CN103429997A

CN103429997A - 进行数字测量的方法和系统

Info

Publication number: CN103429997A
Application number: CN2012800126846A
Authority: CN
Inventors: D·T·赵; B·S·藤本; A·R·甘森; G·S·言; R·M·洛伦兹
Original assignee: University of Washington Center for Commercialization
Current assignee: University of Washington Center for Commercialization
Priority date: 2011-01-20
Filing date: 2012-01-20
Publication date: 2013-12-04
Anticipated expiration: 2032-01-20
Also published as: US20170145490A1; CN107502660B; JP2019030323A; WO2012100198A3; JP2014505476A; EP3410080B1; EP2665995A4; WO2012100198A2; JP6654680B2; JP2017062250A; US20180251827A1; JP6063395B2; EP2665995A2; US11401547B2; US20140087386A1; US10000797B2; CN107502660A; CN103429997B; EP2665995B1; US9428793B2

Abstract

本发明提供了进行数字化测量的方法、装置和系统。

Description

进行数字测量的方法和系统

相关申请的交叉引用

本申请要求于2011年1月20日提交的第61/434,670号美国临时专利申请的权利，出于所有目的将其全文清楚地引入本文作为参考。

发明背景

本发明涉及进行数字测量的方法、装置和系统。更具体地，本发明涉及在不同体积中进行数字测量的方法、装置和系统。

数字测量因其所提供的稳定性、较高的灵敏度和较高的准确性而在生物学中日益重要。此外，与模拟测量不同，在所述模拟测量中通常必须通过加标（running standard）进行校准，数字测量是基于计算二进制是或否的回复，不需要校准，从而节省用户的时间，增强稳定性和分析的方便性。

数字分析的一个重要应用是对样品中存在的DNA或RNA的准确定量。在这里，检测DNA或RNA的最广泛使用的方法是聚合酶链反应（PCR），其中样品通常在约60℃和95℃的两个或三个温度之间循环。使用PCR扩增DNA或RNA大大地推进了大范围的学科，范围从基础生物学到临床诊断学和法医学。诊断学和生物医学研究中常用的一种特别形式的PCR是定量PCR（qPCR），它不仅能够检测样品中是否存在DNA或RNA，而且能准确地测量其浓度。这是进行后续决策和分析的一个重要的数据点-——例如，通过在试验样品中检测到的病毒RNA载量确定给患者的HIV治疗药物的量。

目前，进行qPCR的最常见形式是实时PCR，广泛应用于多个领域，包括基础生物医学研究和临床诊断学。在实时PCR中，样品的绝对浓度是通过扩增过程的时间进展推导出来的，其中所述扩增过程通过能够具体地识别扩增产物的荧光探针监测，如分子信标或

探针。实时PCR对各种错误敏感，包括不需要的引物二聚体的形成，其中引物分子由于其序列中的互补段而彼此附着。这样就会产生一种副产物，可以与现有PCR试剂的靶元素相竞争，从而能够抑制靶序列的扩增，并且干扰准确的定量。目标的定量还要求对每个循环的扩增效率有精确的了解，并且由于增长是指数性的，扩增效率中微小的不确定性（例如，低于阈值检测水平）会使目标拷贝数的确定发生极大的错误。当核酸的初始浓度低或荧光检测不够灵敏时，这种错误会非常大。虽然实时PCR能够识别并定量复杂样品中的靶DNA，但还是不能足够精确地定量低样品浓度，而这正是例如病原体检测或临床诊断学所需要的。

为了解决实时PCR难以定量低拷贝数DNA的问题，发展了数字或限制稀释DNA扩增，所述数字或限制稀释DNA扩增能够更准确地定量样品中模板拷贝的绝对数。在dPCR中，总样品被分为一批小的体积，使得根据Poisson统计，只有少数的体积含有一个或多个靶分子，而大多数体积不含DNA。然后，在所有体积中同时进行DNA扩增，使只有含有靶分子的那些少数体积中的荧光增加。通过对荧光体积（即含有DNA拷贝的那些）进行计数，就能简便而准确地确定DNA拷贝数。

dPCR的概念很有吸引力，但其尚未广泛应用，这是因为（1）不易建立dPCR中使用的一大批的极小的体积（皮升到纳升），以及（2）实验的动态范围由离散阵列的大小和数量限定，通常极低。为了准确地定量样品中DNA或蛋白的量，大多数区室通常最多含有一个靶分子。这就意味着样品的初始浓度与分析的动态范围相匹配。换句话说，初始样品浓度应当在向运行dPCR的设备中输入正确的样品浓度之前进行测定。这会增加运行dPCR的不便，并会限制具有恒定体积的数字阵列的可能性。

不管使用何种具体的反应，重要的是克服数字分析的有限动态范围。直接的方法是通过增加相同大小的数字体积的数量来扩大分析的范围。这一方法是有问题的；为了容纳大量的体积，设备需要很大，并会涉及相当复杂和昂贵的微加工过程。因此，需要进行数字测量的另外的方法和系统。

除了上述dPCR的实际问题之外，精确的温度控制和温度循环也阻碍着该方法的广泛使用。一般来说，退火和解链步骤的温度控制在+/-1摄氏度。对于DNA和RNA绝对定量重要的许多应用，这些因素难以满足，或者其实现昂贵，特别是在资源有限的环境以及医疗点中。为了提供在这些环境中扩增DNA和RNA的更为符合人体工学的方式，开发了几种等温方法，包括滚环扩增（RCA）、基于核酸序列的扩增（NASBA）或环介导扩增（LAMP）。

LAMP是用于扩增DNA或RNA的等温过程，在60-65摄氏度的固定温度下有极高的特异性。由于其高的特异性，LAMP在扩增过程中能够区分单核苷酸差异。因此，LAMP已应用于SNP（单核苷酸多态性）分型。LAMP还显示能够检测病毒RNA，其灵敏度比RT-PCR高约十倍。LAMP与其它等温方法区分的另一个特征是其能够直接将DNA的扩增与增加溶液浑浊度的焦磷酸镁的产生相关联。这样，使用一个浊度计就可以跟踪LAMP溶液的进展。因此，非均质分析可以用来检测LAMP产生的扩增产物。焦磷酸镁的产生也能够以荧光指示剂的形式使用，这对数字分析的读出特别有用。在反应前，在反应混合物中加入少量的钙黄绿素。在扩增过程中，焦磷酸盐的产生增加会使含有一个或多个靶分子的体积中的钙黄绿素荧光快速增加。

这些反应在固定温度下进行，可以减少仪器的复杂度，降低能耗，使其更适合于治疗点诊断和家庭医疗设备。将这些方法转换为数字形式是为了更好、更准确地在治疗点检测出病原体的重要步骤。另外，数字分析还会提高基于蛋白扩增的分析的准确度，如ELISA（酶联免疫吸附试验）或任何单分子分析，其中所述单分子分析可能要求或不要求扩增。

鉴于上述情况，需要提供进行数字测量的改进的方法和系统。此外，还需要提供使用数字测量的另外的技术，例如数字LAMP。本文公开的本发明提供这些需要以及更多。

发明概述

本发明提供进行数字化测量的方法、装置和系统。更具体地，本发明涉及在不同体积中进行数字测量的方法、装置和系统。在一些方面中，本发明提供增加数字测量动态范围的方法和装置，包括但不限于数字PCR、数字等温核酸扩增（例如：数字NASBA和数字LAMP）、数字蛋白扩增（例如：数字ELISA）、数字单分子测量以及其它形式的数字测量。

在一个方面中，本发明提供一种用于扩大样品数字测量的动态范围的方法，所述方法包括：

建立样品浓度梯度；和／或

建立不同大小的样品体积。

在一个实施方案中，动态范围是通过将数字测量和读数与用于形成浓度梯度的方法和装置整合而扩大的。分析物分子的浓度梯度优选地呈对数或指数形状，但也可以是许多其它形状，包括但不限于线性、多项式、误差、高斯、指数、对数、及其任何组合。

在另一个实施方案中，通过使用不同大小的数字化体积扩大动态范围。例如，动态范围可以通过在同一芯片或基底上具有下列数字化体积阵列实现：体积为100nL的第一组阵列、体积为10nL的第二组阵列、体积为1nL的第三组阵列、体积为100pL的第四组阵列、体积为10pL的第五组阵列、体积为1pL的第六组阵列、体积为100fL的第七组阵列、体积为10fL第八组阵列、最后是体积为1fL的第九组阵列。根据最终的应用，可能在同一芯片上不需要有所有这些阵列组。对于一些应用，从1fL到1nL的阵列可能就足够了；而对于其它应用，从100nL到1pL的阵列可能更合适。然而对于其它应用，仅有不同体积的两组阵列可能就足够了。含有不同体积的阵列组的数量会不同，并取决于每个阵列的大小。例如，如果一个阵列包含一百万个数字化体积，则可能无需涵盖pL到nL的浓度范围的1nL、100pL和1pL的阵列，仅100pL和1pL两组阵列可能就足够了。

在另一个方面中，可以结合浓度梯度和不同数字化体积大小进一步扩大数字测量的动态范围。在另一个方面中，本发明是采用浓度梯度或不同大小不相关体积扩大数字单分子测量动态范围的一种方法。在另一个方面中，本发明是一种制备具有疏水和亲水斑块（patch）的图案化表面的工艺，其中所述斑块导致不同大小样品体积的润湿液滴的形成。在另一个方面中，本发明是非暂时性计算机可读取介质，所述可读取介质具有存储在其上的计算机可执行的指令，所述指令是用于使机器实施本文所述的任何方法的指令。在另一个方面中，本发明是一种包括疏水和亲水斑块的图案化表面的阵列，其中所述斑块导致不同大小样品体积的润湿液滴的形成。在另一个方面中，本发明用于扩大非均质分析中样品数字测量的动态范围。需要注意的是，用于形成浓度梯度和用于数字化样品体积的方法很多。本文提供的实例不应被视为限制性的。

本发明还描述了用于进行以下的方法和装置：（1）数字NASBA，（2）数字LAMP，（3）进行PCR或使用具有疏水和亲水斑块的图案化表面形成的表面附着液滴进行其它核酸扩增，以及（4）进行使用非均质分析进行数字核酸扩增读数。

在又一个方面中，本发明提供一种方法，用于使用数字测量确定样品浓度。该方法可以包括产生具有第一体积分布的第一多个液滴，其中第一多个液滴的至少一个液滴包含来自样品的成分；分析具有第二体积分布的第二多个液滴，以确定第二多个液滴中的单个液滴的体积以及第二多个液滴中的含有可检测试剂的液滴的数量，其中第一体积分布与第二体积分布是相同的或不同的；并且使用第二多个液滴中的单个液滴体积和第二多个液滴中的含有可检测试剂的液滴数量确定样品的浓度。

在又一个方面中，本发明提供一种用于对样品进行数字测量的系统。该系统包括含有第一多个液滴的样品容器，所述第一多个液滴具有第一体积分布；用于检测第一多个液滴的至少一个液滴含有的可检测试剂的探测器；以及包含具有可执行指令的存储装置的计算机，所述指令由处理器执行时，可以使处理器：分析具有第二体积分布的第二多个液滴，以确定第二多个液滴中的单个液滴的体积以及第二多个液滴中的含有可检测试剂的液滴数量，其中第一体积分布与第二体积分布是相同的或不同的；并且使用第二多个液滴中的单个液滴体积和第二多个液滴中的含有可检测试剂的液滴数量确定样品的浓度。

在又一个方面中，本发明提供了一种对样品进行数字环介导扩增的方法。该方法包括在微流体装置上产生多个样品液滴，其中至少多个液滴中的至少一个液滴含有核酸分子；和在至少一个液滴中进行环介导扩增，以产生核酸分子的扩增产物。

为了更完整地理解本发明的性质和优点，应参考随后的与附图结合的详细描述。这些附图以说明的方式表示了本发明的实施方案。本发明可以在多个方面修改而不偏离本发明。因此，附图／图示和这些实施方案的描述的本质是说明性的，而不是限制性的。

附图的简要说明

图1描述了含有分析物的梯度浓度的数字化体积的生成。出于可视化的目的，我们使用荧光染料荧光素作为我们的分析物。我们使梯度流过一列孔。在这里，梯度是使用以200μL/min来自顶部入口（上面箭头）的200μM荧光素和以400μL/min来自底部入口（下面箭头）水生成的。当孔充满浓度梯度时，我们使轻质矿物油（比水密度小）在孔上方流动，以在孔中建立单个数字化体积。在这个实例中的孔体积相同，但也可使用不同体积的孔。对于该实验，孔的直径为75μm，深度为100μm，并且位于2mm高的流动室下方。

图2描述了使用亲水和疏水图案化表面生成不同大小（体积）的数字化体积的方法和装置。在这里，圆形的亲水斑块在疏水表面的背景上形成图案。当该表面暴露于水（或任何其它水溶液，如样品溶液、PCR试剂溶液或缓冲液）和油时，水溶液会优先润湿亲水斑块，而油溶液会优先润湿疏水表面。这样，就会在被油包围的亲水斑块上形成水溶液的液滴（或半液滴）。此外，亲水斑块的面积（即圆圈的面积）各异，以使亲水斑块的不同尺寸控制亲水斑块保留的水溶液的体积。即使斑块是圆形的，亲水斑块保留的体积的横截面也可以有不同的形状。确切的形状将取决于所使用的亲水和疏水表面以及油相和水相的性质。横截面的形状可以是半圆或比半圆更圆或更扁。亲水斑块优选为圆形的，但也可以为许多其它形状，包括正方形和长方形。

图3提供了对根据本发明的一个实施方案的计算机系统的说明。

图4描述了根据本发明的一个示例性实施方案，所占据的液滴的累积数对液滴数量的关系。图中所示尺寸模拟针对浓度（在绘图中从左到右）2.0×10^-3、2.0×10^-4、2.0×10^-5、2.0×10^-6、2.0×10^-7和2.0×10^-8摩尔/fL。所有模拟包含10,000个液滴，其直径由从4到190微米延伸的均匀分布中得到。所有液滴按照体积从最小到最大排列，液滴数量i的所占据的液滴的累积数为液滴数量≤i的所占据的液滴总数。

图5提供了根据本发明的一个示例性实施方案，浓度为2.0×10^-6的所占据液滴累积数的模拟。其它详细信息同图1。在低位区域，液滴被占据的概率极低，因此模拟曲线为零。在高位区域，液滴被占据的概率非常接近1，曲线以接近单位斜率上升。在过渡区域，液滴被占据的概率从零增加到近乎1。

图6显示了根据本发明的一个示例性实施方案，均匀液滴分布（直径为4到190微米）的估计功效（power）。虚线是尺寸E₁的测量误差，实线是尺寸E₂的测量误差。下部两条线是1.2倍分辨率，上部两条线是1.5倍分辨率。点线绘制在0.95处。

图7显示了根据本发明的一个示例性实施方案，均匀液滴分布（直径为10到100微米）的估计功效。虚线是尺寸E₁的测量误差，实线是尺寸E₂的测量误差。下部两条线是1.2倍分辨率，上部两条线是1.5倍分辨率。点线绘制在0.95处。

图8A-8B描述了根据本发明的一个示例性实施方案，使用显微镜确定乳化液滴的大小。图8A显示了硅烷化的显微镜载玻片上液滴的暗场像。如果液滴足够分开，则可根据暗场像确定单个液滴的大小。使液滴呈圆形轮廓的水相和油之间的界面散射的光形成对比度，从此可以测量液滴的直径。比例尺代表100微米。图8B显示了乳化后测量的577个液滴的尺寸分布。分布是不对称的，中位直径为20μm。大多数液滴的直径在10到40微米的范围内。

图9显示了用于说明书的表3中的模拟的部分省略的对数正态分布。这一分布理想化地接近图8中所示的实验性分布。

图10描绘了图9所示部分省略的对数正态液滴分布的估计功效。虚线是尺寸E₁的测量误差，实线是尺寸E₂的测量误差。下部两条线是1.2倍分辨率，上部两条线是1.5倍分辨率。点线绘制在0.95处。

图11A-11D显示了根据本发明的一个示例性实施方案，液滴中PCR扩增的检测。图11A和11B描绘了PCR（阴性对照实验）后不含靶DNA的液滴的图像。所显示的是组合的暗场／ROX（11A）和暗场／FAM（11B）图像，其中ROX是加入反应中的参比染料，FAM是检测DNA扩增的

探针中使用的荧光指示剂。暗场照亮液滴的环形轮廓，覆以来自荧光团的高斯形荧光信号。插入物显示沿着穿过液滴中心的浅灰色线测得的强度。液滴中心区域的信号主要是由于荧光，如果没有DNA靶标，中心区域保持暗的状态，ROX和FAM荧光的比例高（ROX:FAM=120:20=6:1）。图11C和11D是在含有靶DNA液滴的PCR图像之后。显示了组合的暗场／ROX（11C）和暗场／FAM（11D）图像，其具有穿过液滴的相应的线扫描。线扫描显示中心区域增强的荧光信号以及空液滴中未观察到的高斯分布。这两种荧光信号之间的各自的比例明显低于空液滴（ROX:FAM=60:30=2:1）。

图12A-12C描述了根据本发明的一个示例性实施方案，数字LAMP自数字化芯片的设计。图12A是显示完全组装的芯片的各个组件的示意图。微流体阵列可以嵌入PDMS薄片中，所述PDMS薄片的顶部覆盖有密封膜，底部有PDMS包被的盖玻片。空气压力可以通过可拆式接合器送入，所述可拆式接合器可以连接到外部压力源。图12B是微流体网络的示例性布置。长方形侧室的密集阵列连到薄的主通道。整个阵列由单独的蓄水池包围，以在65℃下孵育时饱和PDMS。比例尺表示5mm。图12C显示了侧室阵列和主通道的示例性几何形状。所有尺寸的单位都是微米。

图13A-13E显示了根据本发明的一个示例性实施方案，dLAMP SD芯片中样品的自数字化。图13A提供了使用水溶液初次灌注侧室阵列的连续图像。在芯片上涂油之后，含水样品进入主通道并分布到侧室中，置换室中的油相。图13B提供了显示侧室中含水样品自数字化的一系列图像。在全部水相进入芯片后，主通道中的尾油相将纳升大小的液滴隔离到侧室中。图13C显示了侧室中液滴大小分布对所施加压力的依赖关系。平均相对体积分数（RVF）最高的最均匀分布获得自7psi的外部压力。更低和更高的压力会导致具有更易变的体积和降低的RVF的液滴的形成。图13D描绘了来自16个单个芯片的5000个自数字化液滴的RVF值的大小分布。在所有实验中，外部压力均设定为7psi。所有液滴的平均RVF为0.89±0.14。插入物显示RVF值的累积分布。数量对应于RVF分别超过50%、75%和90%的液滴分数。例如，所有液滴的85%充满侧室的75%以上。图13E显示了样品自数字化的重现性。所显示的是15个单个芯片的平均RVF值以及标准偏差，每个芯片有7psi的外部压力。

图14A和14B描绘了根据本发明的一个实施方案，在升高的温度下的芯片性能。图14A显示了液滴体积上孵育的效果。显示了在65℃下孵育70分钟之前和之后典型的液滴大小分布。样品包含没有模板的阴性对照溶液，因此不会发生扩增。液滴平均收缩约10%。从插入物中可以看到，位于阵列外周的液滴收缩会稍微增加，这是因为他们更多地暴露于大量的PDMS。而在阵列中心的液滴则较少地受到收缩的影响。图14B显示了在我们的芯片中观察到的数字LAMP签名。显示了孵育之前和之后的室阵列的一部分。强度分布对应于穿过各室中心的线。一些侧室中的环介导DNA扩增导致它们的荧光激增。邻近的非LAMP活性的室显示荧光未增强，表明相邻室之间的样品串扰可以忽略。

图15A-15F显示了不同DNA模板浓度c_i的数字LAMP结果：c_i=c₀/4(15A)、c_i=c₀/30(15B)、c_i=c₀/150(15C)、c_i=c₀/430(15D)和c_i=c₀/1300(15E)。c₀为模板储备溶液的浓度。LAMP有效室的各分数在图16中分析。对于在最低样品浓度（c₀/1300）下的实验，使用535室芯片以增加阳性室的绝对数量。图15F显示了不加模板的LAMP溶液的对照实验。如预期的一样，没有室显示超过背景的荧光的增强。

图16A和16B显示了根据本发明的一个实施方案，DNA浓度的相对和绝对变化的定量。图16A显示了

试剂盒中所含的对照DNA样品的稀释系列，见图15。对于每个样品浓度，分析至少三个不同的芯片。实线代表在储备溶液中模板浓度为0.99×10⁴摩尔每μl的泊松分布基础上的预期的阳性事件的分数。该浓度由三个最低样品确定。图16B显示了DNA浓度的绝对定量。显示了在65℃下孵育70分钟之前和之后的535孔芯片。λ-噬菌体DNA稀释到20拷贝每μl的终浓度，我们预期约有12%的阳性室。在孵育之后，在535孔阵列中检测到9.8%的LAMP有效液滴（最初形成的479个液滴中的47个）。期望值和测量值之间的差异f_a可能是由于八倍稀释系列所累积的吸量误差导致的。

图17显示了表2，其中包括由Z-测试和模拟估计的置信水平的比较。

发明详述

本发明涉及进行数字测量的方法和系统。更具体地，本发明涉及在变化的体积中进行数字测量的方法和系统。

I.综述

虽然不是限制性的，本发明部分基于通过生成大小可变化的体积来增加数字分析的动态范围。对于给定的样品浓度，体积的大小可以确定被一个或多个感兴趣的分子（例如：模板分子）占据的概率。在扩增相关技术的实例中，体积大小的变化可以用来改变占据概率，从而改变显示扩增的孔的数量或样品体积（即液滴）。尤其地，本发明优于现有技术，所述现有技术仅增加大小恒定的体积的数量以扩大动态范围。这一优点是由于本文公开的方法和系统不要求很大的面积来容纳需要扩展动态范围的体积，那样会增加芯片上产生缺陷的可能性，其中数字化体积在所述芯片上不正确形成或有其它缺陷。此外，仅增加体积的数量也会增加分析所有数字化体积所需的时间。

另外，本发明提供了用于进行动态范围增加的数字分析的方法、系统和装置，其中生成大量大小不同的体积。与上述预制的平台不同，本发明可以包括使用连续的而非离散的大小（例如，体积）分布。在一些实施方案中，可以随机地或通过微流体的可控式应用，按照各种方式建立大小不同的液滴。例如，本领域公知通过使用T形接头或流动集中（flow focusing）设备来微流体生成恒定体积液滴。在这些系统中，液滴的大小可以通过剪切速率和通道尺寸控制。如果对于给定的T形接头几何的剪切速率连续变化，那么可以生成不同体积的液滴。这些方法可以通过例如计算机控制的注射泵或调整气压实现，所述计算机控制的注射泵或调整气压调整水相和载油流体的相对流速。

在一些实施方案中，可以通过在样品容器（例如，试管）中乳化而随机生成不同大小的液滴。由于例如无需努力控制液滴的大小，因此液滴随机性可以简化实验。在乳化过程中，不同体积的液滴可以通过使用不同的表面活性剂稳定。该乳化方法特别有用，原因如下：（1）该方法与每个生物医学实验室中发现的基本仪器兼容，（2）液滴的生成简单，不要求复杂的芯片设计或用于流量控制的精细设备，（3）液滴不限制在单个孔中，从而使需要容纳大量液滴的空间最小化，以及（4）由于扩增过程中液滴的生成和存储可以使用相同容器而使分析简单。在液滴生成和扩增反应之间无需样品转移。

术语“动态范围”定义为可变化量的最大和最小可能值之间的比率。

术语“数字化体积”是指在分析的准备中获得初始样品并将其分为物理上明显更小的体积后产生的体积。

术语“均质分析”是指在检测时溶液相中存在所有分析组分。在均质分析中，没有分析组分散射可检测的光。

术语“非均质分析”是指在检测时一种或多种分析组分存在于固相中。沉淀或颗粒的形成，例如在LAMP或滚环扩增中，是异质分析的常见形式。在这类型的分析中，固相成分可能散射可检测的光。

如本文所提供，术语“连续体积分布”意在描述一种体积分布，所述体积分布在体积分布中连续而非通过预定义离散等级（step）变化。例如，基于芯片的平台可能包括通过预定义离散等级定义的体积分布的孔或液滴体积，作为芯片的一部分制造。也就是说，芯片可以制备成具有存在于100nL、10nL和1nL的体积，在那些离散等级之间没有其它体积。相反地，连续体积分布不是预定义的（即体积分布在生成或形成液滴体积之前没有确定）。连续体积分布可以，例如，通过乳化产生，如本文进一步描述。在乳液中，体积（例如，液滴体积）具有不连续体积，但分布中的液滴体积在液滴产生之前没有确定（即没有通过制作技术预定义），体积根据连续体积分布随机分布。液滴体积的上限和下限可以通过施加于乳液的力改变（例如，涡旋振荡速度或振摇强度）。但是，采用这种技术生成的液滴体积会随着产生的体积分布不断变化。

在一些方面中，连续体积分布也可具有特征，以使对于任意组（或多个）液滴体积，其分布函数可以表示为f(x)，其中f(x)dx为组中给定液滴的体积为x到x+dx的可能性。（dx为无限小的小数。）在某些实施方案中，连续分布是指液滴组中液滴的体积为（1）未预先指定以及（2）对于某些范围，x_下限<x<x_上限，f(x)总是大于零（x_下限不能等于x_upper，有关f(x)无需了解更多）。因此，本发明在一些实施方案中可以包括使用连续分布的液滴组，测量组中每个液滴的体积，并将测得的液滴体积用于分析。

I.数字测量的方法

在一个实施方案中，本发明提供了一种方法，用于建立与数字测量和读数整合的浓度梯度。例如，微流体梯度生成可以与样品数字化芯片结合。图1显示了使用微通道插入物形成浓度梯度的实例。对于动态范围的扩大，优选对数或指数浓度梯度，但现在有许多方法可用于在芯片上形成各种类型和形状的浓度梯度，包括非线性梯度，如功效、指数、误差、高斯和立方根函数。图1描绘了包含分析物梯度浓度的数字化体积的生成。

为了使用图1所示的微流体设计类型生成浓度梯度，只需要两个插入口贮液器或通道，但更多也可适用于本发明。一个入口用于样品，一个用于缓冲液（或数字PCR情况下的PCR试剂）。当两种溶液流过网络时，样品溶液按照预定义的方式被缓冲液（水或PCR试剂）稀释，以在各出口通道存在不同浓度的样品。采用这一设计的变型已生成跨越六个数量级的线性、多项和对数梯度。

在另一个实施方案中，使用浓度跨越六个数量级的对数或指数梯度。样品和PCR溶液被吸移到两个入口贮液器中，之后它们将经过孔阵列。孔充满浓度梯度后，在孔上流过轻质矿物油或其它不互溶流体，以在孔内建立数字化体积。在该实例中的孔体积相同。在本发明的另一个实施方案中，在图1中描绘的图表与不同体积的孔一同使用。

在另一个实施方案中，样品和PCR溶液被吸移到两个入口贮液器中，之后它们将经过亲水和疏水斑块阵列。当样品流经亲水斑块时，会导致不同大小样品体积的润湿液滴的形成。

供选择地，样品可通过使用图2所示的图案化表面数字化。

在本发明的另一个方面中，梯度与使用阀门、孔或液滴建立的数字化体积联合使用。在采用液滴的实施方案中，液滴能够以T通道几何或流动集中几何的连续流动方式形成，这两种方式都是本领域公知的。

为了数字化已稀释的样品，可以使用图1所述的数字化方案。在这里，包含不同浓度的靶分子的样品溶液流经地形图案化的表面，以形成数字化的离散体积，用于后续的数字测量和读数。供选择地，我们可以采用图2所示的图案化表面数字化所示的样品。

在另一个实施方案中，可以使用微流体通道和不互溶的流体相数字化样品。在这一实施方案中，样品相被引入通道，之后引入不互溶相，形成由侧腔的几何尺寸限定的离散样品体积（D.E.Cohen,T.Schneider,M.Wang,D.T.Chiu Anal.Chem.82,5707-5717）。

本发明的另一个方面包含进行本发明方法的装置。这样的装置可以建立与数字测量和读数整合的浓度梯度。在另一个实施方案中，装置进行用于扩大样品数字测量的动态范围的方法，包括建立样品浓度梯度，和／或建立不同大小的样品体积。

在一些实施方案中，本发明包括扩大数字测量动态范围的方法，所述数字测量基于建立不同大小的数字化离散体积阵列。该方法优于仅通过增加数字化体积的数量来扩大动态范围的方法。这是因为增加数字化体积的数量会增加体积所占据的面积以及增加芯片上具有缺陷的可能性，在所述芯片上数字化体积不正确地形成或有其它缺陷。仅增加数字化体积的数量还会增加分析所有数字化体积所需的时间。扩展动态范围的更好方法是建立不同大小的数字化体积的阵列，而不是仅增加数字化体积的数量。不同大小数字化体积阵列可以是随机阵列（例如，不同直径的液滴均存在并随机分布在容器中），也可以是规则的阵列（例如，图2所示的阵列）。

图2显示了建立不同大小的数字化体积的实例，其中采用图案化表面建立不同大小的体积阵列。在该实例中，建立了七组阵列，每组阵列包含900个数字化体积（30×30）。阵列通过在疏水表面的背景中建立圆形亲水斑块形成。因此，当表面暴露于水溶液和油时，亲水斑块会被油包围的水滴覆盖。图下方显示了水滴的侧视图。该侧视图描绘了半圆形液滴，但液滴的形状可以根据我们所使用的具体表面以及使用的油和水溶液而变化（更扁或更圆）。在一个实施方案中，使用了重油，由于油会压迫液滴，因此液滴会更扁。

限定每组900个亲水斑块的圆圈大小不同，其直径可以是1μm到5μm到10μm到50μm到100μm到500μm和直径最终到1mm。由于液滴的体积粗略地测量为直径的立方，因此斑块的直径增加10倍，体积就会增加约1000倍。因此，从空间和读数来说，使用不同大小的数字化体积比仅使用大小相同的数字化体积更为有效。在一个实施方案中，使用每组阵列900个数字化体积，这是由于该数字适合实现统计学稳定的数字读数。但是，根据具体的应用和所需的读数稳定性，可以在每组阵列中设计更多或更少的数字化体积。

由于不同大小的表面图案亲水斑块的容易性，这一设计的使用代表了建立大小不同的数字化体积阵列的独特方案。因此，对于数字PCR等通常需要大的动态范围的应用，在采用图2所述的图案化表面建立的液滴中进行PCR是高度有益的。

在一些实施方案中，本发明提供了使用数字测量确定样品浓度的方法。该方法可以包括产生具有第一体积分布的第一多个液滴，其中第一多个液滴的至少一个液滴包含来自样品的成分；分析具有第二体积分布的第二多个液滴，以确定第二多个液滴中的液滴体积以及第二多个液滴中的含有可检测试剂的液滴的数量，其中第一体积分布与第二体积分布是相同的或不同的；并且使用第二多个液滴中的液滴体积和第二多个液滴中的含有可检测试剂的液滴数量确定样品的浓度。

在一些实施方案中，体积可以使用阀门、孔或液滴建立。涉及液滴的实施方案可能特别有用。在这里，可以采用多种方法生成不同体积（直径）的液滴。在一种方法中，使用微流体（例如，本领域公知的T形通道或流动集中设备）生成确定体积的液滴；通过改变剪切速率或通道尺寸，容易地形成不同大小的液滴。在另一种方法中，在不同表面活性剂的辅助下通过乳化生成不同体积的液滴；在这里，使用不同的表面活性剂稳定和控制不同体积的液滴。在任何一种方法中，都可以在不同体积（大小）的所有液滴中同时进行分析物的扩增（例如，数字PCR），之后液滴能够以单一文件形式流过流式细胞仪或其它类似设备，在所述流式细胞仪或其它类似设备中可以确定液滴的大小，并测定来自液滴的荧光。在该示例性设备中，根据荧光确定每个液滴中是否存在扩增产物，并且根据液滴的散射信号确定每个液滴的大小（体积）。这样，通过记录每个液滴的大小以及每个给定大小的液滴中是否存在扩增产物，可以在测定足量的不同大小的液滴后倒退计算样品中存在的分析物的初始浓度。由于液滴大小不同，因此对于给定的动态范围，出于之前讨论的原因，分析比大小相同的液滴快得多。

如本文所述，可以产生具有多种体积分布的体积，所述多种体积分布可以采用多种不同的方法分析。在一些实施方案中，样品可以包含可分析的一个或多个感兴趣的分子。通过数字测量，可以生成样品的离散体积以用于分析。例如，本文所述的方法可以包括产生具有体积分布的多个液滴。在一些实施方案中，可以在含有合并的不互溶流体的乳液中产生样品的多个液滴，如本文进一步描述。在一个实例中，样品包括含有感兴趣的分子（例如，核酸分子）的水溶液。样品可以与油混合以形成在油中悬浮的样品液滴。根据所采用的方法，乳液中多个液滴的体积可以随着连续体积分布随机分布。此外，体积的范围可以由用于形成乳液的方法控制。例如，可以通过控制涡旋振荡、振摇和／或超声波的强度产生所需要的体积分布。

如本领域一般技术人员所理解的，体积分布的范围和体积将取决于给定的分析的多个因素。在一些实施方案中，多个液滴的体积分布包括的体积范围可以是约100纳升（nL）到约1毫微微升（fL）、约10nL到约10fL、约1nL到约100fL、约100nL到约1皮升（pL）、约10nL到约10pL、约1nL到约1pL。根据所选择的液滴生成的因素，通常通过例如改变样品和油与表面活性剂混合的强度确定体积分布的上限和下限。在体积分布中可以具有体积的范围。例如，分布中的体积的范围可以是2倍以上、10倍以上、100倍以上或其它倍数。如果范围是2倍，则体积分布的下限可以是例如10nL，上限为20nL。同样地，如果范围是10倍，则体积分布的下限可以是例如10nL，上限为100nL。

除了生成具有第一体积分布的第一多个液滴以外，本发明还包括对具有第二体积分布的第二多个液滴进行分析。对第二多个液滴的分析包括，例如，确定第二多个液滴中液滴的体积。体积的确定可以采用多种方法进行（例如，采用散射和／或显微技术）。在一些实施方案中，可以确定多个液滴中所有液滴的单个体积。在一些实施方案中，只能确定一些液滴的单个体积。液滴的分析还包括确定含有本文进一步描述的可检测试剂（即一种或多种可检测试剂）的液滴数量。还应当指出的是，第二多个液滴是基于与产生的第一多个液滴相同的液滴。这样，第一体积分布可以与第二体积分布相同，也可以不同（即更窄）。如果分布相同，则第一多个液滴中的每个液滴将包含在第二多个液滴中。在某些实施方案中，第二体积分布比第一体积分布更窄。例如，液滴可以从具有约1fL到约100nL的体积分布的乳液中产生。根据例如样品的浓度，可以对从1fL到约1nL的体积分布进行数字测量的分析，其中第二体积分布比第一体积分布更窄。

在体积分析之前或分析期间，可以在大小不同的体积中进行反应（例如，扩增），确定哪些体积经历了反应（例如，有扩增产物）。在特定的实例中，可以确定体积（例如，液滴）大小并计数所占据的液滴（例如，含有可检测试剂的液滴）的数量。可以分析所有液滴或仅分析某些液滴。分析可以，例如，通过将液滴以单列的形式流过流式细胞仪或类似设备来实现，在所述流式细胞仪或类似设备中可以确定液滴的大小，并检测是否存在扩增。液滴的大小可以，例如，根据来自液滴的散射信号确定，是否存在扩增可以由来自液滴的荧光信号指示。供选择地，液滴的直径也可以通过显微法确定。液滴可以从样品容器中提取（在反应例如扩增之前、期间或完成之后），并用CCD摄像机取得广角图像。液滴，例如，可以铺展在表面上，或嵌于两个载玻片之间，并放置在广角显微镜下。通过使用合适的激发和发射滤光片，可以定量液滴中的荧光，从而显示是否存在扩增。通过记录液滴的大小以及每个液滴中是否存在扩增产物，可以在测定足量的不同大小的液滴之后倒退计算样品中存在的分析物的初始浓度。由于液滴大小不同，因此对于给定的动态范围，出于之前讨论的原因，分析比大小相同的液滴快得多。在一些实施方案中，本文的方法进一步包括使用多个液滴中的液滴数量和多个液滴中的液滴体积进行数字测量。例如，样品中感兴趣的分子的浓度可以通过使用多个液滴中的液滴数量、含有一个或多个感兴趣的分子的多个液滴中的液滴数量以及通过测量多个液滴中一些或所有液滴的体积来确定。确定样品浓度的示例性方法请见实施例部分。

本发明可用于数字测量提供有关样品的有用信息的任何技术中。因此，本文提供的方法、系统和装置可以包括含有可检测试剂的体积。在特定的实施方案中，体积可以是微流体芯片上的孔或室，或含有可检测试剂的液滴（例如，在乳液中或芯片表面上形成的水滴）。一般理解的是，可检测试剂可以含有可检测的单个分子或多个可检测分子。也可以使用其它类型的可检测试剂，例如珠子、量子点、纳米粒等。另外，可检测试剂可以，例如，是待分析的样品中存在的感兴趣的分子（例如，血液、血清、唾液或其它溶液中的核酸分子）。供选择地，可检测试剂可以是与样品中感兴趣的分子（例如，核酸分子）相关的分子，从而使该分子可被检出。在一些实施方案中，本发明的方法和系统可以用于涉及数字测量的扩增相关技术（例如，数字PCR）。对于扩增测量，体积（例如，液滴）可以包含单个DNA分子，例如，但该体积还包含一般公知用于扩增和检测的必要组分。在一些实施方案中，可检测试剂是荧光的，因此，可通过本领域已知的基于荧光的检测方法检测。但是，也可使用其它检测方法（例如，吸光度、化学发光、浊度、和／或散射）分析体积的成分。适用于本发明的多种可检测试剂都是本领域公知的，并且可以例如在第11版（2010）中找到。

在特定的实施方案中，可检测试剂可与用于检测的感兴趣的分子关联。例如，可检测试剂可与核酸分子（例如，DNA或RNA）、肽、蛋白、脂质或样品中存在的其它分子（例如，生物分子）关联。如本文所定义，在可检测试剂上下文中的“关联”包括通过共价和／或非共价相互作用与分子的相互作用。例如，可检测试剂可以共价连接于靶分子。供选择地，可检测试剂可以，例如，是可以用于检测核酸分子（例如，DNA和／或RNA分子）的插层剂或

探针。可以使用其它可检测试剂，例如不会与感兴趣的体积中的分子关联的参比染料。

本发明的一些实施方案包括在不互溶的流体中产生液滴。如本领域公知，多种不互溶流体可以结合以产生体积不同的液滴。如本文进一步描述的，流体可以以多种方式结合，例如通过乳化作用。例如，水溶液（例如，水）可以与非水流体（例如，油）结合，在样品容器内或微流体芯片上产生液滴。适用于本发明的水溶液包括水基溶液，所述水基溶液进一步包括缓冲液、盐及一般已知在诸如PCR的检测分析中使用的其它组分。因此，本文描述的水溶液可以包括，例如，引物、核苷酸和探针。适合的非水流体可以包括但不限于，有机相流体如矿物油（例如，轻质矿物油）、硅油、含氟油或含氟流体（例如，含氟乙醇或Fluorinert）、其它市售材料（例如，

）或其组合。

除了水溶液和非水流体以外，还可含有表面活性剂，以例如改善液滴的稳定性和／或促进液滴的形成。合适的表面活性剂可以包括但不限于，非离子型表面活性剂、离子型表面活性剂、硅酮基表面活性剂、含氟表面活性剂或其组合。非离子型表面活性剂可以包括，例如，山梨糖醇酐单硬脂酸酯（Span60）、辛基苯氧基乙氧基乙醇（Triton X-100）、聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯（Tween80）和山梨糖醇酐单油酸酯（Span80）。硅酮基表面活性剂包括，例如，ABIL WE09表面活性剂。本领域一般地熟知的其它类型的表面活性剂也同样可用。在一些实施方案中，表面活性剂可以存在于多种浓度或浓度范围下，例如按重量计约0.01%、0.1%、0.25%、0.5%、1%、5%或10%。

本发明进一步包括样品浓度的确定。例如，所述方法和系统可以用于确定（1）液滴的体积，以及（2）含有可检测试剂的液滴的数量，以用于确定样品浓度。这一信息能够以多种方式应用，以确定样品浓度。例如，靶分子在样品中以是摩尔／体积的浓度单位存在。样品可分布为体积不同的液滴，可以对所述体积进行分析。（所有或一些）液滴的单个体积可以采用本文提供的方法确定。另外，使用本文所述的检测方法，可以分析液滴是否含有可检测试剂。对于给定的样品浓度，一些体积不同的液滴可能包含可检测试剂，一些液滴可能不包含。对于更高的样品浓度，一般地多个液滴中更多的液滴可能包含可检测试剂，反之亦然；对于低的样品浓度，多个液滴中更少的液滴可能被可检测试剂占据。如本文进一步描述的，在具体体积分布中被可检测试剂占据的概率可针对广泛范围的样品浓度确定，然后可与实际数据比较，确定未知样品的浓度。下面实施例1和实施例2中进一步公开了样品浓度的确定。实施例所示的方法涉及初步估计样品浓度，然后计算液滴数量，预测所述液滴包含一个或多个可检测试剂（被占据的液滴）。然后，使用熟知的数值法调整估计的样品浓度，直到多个液滴中被占据液滴的预测数量与被占据液滴的实际数量相等，达到希望的准确度。

如本文进一步描述的，本发明提供了一些现有方法和系统无法实现的数字测量的多个方面。例如，本发明能够提供在广泛动态范围内测量样品浓度的能力。在一些实施方案中，动态范围可以是至少三个数量级、至少四个数量级、至少五个数量级、或至少六个数量级。在一些实施方案中，动态范围可以是约10^-1到约10^-9摩尔／fL、约10^-2到约10^-8摩尔／fL、约10^-3到约10^-7摩尔／fL、或约10^-4到约10^-6摩尔／fL。在特定的实施方案中，可以通过检测与样品中感兴趣的分子相关联的可检测试剂来确定动态范围内的样品浓度。动态范围可以取决于多种因素，诸如乳液中产生的体积的范围和／或分析和检测的体积范围。例如，具有第一体积分布的第一多个液滴能够产生可检测浓度的动态范围。在某些情况下，动态范围可以通过分析具有第二体积分布的第二多个液滴中更窄的体积分布来减小。在特定的实施方案中，体积分布包括连续变化的液滴体积。

通过整合dPCR与芯片上的梯度生成、或通过使用大小不同的数字化体积、或这两种方法的组合，本发明有效地将我们的dPCR芯片的动态范围从1个数量级扩大到6个数量级，所述动态范围可以与RT-PCR提供的动态范围相当。如果需要，可以通过使用更广范围的浓度梯度或更大尺寸差异的数字化体积阵列进一步扩大动态范围。这种进行定量PCR（qPCR）的新方法有几个主要的优点：（1）如前所述的更为准确，（2）避免了进行RT-PCR所需的校准样品类型，从而节省时间，以及（3）无需实时灵敏荧光检测，所述实时灵敏荧光检测会使RT-PCR与常规的PCR机器相比产生相对更高的成本（约十倍）。

本发明的另一个方面包括用于实施本发明方法的装置。这样的装置可以建立不同大小的数字化和离散体积阵列。在另一个实施方案中，装置实施用于扩大样品的数字化测量动态范围的方法，所述方法包括建立样品浓度梯度和建立不同大小的样品体积。

在本发明的又一个方面中，本文所述的方法、系统和装置可以用于等温扩增技术，例如数字ELISA、NASBA和LAMP。ELISA是基于蛋白的，常用于蛋白或小分子的定量。NASBA和LAMP是被开发以补充PCR的等温扩增方案。

在等温扩增中，没有传统PCR中发生的温度循环。有几种类型的等温核酸扩增方法，例如转录介导扩增、基于核酸序列的扩增、RNA技术的信号介导扩增、链置换扩增、滚环扩增、DNA环介导等温扩增、等温多置换扩增、解链酶依赖性扩增、单引物等温扩增、以及环状解链酶依赖性扩增。

NASBA（基于核酸序列的扩增）是用于扩增RNA的等温（约40℃）过程，并已成功应用于检测临床样品中的病毒和细菌RNA。NASBA的优点是：（1）其具有高的扩增效率和快速的扩增动力学，在一或两个小时内可以实现一千倍以上的扩增；（2）不会产生象RT-PCR那样由基因组dsDNA导致的假阳性结果；（3）可以不使用内含子侧翼引物而进行基因表达研究；（4）不要求PCR需要的温度控制和反馈的程度。因此，NASBA已广泛用于检测病毒和细菌RNA。NASBA是一种等温方法的事实使其可以使用温控烤箱同时运行多个样品，这在许多现场工作中都是重要的实用优点。

LAMP代表环介导等温扩增，能够在等温条件（约60℃）下高特异性、高效率和快速扩增DNA。由于其扩增反应的特点，LAMP能够在扩增过程中区分单核苷酸差异。因此，LAMP已被用于SNP（单核苷酸多态性）分型。LAMP已在检测病毒RNA中的灵敏度比RT-PCR高约十倍。此外，由于DNA的LAMP扩增可以直接与增加溶液浑浊度的焦磷酸镁的产生相关联，因此使用简单的浊度计就可以监测LAMP的进展。因此，非均质分析可以用来检测LAMP产生的扩增产物。

在一个方面中，本发明提供了用于进行样品的数字环介导扩增的方法。该方法可以包含在微流体装置上产生样品的多个液滴，其中多个液滴中的至少一个液滴含有核酸分子（例如，DNA和／或RNA分子）；然后在至少一个液滴中进行环介导扩增，以产生核酸分子的扩增产物。该方法还可以包括扩增产物的检测。在一些实施方案中，该方法包括确定多个液滴中含有扩增产物的液滴数量；并使用多个液滴中单个液滴的体积和多个液滴中含有核酸分子的液滴数量来计算样品中核酸分子的浓度。微流体装置可以包括配置以形成多个液滴的多个室。采用本发明进行数字LAMP的其它方面可见实施例3。

尽管NASBA和LAMP有这些优点，其一个重要的缺点是难以进行定量化，而定量化在大多数情况中都是有益的。定量通常要求在相同的条件下使用标准扩增产物进行谨慎的校准和控制，这可能非常单调（特别是对于现场研究），并且在许多情况下不实用。对于非均质分析，如检测LAMP中的沉淀，准确的校准可能尤其有挑战性。

滚环扩增（RCA）是一种等温核酸扩增法。这种方法在几个方面与聚合酶链反应和其它核酸扩增方案有区别。在RCA过程中，短DNA探针退火到感兴趣的DNA，如病原生物的DNA或含有有害突变的人类基因。然后，探针充当滚环扩增反应的引物。探针的自由端退火到小的环状DNA模板。加入DNA聚合酶以延伸引物。DNA聚合酶沿着环状DNA模板不断延伸引物，生成由该环状模板的许多重复拷贝构成的长的DNA产物。在反应结束时，聚合酶生成几千个环状模板的拷贝，拷贝链与原始靶DNA相连。这允许靶标具有空间分辨率，和信号的快速扩增。正向和反向引物的使用可以将上述线性扩增反应改变为在一个小时内生成多达1012个拷贝的指数模式。这种定量测量要求的校准可能比较麻烦。

为了克服这一缺点，本发明提供了数字等温扩增，如NASBA和LAMP，其中与数字PCR类似，数字化体积阵列的使用用于进行数字NASBA、数字LAMP和滚环扩增。此外，通过使用浓度梯度和／或不同大小的数字化体积阵列，我们可以有效地扩大这些数字测量的动态范围。本方法理想地补充了这些等温扩增方案，使其成为用于测量是否存在RNA和DNA的定量技术。在本发明的另一个实施方案中，本方法应用于基于抗体的扩增。在另一个实施方案中，该方法应用于基于特异性分子识别的扩增。

III.数字测量的系统

在又一个方面中，本发明提供了一种系统，用于使用数字测量测定样品浓度。该系统可以包括含有具有第一体积分布的第一多个液滴的样品容器；用于探测第一多个液滴的至少一个液滴中含有的可检测试剂的探测器；以及包括存储有可执行指令的存储装置的计算机，所述指令由处理器执行时，可以使处理器：分析具有第二体积分布的第二多个液滴，以确定第二多个液滴中的液滴的体积以及第二多个液滴中的含有可检测试剂的液滴数量，其中第一体积分布与第二体积分布是相同的或不同的；并且使用第二多个液滴中的液滴体积和第二多个液滴中的含有可检测试剂的液滴数量确定样品的浓度。在一些实施方案中，样品中可检测试剂的浓度用于计算样品的浓度。

如本文进一步描述，用于数字测量的体积可以通过多种方式生成和分析。本发明包括样品容器，所述容器用于容纳体积，以使体积可以进一步被处理和／或分析。本发明的样品容器包括试管、微量离心管、微阵列上或微流体芯片中的孔阵列、配置以生成液滴的微流体芯片、以及市售或一般地公知的能够容纳样品的离散体积（例如，孔或液滴）的装置。本发明的系统还包括配置用于分析体积的检测系统。检测系统可以包括用于分析体积成分、确定液滴体积和／或其它感兴趣特征的探测器。本文所述的方法一般可以与任何已知的能够检测和分析体积（例如，液滴和／或孔）的系统相容。

在又一个方面中，该系统可以包括计算机可读取的存储介质，用于进行数字测量。计算机可读取的存储介质在其上存储有指令，在计算机的一个或多个处理器执行这些指令时会使计算机：分析具有第二体积分布的第二多个液滴，以确定第二多个液滴中的含有可检测试剂的液滴数量，其中第一多个液滴包含第二多个液滴，并且第二体积分布比第一体积分布更窄；并且使用第二多个液滴中的液滴的数量、第二多个液滴中一些或所有液滴的体积以及第二多个液滴中的含有一种或多种可检测试剂的液滴数量来确定样品中可检测试剂的浓度。

在又一个方面中，提供了用于进行体积分析并且从分析的体积中检测和计算信息的系统。该系统包括一个或多个处理器，以及包含可由一个或多个处理器执行的指令的存储装置。当这些指令被一个或多个处理器执行时，该系统至少接收用户输入来进行体积分析（例如，多个液滴）。该系统可配置成进行本发明方法的多个方面，例如计算体积数量（例如，液滴）、确定一种体积分布中的多个液滴的体积，并使用含有一种或多种可检测制剂的液滴数量确定样品中可检测试剂的浓度。该系统还为用户提供数据。提供给用户的数据可以包括样品中可检测试剂的浓度或样品的浓度。

图3是计算机系统100的简化的方框图，该计算机系统100可用于本文所述的方法、介质和系统中。在各种实施方案中，计算机系统100可用于实施以上说明和描述的任何系统或方法。如图3所示，计算机系统100包括处理器102，通过总线子系统104与多个外围子系统联系。这些外围子系统包括存储子系统106、用户界面输入装置112、用户界面输出装置114以及网络界面子系统116，所述存储子系统106包括存储器子系统108和文件存储子系统110。

总线子系统104提供一种机制，使计算机系统100的各种组件和子系统能够如预期一样相互联系。尽管总线子系统104作为单个总线示意性地显示，但总线子系统的供选择的实施方案也可使用多个总线。

网络界面子系统116提供与其它计算机系统和网络的界面。网络界面子系统116充当从其它系统接受数据以及从计算机系统100输出数据到其它系统的界面。例如，网络界面子系统116可以使用户计算机连接到互联网并通过互联网促进通信。

用户界面输入装置112可以包括键盘、定位设备如鼠标、跟踪球、触摸板或图形输入板、扫描仪、条形码扫描仪、纳入显示器的触摸屏、音频输入装置如声音识别系统、麦克风和其它类型的输入装置。一般地，术语“输入装置”的使用意在包括向计算机系统100输入信息的所有可能类型的装置和机制。

用户界面输出装置114包括显示器子系统、打印机、传真机、或非可视显示器如音频输出装置等。显示器子系统可以是阴极射线管（CRT）、平板设备如液晶显示器（LCD）或投影设备。一般地，术语“输出装置”的使用意在包括用于从计算机系统100输出信息的所有可能的类型的装置和机制。使用一个或多个用户界面输出装置114，计算机系统100可以输出广告。

存储子系统106提供一个计算机可读取的存储介质，用于存储基本的编程和数据结构。当被处理器执行时，软件（程序、代码模块、指令）提供了本文所述的方法和系统的功能，可以存储在存储子系统106中。这些软件模块或指令可以由一个（或多个）处理器102执行。存储子系统106也可以提供一个存储库，用于存储根据本发明使用的数据。存储子系统106可以包括存储器子系统108和文件／磁盘存储子系统110。

存储器子系统108可以包括多个存储器，包括用于存储程序执行过程中的指令和数据的主随机存取存储器（RAM）118，以及用于存储固定指令的只读存储器（ROM）120。文件存储子系统110提供程序和数据文件的非短暂性持久（非易失）存储，可以包括硬盘驱动器、软盘驱动器及相关的可移动介质、光盘只读存储器（CD-ROM）驱动器、光驱、可移动介质盒以及其它类似的存储介质。

计算机系统100可以有多种类型，包括个人计算机、便携式计算机、工作站、网络计算机、主机、一体机、服务器或任何其它数据处理系统。由于计算机和网络的性质不断变化，图3中对计算机系统100的描述只作为用于说明计算机系统的实施方案的一个具体示例。具有比图3所描绘的系统更多或更少的组件的许多其它配置也是可以的。

鉴于本公开，本领域技术人员显而易见的是，本发明的装置、设备、系统和组件的具体尺寸可以根据预期的应用而容易地改变。此外，应懂得的是，本文所述的实施例和实施方案仅出于说明性目的，可向本领域技术人员建议各种改变或变化，并且这些改变或变化都在本申请的精神和范围内以及所附权利要求的范围内。本文所述实施方案的众多不同组合是可能的，并且这些组合方式被视为本发明的一部分。另外，本文中与任何一个实施方案结合讨论的所有特征都可以容易地调整以用于本文的其它实施方案中。在不同实施方案中针对类似特征使用的不同术语或标记符号不一定意味着与明确规定的不同。因此，意在仅参照所附权利要求描述本发明，并不限于本文所公开的实施方案。

IV.实施例

实施例1

实施例的理论框架

该实施例描述了一个非限定性的理论框架，所述理论框架可以用来描述本文所公开的本发明的特定方面。应当理解的是，该实施例中描述的方法是采用本发明确定样品浓度的众多方法之一。在这一理论框架下，假设靶分子以单位为摩尔／体积的浓度Cs存在于样品中。样品分布为不同体积的数字化体积；靶分子按照泊松统计分布为液滴。对于数字阵列中的每个液滴，如方程式1中所示，靶标的平均数取决于其体积Vi，和初始样品浓度Cs：

P (n, C_{S} V_{i}) = \frac{{(C_{S} V_{i})}^{n}}{n!} \exp (- C_{S} V_{i}) - - - (1)

是对于溶液中靶分子的给定浓度Cs，在体积Vi的液滴中找到n个分子的概率。扩增反应会导致包含一个或多个分子的液滴与空液滴区别开来，例如通过其荧光强度。在该方法中，我们只知道液滴是空的还是已被占据。有关的概率如方程式2所示：

\begin{matrix} P (0, C_{S} V_{i}) = \exp (- C_{S} V_{i}) \\ P (n > 0, C_{S} V_{i}) = 1 - \exp (- C_{S} V_{i}) \end{matrix} - - - (2)

为了确定靶分子的浓度Cs，P（n>0,C_SV_i）需要是各自体积为Vi的足够大量的液滴之和。

模拟方法

这里描述了数字扩增分析的模拟，例如数字PCR、数字LAMP或数字ELISA，采用连续的不同体积验证可以准确确定靶浓度C_S。

每次模拟选择固定的液滴数量N_d和分析物分子的模拟浓度C_S。对C_S的多个值进行模拟。使用随机数发生器从给定范围和分布中选择N_d个液滴的直径。为了说明本发明的原理，假设液滴直径D在4微米的最小直径和190微米的最大直径之间均匀分布下进行模拟。这样产生了34到3.6×10⁶fL的模拟的体积范围。下面讨论了更实际的液滴直径分布。

在每次模拟中，当初始靶浓度为C_S时，使用随机数发生器确定特定的模拟液滴是被占据的还是空的。计算模拟中被占据的液滴的总数N_S并随后与被占据的液滴的预期数量比较。

N_{E} = Σ_{i = 1}^{N_{d}} (1 - \exp (- {CV}_{i})) - - - (3)

其中，在C=C_S时获得N_E的最概然值。采用N_d个液滴的体积，方程式（3）可以调整到N_S以获得浓度的最佳匹配值，C为唯一可调整的参数。我们采用牛顿-拉夫森（Newton-Rhapson）算法发现N_S-N_E的零值。将方程式（3）中的V_i替换为分布的中位体积，以获得C的初始值。然后，算法一般取C变化的5-11次重复，以降至10⁵之一份（1part in10⁵）。在该点的C值被视为C的最佳匹配值。

对于模拟，一些目的是（i）确定该程序在估计C_S时有多准确，以及（ii）如果两个不同的样品产生C的不同的最佳匹配值，如何计算样品具有不同浓度的置信度。

该方法包括测量每个液滴的体积，其中有关的误差也考虑在内。为了模拟这个，在每个模拟直径加入高斯分布误差，以产生模拟的测量直径。然后，这些模拟的测量直径用于计算模拟的测量体积

，将所述模拟的测量体积代入方程式（3）中，以产生在测量体积的基础上被占据的液滴的预期数量。

{\hat{N}}_{E} = Σ_{i = 1}^{N_{d}} (1 - \exp (- C {\hat{V}}_{i})) - - - (4)

确定液滴直径的一种方法是使用显微镜。这个方法的准确度取决于所使用对象的数值孔径（NA）以及成像系统的其它细节。对于在表面上成像大量的静止液滴，NA可能小于1，根据我们的经验，无论液滴大小如何，直径测量的误差一般是0.5到1.0微米。我们模拟了两种不同量级的测量误差，标为E₁和E₂。对于E₁，加入液滴直径的高斯分布误差的标准偏差为1微米或液滴直径的8%中的较大数。包含了相对误差，以使模拟包括最大液滴的不可忽略的测量误差。对于E₂，加入液滴直径的高斯分布误差的标准偏差为2微米或液滴直径的15%中的较大数。在两种情况下，模拟的测量直径都有一个限度。如果特定的高斯偏差使液滴直径小于0.5微米，则弃用该偏差，并为该液滴生成一个新的偏差。

在实验分析中，C_S为程序尝试确定的实际未知浓度，C为最佳匹配估计值，V_i是液滴的实际体积，

是实验者测得的体积。

模拟结果

图4显示了一组典型模拟的结果。模拟使用10,000个液滴和六种不同的浓度C_S（2.0×10^-3、2.0×10^-4、2.0×10^-5、2.0×10^-6、2.0×10^-7和2.0×10^-8摩尔／fL）进行。液滴的大小为4.0到190微米的直径的均匀分布。对于每次模拟，液滴按照体积排列，体积最小的液滴为1号，体积最大的液滴为10,000号。图4绘制了被占据的液滴的累积数量。第i个液滴的被占据的累积数量为≤i的所有被占据液滴的总和。

曲线的形状是浓度和液滴体积分布形状的函数。液滴体积（而非液滴直径）均匀的分布与不均匀的分布一样都会产生不同形状的曲线。对于任何给定的大小分布，图4中的曲线类型会随着液滴数量单调上升，不同浓度的曲线永远不会相交。因此，一旦测量了液滴大小的分布，曲线的形状和被占据液滴的总数只会取决于分析物分子的浓度。对于足够大的浓度，有一种液滴体积，被占据的概率非常接近于1.0。一旦达到了对应该体积的液滴数量，曲线随着接近所有较大液滴数的单位斜率上升。对于足够小的浓度，有一种液滴体积，在所述液滴体积以下被占据的概率为0.0。对于所有液滴数小于对应该体积的液滴数，曲线等于零。

液滴直径测量误差对最佳匹配结果的影响

如本文所描述的，本发明涉及单独测量液滴的大小。由于液滴的体积决定其被占据的概率，因此体积的非常准确的测量似乎是重要的。对于该模拟中的液滴大小范围，最小液滴（直径约4微米）基本上不比使用光学显微镜测量的液滴直径的典型误差大（标准偏差约1微米）。在液滴体积中产生的相对误差可以很显著，预期可能会降低该方法的准确度。令人惊讶的是，情况似乎并非如此。表1将拟合方程式（3）的结果与拟合方程式（4）的结果及一系列模拟进行比较。对于每种浓度，进行100个模拟，每个模拟含2000个液滴。对于方程式（3），采用模拟体积V_i。对于方程式（4），采用模拟测量体积

。问题在于采用方程式（3）拟合模拟结果的结果代表了当已知液滴体积具有良好的准确度时获得的最佳匹配浓度，而用方程式（4）拟合的5结果包括在液滴体积测量中的误差影响。表1列出了对于E₁和E₂，使用方程式（3）和方程式（4）的最佳匹配浓度的平均和标准偏差。

表1-在2000个液滴的模拟中体积测量误差的影响

（a）每个液滴的固定和相对误差较大者作为加入该液滴的高斯分布误差的标准偏差，从模拟直径中生成模拟测量直径。这些分别用于计算模拟测量体积

和模拟体积（V）。

除了最大浓度以外，采用方程式（3）和方程式（4）得出的最佳匹配浓度的差异非常小。即使当误差为±2微米或15%时，误差也只达到最大浓度的25%。此外，对每个浓度，除了最大浓度以外，采用方程式（3）和方程式（4）得出的最佳匹配结果的标准偏差几乎相同，之间没有任何明显的系统性差异。这表明，对于表1中的大多数浓度，最佳匹配浓度变化的最大来源是一个模拟到下一个模拟的液滴占据数的变化。只要是无偏性的，由液滴大小测量误差产生的最佳匹配结果的任何变化对浓度确定的影响很小或几乎没有影响。尽管对于最小液滴，误差的标准偏差接近具有2.0微米误差（E₂）的模拟的直径一半，情况也是如此。由于意味着该方法不要求液滴直径测量中不合理的高准确度，因此这是一个重要的结果。如下所讨论，该方法主要要求任何测量误差是无偏性的。通过图5的帮助可以对这一令人惊讶的结果进行解释。

图5显示了浓度为2.0×10^-6的被占据液滴累积数量的模拟结果。该模拟包括10,000个直径在4和190微米之间均匀分布的液滴。曲线分为三个区域：低位区、过渡区和高位区。在低位区，液滴被占据的概率非常小，因此模拟曲线为零。在高位区，液滴被占据的概率非常接近1，曲线以接近单位斜率上升。在过渡区，液滴被占据的概率从零上升到几乎为1。低位区或高位区内的液滴的测量误差对被占据液滴的总数影响很小或没有影响。从方程式（4）我们可以看出，在低位区内的液滴的测量误差只是把总和中几乎为零的一项替换为也几乎为零的不同项，这样可以使得被占据液滴总数的变化可以忽略。在高位区也有类似的情况，其中测量误差将方程式（4）中几乎为1.0的项替换为也几乎为1.0的其它项。如果误差和在表1中的模拟一样是无偏性的，则也会取消一些误差。方程式（4）中总和中对应于低位区或高位区液滴的项可能与被稍小的项代替一样，被稍大的项代替。因此，会取消一些液滴体积测量误差，这将减少那些误差对最佳匹配浓度的影响。如果误差是无偏性的且在确定过渡区的体积中分布有足够的液滴，那么也会取消过渡区内液滴体积测量的误差。事实上，似乎体积测量误差只有当测量误差明显改变体积分布函数的形状时才会给最佳匹配浓度带来明显的误差，甚至过渡区内的液滴发生变化也是如此。表1所用的高斯分布测量误差对直径分布的影响只在分布接近结束时才会明显。例如，这些模拟中生成的最小液滴的直径接近4微米。但是，当包含测量误差时，模拟测量直径可能小于4微米。也就是说，模拟测量直径的分布会延伸到比实际模拟直径更小的尺寸，从而将分布函数稍微扩大到接近4微米。对于这些最小的液滴，使用模拟尺寸计算被占据的概率，但是在拟合数据时，则使用较小的测量尺寸计算被占据的概率。这样，当过渡区含有这些最小的液滴时，可以拟合估计的浓度。这就是表1所示的，尽管影响不是非常大。由于分布函数稍微扩展到接近190微米，因此在最低浓度下也应有同等的影响，但影响不那么明显。

模拟中使用的液滴直径范围的选择使任何合理尺寸的液滴体积测量误差会预期对根据被占据液滴总数估计浓度的尝试有明显的影响。但是，这一现象似乎并未发生，即使模拟浓度范围（10⁶）大于模拟体积范围（10⁵）。对小范围内均匀分布的液滴直径的其它模拟产生了类似的结果，这是由于在比体积范围大约10倍的模拟浓度范围下可获得相当准确的最佳匹配浓度。

如果该方法用于确定两个不同样品的浓度是否不同，则出现了不同的问题。对此，必须考虑该方法的置信度和统计功效。这在下面章节中进行。

置信度和功效的估计

区别浓度差异的方法的能力可以用置信度和功效描述。（Lieber,R.L.(1990)“Statistical Significance and Statistical Power in Hypothesis Testing”,J.Orthopaedic Research8,304-309）如果两个不同样品的测量产生两个不同的最佳匹配浓度（C₁和C₁），则了解在断定这两个样品的浓度不同时的置信度是怎样的，以及如果做出浓度相同的结论的错误概率是有用的。假阳性结果（I类错误）的风险通过要求结果具有要求的最低置信度来控制，而假阴性结果（II类错误）的风险则通过要求方法具有要求的功效来控制。

对于两个不同样品最佳匹配浓度的比较，无效假设为两个样品浓度相同（未知）。如果浓度相同的两个样品可以产生数量级差异超过|C₁-C₂|的最佳匹配浓度的概率为α，则(1-α)为与拒绝无效假设相关的置信度。(1-α)可接受最小值的选择是为了限制假阳性结果。后面描述了使用功效防止假阴性结果。

用于估计置信水平的一个方法是Z-检验。

Z = \frac{C_{1} - C_{2}}{\sqrt{σ_{1}^{2} + σ_{2}^{2}}} - - - (5)

通常选择95%的置信水平，并要求Z＞1.96。C_n为方程式（4）的最佳匹配结果，

为与测量C_n相关的方差。我们的方法不存在

易于分析的表达式，因此需要通过模拟估计

此外，Z-检验的一个另外的限制是其假设测量结果正态分布。由于不一定是这一情况，因此需要进行第二种模拟方法估计置信度并与Z检验结果进行比较。在下文中，这两种方法表示为Z方法和Paris或P方法。

对于使用Z方法估计置信度，我们使用C_s的两个不同值（C_S1=2.0×10^-5和C_S2＝2.2×10^-5）。对于C_s的每个值，从4到190微米范围内延伸的均匀分布的液滴直径中随机选择5000个液滴的组，并使用方程式（2）模拟被占据液滴的数量。测量误差的E₁大小用于生成模拟测量体积。确定每组的最佳匹配值，获得C₁和C₂，其中C_n为采用C_Sn作为模拟浓度的模拟的最佳匹配结果。对于每个C_n，进行另外的Z方法模拟。方程式（2）中使用C_n和模拟测量体积

获得N_Z=1000，

组被占据液滴的模拟总数。然后，使用方程式（2）进行拟合，获得N_Z最佳匹配浓度

的标准偏差用于方程式（5）中的σ_n。这对应于实验者拥有的信息。置信度的估计可以由最佳匹配浓度C_n以及测量的液滴体积计算。

对于使用Paris方法估计置信度，我们假设无效假设是两个最佳匹配结果（C₁和C₂）各自从实际浓度

为两个最佳匹配浓度平均值的样品中获得。对N_p=500的另外的组液滴直径进行模拟，对于每组液滴，模拟浓度为

的被占据液滴数量，模拟误差的E₁大小用于生成模拟测量体积。每组获得最佳匹配浓度

然后，从

组随机选择M_p=500对数值，其差异

的绝对值与ΔC＝C₂-C₁相比较。大于ΔC的

的分数提供了α的估计，具有浓度

的样品的两次测量彼此差异超过ΔC的概率。α的P方法估计用于计算置信度，其等于(1-α)。

获得置信度的两种估计的整个程序对一对C_s值重复100次。对于每次重复，每个C_s生成一组新的模拟体积，使用方程式（2）生成每个C_s的被占据的液滴数目。生成模拟测量体积，并用于方程式（4）中以拟合结果并取得一对新的最佳匹配浓度（C₁和C₂）。然后，使用Z方法和P方法估计置信度。

C_s的两个选定值之间小的差异（10%）使置信度处于0到1的范围内，这使我们可以比较在一系列值中估计置信度的两种方法，在所有情况下都能取得合理的一致。图17中的表2显示了100个结果中的几个。特别地，表2显示了产生置信度最小值的5个组、产生置信度中位值的6个组和产生接近1.0的置信度值的5个组。Z方法的结果显示在前5栏中，P方法的结果显示在后3栏中。两种不同方法的置信度值(1-α)分别在第5栏和第8栏，二者对于所有模拟组都有合理的一致性。由于Z方法中实施的Z检验似乎足够准确，因此没有解析式并不是问题。虽然我们在计算功效时继续采用P方法，但是在实践中，Z方法是一个合理的选择，计算起来不那么昂贵。此外，P方法需要一种数值法，用于生成最接近于实际分布的液滴大小分布，而Z方法无此要求。最后这个要求在模拟中不是问题，但在分析实验结果时可能成为一个困难，因此Z方法在这种情况下更为有用。我们注意到，对其所有N_Z模拟均采用相同的实验测量液滴大小的Z方法产生的置信度与P方法产生的置信度合理地一致，所述P方法对其每个N_P模拟生成一组新的模拟液滴体积和相关测量误差。这意味着对于足够大量的液滴，特定样品分布的液滴体积的方差对被占据液滴数量变化的影响比液滴被占据的泊松概率（方程式（2））的影响要小。

置信水平估计了指示两个样品浓度不同的结果为假阳性的可能性。功效估计了假阴性的可能性。对此，采用了前一组模拟的程序。对于参比和测试浓度之间给定的百分数差异，计算了太接近而无法满足要求的置信水平的结果的分数。这是结果（β）的分数，会产生特定浓度差异和要求的置信水平（在这种情况下为95%）的假阴性，统计功效为(1-β)。图6-7显示了这一检验的结果。不同的数字为产生的两种液滴直径不同分布的功效，包括E₁和E₂测量误差。图6和7是均匀分布的结果，直径范围为4到190微米（图6，体积范围约10⁵）和10到100微米（图7，体积范围约10³）。横坐标上的每个浓度对高20%和50%的浓度进行检验（分别1.2倍和1.5倍的分辨率）。所有附图中的结果都是5000个液滴组的，其它参数与用于Paris方法估计置信度中的参数相同。

在区别浓度差异20%的样品时，该方法中浓度范围跨越约100倍的功效>0.95。如果要求从1.2倍放宽到1.5倍分辨率，则功效>0.95的浓度范围对宽广的均匀分布（图6，液滴直径范围为4到190微米）跨越10⁴倍以上，对其它几乎为10⁴（图7，液滴直径范围为10到100微米）。该范围的定位取决于液滴大小分布的形状。如果要求的分辨率放宽或液滴数量增加，则功效>0.95的范围增加。

对于4到190微米的均匀分布范围，5000个液滴样品的总体积约为5uL。8×10^-9模拟中的拷贝总数约为35/5000液滴，或约7800个拷贝／ml。采用包含更大尺寸的液滴或更多数量的液滴的液滴范围，可以实现更小的浓度。

实施例2

生成具有不同体积的液滴并确定其大小的实验方法

不同大小的液滴可以以多种方式建立。在一种方法中，可以使用微流体在T形接头或流动集中设备中生成不同大小的液滴。这使用专门的芯片，芯片上先载入两种成分（油相和水性样品），然后通过液滴的形成实现水性样品的数字化。在这一实施例中，我们采用一种更简单、更用户友好的方法，其中随机生成不同大小的液滴，即在试管或合适的容器内乳化。在第一个实施方案中，包含反应混合物的水相被吸入一个0.2mL的预先注满合适的油-表面活性剂混合物的PCR试管中。如本文所提供的，油相包含73%的

20%的轻质矿物油和7%的ABIL WE09表面活性剂，在使用前新鲜混合并平衡至少30分钟。采用这种混合物形成的乳液在标准乳液PCR过程中能显示卓越的热稳定性。在将水相吸入油混合物之后，通过以约3000rpm的速率涡旋振荡约十秒钟，形成不同大小的液滴。在混合物中加入一个小的搅拌棒而进一步增强乳化作用，所述搅拌棒在振荡过程中促进水相分裂为小的液滴。油中存在的表面活性剂会使乳液稳定，从而使单个水滴不会融合。在另一个实施方案中，将水相和油混合物加入包含小不锈钢珠的小型收集微管中。然后在15-17Hz下振摇管20秒钟，生成乳液。之后将乳液转移到0.2mL的PCR试管中，进行PCR反应。

为了测量液滴大小分布，在硅烷化载玻片上铺少量的乳液，盖上过量的油-表面活性剂的混合物。然后将样品放置在广角显微镜下，从底部用暗场照明照亮。在这个方案中，在光源的光路上放有合适尺寸的不透明圆盘，阻挡试样前大部分的光。这样，只有光源外圈的光才能到达试样。不透明圆盘的位置应与显微镜物镜匹配，使从试样散射出来的一小部分光进入物镜。由于样品的对比度来自于从样品散射的光，因此产生的图像主要是单个液滴的环形圆周，如图8A所示。由于在暗场获得的大的对比度，因此只要液滴的分布够稀疏，就可以轻松确定图像中每个圆圈的液滴直径。

图8B显示了乳化后577个液滴的分布。该分布与20μm的中位直径高度不对称。乳化作用优先地生成约10-40μm的较小液滴，其中最小的液滴直径约6-8μm，最大液滴直径为70-80μm。液滴直径中10倍转化为约1000的动态体积范围。

如图8所示，用于生成大小不同的液滴的任何实际过程都容易产生尖峰分布而非均匀的分布。为了验证我们从液滴大小的均匀分布中得出的结论对诸如从实验中获得的尖峰分布同样有效，我们用液滴模拟数字PCR实验，所述液滴的大小分布如图9所示。该分布是对数正态分布，其中只包含8到64微米的直径。该分布也用于表1中进行的同样类型的模拟，结果如表3所示。

表3-体积测量误差在具有非均匀分布的2000个液滴的模拟中的影响

和模拟体积（V）。

表3的结果说明，即使是适中动态范围的不对称分布，也可以获得大量浓度范围内分析物分子浓度的相当准确的估计（±10%）。这一点是重要的，因为它显示了像乳化作用这种可以在几乎所有实验室环境下进行的简单的过程能够产生液滴足够大的分布，以准确确定4-5数量级的靶DNA浓度。小的改进又能进一步提高这一动态范围。

作为进一步的试验，我们估计了图10（体积范围约500）所示的部分省略的对数正态函数方法的功效。在图6和7所示的情况下，进行四组模拟，跨越的浓度范围为8×10^-9到8×10^-3摩尔／fL。数据显示，通过液滴实验分布实现的功效可与针对类似范围的均匀分布的液滴估计的相当（图7）。这种简单而用户友好的在乳液中生成液滴的程序与分析的稳定性能结合，使本发明成为一种有吸引力的新方法，用于以扩展的动态范围进行数字测定。

dPCR后扩增分析

为了使液滴中的扩增产物的存在可视化，在反应混合物中加入荧光探针，以特异性识别扩增子的存在。在大多数情况下，这是分子信标，即发夹结构，荧光在所述分子信标的闭合构象中快速淬灭，并且当与扩增靶DNA杂交时其强度会增强，或者是

探针，所述

探针与靶DNA杂交，导致在下一个扩增步骤过程中探针DNA的荧光指示剂断裂。

这些探针具有不可忽略的背景荧光，根据加入反应中的探针量，在扩增过程中强度的相对增长可以相当小。此外，在检测过程中的激发强度在整个视场有所不同。这样，由于数据通常需要是阈值，以确定荧光变化是否显著以指示扩增产物的生成，因此一种简单的强度度量有时会产生不明确的结果。因此在我们的所有实验中，我们在反应混合物中加入少量（1-2μM）的红色荧光染料罗丹明作为参比染料，所述罗丹明的光谱特征能够很好地从显示扩增的荧光探针上分离。然后，我们建立了两种强度比，一种由参比染料测量，一种由探针测量。强度比不会受液滴体积因融合或收缩而发生的变化或激发功效的不需要的变化的影响，因为这会对两种染料产生同样的影响，但不会改变其比例。图11显示了两种PCR反应的图像，其中（1）液滴在扩增过程中不含靶DNA（阴性对照），以及（2）反应混合物包含靶DNA。在荧光显微镜下拍摄了显示有参比染料（ROX）和探针（FAM）存在的荧光图像，液滴通过底部照明在暗场同时成像。插入物显示测量的强度在穿过液滴中心的线上。在没有靶DNA（A，B）时，FAM通道中的强度取决于液滴的暗场信号，中心部分显示信号没有增强，而在ROX通道中，暗场信号叠加在参比染料的高斯形荧光信号上。来自ROX和FAM通道中心区域的强度之间的比较大（ROX:FAM=120:20=6:1）。在反应混合物（C，D）中有DNA存在时，在FAM通道中也能观察到液滴中心增强的信号，显示该液滴中发生扩增反应。因此，ROX和FAM荧光之间的比明显较小，ROX:FAM=60:30=2:1。

本发明实施的另外一种方式是采用包含不同稀释度的样品溶液的不同液滴组。包含不同稀释度样品的液滴应彼此分离。如果能够实现这一点，则实验分析的变化只是将方程式中的体积因数替换为d_iV_i，其中d_i为第i个液滴的稀释因数。例如，方程式（2）会变成

\begin{matrix} P (0, C_{S} d_{i} V_{i}) = \exp (- C_{S} d_{i} V_{i}) \\ P (n > 0, C_{S} d_{i} V_{i}) = 1 - \exp (- C_{S} d_{i} V_{i}) \end{matrix} - - - (6)

其它方程式也有类似的变化。这样会使该方法扩展到准确测量比液滴大小分布更大的浓度。

实施例3

数字等温DNA扩增的实施例

该实施例描述了一种方法，所述方法不仅适用于基于PCR的DNA扩增，而且适合于本领域公知的各种类型的数字分析。该方法的简单和稳定性使该实施例在专门的工作台设备有限的医疗点和资源有限的环境中特别有用。

具有可重现的液滴形成的自动化的样品自数字化

数字LAMP芯片设计为容纳液滴的一系列长方形腔，所述腔沿着用于输送样品的更小的长方形通道排列（图12）。芯片布局的设计是为了增强液滴的稳定性和保留、充注过程的自动化以及在升高的温度下的操作。主通道和侧腔之间的高度比减到1/3会减少各室之间串扰的机会。侧室的深度延伸到400μm，我们发现这样可以增强液滴的保留。气压调节流量用于确保自动化充注的重现性和稳定性。采用各种措施尽可能减少含水液滴在较高温度下的蒸发：a）室以密集的阵列排列，并嵌入薄的PDMS顶层和底层之间。b）阵列周围放置另外的牺牲水通道。c）芯片顶部加入自粘膜，作为隔汽层。

在载入水相之前，芯片用连续相（有0.025%w/w SPAN-80表面活性剂的轻质矿物油）处理。在入口中引入新鲜的LAMP溶液，并在侧室内自数字化为纳升大小的液滴。图13A和13B显示了在室充注和液滴形成过程中拍摄的一系列图像。水相进入主通道，慢慢替换侧室的油。一旦整个样品进入芯片，尾油相在侧室开口处切断流体并隔离纳升液滴。

整个阵列液滴大小的均匀度取决于所施加的气压，如图13C所示。保留液滴的体积是根据在芯片孵育之前采集的图像估计的，如实验部分所描述。在我们的设置中，7-8psi的气压产生最均匀的液滴大小分布，而大多数液滴显示近乎完整的体积保留，接近一致的相对体积分数（RVF）表明了这一点。只发现一部分较小的尺寸，大多数靠近出口，水相的初始侧室充注在所述出口处是不完整的。更高或更低的压力使RVF分布扩大，更多液滴显示RVF值明显降低。

图13D显示了5000个液滴的累积直方图。96%以上的液滴占据至少一半的室体积，而56%的液滴的RVF超过90%。我们发现RVF平均值为0.89±0.14。液滴均匀性是理想的，因为减少了因初始液滴体积的差异导致的定量误差。我们会在后面的章节中显示液滴大小的分布不会对我们的dLAMP分析的结果产生重大影响。

图13E显示了7psi气压下样品数字化的重现性。对于15个单个的芯片，计算平均RVF及其标准偏差。平均RVF在10%的窗口内变动，显示了芯片性能具有足够的重现性。对所有芯片比较液滴大小的标准偏差，虽然芯片之间有较大的差异。

升高温度下的液滴稳定性

充注后，芯片在65℃下孵育70分钟，以进行等温DNA扩增。在升高的温度下，纳升大小的室容易通过PDMS蒸发水，并将水分配到油相。这样会使试剂浓度上升，例如使离子强度升高，会使反应受到抑制。

我们发现，热孵育过程中的样品蒸发量限制在数字化体积的约10%（图14A）。位于芯片外围的室暴露于更大的PDMS，与位于阵列中心的室相比显示稍高的收缩（见图14A的入口图像）。但是，总的影响较小，我们预期不会影响扩增反应。如果外围的蒸发还是一个问题，可忽略相关的室，并在进一步分析中只考虑最里面的室，这在下面有进一步讨论。

在65℃温度下孵育期间，我们期望在含有一个或多个DNA模板的室内会进行等温DNA扩增。在扩增过程中释放焦磷酸盐后，由钙黄绿素荧光的较大增长证明了阳性扩增。不含模板DNA的那些室只显示背景荧光。我们下一步测试我们是否能通过稀释的DNA样品（储备溶液的430倍稀释）的扩增获得数字签名。图14B显示了孵育之前和之后一部分芯片的图像和强度扫描。如预期的那样，一些室显示了荧光明显增加，而相邻的室仍然是暗的。因此，室之间的串扰似乎不是问题：LAMP有效的室被只显示背景信号的相邻室很好地分离开。

液滴大小的变化对dLAMP分析无影响

较小的液滴含有一个或多个模板分子的概率更低；较小的液滴中不易发生阳性事件，因此应在分析中占有更高权重。为了检验这个程序是否与直接计数LAMP有效室获得的结果不同，我们在三个不同的初始模板浓度c_i（c_i=c₀/150(A)，c_i=c₀/430(B)和c_i=c₀/1300(C)）下针对三个代表芯片比较了这两种分析方法。表4总结了该结果。在第一种情况下，无论初始液滴大小怎样，从阳性液滴的简单计数推算LAMP有效室的分数f₀。该分数与我们根据初始液滴体积估算的“有效”分数f_eff比较。f_eff计算为所有阳性液滴的相反相对体积分数的总和。换言之，RVF为50%的液滴是占据全部侧室的液滴的两倍。然后，我们比较了所分析三个芯片之间的f₀和f_eff的比。我们发现对于我们的系统，两种分析方案在所有参数中得到类似的结果。f_eff比f₀大约10%反映了初始液滴大小10-15%的变化。从这个对比中我们推论，在我们的实验中，对于初始液滴大小的均质性的实验足以验证直接计数的方法。

表4：dLAMP分析方法比较

我们还检查了外围液滴的优先收缩是否会对分析产生影响。我们比较了下列情况的LAMP有效室的分数：a）分析中考虑了所有液滴（f₀），以及b）分析中排除了外围液滴（f_内部）。还记得收缩的增加会提高局部溶质浓度，从而对扩增过程产生影响。对于所考虑的所有三个浓度，如果只分析最里面的液滴，则LAMP有效液滴的相对分数变化小于6%。不同样品浓度的各个比统一在彼此的10%以内。因此，对于dLAMP，我们在分析中考虑了所有液滴，从而避免了因排除外围液滴而产生的不必要的样品浪费。

dLAMP定量相对和绝对DNA浓度

数字DNA扩增的一个重要应用是定量样品中绝对模板浓度。我们接下来分析了样品中有连续DNA模板稀释的dLAMP芯片的性能。如果液滴平均含不到一个模板，则我们期望LAMP有效室的数量与DNA浓度成线性比例。模板包含

试剂盒中提供的DNA对照样品。我们首先进行紫外线吸收光谱法，来估计DNA储备溶液中的模板浓度。DNA的量太小，无法提供260nm下的可定量的吸收度。于是我们尝试使用插入染料进行DNA定量。在这个实验中，靶模板与已知浓度的λ-噬菌体DNA稀释系列比较。所有样品均采用DNA插入染料（

Biotium,Hayward,CA,USA）孵育30分钟。然后，在Typhoon^TM成像器上定量每个样品的荧光信号。由于已知λ-噬菌体DNA的浓度和长度（48502bp），我们获得了至少对模板溶液中存在的bp数量的准确估计。未知样品的强度与少于10⁵个λ-噬菌体DNA每μl的溶液强度比较。由于这一浓度方案的低对比度，我们无法进一步缩小浓度。假设将质体与完整的λ-噬菌体DNA的大小相当，因此我们估计浓度为10⁴到10⁵个模板拷贝每μl。

为了确定dLAMP实验的浓度，我们首先在模板浓度为储备溶液的1/4到1/1300的稀释系列上进行dLAMP。每个实验至少进行三次。图15显示了在65℃下孵育70分钟后数个芯片的代表图像。图16显示了LAMP有效室的各个分数f₀。要计算f₀，我们首先确定孵育前初始室的数量n_i。然后，我们计数扩增室的数量n_a，这是由孵育后采集的图像所定量的荧光比背景增长至少三倍的室。f₀计算为f₀=n_a/n_i。

我们观察到LAMP有效室数量的线性变化，其中DNA浓度为所分析的最低的三个浓度。为了通过dLAMP估计靶DNA的浓度，我们计算了与三个最低样品浓度的线性泊松拟合。拟合产生(0.99±0.03)×10⁴个拷贝每μl的浓度，这与我们从DNA插入实验中的估计一致。这一结果证实我们的dLAMP芯片能够准确地重现在连续稀释的未知样品中的DNA浓度的相对变化。但是，如果初始DNA浓度确定不准确，数据不一定能显示我们可以通过dLAMP确定绝对DNA浓度。于是我们用已知浓度的新靶模板进行另外的dLAMP实验。

我们选择完整λ-噬菌体DNA模板，用于使用一组相应的LAMP引物进行插入分析。采用紫外分光光度法测量测得储备溶液的DNA浓度为465μg/ml，相当于8.9×10⁹个拷贝每μl。然后，样品被稀释到终LAMP溶液中20个拷贝每μl。对于这一浓度以及6纳升的侧室体积，我们期望能在所有室的12%中观察到扩增发生。进行dLAMP70分钟，图16B显示LAMP反应之前和之后535孔芯片的图像。根据芯片上离散化的液滴的初始数量（479）以及孵育后LAMP有效的侧室数量（47），我们计算出阳性事件的相对分数为9.8%。对于相同的模板浓度，在351室阵列中进行的第二个实验产生了10.7%的相当的分数。f_a的期望值和测量值之间的小差异可能是由于八倍稀释系列累积的吸移误差。

因此，我们得出的结论是，我们的dLAMP芯片能够正确地确定绝对DNA浓度以及DNA浓度的相对变化。SD芯片中的dLAMP不仅操作简单，而且在样品消耗最小的情况下提供了进行等温数字DNA定量的方便的平台。

我们展示了以数字的形式成功地进行芯片上环介导DNA扩增。受到现有平台在以简单可用的形式使用最少的样品消耗进行数字DNA扩增的限制性的驱使，我们改进了自数字化概念以允许在65℃下进行等温DNA扩增。我们的方法简单而稳定：水相一旦被吸移入芯片，仅使用泵头和恒定气压就足以诱导样品离散，而无需进一步的芯片操作，如装设气动阀门或机械装置。与大多数（如果不是全部的）其它数字化平台不同，我们的设计提供了完全无损的样品区室化。这在样品来源有限的情况下尤其重要，如医疗点应用。

数字LAMP签名在70分钟的孵育期内足够准确地重现了绝对DNA浓度以及相对变化。在升高的温度下，在样品孵育期间的液滴收缩极小，对扩增过程没有影响。我们还解决了在芯片充注过程中液滴大小变化的问题，显示充分的尺寸均质性，液滴体积在约10-15%范围内变化。液滴体积的差异可能会潜在地影响每个液滴的平均模板数量以及所产生的数字签名。我们验证了我们的自主的芯片充注产生有充分均质体积的液滴，使数据分析简化以计数LAMP有效室，而无需考虑液滴体积的变化。

我们的实验设计采用标准实验室仪器，用于加热和成像，因此与大多数诊断装置相容，无需另外的的定制仪器。由于65℃的适中的反应温度，也可以在热水浴中进行芯片孵育，这样会进一步简化芯片的操作。最后，我们注意到，除了钙黄绿素荧光的增长外，LAMP可能会生成焦磷酸盐沉淀的可视信号。检测可以在简单显微镜上进行，以根本上避免对荧光设备的要求，进一步降低分析的复杂度。

dLAMP实验部分

化学品和试剂

DNA扩增试剂盒和钙黄绿素荧光指示剂试剂盒购自SAScientific（San Antonio,TX,USA）。试剂盒中包含阳性对照DNA和一组对应的引物。轻质矿物油、山梨糖醇酐单油酸酯（SPAN-80）、牛血清白蛋白（BSA）、丙二醇甲醚醋酸酯（PGMEA）以及异丙醇来自Sigma Aldrich（St.Louis,MO,USA）。聚二甲基硅氧烷（PDMS,Sylgard184试剂盒）购自Dow Corning（Midland,MI,USA）。

对于完整λ-噬菌体DNA的LAMP实验，使用下面六组引物（正向内引物（FIP））：

5'-CAGCATCCCTTTCGGCATACCAGGTGGCAAGGGTAATGAGG-3'(SEQ ID NO:1)，

反向内引物（BIP）：

5'-GGAGGTTGAAGAACTGCGGCAGTCGATGGCGTTCGTACTC-3'(SEQ ID NO:2)，

正向外引物（F3）：5'-GAATGCCCGTTCTGCGAG-3'(SEQ ID NO:3)，

反向外引物（B3）：5'-TTCAGTTCCTGTGCGTCG-3'(SEQ ID NO:4)，

正向环引物（LF），5'-GGCGGCAGAGTCATAAAGCA-3'(SEQ ID NO:5)，

反向环引物（LB）：5'-GGCAGATCTCCAGCCAGGAACTA-3'(SEQ IDNO:6)。所有引物均购自IDT（San Diego,CA,USA）。

微流体芯片制作

用于数字LAMP的微流体芯片是采用标准的软刻蚀技术由聚二甲硅氧烷（PDMS）复制的。微流体通道和侧室的网络在AutoCAD（Autodesk,SanRafael,CA,USA）中设计，并印刷在Mylar光掩模（Fineline Imaging,ColoradoSprings CO,USA）上。掩模用于制造两层SU-8硅母模。对每一层进行下列步骤：将SU-8光刻胶（SU-82050,MicroChem,Newton,MA,USA）旋涂在新鲜清洁的硅片上。软烘烤之后，对准硅片和光掩模，在商用掩模对准器（Newport,Irvine CA,USA）中暴露于紫外线。暴露到紫外线会使SU-8在光掩模的透明区域下交联。固化后，未暴露的SU-8在PGMEA中溶解，并用异丙醇清洁硅片，在155℃下硬烘烤10分钟。用自制干涉仪测量母模中阳性特征的高度约为75μm。为了避免在复制过程中PDMS粘到硅片上，通过气相沉积在硅片上涂覆(十三氟)-1,1,2,2-四氢辛基)三氯硅烷（Gelest,Morrisville,PA,USA）。

对于芯片的复制，制造商建议PDMS碱和催化剂以10:1的重量比混合。混合物进行脱气处理15-20分钟，并旋转涂覆于SU-8硅母模上，形成约300μm厚的薄膜。在70℃下固化三小时后，将PDMS从硅片上剥离。用尖的15隔距冲头（gauge punch）在弹性体上打检查孔。PDMS复制品粘到显微镜载玻片上，所述载玻片通过氧等离子体处理而包被有一薄层的固化PDMS。PDMS芯片在115℃下存放两天，使表面恢复疏水性。

实验方案

在实验之前，在PDMS中复制一组与入口和出口孔匹配的小槽，用双面胶带粘到芯片上。每个槽的容积大约是50μl。芯片放置在真空下20-30分钟，去除PDMS中的多余空气。将40μl补充了0.025%w/w SPAN-80的轻质矿物油放置在主通道的入口中以预填装（prime）芯片。施加空气压力以保持油流，直到空气被排出芯片为止。预填装后，在芯片上盖上一小片粘性PCR密封膜（Bio-Rad,Hercules,CA,USA），减少孵育期间水的蒸发。

根据制造商的指示新鲜制备13μl的LAMP溶液。混合物中添加1.2g/lBSA，以在反应期间保持聚合酶的稳定，以及0.6μl的钙黄绿素基荧光探测试剂盒。在入口中吸入1.8-2μl的LAMP溶液，在覆盖有多余的油的槽底部形成一个水塞。施加外部空气压力，使水塞沿着通道网络移动，直到整个样品实现芯片上的数字化。在显微镜（AZ100,Nikon Instruments,Melville NY,USA）上可以目视检查数字化。使用出口的负压手动地在牺牲水通道中注满脱气水。所有入口都覆盖有至少20μl的油，然后在配有原位适配装置的热循环仪（Mastercycler,Eppendorf,Westbury,NY,USA）上在65℃下孵育芯片70分钟。

芯片成像和定量

在热孵育之前和之后，所有芯片都在可变模式的成像仪（TyphoonFLA9000,GE Healthcare,Pittsburgh,PA,USA）上扫描。室内的钙黄绿素荧光在473nm下激发，通过长通滤波器（510LP）采集图像，像素分辨率为10μm，光电倍增管的电压为350V。然后在ImageJ（rsbweb.nih.gov）中进行图像分析，定量不连续体积的数量和大小分布以及显示DNA扩增的室数量。采用IGOR Pro（WaveMetrics,Lake Oswego,OR,USA）进行进一步的数据分析。虽然钙黄绿素荧光最初被高度淬灭，仍可使用Typhoon成像仪监测其残留发射以确定室中初始液滴大小。初始液滴大小的分布根据保留体积分数（RVF）定量，所述分数估计为液滴面积与侧室面积之比。等于液滴中钙黄绿素荧光平均像素强度1/3的阈值用于背景的区分。进一步分析中只考虑RVF至少为0.15的液滴。

如本文所提供，本发明呈现了采用来自连续的大小分布的液滴进行的数字液滴分析的统计学分析。最佳匹配浓度对单个液滴体积确定中的无偏误差适度地不敏感，因此对此确定要求的准确度不会成为一种不合理的负担。本发明提供了一种用于在比较来自不同样品的结果时估计置信度的简单方法。这种方法对置信度的估计与采用更加计算密集的方法估计的置信度合理地一致。从模拟中可以计算1.2倍和1.5倍分辨率下针对液滴直径的三种不同分布的方法的统计功效。有了需要的分辨率、液滴大小分布和液滴数量，这些方法可用于确定该方法可以产生可用结果的浓度范围。

虽然本发明的描述着重于特定的实施方案，但是本领域技术人员显而易见的是，本发明可以进行各种修改和变化，而不背离本发明的范围或精神。在考虑到本文公开的本发明的说明书和实施的情况下，本发明的其它实施方案对于本领域技术人员是显而易见的。说明书和实施例仅被考虑为示例性的，本发明的真实范围和精神由以下权利要求限定。

Claims

1.一种采用数字化测量确定样品浓度的方法，所述方法包括：

生成具有第一体积分布的第一多个液滴，其中所述第一多个液滴中的至少一个液滴包含来自于所述样品的成分；

对具有第二体积分布的第二多个液滴进行分析，以确定第二多个液滴中的单个液滴的体积以及第二多个液滴中包含可检测试剂的液滴的数量，其中所述第一体积分布与第二体积分布是相同的或不同的；以及

使用第二多个液滴中的单个液滴体积和第二多个液滴中包含可检测试剂的液滴数量确定所述样品的浓度。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一和第二体积分布为连续的体积分布。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二体积分布在产生步骤之前是未限定的。

4.根据权利要求1所述的方法，其中通过合并不互溶流体而在乳液中产生所述第一多个液滴。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述不互溶流体包括水和油。

6.根据权利要求4所述的方法，其中所述乳液包括表面活性剂。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个液滴的第二体积分布包括以下体积范围：约100纳升（nL）到约1毫微微升（fL）、约10nL到约10fL、约1nL到约100fL、约100nL到约1皮升（pL）、约10nL到约10pL、约1nL到约1pL。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述可检测试剂是荧光的。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述可检测试剂与核酸分子、肽、蛋白或其组合关联。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括进行聚合酶链反应（PCR）、滚环扩增（RCA）、基于核酸序列的扩增（NASBA）、环介导扩增（LAMP）或其组合。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述可检测试剂的浓度在至少三个数量级的动态范围内确定。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述可检测试剂的浓度在至少六个数量级的动态范围内确定。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一体积分布中的体积变化超过两倍。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一体积分布中的体积变化超过10倍或超过100倍。

15.一种采用数字化测量确定样品浓度的系统，所述系统包括：

包含具有第一体积分布的第一多个液滴的样品容器；

用于检测在第一多个液滴中的至少一个液滴内含有的可检测试剂的探测剂；以及

包括存储有可执行指令的存储装置的计算机，所述指令由处理器执行时，可以使处理器：

分析具有第二体积分布的第二多个液滴，以确定第二多个液滴中的单个液体体积以及第二多个液滴中含有可检测试剂的液滴数量，其中所述第一体积分布与第二体积分布是相同的或不同的；以及

使用第二多个液滴中的单个液滴体积和第二多个液滴中包含可检测试剂的液滴数量来确定所述样品的浓度。

16.根据权利要求15所述的系统，其中所述第一和第二体积分布为连续的体积分布。

17.根据权利要求15所述的系统，其中所述第二体积分布在产生步骤之前是未限定的。

18.根据权利要求15所述的系统，其中通过合并不互溶流体而在乳液中产生所述第一多个液滴。

19.根据权利要求18所述的系统，其中所述不互溶流体包括水和油。

20.根据权利要求15所述的系统，其中所述可检测试剂是荧光的。

21.根据权利要求20所述的系统，其中所述可检测试剂与核酸分子、肽、蛋白或其组合关联。

22.根据权利要求15所述的系统，其中所述第一多个液滴中的至少一个液滴包括来自聚合酶链反应（PCR）、滚环扩增（RCA）、基于核酸序列的扩增（NASBA）、环介导扩增（LAMP）或其组合的扩增产物。

23.根据权利要求15所述的系统，其中所述可检测试剂的浓度在至少三个数量级的动态范围内确定。

24.根据权利要求15所述的系统，其中所述可检测试剂的浓度在至少六个数量级的动态范围内确定。

25.根据权利要求15所述的系统，其中所述第一体积分布的体积变化超过两倍。

26.根据权利要求15所述的系统，其中所述第一体积分布的体积变化超过10倍或超过100倍。

27.一种用于进行样品的数字环介导扩增的方法，所述方法包括：

在微流体装置上产生所述样品的多个液滴，其中所述多个液滴中的至少一个液滴含有核酸分子；以及

在所述至少一个液滴中进行环介导扩增，以产生所述核酸分子的扩增产物。

28.根据权利要求27所述的方法，还包括扩增产物的检测。

29.根据权利要求28所述的方法，还包括：

确定多个液滴中包含扩增产物的液滴数量；以及

使用多个液滴中单个液滴的体积和多个液滴中含有核酸分子的液滴数量计算所述样品中核酸分子的浓度。

30.根据权利要求27所述的方法，其中所述微流体装置包括配置用于形成多个液滴的多个室。