CN103352078B - 一种基于lamp技术检测大豆尖镰孢菌的方法及使用的引物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于LAMP技术检测大豆尖镰孢菌的方法及使用的引物组合物。一种基于LAMP技术检测大豆尖镰孢菌的引物组合物，由大豆尖镰孢LAMP分子检测的四条特异性引物FIP、BIP、F3、B3，以及两条用于加快反应速度的环引物LF、LB组成。一种基于LAMP技术检测大豆尖镰孢菌的方法，使用本发明提供的引物组合物对待检DNA进行环介导等温扩增，肉眼或在245nm波长紫外光照射下观测，以SYBR Green I的颜色变化和荧光强弱做为结果判定标准。本发明提供了大豆尖镰孢新的分子检测方法及引物组合物，对大豆尖镰孢进行LAMP检测，检测周期短、准确性高、灵敏性高、肉眼观察检测结果。

Description

一种基于LAMP技术检测大豆尖镰孢菌的方法及使用的引物组合物

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种基于LAMP技术检测大豆尖镰孢菌的方法及使用的引物组合物。

背景技术

大豆枯萎病又称萎蔫病、黄叶病、根腐病，是一种分布较广、危害较重、防治困难的世界性土传病害。美国Cromwell于1917年首次报道因镰孢菌引起大豆枯萎病[2]。目前，该病害在中国[19,22,23]、美国[7,13]、印度、菲律宾及日本等国每年均有不同程度的发生，严重影响大豆的产量，对农业生产造成巨大的经济损失。在我国，东北大豆产区枯萎病发生较为严重，王昌家等于1997年对黑龙江省部分农场2314公顷种植面积大豆进行病害调查时发现，大豆枯萎病株面积达2036公顷，占调查面积的88%；发病程度多为单株零星分布，病株率一般在1‰～6%，少数为点片发生。部分地区大豆田因连作多年，枯萎病发生严重，死苗达30%以上。幼苗、幼株患病造成缺苗断垄，成株患病秕荚增多，百粒重降低50%，减产70%以上[20]。

近年来，随着大豆种植面积不断扩大，大豆枯萎病的发生呈扩大蔓延、加重危害的趋势，全国各大豆产区均有枯萎病的发生，对大豆生产造成很大威胁。为了阻止大豆枯萎病传播范围的不断扩大，使大豆枯萎病得到控制，需要对其进行快速、准确地检测。

大豆枯萎病可由多种镰孢菌侵染引起，迄今中国已报道引起大豆枯萎病的镰孢菌有尖镰孢菌（F.oxysporum）、茄腐镰孢菌（F.solani）、木贼镰孢菌（F.equiseti）、禾谷镰孢菌（F.graninearum）、燕麦镰孢菌（F.aveneum）、半裸镰孢菌（F.semitectum）等。其中，尖镰孢菌是最为常见的一种[17,18]。因此针对大豆尖镰孢菌的分子检测我们进行了一系列的研究。

传统病原菌的分类、鉴定主要基于形态学特性、致病性测定等，但尖镰孢菌在生长过程中形态变异较大，很多性状不稳定，而且根据对不同寄主植物的致病性差异可分为不同的专化型[12]，有些专化型内还可进一步分为不同的小种，目前已报道的尖镰孢菌专化型和小种有120多个[1]。同时传统分类鉴定方法耗时长、灵敏度低、易受人为及环境等诸多因素的干扰[3]，不能在病害潜伏期和初发期做出诊断，很难对病害发生进行及时的监测和有效控制。

随着分子生物学的发展，分子生物学技术已逐步应用到尖镰孢菌的研究中[5,16]。基于普通PCR的方法已经成功用于检测大豆尖镰孢[21]，虽然普通PCR法在特异性和灵敏度上有较大的提高，但是检测时间仍然比较长，大概4～5h，同时普通PCR方法依赖精密的温度循环装置，检测过程复杂，不能满足快速检测的需求。

环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）是日本的荣研株式会发明的一种新的核酸扩增技术（9），因为其操作简单、快速、特异性高、成本低等优点，成为可以替代普通PCR的新的核酸扩增技术。它是针对靶基因的6个区域设计4种特异的引物，在Bst大片段聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，60～65℃范围60min内，大量合成目标DNA的同时伴随有副产物——白色的焦磷酸镁沉淀产生。由于LAMP扩增过程依赖识别靶序列6个独立区域，所以反应特异性很强，并且核酸扩增过程是在恒温条件下进行，普通水浴锅或者有稳定热源的设备就能满足反应要求，检测成本大大降低。

此外，普通PCR反应对产物进行凝胶电泳很容易造成产物扩散，这是实验室污染的一个主要来源；而且溴化乙锭（EB）有巨毒，可累积致癌；长期观察紫外灯也会对实验人员造成一定程度的伤害。而LAMP反应只需在恒温水浴锅中进行，反应结束之后通过加入SYBR Green I观察颜色和荧光变化便可直接判断结果，大大降低了对实验人员的伤害，并且增加了在田间的应用价值。

靶标基因的选择是LAMP检测的重要因素之一。普通PCR常用的靶标基因有核糖体基因转录间隔区（Internal transcribed space,ITS）[14]，然而许多学者认为该靶标不能够很明确的区分镰孢属真菌[10,11]。

CYP51基因编码的甾醇14α-去甲基化酶是分布最广的细胞色素P450家族成员，是生物甾醇合成过程中的关键酶[16]。在人类基因和植物病原真菌中发现了多个拷贝的CYP51基因，如曲霉菌、稻瘟菌等中含有两种拷贝CYP51A、CYP51B[6,8]。另外还存在第三种拷贝CYP51C，被发现特异地存在于镰孢菌种基因中[4]。在我们实验室前期以普通PCR技术检测大豆尖镰孢的研究中也发现，CYP51C基因序列在Fusarium种内不同菌株间高度保守，种间存在丰富的变化，是相比rDNA-ITS、β-tubulin序列更好的分子检测靶标[5]。

本发明分析了大豆尖镰孢CYP51C基因和其他镰孢菌在序列上的差异，设计了四条特异性的LAMP引物和两条环引物，在此基础上建立了检测大豆尖镰孢的LAMP体系。

参考文献：

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发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种基于LAMP技术检测大豆尖镰孢菌的方法。

本发明的另一目的是提供基于LAMP技术检测大豆尖镰孢菌的引物组合物。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种基于LAMP技术检测大豆尖镰孢菌的引物组合物，由大豆尖镰孢LAMP分子检测的四条特异性引物FIP、BIP、F3、B3，以及两条用于加快反应速度的环引物LF、LB组成；其中，引物FIP序列如SEQ ID NO.1所示，引物BIP序列如SEQ ID NO.2所示，引物F3序列如SEQ IDNO.3所示，引物B3序列如SEQ ID NO.4所示，引物LF序列如SEQ ID NO.5所示，引物LB序列如SEQ ID NO.6所示。

所述的引物组合物在检测大豆尖镰孢菌中的应用。

所述的引物组合物在制备大豆尖镰孢菌检测试剂中的应用。

一种大豆尖镰孢LAMP检测试剂盒，包括：SEQ ID NO.3所示的正向外引物F3、SEQ ID NO.4所示的反向外引物B3、SEQ ID NO.1所示的正向内引物FIP、SEQ ID NO.2所示的反向内引物BIP、SEQ ID NO.5所示的环引物LF、SEQ ID NO.6所示的环引物LB。

所述的试剂盒优选包括1ml检测溶液以及染料SYBR Green I25μL，所述的1mL检测溶液每毫升包括：32mM正向内引物FIP、32mM反向内引物BIP、8mM正向外引物F3、8mM反向外引物B3、8mM环引物LF、8mM环引物LB、56mM dNTPs、0.8M Tris-HCl(pH8.8)、0.4mM KCl、0.4mM(NH4)₂SO₄、0.24mM MgSO₄、4%Triton X-100、Bst DNA polymerase320单位，加入超纯水至总体积为1mL。

一种基于LAMP技术检测大豆尖镰孢菌的方法，包括：取4μL待检DNA溶液，加入18μL所述的检测溶液和3μL灭菌去离子水，总体积为25μL；反应程序为：62℃，60min；扩增产物的检测：扩增后加入0.25μL染料SYBR Green I作为反应指示剂，肉眼观察，以SYBRGreen I的颜色变化做为结果判定标准：日光下，黄绿色表示检测为阳性，存在大豆尖镰孢，黄色表示检测结果为阴性；或者在245nm波长紫外光照射观察荧光，以荧光强弱做为结果判定标准：强烈的绿色荧光表示检测为阳性，存在大豆尖镰孢，没有荧光表示检测为阴性。

有益效果：

本发明与现有技术相比，其优点和积极效果表现在：

（1）实用性好。普通PCR反应对产物进行凝胶电泳很容易造成产物扩散，这是实验室污染的一个主要来源；而且溴化乙锭（EB）有巨毒，可累积致癌；长期观察紫外灯也会对实验人员造成一定程度的伤害。而LAMP反应只需在恒温水浴锅中进行，反应结束之后通过SYBR Green I的颜色和荧光变化便可直接判断结果，从而增加了其在田间的应用价值。

（2）恒温扩增。不像PCR法必须要热循环，这样就摆脱了对热循环仪器的依赖，只要有稳定的热源LAMP反应就可以发生，极大的扩展了LAMP使用的范围，LAMP之所以能在恒定的热源下发生反应是因为在LAMP反应液中添加了甜菜碱，使双链DNA处于解链的动态平衡中，在Bst DNA聚合酶的作用下实现扩增。

（3）准确性高。由于传统大豆尖镰孢检测技术只是根据形态特征来确定检疫对象，鉴定方法耗时长、灵敏度低、易受人为及环境等诸多因素的干扰；而本发明根据大豆尖镰孢的CYP51C序列，该序列在大豆尖镰孢中的基因组中非常保守，利用Bioedit软件将大豆尖镰孢的CYP51C序列和其他镰孢菌的CYP51C序列进行比较，选取大豆尖镰孢特有的一段CYP51C序列设计特异性的LAMP引物。LAMP反应通过4条引物特异性识别靶序列上的6个独立区域，相对于PCR引物识别靶序列的2个独立区域而言，特异性和灵敏度都比较高。

本发明在设计引物时，尝试了多种基因靶标，如核糖体基因转录间隔区、转录延伸因子，肌动蛋白基因等，但都没有筛选到合适的靶标。最终，在比对镰孢菌甾醇14α-去甲基化酶CYP51C基因时，找到了比较特异的序列，以此为靶标通过软件得到多个备选引物。再针对这些备选引物进行预实验，最终确定了我们所用的这六条特异性引物。

本发明提供的检测大豆尖镰孢菌的LAMP方法克服了现有技术中生物学检测方法所需周期长、费时费力、繁琐、特异性差的问题及PCR检测技术需要热循环仪器，无法快速检测大豆尖镰孢菌的问题。本发明检测方法在62℃等温条件下，能快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到大豆尖镰孢菌，不需要复杂仪器，能较好满足对大豆尖镰孢菌的现场检测，为大豆尖镰孢菌的检测提供了新的技术平台，可用于田间大豆枯萎病的早期诊断和病菌的监测。

附图说明

图1以SYBR Green I的颜色变化和荧光强弱做为LAMP检测大豆尖镰孢的结果判定。

左图为肉眼观察结果黄绿色表示检测为阳性，存在大豆尖镰孢，黄色表示检测结果为阴性；

右图为在245nm波长紫外光照射观察荧光，以荧光强弱做为结果判定标准：强烈的绿色荧光表示检测为阳性，存在大豆尖镰孢，没有荧光表示检测为阴性。

图2本发明试剂盒检测大豆尖镰孢

通过对6个尖镰孢种的菌株共计132个菌株进行了LAMP扩增检测试剂盒的特异性

1：标准大豆尖镰孢菌株（购自CBS数据库，Fusarium oxysporum f.sp.tracheiphilum(E.F.Smith)Snyder＆Hansen-PP3;cond:OA,SNA175.33下同）；2-3：大豆尖镰孢菌株（分离自大豆枯萎病标本）；4-6：尖镰孢其他专化型；7-8：阴性对照。A图是肉眼观察结果：第1～6管显黄绿色，第7～8管显黄色；B图为在245nm波长紫外光照射下显色结果：第1～6管显强烈的绿色荧光，第7～8管没有荧光。

图3本发明试剂盒检测大豆尖镰孢的特异性一

通过对镰孢属8个其它种的菌株共计180个菌株进行了LAMP扩增，特异性LAMP反应只能在供试的F.oxysporum菌株中产生黄绿色的颜色变化与产生绿色荧光。

1：标准大豆尖镰孢菌株；2：茄腐镰孢菌；3：禾谷镰孢菌；4：串珠镰孢菌；5：黄色镰孢菌；6：燕麦镰孢菌；7：雪腐镰孢菌；8：木贼镰孢菌；9：层出镰孢菌；10：阴性对照。

A图是肉眼观察结果：第1管显黄绿色，第2～10管显黄色；B图为在245nm波长紫外光照射下显色结果：第1管显强烈的绿色荧光，第2～10管没有荧光。

图4本发明试剂盒检测大豆尖镰孢的特异性二

通过对镰孢属和11个其它属病原菌菌株共计76个菌株进行了LAMP扩增，特异性LAMP反应只能在供试的F.oxysporum菌株中产生黄绿色的颜色变化与产生绿色荧光。

1：标准大豆尖镰孢菌株；2：大豆锈菌；3：大豆拟茎点肿腐；4：平头炭疽；5：胶孢炭疽；6：稻瘟菌；7：链格孢；8：球黑孢；9：大豆疫霉菌；10：大豆炭腐；11：米曲霉；12：油瓶霉；13：阴性对照。

A图是肉眼观察结果：第1管显黄绿色，第2～13管显黄色；B图为在245nm波长紫外光照射下显色结果：第1管显强烈的绿色荧光，第2～13管没有荧光。

图5本发明试剂盒检测大豆尖镰孢的灵敏度

LAMP扩增不同浓度基因组DNA；第1～10管分别为25μL的反应体系中含有100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg DNA及不含DNA的阴性对照的扩增结果。

A图是肉眼观察结果：第1～4管显黄绿色，第5～10管显黄色；B图为在245nm波长紫外光照射下显色结果：第1～4管显强烈的绿色荧光，第5～10管没有荧光；结果表明LAMP反应的灵敏度达到100pg。

具体实施方式

实施例1

大豆尖镰孢检测试剂盒，包括1mL检测溶液+染料SYBR Green I25μL；1mL检测溶液包括：32mM正向内引物FIP、32mM反向内引物BIP、8mM正向外引物F3、8mM反向外引物B3、8mM环引物LF、8mM环引物LB、56mM dNTPs、0.8M Tris-HCl(pH8.8)、0.4mM KCl、0.4mM(NH4)₂SO₄、0.24mM MgSO₄、4%Triton X-100、Bst DNA polymerase320单位，加入超纯水制备成1mL检测溶液。其中大豆尖镰孢LAMP分子检测的四条特异性引物FIP、BIP、F3、B3和两条环引物LF、LB如下：

本试剂盒保存期限为1年。

实施例2大豆尖镰孢LAMP检测

为了验证LAMP方法的可行性，选择标准大豆尖镰孢菌株6497（购自CBS数据库，Fusariumoxysporum f.sp.tracheiphilum(E.F.Smith)Snyder＆Hansen-PP3;cond:OA,SNA 175.33下同），各地大豆枯萎病标本中分离得到的大豆尖镰孢菌株以及镰孢菌其他专化型菌株的DNA作为模板，取4μl DNA溶液，加入18μl实施例1制备的检测溶液和3μl灭菌去离子水进行LAMP反应，反应程序为：62℃ 60min，扩增后加入0.25μL染料SYBR Green I作为反应指示剂，肉眼观察，以及245nm波长紫外光照射观察荧光。以SYBR Green I的颜色变化和荧光强弱做为结果判定标准。结果显示用LAMP引物去扩增大豆尖镰孢菌株以及尖镰孢其他专化型菌株的DNA模板时，产生黄绿色的颜色变化与绿色荧光；而阴性对照没有颜色变化和荧光。这表明本发明建立的LAMP检测方法在大豆尖镰孢中可以使用（图2）。

实施例3大豆疫霉菌LAMP反应的特异性试验一

为了验证LAMP方法的特异性，选择标准大豆尖镰孢菌株以及与尖镰孢不同种的镰孢菌菌株（茄腐镰孢菌；禾谷镰孢菌；串珠镰孢菌；黄色镰孢菌；燕麦镰孢菌；雪腐镰孢菌；木贼镰孢菌；层出镰孢菌）的DNA作为模板，取4μl DNA溶液，按实施例2的方法，进行LAMP反应和结果观察。结果显示用LAMP引物去扩增大豆尖镰孢的DNA模板时，产生黄绿色的颜色变化与产生绿色荧光；而其他种的镰孢菌与阴性对照一样，没有颜色变化或者强烈的绿色荧光（图3）。

实施例4大豆疫霉菌LAMP反应的特异性试验二

为了验证LAMP方法的特异性，选择标准大豆尖镰孢菌株与大豆尖镰孢不同属的菌株（大豆锈菌；大豆拟茎点肿腐；平头炭疽；胶孢炭疽；稻瘟菌；链格孢；球黑孢；大豆疫霉菌；大豆炭腐；米曲霉；油瓶霉；）的DNA作为模板，取4μl DNA溶液，按实施例2的方法，进行LAMP反应和结果观察。结果显示用LAMP引物去扩增大豆尖镰孢的DNA模板时，产生黄绿色的颜色变化与产生绿色荧光；而其他属的菌株与阴性对照一样，没有颜色变化或者强烈的绿色荧光（图4）。

实施例5大豆疫霉菌LAMP反应的灵敏度试验

为了确定LAMP检测方法的灵敏度，将提取的标准大豆尖镰孢菌株的DNA用分光光度计测定浓度（1μg/μl）后用DEPC水进行10倍比稀释，‐70℃保存作为模板。分别取10倍比稀释后的各浓度DNA稀释液4μL作为模板，按实施例2的方法，进行LAMP反应和结果观察。结果显示LAMP方法可以检测到浓度是100pg的大豆尖镰孢的DNA（图5）。

实施例6从海关进境大豆带菌土样中检测大豆尖镰孢：

1）土壤中卵孢子的富集：

取待检土壤样品20～100克，研碎，先后采用200目筛网去处较大土粒，然后经过400、500、800目筛网过滤，同时用3～10升水反复冲洗，从800目筛网上收集卵孢子，用1ml水悬浮。由于卵孢子不能透过800目筛网，这样处理可以达到使卵孢子富集的效果。

2）从微量卵孢子中提取DNA：

将用无菌水悬浮的卵孢子转移到1.5mL的离心管中，在12000r.min-1转速下离心5分钟，倒出液体；

加入50μL CTAB buffer，研磨，再加入500μL CTAB buffer，水浴30分钟；

加入等体积氯仿抽提，在12000r·min^-1转速下离心10分钟，吸取上清；

加入1/10体积的3M NaAc，2倍体积的无水冰乙醇，室温沉淀30分钟，12000r·min^-1转速下离心10分钟，倒干液体；

加1mL70%(V/V)乙醇洗涤，12000r·min^-1转速下离心10分钟，倒干液体，晾干至无酒精味；

加10μL无菌双蒸水溶解，用于LAMP扩增的模板。

3）大豆尖镰孢LAMP检测，包括：

（1）大豆尖镰孢的LAMP检测：取4μL DNA溶液，加入18μL试剂盒检测溶液和3μL灭菌去离子水，总体积为25μL；

（2）反应程序为：62℃，60min；

（3）扩增产物的检测：扩增后加入0.25μL染料SYBR Green I作为反应指示剂，肉眼观察，以及245nm波长紫外光照射观察荧光。以SYBR Green I的颜色变化和荧光强弱做为结果判定标准。日光下，黄绿色表示检测为阳性，存在大豆尖镰孢，黄色表示检测结果为阴性；紫外光下，强烈的绿色荧光表示检测为阳性，存在大豆尖镰孢，没有荧光表示检测为阴性；以此判断从海关进境大豆带菌土样中能否检测到大豆尖镰孢。

实施例7从发病大豆组织中鉴定大豆尖镰孢

将被病原物侵染的大豆叶片或根茎部位用70%酒精消毒后，采用改进的NaOH法提取DNA。取一段新发病的植株组织，每毫克组织加入10μL 0.5mol/L NaOH，在研钵中充分研磨后转移至1.5mL的离心管中，12000r·min^-1转速下离心5min，取5μL上清液加入495μL 0.1mmol/L Tris（pH8.0），混匀后吸取4uL DNA溶液，按实施例2的方法，进行LAMP反应，结果在日光下，显黄绿色；在245nm波长紫外光照射下发强烈绿色荧光，证明所检测的病原为大豆尖镰孢。

Claims (6)

1. 一种基于环介导等温扩增技术检测大豆尖镰孢菌的引物组合物，其特征在于由大豆尖镰孢LAMP分子检测的四条特异性引物FIP、BIP、F3、B3，以及两条用于加快反应速度的环引物LF、LB组成；其中，引物FIP序列如SEQ ID NO.1所示，引物BIP序列如SEQ ID NO.2所示，引物F3序列如SEQ ID NO.3所示，引物B3序列如SEQ ID NO.4所示，引物LF序列如SEQ ID NO.5所示，引物LB序列如SEQ ID NO.6所示。

2.权利要求1所述的引物组合物在检测大豆尖镰孢菌中的应用。

3.权利要求1所述的引物组合物在制备大豆尖镰孢菌检测试剂中的应用。

4.一种大豆尖镰孢环介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于包括：权利要求1所述的引物组合物。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒包括1ml检测溶液以及染料SYBR Green I 25 μL ，所述的1mL检测溶液每毫升包括：32 mM正向内引物FIP、32 mM 反向内引物BIP、8 mM正向外引物F3 、8 mM反向外引物B3、8 mM环引物LF、8 mM环引物LB、56 mM dNTPs、pH 8.8的0.8 M Tris-HCl、0.4 mM KCl、0.4 mM (NH4)₂SO₄、 0.24 mM MgSO₄、4% Triton X-100、Bst DNA polymerase 320单位，加入超纯水至总体积为1mL。

6.一种基于环介导等温扩增技术检测大豆尖镰孢菌的方法，其特征在于：取4 μL 待检DNA溶液，加入18 μL 权利要求5所述试剂盒中的检测溶液和3 μL灭菌去离子水，总体积为25 μL； 反应程序为：62℃ ，60min；扩增产物的检测：扩增后加入0.25 μL染料SYBR Green I作为反应指示剂，肉眼观察，以SYBR Green I的颜色变化做为结果判定标准：日光下，黄绿色表示检测为阳性，存在大豆尖镰孢，黄色表示检测结果为阴性；或者在245 nm波长紫外光照射观察荧光，以荧光强弱做为结果判定标准：强烈的绿色荧光表示检测为阳性，存在大豆尖镰孢，没有荧光表示检测为阴性。