CN105331713A - 微滴数字PCR（ddPCR）检测土壤中TCK冬孢子的方法 - Google Patents

微滴数字PCR（ddPCR）检测土壤中TCK冬孢子的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105331713A
CN105331713A CN201510819292.6A CN201510819292A CN105331713A CN 105331713 A CN105331713 A CN 105331713A CN 201510819292 A CN201510819292 A CN 201510819292A CN 105331713 A CN105331713 A CN 105331713A
Authority
CN
China
Prior art keywords
soil
minutes
droplet
digital pcr
pedotheque
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201510819292.6A
Other languages
English (en)
Inventor
高利
蔚慧欣
沈慧敏
齐婷
董二容
陈万权
刘太国
刘博�
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Original Assignee
Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences filed Critical Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority to CN201510819292.6A priority Critical patent/CN105331713A/zh
Publication of CN105331713A publication Critical patent/CN105331713A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及微滴数字PCR(ddPCR)检测土壤中TCK冬孢子的方法，步骤包括：(1)提取待测土壤样品的总DNA；(2)以待测土壤样品的总DNA为模板进行微滴数字PCR反应，得到PCR产物；(3)将PCR产物放入微滴读取仪中读取信号，分析实验数据，获得土壤样品中小麦矮腥黑粉菌的绝对含量。所述总DNA提取方法包括：将取回的土壤样品过网筛除去杂质，然后冷冻；采用FastDNATM？SPIN？Kit？for？Soil试剂盒提取土壤样品的总DNA。本发明方法能够从土壤中提取出质量较好的DNA，采用微滴数字PCR进行检测，实现了土壤中小麦矮腥黑粉菌的绝对定量，有利于及时采取防治措施，减少经济损失。

Description

微滴数字PCR（ddPCR）检测土壤中TCK冬孢子的方法
技术领域
本发明涉及微滴数字PCR(ddPCR)检测土壤中TCK冬孢子的方法，属于小麦矮腥黑粉菌防治领域。
背景技术
小麦矮腥黑穗病是由小麦矮腥黑粉菌(TilletiacontroversaKühn，TCK)引起的重要国际检疫性病害，也是我国对外检疫的一类危险性植物病害。该病害危害大、防治难，一旦传入会给小麦生产带来毁灭性危害，通常发病率约等于小麦产量损失率。据Hoffmann报告，在流行年份，因TCK引起的损失率一般为20％～50％，最高可达75％～90％。除了产量损失外，被侵染的小麦出粉率也会随着感染严重程度而降低，并且因含有TCK冬孢子而极大地影响品质。TCK的寄主范围很广，危害小麦、大麦、黑麦等禾本科18个属的70多种植物，其中，对小麦危害最严重。小麦矮腥黑粉菌对我国的小麦生产存在潜在危机，该病在栽培条件下的主要寄主为冬小麦，我国常年小麦种植面积约2300万hm2，其中冬小麦占绝大部分，西北、黄淮海等广大冬麦区均适合小麦矮腥黑粉菌的定殖和发生危害，随着我国加入WTO及与TCK疫区国家-美国小麦贸易的增加，TCK传入我国的可能性日益增大，因此，必须加强小麦矮腥黑穗病的早期预警及检疫检测，为病害防治提供技术储备。冬季小麦矮腥黑粉菌冬孢子潜藏在土壤中，定性定量检测土壤中小麦矮腥黑粉菌冬孢子的含量，对于早期预警和预防病害，具有重要的意义。
聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)是分析检测样品中核酸分子最常用的方法。目前，应用最多、灵敏度最高的核酸定量技术是实时荧光定量聚合酶链式反应，其准确度可达95％，检测时将未知的目标核酸分子和已知标准样品同时进行扩增，根据加入的荧光分子探针信号实时观察模板的扩增情况，检测结果以线性的扩增信号形式输出，根据已知标准样品的扩增曲线来推算未知样品的起始模板拷贝量。因此，荧光定量PCR技术是一种相对的核酸定量方法，其灵敏度和准确度均受到限制。qRT-PCR在分析外源基因拷贝数时必须依赖于标准曲线和已知拷贝数的基因，只是一种相对定量方法，且标准曲线的质量易受到DNA纯度、引物和探针的浓度、反应抑制因子等诸多因素影响(Cankaretal.,2006)；另外，标准曲线必须基于标准物质建立，而标准物质的种类有限和昂贵价格不能适用于所有的研究。并且，小麦矮腥黑粉菌孢子体积质量都非常小，而土壤中微生物种类多，TCK的DNA在土壤样品总DNA中的比例极低，有必要采用灵敏度更高的方法进行定量分析。
数字PCR(dropletdigitalPCR,ddPCR)是近10年兴起的第三代PCR技术。通过极度稀释实现理论上的单分子扩增，然后用终点法PCR和泊松分布计算出样品的原始浓度。斯洛文尼亚科研人员利用微滴ddPCR(dropletdigitalPCR,ddPCR)检测转基因玉米MON810的外源基因含量，从而开启了新一代PCR技术检测转基因食品的先河。ddPCR将预混合的PCR反应体系随机分散到数千万个微滴中形成油包水的结构，保证每个微滴中仅含有一个或不含有模板分子。每个微滴在各自的反应体系中进行PCR扩增，扩增的产物通过之前添加的探针发出荧光信号从而实现定量目的。由于微滴中模板的存在情况满足泊松分布，根据发出荧光信号的数目代入泊松分布公式计算即可得出样品的定量结果。而且，该方法无需依赖外部核酸标准，因此可实现对核酸分子的绝对定量分析；其定性和定量检测限比传统定量PCR低，能分别达到5个和6个拷贝数，比定量PCR灵敏度高1000-10000，其他方面如特异性和重复性较之于传统定量PCR也存在极大的优势。鉴于这种微滴反应能极大程度分散反应体系，它可以有效消除抑制因子的作用，保证检测过程中的扩增效率，对检测低含量目标核酸分子的样品有良好的效果。
发明内容
根据上述领域存在的不足和需求，本发明提供一种微滴数字PCR检测土壤中TCK冬孢子的方法，能够对土壤中的小麦矮腥黑粉菌进行绝对定量，有利于及时采取防治措施，防止小麦矮腥黑穗病的发生。
本发明要求保护的技术方案如下：
微滴数字PCR检测土壤中小麦矮腥黑粉菌的方法，其特征在于，包含如下步骤：
(1)提取待测土壤样品的总DNA；
(2)以待测土壤样品的总DNA为模板进行微滴数字PCR反应，得到PCR产物；
(3)将PCR产物放入微滴读取仪中读取信号，分析实验数据，获得土壤样品中小麦矮腥黑粉菌的绝对含量，
其特征在于，土壤中小麦矮腥黑粉菌的总DNA提取方法如下：
将取回的土壤样品过网筛除去杂质；然后冷冻；
采用FastDNATMSPINKitforSoil试剂盒提取土壤样品的总DNA，步骤如下：
(1)称取500mg土壤加到LysingMatrixETube中；
(2)加978ulsodiumPhosphateBuffer到管中；
(3)加122ulMTBuffer；采用细胞震荡破碎仪以6.5M/S震荡2分钟对土壤样品进行处理；
(4)14000r/min离心10分钟；
(5)将上清液转移到一个2ml管，加入250ulPPS，混合均匀；
(6)14000r/min离心5分钟，将上清液转移到一个新的2ml管；
(7)加入1ml充分混匀的BindingMatrix；
(8)涡旋2分钟，让DNA充分结合基质，涡旋后将管放到管架上静置3分钟；
(9)去除500ul上清液，避免碰到沉淀；
(10)重悬试管让BindingMatrix重新混匀，取约600ul的混合液转移到SpinFilter中，14000r/min离心1分钟，倒空流出液，再把剩下的上清液加入SpinFilter中，14000r/min离心1分钟，倒出流出液；
(11)加500ul的已加入无水乙醇的SEWS-M到SpinFilter中，利用水流重悬里面的固体；
(12)14000r/min离心1分钟，倒出流出液；
(13)14000r/min空离2分钟，以清空SpinFilter中剩余的SEWS-M液体；
(14)移动SpinFilter到新的CatchTube中，放置于室温下风干5分钟；
(15)加入50ul的DES，用枪头轻轻搅动滤膜，将样品放到55度水浴锅中加热5分钟；
(16)取出样品后，14000r/min离心1分钟，弃掉SpinFilter，将CatchTube中的DNA放置于4度冰箱备用。
所述微滴数字PCR反应的体系为：10μLddPCRSupermixforProbes，10μL/mol正向引物和反向引物各1.8μL，探针0.6μL，DNA模板2.0μL，ddH2O3.8μL。
所述正、反向引物及探针引物的核苷酸序列为：
正向引物：5’-ACGACCGACTTTCCGAGAGC-3’，
反向引物：5’-GTGTGGGACGAAGGCATCAA-3’，
探针引物：FAM5’-ACGACTTGCGGTCCCTCCACA-3’TAMAR。
所述微滴数字PCR反应的程序为：95℃预变性10分钟，1个循环；94℃变性15秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，10个循环；94℃变性15秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，30个循环。
小麦矮腥黑粉菌孢子体积质量都非常小，而土壤中微生物种类多，TCK的DNA在土壤样品总DNA中的比例极低，使用常规PCR检测不到小麦矮腥黑穗病菌，容易产生假阴性结果。本发明提供的检测方法，通过冷冻处理待测土壤样品，改良DNA提取方法，从土壤中有效提取出质量较好的DNA，再利用微滴数字PCR进行检测，实现了土壤中小麦矮腥黑粉菌的绝对定量，有利于小麦矮腥黑穗病的早期预警，及时采取防治措施，减少经济损失。
本发明提供的DNA提取方法能够有效地提取出土壤样品的总DNA，并且DNA的质量较好，其OD260nm/OD280nm的比值均在1.8至1.9左右，浓度均在200～300ng/μL，提高了后续检测结果的可信度，避免因DNA质量不好造成假阴性结果。
本发明提供的方法利用灵敏度和准确度更高的微滴数字PCR反应进行检测，通过优化反应体系和反应程序，能够对土壤中含量极低的小麦矮腥黑粉菌进行绝对定量。
附图说明
图1.采用本发明方法提取的土壤样品的总DNA。
图2.采用FastDNATMSPINKitforSoil所附带的提取步骤提取土壤样品的总DNA。
图3.微滴数字PCR法检测土壤样品TCK含量的微滴数分布图，
其中，横坐标表示微滴数，纵坐标表示荧光强度，图中蓝色为阳性微滴数，黑色为阴性微滴数。由图中蓝色簇面积可直观得到检测结果。
图4.微滴数字PCR法检测土壤样品TCK含量的的阳性拷贝数，
其中，横坐标表示样品名称，纵坐标表示可检测到的阳性拷贝数，阳性拷贝数的单位为copies/μL。由图得到可检测到的最低拷贝数为3.2copies/μL。
图5.样品生成的阳性微滴数与总微滴数的柱状图，
其中，横坐标表示样品名称，纵坐标表示微滴数，紫色为阳性微滴数，蓝色为总微滴数。总微滴数生成在10000以上得出的结论可靠准确，阳性微滴数为0，土壤未检测到TCK冬孢子。
图6.微滴数字PCR法检测一般方法提取的土壤DNA以及阴性对照样品微滴数分布图，
其中A图，横坐标表示微滴数，纵坐标表示荧光强度，黑色为阴性微滴数，阳性微滴数为0；B图深蓝色为阴性微滴数，浅蓝色为总微滴数。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行详细说明，需要理解的是，以下实施例仅作为解释和说明，而不以任何形式限制本发明的范围。
下述实施例未特别说明的生物化学试剂，均为本领域常规试剂，可以通过本领域常规方法配制而得或商购获得，规格为实验室纯级即可。
含有TCK冬孢子的土壤来自中国农业科学院植物保护研究所，为实验室采用TCK冬孢子接种小麦试验过程中产生的侵染土壤。TCK菌种为小麦矮腥黑粉菌(TilletiacontroversaKühn)菌株：本发明所有的TCK菌株为现有文献L.GAOetal.DevelopmentofaSCARMakerbyinter-simplesequencerepeatfordignoisisofDwarfBuntofWheatandDetectionofTilletiacontroversaKühn.FoliaMicrobiol.55(3),258–264(2010)所记载，参见其中材料与方法部分记载的在美国由B.Goates教授分离到的分离株。另外也记载在L.GAOetal.AnISSR-basedApproachfortheMolecularDetectionandDiagnosisofDwarfBuntofWheat,CausedbyTilletiacontroversaKu¨hn.JPhytopathol159:155–158(2011)，为其中材料与方法部分记载的DrBlairGoates所提供的TCK菌株。本实验室亦有保存，可自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。
实施例1.采用本发明方法检测土壤中的TCK冬孢子
土壤样品的前处理：
将采集的25份鲜土样过40目网筛，放入小号自封袋，并在每个自封袋上写明取样地点、所种植的小麦品种、时期及取样时间，置于-20℃冰箱中过夜。提取DNA前，将经过冷冻处理的土样从冰箱中取出，称取0.5g土样置于2mlLysingMatrixETube中(内含研磨珠)，然后使用细胞震荡破碎仪，6.5M/S震荡2分钟。
1、采用FastDNATMSPINKitforSoil试剂盒，按照下列优化过的步骤提取土壤样品的总DNA：
(a)称取500mg土壤加到LysingMatrixETube中；
(b)加978ulsodiumPhosphateBuffer到管中；
(c)加122ulMTBuffer；
(d)将加好样的LysingMatrixETube放到细胞震荡破碎仪中，6.5M/S震荡2分钟(或Mini-Beadbeater震荡2分钟)；
(e)14000r/min离心10分钟；
(f)将上清液转移到一个2ml管，加入250ulPPS，混合均匀；
(g)14000r/min离心5分钟，将上清液转移到一个新的2ml管；
(h)加入1mlBindingMatrix(使用前充分混匀)；
(i)涡旋2分钟，让DNA充分结合基质，涡旋后将管放到管架上静置3分钟；
(j)去除500ul上清液，避免碰到沉淀；
(k)重悬试管让BindingMatrix重新混匀，取约600ul的混合液转移到SpinFilter中，14000r/min离心1分钟，倒空流出液，再把剩下的上清液加入SpinFilter中，14000r/min离心1分钟，倒出流出液；
(l)加500ul的SEWS-M(药品使用前加入无水乙醇)到SpinFilter中，利用水流重悬里面的固体；
(m)14000r/min离心1分钟，倒出流出液；
(n)14000r/min空离2分钟，以清空SpinFilter中剩余的SEWS-M液体；
(o)移动SpinFilter到新的CatchTube中，放置于室温下风干5分钟；
(p)加入50ul的DES，用枪头轻轻搅动滤膜，将样品放到55度水浴锅中加热5分钟；
(q)取出样品后，14000r/min离心1分钟，弃掉SpinFilter，将CatchTube中的DNA放置于4度冰箱备用。
琼脂糖凝胶电泳检测提取的DNA，结果如图1所示，提取的DNA质量较好。用紫外分光光度计(Denovix)测DNA的浓度，结果表明，采用改良后的方法提取的DNA的OD260nm/OD280nm的比值均在1.8至1.9左右，浓度均在200～300ng/μL，与琼脂糖电泳结果相符合。
2、同样的土样，采用FastDNATMSPINKitforSoil所附带的提取步骤提取DNA。
琼脂糖凝胶电泳检测提取的DNA，结果如图2所示，Marker条带出现，而提取的土壤DNA没有检测到条带。用紫外分光光度计(Denovix)测DNA的浓度，结果表明，提取的DNA的OD260nm/OD280nm的比值均在1.4-1.6左右。由此表明，按照FastDNATMSPINKitforSoil试剂盒说明书中的提取方法不能提取出土壤总DNA。
3、以步骤1和步骤2获得的土壤样品总DNA为分别作为模板，采用下列引物对:
ISSR859-140A：5’-TGGTGGTCGGGAAAGATTAGA-3’，
ISSR859-511A:5’-GGGACGAAGGCATCAAGAAG-3’，
按照下列反应体系和反应程序进行常规PCR反应：
PCR反应体系
PCR反应程序
35个循环
步骤572℃7min延伸
PCR产物保存于4℃结束
采用2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果所有样品中都没有靶带扩增。本研究采用试剂盒提取土壤总DNA，使用常规PCR检测不到小麦矮腥黑穗病菌，说明总DNA中菌量含量极低，需要采用灵敏度更高的方法进行定量分析。
4、采用微滴数字PCR法检测TCK冬孢子
微滴式数字PCR(QX200，BIO-RAD，USA)反应包括配置体系、生成微滴、扩增循环和信号读取4个步骤。
(1)配置体系
以步骤1提取的DNA为模板，采用下列引物：
正向引物：5’-ACGACCGACTTTCCGAGAGC-3’，
反向引物：5’-GTGTGGGACGAAGGCATCAA-3’，
探针引物：FAM5’-ACGACTTGCGGTCCCTCCACA-3’TAMAR，按照下列体系进行配置：
微滴数字PCR体系为20μL，包含10μLddPCRSupermixforProbes(186-3026，BIO-RAD，USA)，10μL/mol正向引物和反向引物各1.8μL、探针0.6μL，DNA模板2.0μL，ddH2O3.8μL。
(2)生成微滴
生成微滴需要使用专门的微滴生成卡(186-4007，BIO-RAD，USA)和微滴生成仪，将40μLPCR体系和70μL微滴生成油(186-3005，BIO-RAD，USA)加入微滴生成卡，覆盖专用胶垫后置入微滴生成仪，生成微滴。
制备微滴的步骤如下：
(a)将20μl反应液加入到微滴发生卡中间一排的8个孔内，不足8个样品时用20μl1×溶液D补足，建议使用8通道20μl排枪和20μl枪头(不能用200ul枪头)，加样时枪头接近孔一侧底部，与侧壁呈大约15°角，缓慢打出液体，打出一部分后慢慢提升枪头位置再打出余下液体，不要将枪按至超过第一档位置以免引入气泡。
(b)在微滴发生卡最底下一排8个孔中各加入70μl微滴生成油，同样不能有空着的孔。
(c)盖上胶垫，注意两边的小孔都要钩牢。
(d)将以上卡托(186-3051，BIO-RAD，USA)轻轻地平稳放置于微滴生成仪中，开始生成微滴，注意仪器上指示灯状态，一般2分钟之内完成
(e)微滴生成于微滴发生卡最上面一排孔内，建议使用8通道排枪和200μl枪头小心缓慢吸取，调整吸取体积为40μl，将卡托放平，枪头以与孔壁呈30～45°角放入，轻触孔底，约5秒吸取40ul，再同样缓慢地打入96孔板(0030128605，eppendorf，Genmany)相应位置孔内(约5秒)，枪头贴近孔壁接近孔底，注意封上盖以防油挥发，每次弃去已使用过的微滴发生卡和胶垫。
(f)封膜：
封膜仪(181-4000，BIO-RAD，USA)180度热封，使用密封箔(181-4040，BIO-RAD，USA)封好之后应该在30分钟内进行PCR反应，或者放于4℃冰箱4小时之内进行PCR，可在任意一台96孔PCR仪上完成，注意升降温速度≤2.5℃/s。
(3)扩增循环
微滴数字PCR扩增使用两部法，设置程序如下：
(4)信号读取
(a)扩增结束后，将96孔板放入plateholder中组装好，注意板斜角方位，组装好之后轻轻地平稳放入微滴读取仪中读取信号。
(b)使用软件QuantaSoft分析实验数据，获得绝对定量结果。
以步骤1提取的DNA为模板，检测结果如图3～5所示。
图3是微滴数字PCR法检测土壤样品TCK含量的微滴数分布图，其中，横坐标表示微滴数，纵坐标表示荧光强度，图中蓝色为阳性微滴数，黑色为阴性微滴数。由图中蓝色簇面积可直观得到检测结果。
图4是微滴数字PCR法检测土壤样品TCK含量的的阳性拷贝数，其中，横坐标表示样品名称，纵坐标表示可检测到的阳性拷贝数，阳性拷贝数的单位为copies/μL。由图得到可检测到的最低拷贝数为3.2copies/μL。
图5是样品生成的阳性微滴数与总微滴数的柱状图，其中，横坐标表示样品名称，纵坐标表示微滴数，紫色为阳性微滴数，蓝色为总微滴数。总微滴数生成在10000以上得出的结论可靠准确，阳性微滴数为0，土壤未检测到小麦矮腥冬孢子。
以步骤2提取的DNA为模板，检测结果如图6所示，其中A图，横坐标表示微滴数，纵坐标表示荧光强度，黑色为阴性微滴数，阳性微滴数为0；B图深蓝色为阴性微滴数，浅蓝色为总微滴数，总微滴数与阴性微滴数相同，说明没检测到阳性微滴。
以上结果说明，采用本发明的土壤DNA提取方法，结合微滴数字PCR方法，能够高灵敏度地检测到土壤中的TCK冬孢子。

Claims (4)

1.微滴数字PCR检测土壤中小麦矮腥黑粉菌的方法，其特征在于，包含如下步骤：
(1)提取待测土壤样品的总DNA；
(2)以待测土壤样品的总DNA为模板进行微滴数字PCR反应，得到PCR产物；
(3)将PCR产物放入微滴读取仪中读取信号，分析实验数据，获得土壤样品中小麦矮腥黑粉菌的绝对含量，
其特征在于，土壤中小麦矮腥黑粉菌的总DNA提取方法如下：
将取回的土壤样品过网筛除去杂质；然后冷冻；
采用FastDNATMSPINKitforSoil试剂盒提取土壤样品的总DNA，步骤如下：
(1)称取500mg土壤加到LysingMatrixETube中；
(2)加978ulsodiumPhosphateBuffer到管中；
(3)加122ulMTBuffer；采用细胞震荡破碎仪以6.5M/S震荡2分钟对土壤样品进行处理；
(4)14000r/min离心10分钟；
(5)将上清液转移到一个2ml管，加入250ulPPS，混合均匀；
(6)14000r/min离心5分钟，将上清液转移到一个新的2ml管；
(7)加入1ml充分混匀的BindingMatrix；
(8)涡旋2分钟，让DNA充分结合基质，涡旋后将管放到管架上静置3分钟；
(9)去除500ul上清液，避免碰到沉淀；
(10)重悬试管让BindingMatrix重新混匀，取约600ul的混合液转移到SpinFilter中，14000r/min离心1分钟，倒空流出液，再把剩下的上清液加入SpinFilter中，14000r/min离心1分钟，倒出流出液；
(11)加500ul的已加入无水乙醇的SEWS-M到SpinFilter中，利用水流重悬里面的固体；
(12)14000r/min离心1分钟，倒出流出液；
(13)14000r/min空离2分钟，以清空SpinFilter中剩余的SEWS-M液体；
(14)移动SpinFilter到新的CatchTube中，放置于室温下风干5分钟；
(15)加入50ul的DES，用枪头轻轻搅动滤膜，将样品放到55度水浴锅中加热5分钟；
(16)取出样品后，14000r/min离心1分钟，弃掉SpinFilter，将CatchTube中的DNA放置于4度冰箱备用。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微滴数字PCR反应的体系为：10μLddPCRSupermixforProbes，10μL/mol正向引物和反向引物各1.8μL，探针0.6μL，DNA模板2.0μL，ddH2O3.8μL。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述正、反向引物及探针引物的核苷酸序列为：
正向引物：5’-ACGACCGACTTTCCGAGAGC-3’，
反向引物：5’-GTGTGGGACGAAGGCATCAA-3’，
探针引物：FAM5’-ACGACTTGCGGTCCCTCCACA-3’TAMAR。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述微滴数字PCR反应的程序为：95℃预变性10分钟，1个循环；94℃变性15秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，10个循环；94℃变性15秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，30个循环。
CN201510819292.6A 2015-11-10 2015-11-23 微滴数字PCR（ddPCR）检测土壤中TCK冬孢子的方法 Pending CN105331713A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510819292.6A CN105331713A (zh) 2015-11-10 2015-11-23 微滴数字PCR（ddPCR）检测土壤中TCK冬孢子的方法

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510763166 2015-11-10
CN2015107631663 2015-11-10
CN201510819292.6A CN105331713A (zh) 2015-11-10 2015-11-23 微滴数字PCR（ddPCR）检测土壤中TCK冬孢子的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105331713A true CN105331713A (zh) 2016-02-17

Family

ID=55282476

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510819292.6A Pending CN105331713A (zh) 2015-11-10 2015-11-23 微滴数字PCR（ddPCR）检测土壤中TCK冬孢子的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105331713A (zh)

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1891835A (zh) * 2005-06-29 2007-01-10 中国农业科学院植物保护研究所 小麦矮腥黑粉菌检测的一种pcr方法
CN101560515A (zh) * 2009-06-02 2009-10-21 中国农业科学院植物保护研究所 一种小麦矮腥黑粉菌的特异基因序列、特异性scar标记及pcr检测方法
CN102154279A (zh) * 2009-06-02 2011-08-17 中国农业科学院植物保护研究所 一种小麦矮腥黑粉菌的检测方法及特异性scar标记
CN102154278A (zh) * 2009-06-02 2011-08-17 中国农业科学院植物保护研究所 一种小麦矮腥黑粉菌的快速检测方法及其特异性scar标记
CN104774920A (zh) * 2014-09-18 2015-07-15 中国农业科学院植物保护研究所 采用Taqman探针法鉴定小麦黑穗菌(Tilletia controversa Kühn)的方法及试剂盒
CN104846100A (zh) * 2015-05-24 2015-08-19 北京工业大学 一种可用于微滴数字pcr的微滴制备方法
CN104928368A (zh) * 2015-05-24 2015-09-23 北京工业大学 一种利用硅油的适用于微滴数字pcr的微滴制备方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1891835A (zh) * 2005-06-29 2007-01-10 中国农业科学院植物保护研究所 小麦矮腥黑粉菌检测的一种pcr方法
CN101560515A (zh) * 2009-06-02 2009-10-21 中国农业科学院植物保护研究所 一种小麦矮腥黑粉菌的特异基因序列、特异性scar标记及pcr检测方法
CN102154279A (zh) * 2009-06-02 2011-08-17 中国农业科学院植物保护研究所 一种小麦矮腥黑粉菌的检测方法及特异性scar标记
CN102154278A (zh) * 2009-06-02 2011-08-17 中国农业科学院植物保护研究所 一种小麦矮腥黑粉菌的快速检测方法及其特异性scar标记
CN104774920A (zh) * 2014-09-18 2015-07-15 中国农业科学院植物保护研究所 采用Taqman探针法鉴定小麦黑穗菌(Tilletia controversa Kühn)的方法及试剂盒
CN104846100A (zh) * 2015-05-24 2015-08-19 北京工业大学 一种可用于微滴数字pcr的微滴制备方法
CN104928368A (zh) * 2015-05-24 2015-09-23 北京工业大学 一种利用硅油的适用于微滴数字pcr的微滴制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
洪来法: "基于核酸精准检测的微滴式数字PCR 检测技术", 《新发传染病研究热点研讨会》 *
董莲华等: "大肠杆菌O157：H7微滴数字PCR定量方法的建立", 《分析化学研究报告》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104611428A (zh) 一种检测胶孢炭疽菌的环介导等温扩增引物组合物及其应用
CN102363815B (zh) 运用交叉引物核酸恒温扩增技术检测沙门菌的试剂及其扩增方法和检测方法
CN105039586A (zh) 检测鸭2型腺病毒的引物及试剂盒
CN107338314B (zh) 闭管可视化鳗源嗜水气单胞菌环介导等温扩增检测方法
CN107022624A (zh) 从稻种中快速检测水稻恶苗病病菌的lamp法及试剂盒
CN104774955A (zh) 一种葡萄座腔菌的检测方法
CN109897910A (zh) 一种基于rpa-侧流层析试纸条技术快速精准检测尖镰孢菌的方法
CN105112564A (zh) 一种运用连接酶检测高危型HPV E6/E7 mRNA的方法及试剂盒
CN103276057B (zh) 一种基于lamp技术快速检测灰葡萄孢的方法
CN102634580B (zh) 同时检测多种致病菌的检测用引物及检测方法
CN104232783B (zh) 牛种布氏菌弱毒疫苗株a19的快速检测方法
CN113684321B (zh) 香蕉线条病毒ol rpa检测引物、检测试剂盒及应用
CN102676664A (zh) 同时检测多种水产品致病菌的荧光定量pcr引物和探针及检测方法
CN104328175A (zh) 用于检测鼠肺炎克雷伯氏菌的环介导等温扩增引物、试剂盒及方法
CN104313128A (zh) 基于环介导等温扩增技术检测禾谷镰孢菌的方法及引物组合物
CN104031997B (zh) 一种用于快速检测甘蔗黑穗病菌的lamp引物组、试剂盒及其检测方法
CN105154584A (zh) 一种快速区分prrsv经典毒株和变异毒株的hrm非标记探针方法及其引物和探针
CN105331713A (zh) 微滴数字PCR（ddPCR）检测土壤中TCK冬孢子的方法
CN103993102A (zh) 一种同时检测人腺病毒、人肺炎支原体、人博卡病毒的方法及试剂盒
CN101475991B (zh) 一种鉴定黑木耳菌株185的方法及用于鉴定黑木耳菌株185的基因序列
CN108384881B (zh) 煤污假尾孢的荧光定量pcr检测方法
CN105779443B (zh) 鉴定或辅助鉴定牡蛎疱疹病毒的引物组合物
CN105950788A (zh) 检测18种高危型hpv核酸的引物、探针及试剂盒
CN108411017A (zh) 检测丁香假单胞菌番茄致病变种的lamp引物及方法
CN105200122A (zh) 小麦条锈菌的定量检测试剂盒及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20160217