CN104846100A - 一种可用于微滴数字pcr的微滴制备方法 - Google Patents

Abstract

一种可用于微滴数字PCR的微滴制备方法，配制PCR水相，PCR水相包括上游引物、下游引物、PCR模板、PCRmix、以及双蒸水；将上述药品以此均匀混合，作为反应水相备用；将上游引物、下游引物、PCR模板、PCRmix依次均匀混合，滴加双蒸水后将溶液体系作为反应水相备用；配制PCR油相，将丙三醇、Trition X-100、Tween-80、壬基苯基醚IgelCO520依次均匀混合；取1体积水相PCR加到2体积的PCR油相中，涡旋搅拌并反应，得到油包水微滴；本发明提供的制备方法，可便捷地配制具有颗粒均匀、热力学性能稳定的油包水反应微滴，简便了微滴数字PCR实验的操作。

Description

一种可用于微滴数字PCR的微滴制备方法

技术领域

本发明涉及分子诊断领域，主要应用于数字微滴PCR中的微滴制备或其它PCR中。

背景技术

传统的反相微乳液法制备的纳米微球粒径一般在10-100纳米左右，不仅粒度小，而且中空。其多应用于在其表面进行化学修饰。本发明提供了一种新方法的建立，在改进的反相微乳液方法的基础上通过水入油时油水不互溶的性质形成一个个单分散的油包水微滴，粒径大约在10-100μm之间，由于内含水溶液，可以作为许多生化反应的微容器。

传统的PCR方法是在PCR水溶液里进行，由于模板之间，引物之间会产生同源碱基序列互补而导致PCR的非特异性条带的扩增，往往增加了假阳性的产生。本发明在微滴制备的基础上，将PCR反应时的模板，引物，Taq酶和PCR mix通过水入油的方式进入形成包含PCR反应产物的微滴，并进行PCR反应。由于被包含的PCR反应产物在单个独立的微滴反应器中反应，降低了非特异性反应的发生。

发明内容

本发明的目的是提供一种PCR实验中油包水微滴及其制备方法，主要应用于目前数字微滴PCR实验中PCR反应液的包裹。通过不同的水相、油相成分的配比，不同的操作条件，便捷地配制一种具有颗粒均匀、热力学性能稳定的油包水反应微滴，简便了PCR实验的操作，以及实验结果的精确性。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的，一种可用于数字微滴PCR的油包水微滴，包括如下步骤：

S1配制PCR水相，PCR水相包括上游引物、下游引物、PCR模板、PCRmix、以及双蒸水；将上述药品以此均匀混合，作为反应水相备用，上述构成的配合比例关系为(0.8-1):(0.8-1):(0.1-0.2):(10-15):(35-40)；将上游引物、下游引物、PCR模板、PCRmix依次均匀混合，滴加双蒸水后将溶液体系作为反应水相备用；

S2配制PCR油相，将95％-98％的丙三醇、0.1％-0.5％的Trition X-100、0.1％-0.5％的Tween-80、0.5％-1％的壬基苯基醚IgelCO520依次均匀混合，获得的溶液作为反应油相备用；

S3取1体积水相PCR加到2体积的PCR油相中，涡旋搅拌并反应，得到油包水微滴；

所述油包水微滴的粒径10-100微米。

所述油相体系中丙三醇、TritionX-100、Tween-80、壬基苯基醚IgelCO520的配比为(95-98):(0.1-0.5):(0.1-0.5):(0.5-1)。

所述水相逐滴加入油相，同时涡旋搅拌。

所述水相一次性加入油相，并且涡旋搅拌。

所述水相和油相的体积比为1:2。

涡旋搅拌的时间为4-6min，反应时间为14-16min。

本方法中Trition X-100、壬基苯基醚IgelCO520作为表面活性剂、Tween-80作为乳化剂，促进油相包裹水相生成微滴。

本方法中涡旋搅拌有利于生成大小均匀、稳定的微滴。

附图说明

图1为利用本方法进行实验的微滴生成结果图一。

图2为利用本方法进行实验的微滴生成结果图二。

图3为利用本方法进行实验的微滴生成结果图三。

具体实施方式

PCR油相的制备：一次往试管中加入98％的丙三醇，0.5％的曲拉通X-100，0.5％的吐温-80和1％的壬基苯基醚Igel CO520配制成总体积3ml的油相，充分搅拌混匀。

PCR水相的制备：在超净台中往试管中加入5.2μL，10μm的上游引物和下游引物和PCRmix 49.4μL，然后将试管转移到PCR模板加入区加1.66fmol的模板，在超净台中滴加双蒸水补足至260ul,充分混匀。

微滴的制备：分别取200μLPCR油相和100μLPCR水相，将100μLPCR水相快速加入到200μLPCR油相中，充分混匀并涡旋5min，反应10-15min，使油水反应体系充分乳化。

PCR反应：将上述充分乳化的油水体系分装成没管50μL设定PCR反应条件:95℃预变性5min，2个循环，95℃变性30s，56℃复性40s，72℃延伸30s，其中变性，复性和延伸共40个循环，72℃延伸5min 2个循环。

取出反应后的PCR溶液，如果出现微弱的分层现象则涡旋数秒。实验结果如图1-3所示。

所述水相由5.2μL上游引物、5.2μL下游引物、1.66fmolPCR模板、49.4μL的PCRmix均匀混合，补双蒸水至260μL。

Claims (7)

1.一种可用于微滴数字PCR的微滴制备方法，其特征在于：该方法包括如下步骤，

S1配制PCR水相，PCR水相包括上游引物、下游引物、PCR模板、PCRmix、以及双蒸水；将上述药品以此均匀混合，作为反应水相备用，上述构成的配合比例关系为0.8-1:0.8-1:0.1-0.2:10-15:35-40；将上游引物、下游引物、PCR模板、PCRmix依次均匀混合，滴加双蒸水后将溶液体系作为反应水相备用；

S2配制PCR油相，将95％-98％的丙三醇、0.1％-0.5％的Trition X-100、0.1％-0.5％的Tween-80、0.5％-1％的壬基苯基醚IgelCO520依次均匀混合，获得的溶液作为反应油相备用；

S3取1体积水相PCR加到2体积的PCR油相中，涡旋搅拌并反应，得到油包水微滴。

2.根据权利要求1所述的一种可用于微滴数字PCR的微滴制备方法，其特征在于：所述油包水微滴的粒径10-100微米。

3.根据权利要求1所述的一种可用于微滴数字PCR的微滴制备方法，其特征在于：所述油相体系中丙三醇、Trition X-100、Tween-80、壬基苯基醚IgelCO520的配比为95-98:0.1-0.5:0.1-0.5:0.5-1。

4.根据权利要求1所述的一种可用于微滴数字PCR的微滴制备方法，其特征在于：所述水相一次性加入油相，并且涡旋搅拌。

5.根据权利要求1所述的一种可用于微滴数字PCR的微滴制备方法，其特征在于：所述水相和油相的体积比为1:2。

6.根据权利要求1所述的一种可用于微滴数字PCR的微滴制备方法，其特征在于：涡旋搅拌的时间为4-6min，反应时间为14-16min。

7.根据权利要求1所述的一种可用于微滴数字PCR的微滴制备方法，其特征在于：该方法包括如下步骤，

PCR油相的制备：一次往试管中加入98％的丙三醇，0.5％的曲拉通X-100，0.5％的吐温-80和1％的壬基苯基醚Igel CO520配制成总体积3ml的油相，充分搅拌混匀；

PCR水相的制备：在超净台中往试管中加入5.2μL，10μm的上游引物和下游引物和PCRmix 49.4μL，然后将试管转移到PCR模板加入区加1.66fmol的模板，在超净台中滴加双蒸水补足至260ul,充分混匀；

微滴的制备：分别取200μLPCR油相和100μLPCR水相，将100μLPCR水相快速加入到200μLPCR油相中，充分混匀并涡旋5min，反应10-15min，使油水反应体系充分乳化；

PCR反应：将上述充分乳化的油水体系分装成没管50μL设定PCR反应条件:95℃预变性5min，2个循环，95℃变性30s，56℃复性40s，72℃延伸30s，其中变性，复性和延伸共40个循环，72℃延伸5min 2个循环；

取出反应后的PCR溶液，如果出现微弱的分层现象则涡旋数秒；

所述水相由5.2μL上游引物、5.2μL下游引物、1.66fmolPCR模板、49.4μL的PCRmix均匀混合，补双蒸水至260μL。