KR101437498B1

KR101437498B1 - 벼키다리병균(Ｆｕｓａｒｉｕｍｆｕｊｉｋｕｒｏｉ) 신속 검출용 특이 프라이머 및 이를 이용한 균 검출방법

Info

Publication number: KR101437498B1
Application number: KR1020130122402A
Authority: KR
Inventors: 최효원; 홍성기; 김완규; 이상엽; 한성숙
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2013-10-15
Filing date: 2013-10-15
Publication date: 2014-11-03
Also published as: KR20130119408A

Abstract

본 발명은 벼키다리병균(Fusarium fujikuroi)을 신속, 정확하게 종 특이적으로 검출할 수 있는 특이 프라이머 및 이를 이용하는 균 검출방법에 관한 것이다.
본 발명의 벼키다리병균 신속 검출용 프라이머는 병원성이 없는 균주와는 반응하지 않도록 설계되었으며, 벼키다리병균과 형태적으로 비슷하여 현미경적으로 구분이 어려운 다른 Fusarium종과도 반응하지 않도록 설계되어 벼키다리병균을 종 특이적으로 검출할 수 있다. 또한, 본 발명의 벼키다리병균 신속 검출용 프라이머를 이용한 균 검출방법은 벼 종자에서 본 병원균의 검출여부를 조사하기 위하여 기존에 사용되던 blotter법 및 선택배지 치상에 의한 현미경 관찰에서 나타나는 문제점을 해결하여 보다 간편하고 정확하게 진단이 가능하며, 벼 종자에서 병원균의 감염여부를 진단하는데 필요한 소요시간을 현저히 줄어든다는 장점을 가진다.

Description

벼키다리병균(Ｆｕｓａｒｉｕｍｆｕｊｉｋｕｒｏｉ) 신속 검출용 특이 프라이머 및 이를 이용한 균 검출방법{Specific Primers For Rapid Detection Of Bakanae Disease Pathogen(Fusarium fujikuroi) And Method For Detection Using The Same}

본 발명은 벼키다리병균(Fusarium fujikuroi)을 신속, 정확하게 종 특이적으로 검출할 수 있는 특이 프라이머 및 이를 이용하는 균 검출방법에 관한 것이다.

종자전염은 식물 병의 전염방법 중 하나로서 병원균에 감염된 종자는 포장에서 전염원으로 작용할 뿐만 아니라 무병지역에서 새로운 발병의 원인이 되고, 상품가치가 하락하며, 병원균의 독소분비로 인하여 인간이나 동물에게 심각한 질병을 일으키기도 한다.

벼키다리병은 Fusarium fujikuroi Nirenberg에 의해 발생하는 대표적인 종자전염성 병해로, 육묘시부터 본답시기까지 발생하는 병해이다. 1828년에 일본에서 처음 발견되었으며, 묘가 비정상적으로 신장하는 병징때문에 Bakanae disease라 명명되었다. 벼키다리병은 90년대 후반부터 효과적인 종자소독제의 개발로 크게 문제가 되지 않았으나, 최근에는 기온상승, 친환경재배 등 여러 가지 원인으로 인해 본 병의 발생이 증가하고 있으며, 국가 보급종 종자에서도 병이 발생하여 문제시된 바 있다. 일반적으로 벼키다리병의 방제를 위해서는 종자소독과 더불어 건전종자를 사용하여야 하는데, 사용전 키다리병의 감염여부를 조사하는 것은 매우 어려운 실정이다. 따라서 파종 전, 종자에서의 정밀하고 신속한 진단은 이 병의 방제 및 관리에 있어 매우 중요하다.

종자에서 각종 병원균의 검출율을 조사하는 대표적인 방법으로는 blotter법(습지법)이 있으며, Fusarium균 선택배지를 사용하기도 한다. 그러나 이 방법으로 키다리병균의 검출율을 조사하기 위해서는 몇 가지 어려움이 있다. 첫째, 키다리병균과 형태적으로 유사한 다른 Fusarium균을 구분하기 위한 균학적 전문지식이 필요하다. 둘째, 현미경을 사용하여 조사해야 하기 때문에 그 사용법이 익숙해야 한다. 셋째, 종자를 치상하여 배양한 후 조사하기까지 적어도 7일 이상의 시간이 소요된다. 넷째, 균의 형태적 특성에 의존하여 조사하기 때문에 정확성이 떨어진다.

최근의 분자생물학적 기법이 발전함에 따라 유전자(DNA) 수준에서 생물종을 식별하는 방법을 통해 벼키다리병균의 감염여부를 진단하고자 하였다. 일반적으로, 유전자 수준에서 생물종을 식별하는 방법으로 가장 광범위하게 사용되고 있는 방법은 핵산지문법(DNA fingerprinting)이다. 이 방법은 다시 제한효소단편장다형(RFLP:Restriction Fragment Length Polymerase) 분석법, 라이보좀 구성 핵산 염기서열의 차이를 이용한 분석법, 특정 프라이머를 이용한 PCR(polymerase chain reaction) 진단법 등으로 구분된다. 여기서 상기 PCR법은 10~20mer로 구성된 특정 DNA 단편(프라이머(primer))을 분석하고자 하는 게놈 유전자(genomic DNA)에 접촉(annealing)한 후, DNA 중합효소(polymerase)를 첨가하고 합성반응을 반복적으로 행하게 되면, 프라이머가 결합된 영역이 급속히 증폭하게 되며, 그 PCR 증폭산물을 아가로스 겔(agarose gel) 또는 아크릴아마이드 겔(acrylamide gel)에 전기영동하고 에티디움브로마이드(Ethidium bromide) 및 은염색(silver stain)으로 DNA를 염색한 후 나타나는 DNA 밴드의 유무 혹은 형태의 차이와 같은 종의 DNA 다형성을 검출하는 진단방법이다.

따라서, 종래의 문제점을 해결하기 위하여 신속하고 정확한 벼키다리병 진단법의 필요성이 대두되고 있으며, 따라서 본 병원균을 종 특이적으로 검출할 수 있는 특이 프라이머를 개발하고 이를 이용한 벼 종자에서의 균 검출법이 요구된다.

Applied and Environmental Microbiology, Vol. 74, pp. 7790-7801

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 목적은 종래의 문제점을 해결하고 병원성이 없는 균주와는 반응하지 않으면서 벼에 키다리병 증상을 나타내는 균주를 종 특이적으로 검출할 수 있도록 설계된 벼키다리병균 신속 검출용 프라이머 및 이를 이용하여 보다 신속, 정확하게 진단하는 벼키다리병균 검출 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 프라이머(primer) 또는 서열번호 2로 표시되는 프라이머를 이용하여 벼키다리병균의 감염여부를 진단하는 벼키다리병균(Fusarium fujikuroi) 신속 검출용 특이 프라이머를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 포워드 프라이머(Forward primer) 및 서열번호 2로 표시되는 리버스 프라이머(Reverse primer)를 한 세트로 이용하여 벼 종자에서 벼키다리병균을 검출하는 벼키다리병균 신속검출용 프라이머를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 벼키다리병균 신속검출용 프라이머를 이용하여 벼에서 벼키다리병균을 종 특이적으로 검출하는 벼키다리병균 신속 검출용 특이 프라이머를 이용한 균 검출 방법을 제공한다. 보다 구체적으로는, 벼에서 벼키다리병 균 검출 방법으로서,

(S1) 벼 종자에서 게놈 DNA를 추출하는 단계;

(S2) 상기 게놈 DNA를 주형으로 이용하고, 서열번호 1을 포워드(Forward) 프라이머, 서열번호 2를 리버스(Reverse) 프라이머로 이용하여 PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭시키는 단계;

(S3) 상기 증폭시킨 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 벼키다리병균 검출 방법을 제공한다.

본 발명의 벼키다리병균 신속 검출용 프라이머는 병원성이 없는 균주와는 반응하지 않도록 설계되었으며, 벼키다리병균과 형태적으로 비슷하여 현미경적으로 구분이 어려운 다른 Fusarium종과도 반응하지 않도록 설계되어 벼키다리병균을 종 특이적으로 검출할 수 있다. 또한, 본 발명의 벼키다리병균 신속 검출용 프라이머를 이용한 균 검출방법은 벼 종자에서 본 병원균의 검출여부를 조사하기 위하여 기존에 사용되던 blotter법 및 선택배지 치상에 의한 현미경 관찰에서 나타나는 문제점을 해결하여 보다 간편하고 정확하게 진단이 가능하며, 벼 종자에서 병원균의 감염여부를 진단하는데 필요한 소요시간을 현저히 줄어든다는 장점을 가진다.

도 1은 본 발명의 진단 대상 유전자로 선정한 지베렐린(gibberellic acid, GA) 생합성 유전자 클러스터(cluster)(S. Malonek et al., 2005)를 나타낸 것이다.
도 2는 벼 종자에서 분리한 8개의 Fusarium균을 주형으로 이용하고, 상기 표 2에 설계한 벼키다리병균 검출용 프라이머 18 세트(set)의 PCR 분석 결과를 나타낸 것이다. 여기서, M은 100bp DNA 분자량 마커를 나타내며, 1 내지 5는 병원성균주, 6 내지 8은 비병원성 균주이다.
도 3은 서열번호 1(BFsp F) 및 서열번호 2(BFsp R) 프라이머를 이용한 벼키다리병균(F. fujikuroi)의 PCR 진단 결과를 나타내었다. 여기서, 주형으로 각각 1: F. annulatum, 2-5: F. fujikuroi , 6-7: F. nygamai , 8-11: F. proliferatum, 12: F. sacchari, 13: F. subglutinans, 14: F. thapsinum , 15-16: F. verticillioides, 17: F. concolor, 18-19: F. globosum , 20: F. nisikadoi , 21-22 : F. asiaticum . 의 게놈 DNA를 사용하였다.
도 4는 본 발명의 벼키다리병균 특이 프라이머의 annealing 온도에 따른 PCR 분석 결과이다. (A): 국내 균주, (B): 미국 ARS collection center 분양균주를 이용한 것이다.
도 5는 본 발명의 벼키다리병균 특이 프라이머를 이용한 벼 종자에서의 균 검출방법의 모식도를 나타낸 것이다.

본 발명은 서열번호 1로 표시되는 프라이머(primer) 또는 서열번호 2로 표시되는 프라이머를 이용하여 벼키다리병균의 감염여부를 진단하는 벼키다리병균(Fusarium fujikuroi) 신속 검출용 특이 프라이머를 제공한다. 보다 바람직하게는 상기 서열번호 1로 표시되는 포워드 프라이머(Forward primer) 및 상기 서열번호 2로 표시되는 리버스 프라이머(Reverse primer)를 한 세트로 이용하여 벼 종자에서 키다리병균을 검출하는 벼키다리병균 신속 검출용 특이 프라이머에 관한 것이다.

상기 벼키다리병균 신속 검출용 특이 프라이머는 벼에서 벼키다리병균(Fusarium fujikuroi )을 종 특이적으로 검출하여 벼키다리병균의 감염여부를 진단할 수 있다.

벼키다리병균은 지베렐린(gibberellic acid, GA)을 생성하여 병징을 나타내며, 벼키다리병균과 분류학적으로 유연관계가 높은 종들은 지베렐린 생합성 유전자 클러스터(cluster)를 전체 혹은 일부 포함하는 것으로 알려져 있다. 이들 중 벼키다리병균만이 지베렐린 생합성 유전자를 발현하며, 지베렐린을 형성한다. 따라서, 본 발명의 벼키다리병균(Fusarium fujikuroi) 신속 검출용으로 개발된 특이 프라이머는 지베렐린 생합성 유전자 클러스터의 염기서열을 분석하여 프라이머를 디자인하여 병원성 검정 결과와의 일치 여부를 조사하여 벼에 벼키다리병 증상을 나타내는 균주를 검출할 수 있도록 설계되었으며, 병원성이 없는 균주와는 반응하지 않도록 설계되었다. 또한, 벼키다리병균과 근연관계이거나 형태적으로 비슷한 11개의 Fusarium종과는 반응하지 않도록 설계되었다.

본 발명에서 용어 “프라이머(primer)”는 특정 유전자 서열에 대하여 상보적인 단일 가닥, 즉 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장산물의 합성을 위한 개시점으로 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 하며, 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 수 있다.

또한, 본 발명의 벼키다리병균 신속 검출용 특이 프라이머를 이용하여 벼에서 벼키다리병균을 종 특이적으로 검출하는 벼키다리병균 신속 검출용 특이 프라이머를 이용한 균 검출 방법을 제공한다.

벼키다리병균 신속 검출용 특이 프라이머를 이용한 균 검출 방법으로서,

(S1) 벼 종자에서 게놈 DNA를 추출하는 단계;

(S3) 상기 증폭시킨 산물을 검출하는 단계;를 포함한다.

상기 (S1)단계의 벼에서 게놈 DNA(genomic DNA)를 추출하는 방법은 당업계에서 알려진 통상의 방법을 이용할 수 있으며, 예컨대 벼의 종자를 PDB(potato dextrose broth) 배지에서 25 내지 30℃ 온도에서 1 내지 3일간 배양하여, 마쇄한 후, 추출버퍼를 이용하여 DNA를 추출하는 것이 바람직하다.

상기 (S2)단계에서의 PCR을 수행하기 위한 시약은 dNTPs, DNA polymerase, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 상기 (S2)단계에서 본 발명의 프라이머를 이용한 PCR 반응 조건 중 어닐링(annealing) 온도는 광범위한 온도범위에서 진단이 가능하나, 50 내지 62℃인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 54 내지 58℃이며, 58℃인 것이 가장 바람직하다.

또한, 상기 증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 및 인광 측정으로부터 선택된 하나이상의 방법으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 주의 하나로서, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아마이드 겔 전기영동을 이용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 이용하여 더욱 상세하게 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로서 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되지 않고 다양하게 수정 및 변경될 수 있다.

실시예 1 : 벼키다리병균 ( Fusarium fujikuroi ) 검출용 프라이머의 설계

a. 벼키다리병균 검출을 위한 대상 유전자의 선정

벼키다리병균은 지베렐린(gibberellic acid, GA)을 생성하여 병징을 나타내며, 벼키다리병균과 분류학적으로 유연관계가 높은 종들은 GA 생합성 유전자 클러스터(cluster)를 전체 혹은 일부 포함하는 것으로 알려져 있다. 이들 중 벼키다리병균만이 GA 생합성 유전자를 발현하며, GA를 형성한다. 따라서 본 실험에서는 GA 생합성 유전자 클러스터(cluster)를 진단대상 유전자로 선정하였다(도 1).

b. 벼키다리병균 ( Fusarium fujikuroi ) 검출용 프라이머의 설계

벼키다리병균 검출용 프라이머는 지베렐린 생산 관련 유전자를 기반으로 디자인하여 벼에 키다리병 증상을 나타내는 균주를 검출할 수 있도록 설계하였다. 따라서, 벼키다리병균 검출용 프라이머 서열은 하기 표 1과 나타낸 것과 같이 지베렐린 생합성 유전자 클러스터 부위에서 9개의 포워드 프라이머(forward primer)와 13개의 리버스 프라이머(reverse primer)를 설계하였다.

프라이머		염기서열(5'-3')	길이 (bp)	Tm값 (℃)
Forward	GfIGS F1	TCGGCAGAGAGAACTCACTT	20	57.3
	GfSMT F1	TCGGTTCATTCTTGGTAGGA	20	55.3
	Ffsp F1	TCGGCAGAGAGAACTCACTT	20	68.0
	Gfcpsintron3 F	AGAATAGTTAGCGAGTGCT	19	52.4
	Gfcpsexon4 F	ACTGTCGTTCCAGAGCTTCG	20	59.4
	GfDesIGS F	TGCTTCGGTCACTGATGATG	20	59.7
	GfP4504IGS F	TCGGCAGAGAGAACTCACTTA	21	57.9
	Ffsp F	TGGGCTATGAGTTTGCTCAGT	21	59.9
	BFsp F	TGAGACTTGTGTCTGAGAGCT	21	55.2
Reverse	GfIGS R1	GCGGAACGTCTGAAATGCCT	20	59.4
	GfIGS R2	GATAGACAAGAGAGGATAGT	20	53.2
	GfSMT R1	CGTTCCTCATCGTCATCATC	20	57.0
	Ffsp R2	ACTGTGATAACATCATAACT	20	54.0
	Ffsp R3	GCGGAACGTCTGAAATGCCT	20	75.0
	Ffsp R1	GATAGACAAGAGAGGATAGT	20	54.0
	Gfcpsexon 2R	CGCGGCTTGTCAACTATAC	19	56.7
	Gfcpsexon 4R	AGGACAACAGTCGCTTCTCC	20	59.4
	GfDes R	AGACTCCGGATGAGGTTCTC	20	59.4
	GfDesIGS R	TTGTTCCAGGTGCTGACTTG	20	57.3
	GfP4504IGS R	GTCCTAGTCAATTGCCGTGTC	21	59.8
	Ffsp R	TAACTCCTGCGGTTCATTCA	20	59.3
	BFsp R	GATAACATCATAACTCCTGCG	21	54.9

c. 설계한 프라이머의 PCR 증폭 예상산물

상기 표 1의 설계한 프라이머를 이용하여 표2와 나타낸 것과 같이 13개 프라이머 세트(set)를 만들었으며, 이에 대한 PCR 증폭 예상산물의 크기를 표 2에 나타내었다.

세트 번호	프라이머		예상 증폭산물(bp)
세트 번호	Forward	Reverse	예상 증폭산물(bp)
(A)	GfIGS F1	GfIGS R1	400
(B)	GfIGS F1	GfIGS R2	413
(C)	GfSMT F1	GfSMT R1	450
(D)	Ffsp F1	Ffsp R2	537
(E)	Ffsp F1	Ffsp R3	318
(F)	Ffsp F1	Ffsp R1	255
(G)	Gfcpsintron3 F	Gfcpsexon2 R	430
(H)	Gfcpsexon4 F	Gfcpsexon 4R	440
(I)	GfDesIGS F	GfDes R	472
(J)	GfDesIGS F	GfDesIGS R	160
(K)	GfP4504IGS F	GfP4504IGS R	640
(L)	Ffsp F	Ffsp R	446
(M)	BFsp F	BFsp R	547

실시예 2 : 벼키다리병균 검출용 프라이머의 선발

a. 병원성이 확인된 균주를 이용한 1차 선발

표 2에 나타낸 것과 같이 설계된 13개 프라이머 세트의 PCR 증폭 특성을 알아보기 위하여 1차적으로 2006년도에 벼에서 분리한 8개의 Fusarium균을 대상으로 실험하였다. 상기 8개 균주의 병원성 검정 결과, 5개 균주는 전형적인 병징을 나타내는 병원성 균주이며, 3개 균주는 병원성이 없는 균주로 확인되었다. 이들 균주에서 게놈 DNA(genomic DNA)를 추출하여 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하였다. 도 2의 결과를 살펴보면 BFsp F/BFsp R 프라이머((M) set)를 이용한 것이 병원성 검정 결과와 일치하는 것으로 나타내어 본 프라이머를 벼키다리병균 검출용 프라이머로 1차 선발하였다(도 2).

b. 표준균주를 이용한 2차 선발

1차 선발된 BFsp F/BFsp R 프라이머 세트의 2차 확인을 위하여 미국 ARS collection center에서 분양받은 균주를 사용하였다. 하기 표 3에는 벼키다리병균 검출용 프라이머의 확인을 위해 사용한 Fusarium 균주명 및 기주를 나타내었다. 벼를 비롯한 화곡류에서 분리된 12종의 Fusarium균의 게놈 DNA(genomic DNA)를 추출하고 선발된 프라이머(BFsp F/BFsp R 프라이머 세트)를 이용하여 PCR 검정하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다. 그 결과, 레인(lane) 2, 3, 4, 5에서만 밴드가 나타났으며, 이는 선발된 BFsp F/BFsp R 프라이머는 F. fujikuroi외의 다른 균에서는 증폭되지 않는 것을 확인하였다.

번호	종명	기주	번호	종명	기주
1	Fusarium annulatum	벼	12	Fusarium sacchari	수수
2	Fusarium fujikuroi	벼	13	Fusarium subglutinans	옥수수
3	Fusarium fujikuroi	벼	14	Fusarium thapsinum	수수
4	Fusarium fujikuroi	벼	15	Fusarium verticillioides	벼
5	Fusarium fujikuroi	벼	16	Fusarium verticillioides	옥수수
6	Fusarium nygamai	벼	17	Fusarium concolor	맥류
7	Fusarium nygamai	수수	18	Fusarium globosum	밀
8	Fusarium proliferatum	옥수수	19	Fusarium globosum	옥수수
9	Fusarium proliferatum	수수	20	Fusarium nisikadoi	밀
10	Fusarium proliferatum	옥수수	21	Fusarium asiaticum	보리
11	Fusarium proliferatum	밀	22	Fusarium asiaticum	밀

실시예 3 : 선발된 프라이머의 PCR 조건 확립

본 발명에서 선발된 프라이머의 PCR 반응조건을 최적화하기 위하여, 상기 선발된 프라이머 BFsp F/BFsp R의 annealing 온도에 따른 PCR 반응을 조사하였다. 이때, 주형은 국내 균주(경북 상주시에서 채집한 병원성 균주 CF283)와 미국 ARS collection center 분양균주(Fusarium fujikuroi NRRL21010)를 각각 이용하였으며, 그 PCR 분석 결과를 도 4에 기재하였다. 도 4에 나타난 것과 같이 BFsp F/BFsp R 프라이머 세트는 광범위한 온도범위에서 진단이 가능한 것으로 나타났으며, 최적 annealing 온도는 약 54-58℃로 나타났다.

실시예 4 : 선발된 프라이머를 사용한 벼 종자에서의 균 검출방법 확립

선발된 프라이머를 적용하여 벼 종자에서의 벼키다리병균 감염 여부를 조사하는 방법을 확립하였다. 종자 1알을 PDB(potato dextrose broth) 배지 (Potato Starch 4g, Dextrose 20g) 50μl에 넣어 2일간 배양한 후, 곱게 마쇄하고 추출 버퍼(200mM Tris-HCl(pH8.0), 300mM NaCl, 25mM EDTA(pH8.0), 1% Sodium dodecylsulfate)를 이용하여 DNA를 추출하였다. 이를 선발 프라이머인 BFsp F(5'-TGAGACTTGTGTCTGAGAGCT-3') 및 BFsp R(5'-GATAACATCATAACTCCTGCG-3')을 이용하여 PCR 증폭한 결과, 인위적으로 접종한 이병종자에서는 81.3%의 검출율을 나타내었으며, 대조로 사용한 건전종자에서는 2.1%의 균검출율을 나타내었다(도 5).

상기와 과정을 통하여 최종적으로 BFsp F/BFsp R를 하나의 세트 프라이머로 이용하여 본 발명의 벼키다리병균 검출용 특이 프라이머 및 이를 이용한 균 검출 방법을 완성하였다. 본 발명의 선발된 프라이머 세트의 특성을 표 4에 나타내었다.

서열번호	구 분	프라이머	염 기 서 열(5′- 3′)	길이	예상 산물	최적반응 온도
1	Forward	BFspF	TGAGACTTGTGTCTGAGAGCT	21	547bp	58℃
2	Reverse	BFspR	GATAACATCATAACTCCTGCG	21	547bp	58℃

따라서, 상기 벼키다리병균 검출용 특이 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 벼 종자에 벼키다리병균이 감염되었는지 여부를 종 특이적으로, 신속 정확하게 검출할 수 있다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Specific Primers For Rapid Detection Of Bakanae Disease Pathogen(Fusarium fujikuroi) And Method For Detection Using The Same <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Specific Primers For Rapid Detection Of Bakanae Disease Pathogen(Fusarium fujikuroi) - BFspF <400> 1 tgagacttgt gtctgagagc t 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Specific Primer For Rapid Detection Of Bakanae Disease Pathogen(Fusarium fujikuroi) - BFspR <400> 2 gataacatca taactcctgc g 21

Claims

서열번호 1로 표시되는 포워드(forward) 프라이머 및 서열번호 2로 표시되는 리버스(reverse) 프라이머를 한 세트로 이용하여 벼 종자에서 벼키다리병균인 Fusarium fujikuroi을 특이적으로 검출하는 것을 특징으로 하는 벼키다리병균 신속 검출용 특이 프라이머 조합.
청구항 1에 기재된 벼키다리병균 신속 검출용 특이 프라이머 조합을 이용한 벼키다리병균 검출 방법.
(S1) 벼 종자에서 게놈 DNA를 추출하는 단계;
(S2) 상기 게놈 DNA를 주형으로 이용하고, 서열번호 1을 포워드 프라이머, 서열번호 2를 리버스 프라이머로 이용하여 PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭시키는 단계;
(S3) 상기 증폭시킨 산물을 검출하는 단계;를 포함하며,
병키다리병균인 Fusarium fujikuroi을 특이적으로 검출하는 것을 특징으로 하는, 벼키다리병균 신속 검출용 특이 프라이머를 이용한 벼키다리병균 검출 방법.
청구항 3에 있어서, 상기 (S1)단계는 벼의 종자를 PDB(potato dextrose broth) 배지에서 25 내지 30℃ 온도에서 1 내지 3일간 배양하여, 마쇄한 후, 추출버퍼를 이용하여 DNA를 추출하는 것을 특징으로 하는 벼키다리병균 신속 검출용 특이 프라이머를 이용한 벼키다리병균 검출 방법.
청구항 3에 있어서, 상기 (S2)단계에서 PCR 반응 조건 중 어닐링(annealing) 온도는 50 내지 62℃인 것을 특징으로 하는 벼키다리병균 신속 검출용 특이 프라이머를 이용한 벼키다리병균 검출 방법.
청구항 3에 있어서, 상기 증폭시킨 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 및 인광 측정으로부터 선택된 하나이상의 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 벼키다리병균 검출 방법.