验结果

获得了只对小麦网腥黑粉菌产生特异扩增的SCAR标记引物Erc19F/R，序列如下：

引物Erc19F/R对三种黑粉菌基因组DNA的扩增结果如图3所示，图3中泳道从左到右依次为：(1)DL2000 DNA Marker(Takara)，(2-4)以小麦网腥黑粉菌DNA为模板的PCR产物，(5-6)以小麦矮腥黑粉菌DNA为模板的PCR产物，(7-9)以小麦光腥黑粉菌DNA为模板的PCR产物。DL2000 DNA Marker(Takara)条带从上到下分别是2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。可以看出，SCAR标记引物Erc19F/R仅在小麦网腥黑粉菌中扩增出266bp条带，该条带的核苷酸序列如下：

5'-CTTGTCCAAGCACGTACCGTAGATGCAGTAAGTAGATACAGTCAGGAAGTATCTAAGCACAGTACATCCATACACCCATACATACATACAGGAGTCAGTAGTCAGTAGTCAGTATCTACAGTAGTCAGTATCTACTTATCTACTTAGGTACTACAGTGTAGTAAGAACATGCGTGATCGCTATAGGTATCCACCACGGCCAAAGCCCCAAAAATTACACCACCGACTCCCGGCCGGCGACGCTTCCCCCCTACTCTCGCTGCGCAG-3'(SEQ ID NO:1)。

实施例3.SCAR标记引物的特异性和灵敏度检测

经过前文的研究，我们已经获得在小麦网腥黑粉菌、小麦光腥黑粉菌、小麦矮腥黑粉菌中只针对小麦网腥黑粉菌有特异性的SCAR标记引物Erc19F/R。但在实际操作中由于环境的变化和不同物种的种植，在小麦上可能会有其他病原菌的干扰。所以本试验利用常见病原菌对设计好的SCAR标记引物进行特异性和灵敏度检测。

3.1实验材料

3.1.1供试菌株

禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)、小麦杆锈菌(Puccinia graminisvar.tritici)、小麦条锈菌(Puccinia striiformis f.sp.Tritici)、小麦叶锈菌(Puccinia triticina)、散黑粉菌(Ustilago tritici)：已知菌株，由中国农业科学院植物保护研究所提供。记载在文献：tongshuo Xu et al.Development of droplet digitalPCR for the detection of Tilletia laevis,which causes common bunt of wheat,based on the SCAR marker derived from ISSR and real-time PCR.[J].Scientificreports,2020,10(1):16106-16106中，参见其中材料与方法部分记载的菌株。

禾本科布氏白粉菌(Blumeria graminis(DC.)Speer)、大麦坚黑粉菌(Ustilagohordei)、玉米黑粉菌(Ustilago maydis)、小麦网腥黑粉菌(Tilletia caries)、小麦光腥黑粉菌(Tilletia laevis)：已知菌株，由中国农业科学院植物保护研究所提供。记载在文献：Li Gao et al.Development of a SCAR marker for molecular detection anddiagnosis of Tilletia controversa Kühn,the causal fungus of wheat dwarf bunt[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,2014,30(12):3185-3195.中，参见其中材料与方法部分记载的菌株。

小麦矮腥黑粉菌(Tilletia controversa)：已知菌株，由中国农业科学院植物保护研究所提供。记载在文献L.GAO et al.Development of a SCAR Maker by inter-simple sequence repeat for dignoisis of Dwarf Bunt of Wheat and Detection ofTilletia controversa Kühn.Folia Microbiol.55(3),258–264(2010)中，参见其中材料与方法部分记载的在美国由B.Goates教授分离到的分离株。另外也记载在L.GAO et al.AnISSR-based Approach for the Molecular Detection and Diagnosis of Dwarf Buntof Wheat,Caused by Tilletia controversaKu¨hn.J Phytopathol159:155–158(2011)，为其中材料与方法部分记载的Dr Blair Goates所提供的TCK菌株。

以上生物材料本实验室亦有保存，申请人声明可自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。

3.1.2供试小麦品种

小麦(Triticum aestivum L.)品种：冬选三号，本实验室保存，申请人声明可自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。

3.1.3供试试剂

同实施例2中2.1.3。

3.1.4实验仪器

同实施例2中2.1.5。

3.2实验方法

3.2.1 DNA提取

方法和步骤同实施例1中1.2.4。提取得到11种病原菌的基因组DNA。

3.2.2 SCAR标记的特异性检测

将事先准备好的11种病原菌基因组DNA作为PCR模板，每个菌株做4次重复，以ddH₂O作为阴性对照。

PCR反应体系如下：

PCR反应程序如下：

扩增结束后，使用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

3.2.3灵敏度检测

在DNA分光光度计下测量小麦网腥黑粉菌基因组DNA浓度，然后将DNA溶液稀释为100ng/ml。对DNA溶液进行梯度稀释，确保每个PCR反应管中的DNA浓度分别为100ng/μl、50ng/μl、25ng/μl，10ng/μl、5ng/μl、1ng/μl、0.5ng/μl、0.1ng/μl、50pg/μl、25pg/μl、10pg/μl、1pg/μl。然后使用SCAR标记引物Erc19F/R分别对各浓度的DNA溶液进行PCR，PCR反应体系和反应程序同3.2.2。扩增结束后，使用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

3.3实验结果

如图4所示，上面那排泳道从左到右依次是：(1)DL2000 DNA Marker(Takara)，(2-5)以小麦网腥黑粉菌DNA为模板的PCR产物，(6-9)以小麦矮腥黑粉菌DNA为模板的PCR产物，(10-13)以小麦光腥黑粉菌DNA为模板的PCR产物，(14-17)以玉米黑粉菌DNA为模板的PCR产物，(18-21)以散黑粉菌DNA为模板的PCR产物，(22-25)以大麦坚黑粉菌DNA为模板的PCR产物。图中下面那排泳道从左到右依次是：(26)DL2000 DNA Marker(Takara)，(27-30)以小麦条锈菌DNA为模板的PCR产物，(31-34)以小麦叶锈菌DNA为模板的PCR产物，(35-38)以小麦杆锈菌DNA为模板的PCR产物，(39-42)以禾本科布氏白粉菌DNA为模板的PCR产物，(43-46)以禾谷镰孢菌DNA为模板的PCR产物，(47-50)以ddH₂O为模板的PCR产物。结果表明，SCAR标记引物Erc19F/R在且仅在小麦网腥黑粉菌中扩增出266bp条带，在小麦矮腥黑粉菌、小麦光腥黑粉菌、玉米黑粉菌、散黑粉菌、大麦坚黑粉菌、小麦条锈菌、小麦叶锈菌、小麦杆锈菌、禾本科布氏白粉菌和禾谷镰孢菌中均未扩增出条带，特异性很好。

如图5所示，泳道从左到右依次是(1)DL2000 DNA Marker(Takara)，(2)100ng/μl，(3)50ng/μl，(4)25ng/μl，(5)10ng/μl，(6)5ng/μl，(7)1ng/μl，(8)0.5ng/μl，(9)0.1ng/μl，(10)50pg/μl，(11)25pg/μl，(12)10pg/μl，(13)1pg/μl。结果显示，当小麦网腥黑粉菌基因组DNA浓度稀释到50pg/μl时引物Erc19F/R仍然可以扩增出条带，具有很高的灵敏度。

实施例4.小麦网腥黑粉菌的特异qPCR引物设计

随着PCR技术的进展，qPCR(Quantitative Real-time PCR，实时荧光定量PCR)技术日益完善。qPCR针对病原菌的检测精度要求更高。本试验在SCAR标记的基础上，设计用于qPCR的qPCR引物。针对引物我们进行溶解曲线、扩增曲线、标准曲线的绘制，测试出引物的检测限。为病原菌鉴定提供更精确的标记引物。

4.1实验材料

4.1.1供试菌株

小麦网腥黑粉菌(Tilletia tritici)：已知菌株，由中国农业科学院植物保护研究所提供。记载在文献：Li Gao et al.Development of a SCAR marker for moleculardetection and diagnosis of Tilletia controversa Kühn,the causal fungus ofwheat dwarf bunt[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,2014,30(12):3185-3195中，参见其中材料与方法部分记载的菌株。

4.1.2供试试剂

TransStart Top Green qPCR SuperMix(+DyeⅠ/+DyeⅡ)购自北京全式金生物技术有限公司。其余试剂同实施例2中2.1.3。

4.1.3实验仪器

同实施例1中1.1.6记载的实验仪器。

4.2实验方法

4.2.1培养网腥黑粉菌

方法和步骤同实施例1中1.2.1。

4.2.2小麦接种网腥黑粉菌

方法和步骤同实施例1中1.2.3。

4.2.3提取DNA

方法和步骤同实施例1中1.2.4。

4.2.4特异条带的回收提纯

以小麦网腥黑粉菌基因组DNA为模板，使用引物ISSR827进行PCR扩增，PCR反应体系和反应程序同实施例2中的2.2.5。扩增结束后，对反应产物进行2％琼脂糖凝胶电泳。然后对515bp条带进行切胶回收，方法和步骤同实施例2中的2.2.5。

4.2.5载体连接及转化

方法和步骤同实施例2中2.2.6。

4.2.6质粒提取

方法和步骤同实施例2中2.2.7。

4.2.7 QPCR引物设计

将质粒送往北京擎科新业生物技术有限公司进行测序，根据测序结果使用PrimerPremier 6设计引物，获得用于小麦网腥黑粉菌QPCR检测的引物Qerc19F/R，其核苷酸序列如下：

4.2.8引物Qerc19绝对定量PCR标准曲线建立

以小麦网腥黑粉菌DNA为模板，使用ISSR827引物对其进行特异性扩增，PCR结束后用2％琼脂糖凝胶电泳检测，扩增长度为515bp与预期相符。经菌液PCR和测序鉴定后，提取质粒，测其浓度为240ng/μl，根据拷贝数计算公式：拷贝数(Copies/μl)＝6.02×10¹⁴×质粒浓度(ng/μl)/[(质粒分子量+插入片段分子量)×660]，得到质粒拷贝数为9.24×10¹⁰Copies/μl。对连接有目标条带的质粒进行倍比浓度稀释，分别稀释10^-5、10^-6、10^-7、10^-8倍，每个浓度(2.4pg/μl，0.24pg/μl，24fg/μl，2.4fg/μl)做三个重复，利用设计好的QPCR引物Qerc19F/R，使用TransStart Top Green qPCR SuperMix(+DyeⅠ/+DyeⅡ)(北京全式金生物技术有限公司)进行荧光定量PCR扩增，并绘制扩增曲线、溶解曲线及标准曲线。

PCR体系如下：

PCR程序如下：

4.3实验结果

图6显示QPCR的扩增曲线，图7显示QPCR的溶解曲线。可以看出，溶解曲线峰值单一，产物的Tm值均一，说明引物具有很好的特异性。以连接有515bp小麦网腥黑粉菌特异条带的质粒的拷贝数的对数值为横坐标，对应循环数为纵坐标绘制标准曲线。如图8所示，标准曲线为：y＝-3.518x+54.772(Y：Ct值，X：起始拷贝数)。曲线回归系数R²＝0.9967，这说明标准质粒稀释浓度范围内具有良好的线性关系。由此表明，针对小麦网腥黑粉菌设计的QPCR引物Qerc19F/R具有很强的特异性，且质粒浓度稀释到2.4fg/μl时仍保持着良好的特异性。

序列表

<110> 中国农业科学院植物保护研究所

<120> 用于检测小麦网腥黑粉菌的SCAR标记引物及其应用

<130> P210115-ZWB

<150> 202110266748.6

<151> 2021-03-11

<160> 106

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 266

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cttgtccaag cacgtaccgt agatgcagta agtagataca gtcaggaagt atctaagcac 60

agtacatcca tacacccata catacataca ggagtcagta gtcagtagtc agtatctaca 120

gtagtcagta tctacttatc tacttaggta ctacagtgta gtaagaacat gcgtgatcgc 180

tataggtatc caccacggcc aaagccccaa aaattacacc accgactccc ggccggcgac 240

gcttcccccc tactctcgct gcgcag 266

<210> 2

<211> 515

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acaccaccac acaccgaagg aagccccgag ccggtcctcc cggcgggccc gctaaggctg 60

cctccgaagg cgaggacgac ctgttcctct gcggcgttcg cgtagctttc tgttgtttgc 120

tgttgacgcg cttgggctgc gtgtgttttg ttccggattg cgatgcatcg ttttgcgaat 180

gcgaatcgtt cctagtaaaa gaaagaacaa caaaaagttt gtgggagtga gtgaatgcag 240

tgaaagcctt gatgatcaca ccctagaaaa ctcacctgta cgctggatac ggggaagtgg 300

gtactctgca tcacctcccg gaagagctca aagtcgagct gggtatagac atcagccagc 360

cgatctgcgc ctgtgctcgg ctcaggcacg ccagtctggc gtgcaaaggc gccgagctcg 420

gtgggtaggg tagaggcaag atagaggaag agggcttctt ggagggcgaa gatgcgggag 480

tggtaggagg atgggtatgg gagtgggtag tgatg 515

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cttgtccaag cacgtacc 18

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctgcgcagcg agagtag 17

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gctttctgtt gtttgctgtt ga 22

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atcggctggc tgatgtctat a 21

<210> 7

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atatatatat atatatt 17

<210> 8

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atatatatat atatatg 17

<210> 9

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atatatatat atatatc 17

<210> 10

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tatatatata tatataa 17

<210> 11

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tatatatata tatatac 17

<210> 12

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atatatatat atatag 16

<210> 13

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

agagagagag agagagt 17

<210> 14

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

agagagagag agagagc 17

<210> 15

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

agagagagag agagagg 17

<210> 16

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gagagagaga gagagat 17

<210> 17

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gagagagaga gagagac 17

<210> 18

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gagagagaga gagagaa 17

<210> 19

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ctctctctct ctctctt 17

<210> 20

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ctctctctct ctctcta 17

<210> 21

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ctctctctct ctctctg 17

<210> 22

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

cacacacaca cacacat 17

<210> 23

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

cacacacaca cacacaa 17

<210> 24

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

cacacacaca cacacag 17

<210> 25

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

gtgtgtgtgt gtgtgta 17

<210> 26

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

gtgtgtgtgt gtgtgtc 17

<210> 27

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

gtgtgtgtgt gtgtgtt 17

<210> 28

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

tctctctctc tctctca 17

<210> 29

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

tctctctctc tctctcc 17

<210> 30

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

tctctctctc tctctcg 17

<210> 31

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

acacacacac acacact 17

<210> 32

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

acacacacac acacacc 17

<210> 33

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

acacacacac acacacg 17

<210> 34

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

tgtgtgtgtg tgtgtga 17

<210> 35

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

tgtgtgtgtg tgtgtgc 17

<210> 36

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

tgtgtgtgtg tgtgtgg 17

<210> 37

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

atatatatat atatatya 18

<210> 38

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

atatatatat atatatyc 18

<210> 39

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

atatatatat atatatyg 18

<210> 40

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

agagagagag agagagyt 18

<210> 41

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

agagagagag agagagyc 18

<210> 42

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

agagagagag agagagya 18

<210> 43

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

tatatatata tatatart 18

<210> 44

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

tatatatata tatatarc 18

<210> 45

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

tatatatata tatatarg 18

<210> 46

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

gagagagaga gagagayt 18

<210> 47

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

gagagagaga gagagayc 18

<210> 48

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

gagagagaga gagagayg 18

<210> 49

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

ctctctctct ctctctra 18

<210> 50

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

ctctctctct ctctctrc 18

<210> 51

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 51

ctctctctct ctctctrg 18

<210> 52

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 52

cacacacaca cacacart 18

<210> 53

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 53

cacacacaca cacacarc 18

<210> 54

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 54

cacacacaca cacacarg 18

<210> 55

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 55

gtgtgtgtgt gtgtgtya 18

<210> 56

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 56

gtgtgtgtgt gtgtgtyc 18

<210> 57

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 57

gtgtgtgtgt gtgtgtyg 18

<210> 58

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 58

tctctctctc tctctcra 18

<210> 59

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 59

tctctctctc tctctcrt 18

<210> 60

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 60

tctctctctc tctctcrg 18

<210> 61

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 61

acacacacac acacacyt 18

<210> 62

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 62

acacacacac acacacya 18

<210> 63

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 63

acacacacac acacacyg 18

<210> 64

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 64

tgtgtgtgtg tgtgtgrt 18

<210> 65

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 65

tgtgtgtgtg tgtgtgrc 18

<210> 66

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 66

tgtgtgtgtg tgtgtgra 18

<210> 67

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 67

accaccacca ccaccacc 18

<210> 68

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 68

agcagcagca gcagcagc 18

<210> 69

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 69

agtagtagta gtagtagt 18

<210> 70

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 70

atgatgatga tgatgatg 18

<210> 71

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 71

ccgccgccgc cgccgccg 18

<210> 72

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 72

ctcctcctcc tcctcctc 18

<210> 73

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 73

ggcggcggcg gcggcggc 18

<210> 74

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 74

gaagaagaag aagaagaa 18

<210> 75

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 75

gttgttgttg ttgttgtt 18

<210> 76

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 76

tgctgctgct gctgctgc 18

<210> 77

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 77

tattattatt attattat 18

<210> 78

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 78

gatagataga tagata 16

<210> 79

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 79

gacagacaga cagaca 16

<210> 80

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 80

ccctccctcc ctccct 16

<210> 81

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 81

ctagctagct agctag 16

<210> 82

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 82

gatagataga cagaca 16

<210> 83

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 83

tgcatgcatg catgca 16

<210> 84

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 84

ggatggatgg atggat 16

<210> 85

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 85

cttcacttca cttca 15

<210> 86

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 86

ggagaggaga ggaga 15

<210> 87

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 87

gggtggggtg gggtg 15

<210> 88

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 88

vbvatatata tatatat 17

<210> 89

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 89

bvbtatatat atatata 17

<210> 90

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 90

hbhagagaga gagagag 17

<210> 91

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 91

bhbgagagag agagaga 17

<210> 92

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 92

vdvctctctc tctctct 17

<210> 93

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 93

dvdtctctct ctctctc 17

<210> 94

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 94

bdbcacacac acacaca 17

<210> 95

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 95

dbdacacaca cacacac 17

<210> 96

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 96

vhvgtgtgtg tgtgtgt 17

<210> 97

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 97

hvhtgtgtgt gtgtgtg 17

<210> 98

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 98

tagatctgat atctgaattc cc 22

<210> 99

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 99

nnnnnnnnnn nnnnn 15

<210> 100

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 100

tggtagctct tgatcannnn n 21

<210> 101

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 101

agagttggta gctcttgatc 20

<210> 102

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 102

aggtcgcggc cgcnnnnnna tg 22

<210> 103

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 103

ccgactcgag nnnnnnatgt gg 22

<210> 104

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 104

gatcaagctt nnnnnnatgt gg 22

<210> 105

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 105

catggtgttg gtcattgttc ca 22

<210> 106

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 106

acttccccac aggttaacac a 21

Claims (10)

1.用于鉴定小麦网腥黑粉菌(Tilletia tritici)的SCAR标记，其核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。

2.用于鉴定小麦网腥黑粉菌(Tilletia tritici)的SCAR标记引物，其核苷酸序列为：

Erc19 F：5’-CTTGTCCAAGCACGTACC-3’；

Erc19 R：5’-CTGCGCAGCGAGAGTAG-3’。

3.用于鉴定小麦网腥黑粉菌(Tilletia tritici)的试剂盒，其包含权利要求2所述的SCAR标记引物。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含PCR通用试剂。

5.一种鉴定小麦网腥黑粉菌(Tilletia tritici)的方法，包括如下步骤：

(1)提取待测样品的DNA；

(2)以待测样品的DNA为模板，使用权利要求2所述的SCAR标记引物进行PCR，得到扩增产物；

(3)通过凝胶电泳检测扩增产物，若扩增产物中出现大小为266bp的条带，则待测样品中含有小麦网腥黑粉菌；若扩增产物中没有出现大小为266bp的条带，则待测样品中不含有小麦网腥黑粉菌。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述待测样品为小麦。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述PCR的反应体系为：2×Pro TaqMaster Mix，12.5μl；ddH₂O，9.5μl；正向引物Erc19 F，1μl；反向引物Erc19 R，1μl；DNA模板，1μl；反应条件为：94℃ 30s；98℃ 10s，61.5℃ 30s，72℃ 1min，35个循环；72℃ 2min。

8.用于检测小麦网腥黑粉菌(Tilletia tritici)的QPCR引物，其核苷酸序列如下：

Qerc19 F：5’-GCTTTCTGTTGTTTGCTGTTGA-3’；

Qerc19 R：5’-ATCGGCTGGCTGATGTCTATA-3’。

9.用于检测小麦网腥黑粉菌(Tilletia tritici)的QPCR试剂盒，其包含权利要求8所述的QPCR引物。

10.权利要求2所述的SCAR标记引物或权利要求8所述的QPCR引物在鉴定小麦网腥黑粉菌(Tilletia tritici)中的应用。

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