CN111378776A - 一种用于检测水稻恶苗病藤仓赤霉菌的rpa引物及检测方法 - Google Patents

一种用于检测水稻恶苗病藤仓赤霉菌的rpa引物及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测水稻恶苗病病原藤仓赤霉菌的RPA引物及检测方法，属于生物安全技术领域。所述的RPA引物如下，RPA上游引物序列Ff‑PRA‑F如SEQ ID No.1所示，其下游引物序列Ff‑PRA‑R如SEQ ID No.2所示。本发明还提供基于所述RPA引物形成的检测方法。本发明首次将RPA技术应用到藤仓赤霉菌的分子检测，其兼具特异性强、灵敏度高、实用性好、对仪器设备要求较低的特点，为水稻恶苗病的早期诊断、病害防治和农药减量使用提供新方法。

Description

一种用于检测水稻恶苗病藤仓赤霉菌的RPA引物及检测方法
技术领域
本发明属于生物安全技术领域，具体地说，涉及一种用于检测水稻恶苗病病原藤仓赤霉菌的RPA引物及检测方法。
背景技术
由藤仓赤霉菌(Fusarium fujikuroi)引起的水稻恶苗病是水稻上一种系统性侵染病害，发病严重的田块可减产50％以上。另外，藤仓赤霉菌在侵染过程中会产生大量毒素，造成食品安全问题。传统的藤仓赤霉菌的检测方法主要包括有的形态学鉴定和基于PCR技术的分子检测，但由于这些技术需要专业形态学知识，或诊断试剂长，或精密的科学仪器，不适合非专业人员操作，或在基础设施和设备较落后的条件下使用，因此建立藤仓赤霉菌的快速诊断技术有十分重要的意义。
重组酶聚合酶等温扩增的技术(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)是一种核酸等温扩增技术。利用RPA进行核酸检测，仅需一对引物，在37℃-42℃的恒温条件下反应10min-15min，即实现目的片段的特异性扩增，且在此过程中，无PCR仪等精密仪器。相比目前应用较多的环等温扩增技术(LAMP)，PRA反应具有仅需一对引物，反应时间短，扩增后产生的单一目的条带可用于测序等诸多有点，具有十分广阔的应用前景，其被称为可替代PCR的核酸检测技术。
目前，RPA技术已广泛应用于病毒、细菌、支原体和寄生虫的快速检测中，但尚未见其在藤仓赤霉菌检测方面的报道。
发明内容
1、要解决的问题
针对藤仓赤霉菌尚无有效进行RPA技术检测的问题，本发明提供一种用于检测藤仓赤霉菌的RPA引物及检测方法，它可以提高藤仓赤霉菌检测的特异性和灵敏度，为水稻恶苗病的早期诊断提供新方法。
2、技术方案.
为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案。
一种用于检测水稻恶苗病病原藤仓赤霉的RPA引物，
所述的RPA引物的上游引物Ff-PRA-F如SEQ ID No.1所示，
所述的RPA引物的下游引物Ff-PRA-R如SEQ ID No.2所示；
一种用于检测水稻恶苗病病原藤仓赤霉的检测方法，
包括以下步骤：
(1)提取样品中的DNA；
(2)以步骤(1)提取的DNA作为待检测DNA模板，采用权利要求1所述的RPA引物，在RPA反应管中进行RPA扩增反应；
(3)分析RPA扩增产物。
上述用于检测水稻恶苗病病原藤仓赤霉菌的检测方法中，步骤(1)中所述的样品为水稻植株样本或待测病原菌培养物。
上述用于检测水稻恶苗病病原藤仓赤霉菌的检测方法中，所述的RPA引物的检出下限为10pg DNA/μL。
上述用于检测水稻恶苗病病原藤仓赤霉菌的检测方法中，步骤(2)中RPA扩增反应的反应体系以50μL计为：
Figure BDA0002248391540000021
上述用于检测水稻恶苗病病原藤仓赤霉菌的检测方法中，步骤(2)中RPA扩增反应的反应条件为：37℃-39℃下反应20min-40min，随后冰上终止反应。
上述用于检测水稻恶苗病病原藤仓赤霉菌的检测方法中，步骤(3)中分析RPA扩增产物的方法包括如下步骤：取RPA扩增产物5μL，使用琼脂糖凝胶电泳检测，如果获得高度为262bp的单一条带，说明待测样本中含有藤仓赤霉菌。
3、有益效果
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明首次将RPA技术应用到藤仓赤霉菌的分子检测，具备特异性强、灵敏度高、实用性好、对仪器设备要求较低的特点，为水稻恶苗病的诊断、病害防治和农药减量使用提供新方法；其中RPA引物基于藤仓赤霉菌保守基因序列设计，特异性较高、检测准确率高；其中检测方法具有较高的检测灵敏度，同时可在39℃下和30min内完成对藤仓赤霉菌的恒温扩增，无需PCR仪，检测效率远高于常规分子检测方法，解决了现有常规技术存在检测方法所需时间较长、对仪器设备依懒性高、检测结果假阳性高的现象。
附图说明
图1为实施例1中水稻恶苗病病原藤仓赤霉菌RPA引物的筛选结果图；
图2为实施例2中水稻恶苗病病原藤仓赤霉菌RPA引物的特异性检测；
图3为实施例3中水稻恶苗病病原藤仓赤霉菌RPA引物的灵敏度检测。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
以下实施例中使用的RPA反应管以及反应缓冲液均购自英国TwistDX公司，商品编号TANFO02KIT；其中，重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶以RPA冻干粉状态存在于RPA反应管中，使用时，用反应缓冲液溶解，整个RPA扩增反应在RPA反应管中进行。
其中藤仓赤霉菌RPA扩增产物的获取方法，包括以下步骤：
(1)提取样品中的DNA；具体为将适量菌株接种于PDA培养基上，28℃培养5天，刮下培养基上的菌丝，放入研钵中，加入适量的石英砂，倒入液氮研磨，研磨后的匀浆使用动物基因组DNA快速抽提试剂盒(上海生工)提取DNA；
(2)以步骤(1)提取的DNA作为待检测DNA模板，采用所述的RPA引物，在RPA反应管中进行RPA扩增反应；
步骤(2)中RPA扩增反应的反应条件为：39℃下反应30分钟，随后冰上终止反应；
步骤(2)中RPA扩增反应的反应体系以50μL计为：
Figure BDA0002248391540000031
实施例1
水稻恶苗病病原藤仓赤霉菌RPA引物的筛选
以藤仓赤霉菌TEF-1基因(GeneBank No.GQ848524.1)序列为靶标，根据RPA引物的设计原则，设计用于RPA试剂盒(TwistAmp nfo)的引物并进行筛选，得到扩增效率高、灵敏度和特异性最好的引物对。筛选得到的最佳引物(即为RPA引物的正向引物和反向引物)序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示：
正向引物Ff-RPA-F(SEQ ID No.1)：5’-GCTTATCTGTCATCGTGATCCTGACCAAGATC-3’，
反向引物Ff-RPA-R(SEQ ID No.2)：5’-TGGACAGGAAAGGGCAAAACGCGCCCATCACTCG-3’：
上述引物的RPA扩增产物(由藤仓赤霉菌RPA扩增产物的获取方法获得)进行琼脂糖凝胶的电泳检测，图1中的标号“2”指的是上述引物的检测结果。如图1所示，该引物的RPA扩增产物条带最清晰(262bp位置处的单一条带)且没有杂带。上述扩增产物为单一条带，不像LAMP扩增产物为弥散条带，因此扩增产物可根据条带高度确定结果，且可用于测序。
此外，发明人在筛选RPA引物的过程中还设计了另外两组引物，它们的序列如下：
第一组
正向引物Ff-RPA-F2(SEQ ID No.3)：5’-CCCTCGACGATGAGCTTATCTGTCATCGTGATC-3’，
反向引物Ff-RPA-R2(SEQ ID No.4)：5’-TAGTTTGACACGTGACAATGCGCTCATTGAGGT-3’；
第二组
正向引物Ff-RPA-F3(SEQ ID No.5)：5’-AGTGATGGGCGCGTTTTGCCCTTTCCTGTCCA-3’，
反向引物Ff-RPA-R3(SEQ ID No.6)：5’-TTAGTATGAATAAGTAGAATGACGCATGAGCG-3’。
上述两组引物的RPA扩增产物进行琼脂糖凝胶的电泳检测，如图1所示，图1中的标号“1”、“2”、“3”分别指的是Ff-RPA-F2(SEQ ID No.3)和Ff-RPA-R2(SEQ ID No.4)扩增产物、Ff-RPA-F(SEQ ID No.1)和Ff-RPA-R(SEQ ID No.2)扩增产物、以及Ff-RPA-F3(SEQ IDNo.5)和Ff-RPA-R3(SEQ ID No.6)扩增产物，“1”泳道中的RPA扩增产物条带出现不清晰的问题，“3”泳道中的RPA扩增产物在500bp高度有一条微弱杂带，只有“2”泳道产物呈现单一明亮条带。因此本发明选取了Ff-RPA-F和Ff-RPA-R引物对进行下一步测试实验。
综上所述，可见本申请的引物对藤仓赤霉菌的扩增特异性强。
实施例2
水稻恶苗病病原藤仓赤霉菌RPA引物的特异性检测
参考水稻恶苗病病原藤仓赤霉菌RPA扩增产物的获取方法，其中引物选择正向引物Ff-RPA-F、反向引物Ff-RPA-R，其中样品分别为藤仓赤霉菌、禾谷镰孢菌、假禾谷镰孢菌、茄腐镰孢菌、尖孢镰孢菌、串珠镰孢菌、雪腐镰刀菌、平脐蠕孢菌。
如图2所示，图2中的标号“1”指的是藤仓赤霉菌的检测结果(阳性对照)，图2中的标号“2”指的是禾谷镰孢菌的检测结果，图2中的标号“3”指的是假禾谷镰孢菌的检测结果，图2中的标号“4”指的是茄腐镰孢菌的检测结果，图2中的标号“5”指的是尖孢镰孢菌的检测结果，图2中的标号“6”指的是串珠镰孢菌的检测结果，图2中的标号“7”指的是雪腐镰刀菌的检测结果，图2中的标号“8”指的是平脐蠕孢菌的检测结果。
上述检测结果表明，仅藤仓赤霉菌作为样品(DNA模板)才能扩增出特异性的目标条带，而其他样品虽然属于藤仓赤霉菌亲缘性较近的菌，但依旧没能有效扩增出来；这表明本申请的RPA引物的特异性高。
实施例3
水稻恶苗病病原藤仓赤霉菌RPA引物的灵敏度检测
参考水稻恶苗病病原藤仓赤霉菌RPA扩增产物的获取方法，其中引物选择正向引物Ff-RPA-F、反向引物Ff-RPA-R，其中原藤仓赤霉菌的基因组DNA，按10倍梯度依次稀释为10ng/μL、1pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL。
如图3所示，其标号“100fg”、“1pg”、“10pg”、“100pg”、“1ng”、“10ng”分别指的是不同浓度(100fg μL、1pg/μL、10pg/μL、100pg/μL、1ng/μL、10ng/μL)基因组DNA的检测结果。
上述检测结果图表明，水稻恶苗病病原藤仓赤霉菌DNA的检出下限为10pg DNA/μL；这表明本申请的RPA引物和探针具有较高的检测灵敏度。
综上所述，由实施例1-3可见，本发明首次将RPA技术应用到水稻恶苗病病原藤仓赤霉菌的分子检测，具备特异性强、灵敏度高、实用性好、对仪器设备要求较低的特点，为水稻恶苗病的诊断、病害防治和农药减量使用提供新方法；其中RPA引物基于藤仓赤霉菌保守基因序列设计，特异性较高、检测准确率高；其中检测方法具有较高的检测灵敏度，同时可在39℃下和30min内完成对藤仓赤霉菌的恒温扩增，无需PCR仪，检测效率高于常规分子检测方法，解决了现有常规技术存在检测方法所需时间较长、对仪器设备依懒性高、检测结果假阳性高的现象，为水稻恶苗病的快速检测提供有力技术支持。
以上内容是结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，不能认定本发明具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的构思的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明所提交的权利要求书确定的保护范围。
Figure BDA0002248391540000061
Figure BDA0002248391540000071
序列表
<110> 安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所
<120> 一种用于检测水稻恶苗病藤仓赤霉菌的RPA引物及检测方法
<140> 2019110338642
<141> 2019-10-25
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 藤仓赤霉菌(Fusarium fujikuroi)
<400> 1
gcttatctgt catcgtgatc ctgaccaaga tc 32
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> 藤仓赤霉菌(Fusarium fujikuroi)
<400> 2
tggacaggaa agggcaaaac gcgcccatca ctcg 34
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> 藤仓赤霉菌(Fusarium fujikuroi)
<400> 3
ccctcgacga tgagcttatc tgtcatcgtg atc 33
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> 藤仓赤霉菌(Fusarium fujikuroi)
<400> 4
tagtttgaca cgtgacaatg cgctcattga ggt 33
<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> 藤仓赤霉菌(Fusarium fujikuroi)
<400> 5
agtgatgggc gcgttttgcc ctttcctgtc ca 32
<210> 6
<211> 32
<212> DNA
<213> 藤仓赤霉菌(Fusarium fujikuroi)
<400> 6
ttagtatgaa taagtagaat gacgcatgag cg 32

Claims (7)

1.一种用于检测水稻恶苗病病原藤仓赤霉的RPA引物，其特征在于：
所述的RPA引物的上游引物Ff-PRA-F如SEQ ID No.1所示，
所述的RPA引物的下游引物Ff-PRA-R如SEQ ID No.2所示。
2.一种用于检测水稻恶苗病病原藤仓赤霉的检测方法，其特征在于：
包括以下步骤：
(1)提取样品中的DNA；
(2)以步骤(1)提取的DNA作为待检测DNA模板，采用权利要求1所述的RPA引物，在RPA反应管中进行RPA扩增反应；
(3)分析RPA扩增产物。
3.根据权利要求2所述的用于检测水稻恶苗病病原藤仓赤霉菌的检测方法，其特征在于：步骤(1)中所述的样品为水稻植株样本或待测病原菌培养物。
4.根据权利要求2所述的用于检测水稻恶苗病病原藤仓赤霉菌的检测方法，其特征在于：所述的RPA引物的检出下限为10pg DNA/μL。
5.根据权利要求2所述的用于检测水稻恶苗病病原藤仓赤霉菌的检测方法，其特征在于：步骤(2)中RPA扩增反应的反应体系以50μL计为：
Figure FDA0002248391530000011
6.根据权利要求2所述的用于检测水稻恶苗病病原藤仓赤霉菌的检测方法，其特征在于：步骤(2)中RPA扩增反应的反应条件为：37℃-39℃下反应20min-40min，随后冰上终止反应。
7.根据权利要求2所述的用于检测水稻恶苗病病原藤仓赤霉菌的检测方法，其特征在于：步骤(3)中分析RPA扩增产物的方法包括如下步骤：取RPA扩增产物5μL，使用琼脂糖凝胶电泳检测，如果获得高度为262bp的单一条带，说明待测样本中含有藤仓赤霉菌。
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