CN104328189A - 环介导等温扩增技术检测大豆茎褐腐病菌引物组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了环介导等温扩增技术检测大豆茎褐腐病菌引物组合物及其应用。引物组合物，所述的引物组合物由SEQ ID NO.1所示的正向外引物F3，SEQ ID NO.2所示的反向外引物B3，SEQ ID NO.3所示的正向内引物FIP，SEQ ID NO.4所示的反向内引物BIP，SEQ ID NO.5所示的环引物LF，以及SEQ ID NO.6所示的环引物LB组成。所述的引物组合物可在制备大豆茎褐腐病菌环介导等温扩增检测试剂盒中应用。本发明试剂盒具有良好的特异性灵敏度，扩增快速、高效，且鉴定简便，能较好满足目前对大豆茎褐腐病菌的快速检测的迫切需要，用于进出口检疫、田间检疫等的现场检测，易于大范围推广应用。

Description

环介导等温扩增技术检测大豆茎褐腐病菌引物组合物及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及环介导等温扩增技术检测大豆茎褐腐病菌引物组合物及其应用。

背景技术

大豆茎褐腐病菌(Phialophora gregata f.sp.sojae，以下简称PGS)侵染大豆植株引起大豆茎褐腐病。该病害于1942年首次在美国的伊利诺斯州被发现，后在北美和加拿大大豆种植地区多次被报道，让美国等地大豆生产蒙受了巨大的损失，产量损失可达30％，最高66％。PGS被列为欧洲和地中海植物保护组织(EPPO)A1类检疫性有害生物，也是我国植物检疫性有害真菌之一。目前，PGS主要发生地在巴西、美国中西部和东南部各州、加拿大、阿根廷、埃及、墨西哥、前南斯拉夫、日本等地，其中在美国和加拿大中北部地区发生尤为严重，给当地的大豆生产造成了极大威胁。PGS的危害症状主要是大豆的茎部的维管束和髓部变成褐色，随着病菌进一步扩展，整个茎部成为褐色，并在大豆生长后期引起叶片部分变色，叶脉坏死和斑点，但是也有些不会发生明显褐变症状，从而使鉴定变得很困难。大豆茎褐腐根据危害症状分为落叶型(A型)和非落叶型(B型)，发病初期的症状与镰孢菌引起的大豆猝死综合症的症状易混淆[8‐10]。大豆茎褐腐病是一种土传维管束类病害，大豆出苗阶段可侵染大豆根系，而在病残体中产生的分生孢子是主要的初侵染源，由于PGS可存活于大豆残体及土壤中3至5年，随着大豆贸易近年来的持续增加，使PGS通过贸易传入我国的风险大大增加，所以日前急需一种可以快速，准确检测PGS的方法。

随着核酸相关的鉴定方法不断发展，基于普通PCR的方法已经成功用于检测大豆茎褐腐病菌，但PCR法特异性等检测耗时偏长，需要6～8h，同时PCR方法需要昂贵仪器PCR仪，且检测灵敏度偏低，检测过程较繁杂。

环介导等温扩增技术(Loop‐mediated isothermal amplification，LAMP)是日本荣研株式会社发明的一种新的核酸扩增技术，因为其操作简单、快速、特异性高、成本低等优点，成为可以替代PCR的新的核酸扩增技术。它是针对靶基因的6个区域设计4对特异性引物，在Bst大片段聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，60～65℃范围60min内，能大量合成目标DNA。由于LAMP扩增过程依赖识别靶序列6个独立区域，所以反应特异性很强，并且核酸扩增过程是在恒温条件下进行，普通水浴锅或者等温保温瓶就能满足反应要求，检测成本降低，所需时间短。

此外，普通PCR反应对产物进行凝胶电泳很容易造成产物扩散，这是实验室污染的一个主要来源；而且溴化乙锭(EB)有巨毒，可累积致癌，对人体产生巨大危害；长期观察紫外灯也会对实验人员健康造成一定程度的伤害。而LAMP反应只需在恒温水浴锅中进行，在扩增前加入染料HNB(羟基萘酚蓝)作为反应指示剂，以HNB的颜色变化做为结果判定标准即可，达到快速检测的目的。

靶标基因的选择是LAMP检测的重要因素之一。普通PCR常用的靶标基因有核糖体基因转录间隔区(Internaltranscribed space,ITS)，它首先由Gonzalea在1990年提出，后逐步发展起来成为分子标记，其优点在于：具有高拷贝数；同时包含保守与变异序列；能根据保守序列中的变异位点设计特殊引物进行特异性扩增比较。虽然真菌的ITS总的说来是相对保守的，但其间有足够的变异位点可以用于鉴别性比较，而且其多拷贝数使鉴别性的扩增更加灵敏。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术中大豆茎褐腐病菌的生物学检测方法所需周期长、费时费力、PCR检测技术需要昂贵的热循环仪器、检测特异性偏低(如假阳性)、耗时偏长且操作较繁琐(扩增结果需经电泳后才可判别)等问题，而提供的大豆茎褐腐病菌新的分子检测方法及使用的引物组合物，对大豆茎褐腐病菌进行LAMP检测，检测周期短(仅需1h)、准确性高、灵敏性高、可用肉眼观察检测结果。

一种用于环介导等温扩增检测大豆茎褐腐病菌(Phialophora gregata f.sp.sojae)的引物组合物，其特征在于由SEQ ID NO.1所示的正向外引物F3，SEQ ID NO.2所示的反向外引物B3，SEQ ID NO.3所示的正向内引物FIP，SEQ ID NO.4所示的反向内引物BIP，SEQ ID NO.5所示的环引物LF，以及SEQ ID NO.6所示的环引物LB组成。

表1

所述的引物组合物在制备大豆茎褐腐病菌环介导等温扩增检测试剂盒中的应用。

一种检测大豆茎褐腐病菌的环介导等温扩增试剂盒，包含所述的引物组合物。

所述的试剂盒中所述的引物组合物浓度为：1.6μM正向内引物FIP、1.6μM反向内引物BIP、0.2μM正向外引物F3、0.2μM反向外引物B3、环引物LB和LF各0.8μM。

所述的试剂盒还包括1.4mM dNTPs、0.8M Tris‐HCl(pH 8.8)、0.4mM KCl、0.4mM(NH₄)₂SO₄、0.24mM 4％Triton X‐100、8mM MgSO₄、0.192mM HNB(羟基溴酚蓝)、8U·μL^‐1Bst DNApolymerase。

所述的试剂盒优选包括1ml检测溶液，检测溶液以超纯水为溶剂，含1.6μM正向内引物FIP、1.6μM反向内引物BIP、0.2μM正向外引物F3、0.2μM反向外引物B3、环引物LB和LF各0.8μM、1.4mM dNTPs、0.8M Tris‐HCl(pH 8.8)、0.4mM KCl、0.4mM(NH₄)₂SO₄、0.24mM4％Triton X‐100、8mM MgSO₄、0.192mM羟基溴酚蓝(HNB)、8U·μL^‐1Bst DNA polymerase。保存期限为1年。

一种检测大豆茎褐腐病菌的方法，其特征在于利用所述的引物组合物对待见样品的DNA进行LAMP扩增，在扩增前加入染料羟基萘酚蓝作为反应指示剂，以羟基萘酚蓝的颜色变化做为结果判定标准，天蓝色表示检测为阳性，存在大豆茎褐腐病菌；紫色表示检测结果为阴性，不存在大豆茎褐腐病菌。

所述检测大豆茎褐腐病菌的方法，优选包括：

(1)大豆茎褐腐病菌的LAMP检测：取2μL DNA溶液，加入25μL试剂盒溶液，总体积为27μL；

(2)反应程序为：64℃60min；

(3)扩增产物的检测：在扩增前加入染料HNB(羟基萘酚蓝)作为反应指示剂，以HNB的颜色变化做为结果判定标准。天蓝色表示检测为阳性，存在大豆茎褐腐病菌。紫色表示检测结果为阴性。

有益效果：

故基于ITS序列分析了PGS与其他大豆常见病害在序列上的差异，应用Bioedit软件进行序列比对分析后，使用PrimerExplore V4软件，参照LAMP引物设计原则，软件自动设计并提供28套引物供于筛选，经过逐一筛选，比较每对引物特异性和灵敏度，从中筛选出了1套特异性好，灵敏度高的LAMP引物。在Bst大片段聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，60～65℃范围60min内，大量合成目标DNA的同时伴随有副产物——白色的焦磷酸镁沉淀产生，达到可视化检测的目的，在此基础上建立了检测大豆茎褐腐病菌的LAMP体系。

本发明与现有技术相比，其优点和积极效果表现在：

(1)实用性好。普通PCR反应对产物进行凝胶电泳很容易造成产物扩散，这是实验室污染的一个主要来源之一；且溴化乙锭(EB)有巨毒，可累积致癌，对身体健康造成很大危害；长期观察紫外灯也会对实验人员造成一定程度的伤害；由于受到时间、场地、仪器等的限制，无法满足田间快速检测的需要。而LAMP反应只需在恒温水浴锅或者保温瓶中进行，1h反应结束之后通过HNB的颜色变化便可直接肉眼判定结果。

(2)实现了恒温扩增，不需像PCR法必须要热循环，这样就摆脱了对热循环仪器的依赖，只要有稳定的热源LAMP反应就可以发生，极大的扩展了LAMP使用的范围，LAMP之所以能在恒定的热源下发生反应是因为在LAMP反应液中添加了甜菜碱，使双链DNA处于解链的动态平衡中，在Bst DNA聚合酶的作用下实现扩增。

(3)准确性高：由于传统大豆茎褐腐病菌检测技术只是根据形态特征以及普通PCR反应来确定检疫对象，检测准确性偏低；而本发明根据大豆茎褐腐病菌的ITS序列，该序列在大豆茎褐腐病菌的基因组中非常保守，应用Bioedit软件进行序列比对分析后，使用PrimerExplore V4软件，参照LAMP引物设计原则，软件自动设计并提供28套引物供于筛选，经过逐一筛选，比较每对引物特异性和灵敏度，最终筛选出了1套特异性好，灵敏度高的LAMP引物。LAMP反应是通过4条引物特异性识别靶序列上的6个独立区域，相对于普通PCR引物识别靶序列的2个独立区域而言，特异性和灵敏度都显著提高。

本发明试剂盒具有良好的特异性灵敏度，扩增快速、高效，且鉴定简便。本文发明的检测体系在64℃等温条件下，能快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到大豆茎褐腐病菌，不需要复杂仪器，能较好满足对大豆茎褐腐病菌的现场检测，为检疫性病害大豆茎褐腐病菌的检测提供了新的技术平台，能较好满足目前对大豆茎褐腐病菌的快速检测的迫切需要，用于进出口检疫、田间检疫等的现场检测，易于大范围推广应用。

说明书附图

图1.LAMP检测大豆茎褐腐病菌的特异性

通过对大豆茎褐色腐病菌菌株和其他病原菌菌株共计11个菌株进行了LAMP扩增，只在供试的Phialophora gregata f.sp.sojae菌株(江苏省检测检疫局提供)中产生天蓝色的阳性反应[1.大豆茎褐腐病菌(落叶型DNA浓度240ng/μL)；2.大豆茎褐腐病菌(落叶型DNA浓度90ng/μL)；3.大豆茎褐腐病菌(落叶型DNA浓度180ng/μL)；4.大豆茎褐腐病菌(落叶型DNA浓度120ng/μL)；5.立枯丝核菌；6.大豆紫斑病菌；7.胶胞炭疽菌；8.镰刀菌；9.大豆炭腐菌；10.米曲霉；11.链格孢；12.平头炭疽菌；13.油瓶霉；14～15.水(阴性对照)]。检验LAMP方法的特异性，反应60min后根据反应管内颜色变化进行结果判定，阳性反应呈现天蓝色，阴性对照呈现紫色。

图2.LAMP检测大豆茎褐腐病菌的灵敏度

LAMP扩增不同浓度基因组DNA；图中从左到右分别对应为27μL的反应体系中分别含有1：大豆茎褐腐病菌标准菌株；2：100ng/μL；3：10ng/μL；4：1ng/μL；5：100pg/μL；6：10pg/μL；7：1pg/μL；8：100fg/μL；9：10fg/μL；10：1fg/μL大豆茎褐腐病菌DNA以及11：阴性对照的扩增结果。颜色判定LAMP检测大豆茎褐腐病菌的灵敏度显色图，阳性反应呈现天蓝色，阴性对照呈现紫色。显色表明LAMP反应的灵敏度达到10pg。

图3.LAMP检测大豆茎褐腐病菌的在实际中的应用

通过对进口大豆及豆荚残体提取DNA进行了LAMP扩增，特异性LAMP反应只在9份中的1份产生了天蓝色的阳性反应[1～2阳性对照；3～8大豆样本；9～11为大豆豆荚样本；12.水(阴性对照)]。颜色判定LAMP检测大豆茎褐腐病菌的实际应用中的显色图。阳性反应呈现天蓝色，阴性对照呈现紫色。

图4.LAMP检测大豆茎褐腐病菌实际应用中的灵敏度

自配LAMP反应体系HNB的显色反应结果为阳性对照以及每10g大豆样本添加孢子量为10000，1000，100，50个时大豆样本提取的DNA反应管均呈天蓝色，为阳性结果，而阴性对照以及每10g大豆样本添加孢子量为10，0个时大豆样本提取的DNA反应管均呈紫色，为阴性结果。上述结果表明，该技术对于进口大豆残体样本中PGS的检测灵敏度为50个孢子/10g大豆残体。

具体实施方式

实施例1检测大豆茎褐腐病菌的环介导等温扩增试剂盒

一种检测大豆茎褐腐病菌的环介导等温扩增试剂盒，包括1ml检测溶液，检测溶液以超纯水为溶剂，含1.6μM正向内引物FIP、1.6μM反向内引物BIP、0.2μM正向外引物F3、0.2μM反向外引物B3、环引物LB和LF 0.8μM、1.4mM dNTPs、0.8M Tris‐HCl(pH 8.8)、0.4mM KCl、0.4mM(NH₄)₂SO₄、0.24mM 4％Triton X‐100、8mM MgSO₄、0.192mM羟基溴酚蓝(HNB)、8U·μL^‐1Bst DNA polymerase。

实施例2引物组合物特异性考察

为了验证引物组合物即在此基础上建立的LAMP方法的特异性，选择标准大豆茎褐腐病菌菌株，立枯丝核菌，大豆紫斑病菌，胶胞炭疽菌，镰刀菌，大豆炭腐菌，米曲霉，链格孢，平头炭疽菌，油瓶霉的DNA作为模板，取2μLDNA溶液，加入25μl试剂盒检测溶液，总体积为27μl；反应程序为：64℃60min；在常光下检测，结果如图1所示。结果显示特异性LAMP引物组合物能特异性地识别大豆茎褐腐病菌菌株，含有大豆茎褐腐病菌的样品(1号～4号管)在常光下变成天蓝色，而其他种(5～13号管)在常光下为紫色，阴性对照(14、15号)在常光下也为紫色。

实施例3大豆茎褐腐病菌LAMP引物灵敏度试验

为了确定LAMP检测方法的灵敏度，将提取的标准大豆茎褐色腐病菌菌株DNA用分光光度计测定浓度(1μg/μl)后用DEPC水进行10倍比稀释，-70℃保存作为模板。分别取10倍比稀释后的各浓度DNA稀释液2μl作为模板，加入25μl试剂盒检测溶液，总体积为27μl；反应程序为：64℃60min；在常光下检测，结果如图2所示：1～6管在常光下变成天蓝色，表明本发明方法的灵敏度为10pg/μL。

实施例4从口岸进境大豆，豆荚残体中检测大豆茎褐腐

1)随机取样：

大豆、豆荚残体样本在盘子内摇晃混匀五点取样，选取之后的样本下一步备用。

2)样本的洗涤：

将9分大豆残体样本，每份样本取10g，倒入250ml干净三角瓶中，加入无菌水至200ml，滴入20％吐温3～5滴。封住瓶口，置于摇床上200‐250rpm，洗涤20min。

3)滤液的收集：

洗涤后用200目钢筛将混合液过滤到干净的烧杯中；用少量纯水反复冲洗钢筛上的大豆残体，滤液集中到烧杯中。

4)离心收集沉淀：

把收集到的滤液分装到50ml离心管中，6500rpm，离心5min，弃上清，收集沉淀。

5)沉淀物处理：

将沉淀置于37℃恒温箱中晾干。

6)沉淀物总基因组的提取：

由于沉淀物种含有大量土壤成分，所以实验采用美国MOBIO公司的土壤微生物DNA强力提取试剂盒DNA Isolation Kit进行提取，方法稍加改进：

取烘干的沉淀物0.25g加入到PowerBead管中。加入60μl C1,漩涡震荡10min；室温10000g、30s离心。上清液400～500μl转移到2ml Collection Tube中，向管中加入250μlC2，涡旋振荡5s，置于4℃，5min；室温离心10000g，1min；将上清600μl转移到新的2ml CollectionTube中；向EP管中加入200μlC3，涡旋振荡5s后，置于4℃，5min；室温10000g，1min离心；上清750μl转移到新的2ml Collection Tube中；向其加入1.2ml C4，涡旋振荡5s；将混合液每次675μl转移到Spin Fittle，10000g，1min；向其加入500μlC5,室温10000g，30s离心；倒掉滤液后，将Spin Fittle放回到2ml Collection Tube中，10000g，1min离心，离心后开口置于室内1min使管中液体充分挥发；将Spin Fittle转移到新的2ml Collection Tube中，向Spin Fittle中加入100μlC6,溶解2min后离心。丢掉Spin Fittle，向每管中加入4μl 5M的氯化钠(NaCL)，涡旋振荡30s；向其中加入200μl无水乙醇，涡旋振荡30s；10000g，5min离心，弃上清，将2ml Collection Tube置于37℃恒温箱，晾干其中水分后向Collection Tube中加入60μl去离子水，备用。

7)大豆茎褐腐LAMP检测，包括：

(1)大豆茎褐腐的LAMP检测：取2μLDNA溶液，加入25μL试剂盒检测溶液，总体积为27μL；

(2)反应程序为：64℃60min；

(3)扩增产物的检测：天蓝色表示检测为阳性，存在大豆茎褐腐病菌。紫色表示检测结果为阴性。

结果如图3所示：通过对进口大豆及豆荚残体提取DNA进行了LAMP扩增，特异性LAMP反应只在9份中的1份即8号管产生了天蓝色的阳性反应，提示该样本含有大豆茎褐腐病菌。实施例5大豆植株残体人工添加孢子灵敏度实验

为明确大豆茎褐腐LAMP检测技术在大豆植株残体样本携带多少PGS分生孢子时可检测出该病菌，作者根据图3的检测结果，选择未携带PGS的大豆植株残体为基质，分别在每10g大豆植株残体中人为添加10000，1000，100，50，10，0个PGS分生孢子，按照实施例4的方法收集PGS分生孢子，提取DNA。结果如图4所示：该技术对于进口大豆残体样本中PGS的检测灵敏度为50个孢子/10g大豆残体。

实施例6从发病大豆组织中鉴定大豆茎褐腐病菌

将有红褐色病斑的大豆根茎部位用70％酒精消毒后，采用CTAB法或者碱裂解法提取DNA，吸取2μL DNA溶液，按实施例2的方法，进行LAMP反应，如果存在颜色反应呈现天蓝色，则证明所检测的病原为大豆茎褐腐病菌。

Claims (7)

1.一种用于环介导等温扩增检测大豆茎褐腐病菌(Phialophora gregata f.sp.sojae)的引物组合物，其特征在于由SEQ ID NO.1所示的正向外引物F3，SEQ ID NO.2所示的反向外引物B3，SEQ ID NO.3所示的正向内引物FIP，SEQ ID NO.4所示的反向内引物BIP，SEQ ID NO.5所示的环引物LF，以及SEQ ID NO.6所示的环引物LB组成。

2.权利要求1所述的引物组合物在制备大豆茎褐腐病菌环介导等温扩增检测试剂盒中的应用。

3.一种检测大豆茎褐腐病菌的环介导等温扩增试剂盒，其特征在于包含权利要求1所述的引物组合物。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒中权利要求1所述的引物组合物浓度为：1.6μM正向内引物FIP、1.6μM反向内引物BIP、0.2μM正向外引物F3、0.2μM反向外引物B3、环引物LB和LF各0.8μM。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒还包括1.4mM dNTPs、0.8M pH8.8的Tris-HCl、0.4mM KCl、0.4mM(NH₄)₂SO₄、0.24mM 4％Triton X-100、8mM MgSO₄、0.192mM羟基溴酚蓝、8U·μL^-1 Bst DNA polymerase。

6.一种检测大豆茎褐腐病菌的方法，其特征在于利用权利要求1所述的引物组合物对待见样品的DNA进行LAMP扩增，在扩增前加入染料羟基萘酚蓝作为反应指示剂，以羟基萘酚蓝的颜色变化做为结果判定标准，天蓝色表示检测为阳性，存在大豆茎褐腐病菌；紫色表示检测结果为阴性，不存在大豆茎褐腐病菌。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于LAMP扩增的反应程序为：64℃，60min。