CN112358973B - 一种背芽突霉属菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一株背芽突霉属菌株及其应用，属于微生物技术领域。本发明所述菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20217。本发明的菌株为背芽突霉属(Cadophora sp)Cadophora luteo‑olivacea。本发明所述菌株会引起黄大豆苗期褐变症状，从而影响黄大豆生长，在筛选防治黄大豆苗期褐变症的药物过程中，黄大豆苗期褐变模型的构建具有重要意义。

Description

一种背芽突霉属菌株及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术技术领域，尤其涉及一种菌株及其应用。
背景技术
背芽突霉属Cadophora sp.常发现于腐烂的树木和植物中，可引起维管束组织褐变。Cadophora luteo-olivacea是一种广泛分布的子囊菌，常见于葡萄上，伴有黑色维管条纹和皮氏病衰退特征，可引起葡萄树干、修剪伤口以及根茎的维管束变色病症，Spadaro等2010年在意大利发现C.luteo-olivacea可导致猕猴桃采收后果皮凹陷，Halleen等2007年发现C.luteo-olivacea是南非葡萄上的一种维管束病害，也可以从健康的苗圃扦条中分离到病菌，Auger等2018年首次报道C.luteo-olivacea在智利引起猕猴桃侧腐病。
大豆苗期褐变，是由致病菌侵染大豆后引起茎部维管束和髓部变为红褐色，随后整个茎部变褐，最终引起叶片变色和叶脉间的坏死、枯斑的病变，容易造成种子数量减少、种子变小以及植株倒伏难以收获等，一般可导致30％以上的大豆产量损失，最高损失可达66％。而目前的研究中均认为这种致病菌是由大豆茎褐腐病菌Phialophora gregata引起的，因此，现有也是对大豆茎褐腐病菌的研究来防治大豆苗期病变。而本发明从美国进境黄大豆中分离到C.luteo-olivacea病菌对农药功能的鉴定研究，对防治大豆苗期褐变具有重要的意义。
发明内容
有鉴于此，本发明一方面提供保藏编号为CGMCC No.20217的背芽突霉属菌株(Cadophora luteo-olivacea)。
优选的，所述菌株由黄大豆中提取得到。
优选的，所述菌株在PDA培养基上菌落扁平，毡状或棉花状，边缘平滑均匀，菌落正面奶黄色，背面中黄色；分生孢子椭圆形、卵球形或长圆形，单胞，有1-2油球，3.1～9.8μm×1.7～3.8μm，分生孢子梗具有瓶梗状结构，无色，基部膨大。
可选的，所述菌株的最适生长温度为15～30℃，优选的为25℃，最适pH为5～8。
优选的，所述菌株的ITS基因序列如SEQ ID NO：1所示，TEF1-α序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。
本发明第二方面提供一种豆类苗期褐变模型的构建方法，包括如下步骤：
(1)将保藏编号为CGMCC No.20217的菌株接种在培养基上进行菌种扩繁；
(2)在扩繁后的菌种中加入无菌水，收集菌丝、分生孢子及分生孢子梗，得到菌液；
(3)将所述菌液接种于健康豆类茎秆内；
(4)观察接种后黄大豆植株的变化，若出现茎部变褐，叶片变色、叶脉间坏死、枯斑的褐变症状，则豆类苗期褐变模型构建成功。
优选的，所述接种菌液的豆类植株在23～28℃光照12小时的环境中培养。
本发明构建得到的豆类苗期褐变模型可以在农药功能鉴定和/或筛选中的应用。
本发明第三方面提供一种保藏编号为CGMCC No.20217的背芽突霉属菌株在鉴定豆类苗期茎杆部病害中的应用。
优选的，鉴定豆类苗期茎杆部病害包括如下步骤：挑取内部病变的茎秆残体培养病原菌，观察和/或检测病原菌，若出现上述所述菌株在PDA培养基上菌落形态，则为豆类苗期褐变病。
相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
本发明提供了一种保藏编号为CGMCC No.20217的背芽突霉属菌株，该菌株会引发豆类苗期褐变，利用本发明提供的菌株构建的豆类苗期褐变模型对于筛选防治筛选防治豆类苗期褐变症的药物具有重要意义。
附图说明
图1：黄大豆感染CGMCC No.20217菌株后植株；
图2：蚕豆感染CGMCC No.20217菌株后植株；
图3：菌株在PDA培养基上培养的菌落特征；
图4：菌株的分生孢子及分生孢子梗形态；
图5：菌株培养7天后在不同农药琼脂平板上的生长情况；
图6：不同药剂及浓度对于CGMCC No.20217菌株的抑菌率折线图。
具体实施方式
本发明从美国进境黄大豆中分离到一株背芽突霉属(Cadophora luteo-olivacea)的病菌。该菌株能够引起黄大豆苗期褐变症状，影响黄大豆生长。
本发明的菌株已于2020年7月1日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，保藏编号为CGMCC No.20217。
本发明的背芽突霉属(Cadophora luteo-olivacea)菌株可以利用PDA培养基，在15～30℃的温度，pH为5～8的条件下进行培养。
本发明的菌株在PDA培养基上菌落扁平，毡状或棉花状，边缘平滑均匀，菌落正面奶黄色，背面中黄色；分生孢子椭圆形、卵球形或长圆形，单胞，有1-2油球，3.1～9.8μm×1.7～3.8μm，分生孢子梗具有瓶梗状结构，无色，基部膨大。
本发明采用引物ITS1/ITS4对菌株的DNA进行PCR扩增及测序，获得721bp的ITS基因序列(GenBank登录号：MT197382)。BLAST分析，菌株与GenBank中Cadophora luteo-olivacea(MF960601、MF962600、MF962599)的序列相似性为97％。采用MAGA5.0软件进行系统发育关系分析，发现该菌株与Cadophora luteo-olivacea在一个分支上，基因序列如SEQID NO：1所示。
本发明采用EF1-728F/EF1-986R扩增TEF1-α基因，扩增产物送北京华大基因测序，序列分析后获得305bp的基因序列。BLAST分析，菌株与GenBank中Cadophora luteo-olivacea(MG745812、JN808856)的序列相似性为88％，基因序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明采用EF1-688F/EF1-1251R扩增TEF1-α基因，扩增产物送北京华大基因测序，序列分析后获得582bp的基因序列。BLAST分析，菌株与GenBank中Cadophora luteo-olivacea(HQ661069、HQ661071、HQ661073)的序列相似性为91％，基因序列如SEQ ID NO：3所示。
本发明通过对分离的菌株进行不同的生物学鉴定，最终认定该菌株为Cadophoraluteo-olivacea。
本发明提供了一种豆类苗期褐变模型的构建方法，包括如下步骤：
(1)将保藏编号为CGMCC No.20217的菌株接种在培养基上进行菌种扩繁；
(2)在扩繁后的菌种中加入2～3ml无菌水，收集菌丝、分生孢子及分生孢子梗，得到菌液；
(3)将收集到的菌液用针头接种于健康豆类茎秆内；
(4)接种3天后，观察接种后黄大豆植株的变化，若出现茎部变褐，叶片变色、叶脉间坏死、枯斑的症状，切开茎秆后沿维管束和髓部组织出现褐变症状，则豆类苗期褐变模型构建成功。
作为优选的技术方案，本发明将步骤(3)中的接种菌液的豆类植株在23～28℃光照12小时的环境中培养。
本发明构建得到的豆类苗期褐变模型可以用于农药功能鉴定和/或筛选。
本发明还供了一种保藏编号为CGMCC No.20217的背芽突霉属菌株在鉴定豆类苗期茎杆部病害中的应用。
作为优选的技术方案，本发明鉴定豆类苗期茎杆部病害包括如下步骤：挑取内部病变的茎秆残体培养病原菌、观察和/或检测病原菌。
本发明将内部病变的茎秆残体用0.5％次氯酸钠表面消毒3～8min，无菌水冲洗3～5次进行消毒处理。
本发明将消毒后的内部病变的茎秆残体置于20℃培养箱中的PDA培养基中培养，待长出菌丝后转至PDA平板上进行纯化，以便更清晰的显示侵染豆类茎秆的病菌形态。
本发明通过观察培养的病菌培养性状以及分生孢子形态和大小，如果菌株形态与Cadophora luteo-olivacea在PDA培养基中培养培养的形态完全一致，则说明该病害为豆类苗期褐变病。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
将保藏编号为CGMCCNo.20217的菌株接种在培养基上进行菌种扩繁，在扩繁后的菌种中加入2ml无菌水，收集菌丝、分生孢子及分生孢子梗，得到菌液，在将菌液用针头接种于健康黄大豆茎秆内，置于25℃光照12小时的环境中培养，无接种菌种的健康黄大豆为对照。接种3天后，观察接种后黄大豆植株的变化，接种3天后，黄大豆开始发病，病斑红褐色，切开茎秆后沿维管束和髓部组织出现褐变症状(如图1所示)，对照植株生长正常，无褐变。
实施例2
将保藏编号为CGMCCNo.20217的菌株接种在培养基上进行菌种扩繁，在扩繁后的菌种中加入2ml无菌水，收集菌丝、分生孢子及分生孢子梗，得到菌液，在将菌液用针头接种于健康蚕豆茎秆内，置于27℃光照12小时的环境中培养，无接种菌种的健康蚕豆为对照。接种3天后，观察接种后黄大豆植株的变化，接种3天后，蚕豆开始发病，病斑红褐色，切开茎秆后沿维管束和髓部组织出现褐变症状(如图2所示)，对照植株生长正常，无褐变。
实施例3
将实施例1或实施例2所述的接种CGMCC No.20217菌株的内部病变的茎秆残体用0.5％次氯酸钠表面消毒3min，无菌水冲洗3次进行消毒处理。将消毒后的内部病变的茎秆残体置于20℃培养箱中的pH为5的PDA培养基中培养，待长出菌丝后转至PDA平板上进行纯化，观察培养的病菌培养性状以及分生孢子形态和大小，其菌落扁平，毡状或棉花状，边缘平滑均匀，菌落正面奶黄色，背面中黄色(如图3所示)；在显微镜下观察其分生孢子椭圆形、卵球形或长圆形，单胞，有1-2油球，3.1～9.8μm×1.7～3.8μm，分生孢子梗具有瓶梗状结构，无色，基部膨大(如图4所示)。
实施例4
将CGMCC No.20217菌株分别接种于含有40.00ug/ml50％多菌灵、70％甲基托布津、75％百菌清、10％苯醚甲环唑、和450g/L咪鲜胺的琼脂平板上，以将CGMCC No.20217菌株接种于琼脂平板上为对照，7天后观察各个平板上菌株的生长情况(如图5所示)，可以看出多菌灵的抑菌效果最好。
实施例5
1.药效实验
表1.供试化学药剂
药剂 剂型 生产厂家
50％多菌灵 可湿性粉剂 江苏省江阴市福达农化有限公司
70％甲基托布津 可湿性粉剂 江苏龙灯化学有限公司
75％百菌清 可湿性粉剂 先正达(苏州)作物保护有限公司
10％苯醚甲环唑 水分散粒剂 先正达(苏州)作物保护有限公司
450g/L咪鲜胺 水乳剂 陕西恒田化工有限公司
2.药剂对菌丝的抑制效果测定，采用含药平板法：
2.1将上述5种药剂分别配制成含有有效成分：1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00μg/ml 6种质量浓度。
(1)50％多菌灵：取2g多菌灵(50％)稀释10000倍配制成100μg/ml浓液，依次取0.125ml、0.250ml、0.50ml、1.000ml、2.000ml、4.000ml配制成10ml浓液即得；
(2)75％百菌清：取1.33g百菌清(75％)稀释10000倍配制成100μg/ml浓液；
(3)70％甲基托布津：取1.43g稀释10000倍配制成100μg/ml浓液；
(4)10％苯醚甲环唑：取10g稀释10000倍配制成100μg/ml浓液；
(5)450g/L咪鲜胺：取2.22mL稀释10000倍配制成100μg/ml浓液；
2.2在无菌操作台中，用灭菌过液枪枪头和10ml量筒，在培养皿中加入1ml配好的药剂，外加已灭菌并降温的PDA培养基9ml，混匀，配成共10ml的培养基，以加入1ml无菌水和9ml灭菌PDA培养基的平板作为空白对照。
2.3待培养皿混匀冷凝后，在分离纯化培养好的病原菌菌落沿边缘用灭菌过的0.5cm打孔器取直径0.5cm的菌块，接种到含有药剂和对照组分的培养皿中央，每个培养皿放一块菌块，并且每种药剂的各个浓度设立3个重复试验。将接种好的培养皿放在27℃恒温培养箱中培养7d后采用十字交叉发测量生长菌落直径，并计算抑制率。
抑制率＝(对照菌落直径—处理菌落直径)/对照菌落直径×100％
测得的数据以质量浓度浓度为横坐标(X)，以抑制率对应的几率值作为纵坐标(Y)构建折线图，抑制率越高，说明该药剂对菌丝的抑制作用越好。
3.抑菌实验结果
将接种好的培养皿放在27℃恒温培养箱中培养7d后采用十字交叉发测量生长菌落直径，并计算抑制率，结果如下表2，测得的数据以质量浓度浓度为横坐标(X)，以抑制率对应的几率值作为纵坐标(Y)构建折线图(如图6所示)，抑制率越高，说明该药剂对菌丝的抑制作用越好。
表2.不同药剂及浓度对于CGMCC No.20217菌株的抑菌率
Figure BDA0002771834060000071
通过以上实施例可以看出，本发明的CGMCC No.20217菌株可以侵染豆类植物，从而引起褐斑病。对豆类的病害的鉴定以及防治具有重要的意义。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中华人民共和国京唐港海关
<120> 一种背芽突霉属菌株及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 721
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
taccgcgcga gcaacgggta acgttcacag actaagtgat tgtgggtagt acgctactta 60
agatatagtc gagccctcac cgaaagggga ggggtagagg tccgtaggtg aacctgcgga 120
aggatcatta ctagagcaaa ggacaggcag cgccccacag aagcttgctt cgtggcgggc 180
taccctactt cggtagggtt tagagtcgtc gaccctctcg gagaaggtcg gtcctgaact 240
ccacccttga atatattacc tttgttgctt tggcgggccg tcgcgcgcca gcggcttcgg 300
ctgttgagtg cccgccagag gaccccaact cttgttttta gtgatgtctg agtactatat 360
aatagttaaa actttcaaca acggatctct tggttctggc atcgatgaag aacgcagcga 420
aatgcgataa gtaatgtgaa ttgcagaatt cagtgaatca tcgaatcttt gaacgcacat 480
tgcgccctct ggtattccgg ggggcatgcc tgttcgagcg tcattataac cactcaagct 540
ctcgcttggt cttggggttc gcggtctcgc ggcccctaaa atcagtggcg gtgcccgtcg 600
gctctacgcg tagtaatact cctcgcgact gagtccgtta ggtctacctg ccagcaaccc 660
ctaatcttta caggttgacc tcggatcagg tagggatacc cgctgaactt aagcatatca 720
a 721
<210> 2
<211> 306
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttacttgaag ggacccttac ccaactcggc ggcttcctgt catgagaatc agcatgtgtg 60
atagacatta ggatactatg atattttgat aaaatggtgt cgatttggga aggcgaagtt 120
gttttgctgt tgttgggcag taattgtggc gaggcattgc ggtgtaaacg ctcgggcgca 180
gaaaaaatga ttgtggaatg ccccaccgag gggcaaattt tgcgataagc ccagcatcaa 240
ggcagaggtg aggggtaaat ttgagacagc gacgaaatat tcttaccttc tcgaacttct 300
cgatga 306
<210> 3
<211> 582
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcaccagtac cggcagcaat gatgagaata gcgcaatcag cttgggaggt accagtaatc 60
atgttcttga tgaaatcacg gtgaccaggg gcatctgcag acagttagca tctgtatgag 120
aactcaacag aaggagcagc ataccaatga cggtgacata gtactttggg gtctcgaact 180
tccagagagc gatatcgatg gtgataccac gctcacgctc ggcctttagc ttgtcaagca 240
cccacgcata cttgaatgaa cccttgccca actcggcggc ttcctgtcat gagaatcagc 300
atgtgtgata gacattagga tactatgata ttttgataaa atggtgtcga tttgggaagg 360
cgaagttgtt ttgctgttgt tgggcagtaa ttgtggcgag gcattgcggt gtaaacgctc 420
gggcgcagaa aaaatgattg tggaatgccc caccgagggg caaattttgc gataagccca 480
gcatcaaggc agaggtgagg ggtaaatttg agacagcgac gaaatattct taccttctcg 540
aacttctcga tggtacgctt gtcgattcca ccgcacttgt ag 582

Claims (10)

1.一种背芽突霉属菌株，其特征在于，保藏编号为CGMCCNo.20217。
2.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，所述菌株由黄大豆中提取得到。
3.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，所述菌株在PDA培养基上菌落扁平，毡状或棉花状，边缘平滑均匀，菌落正面奶黄色，背面中黄色；分生孢子椭圆形、卵球形或长圆形，单胞，有1-2油球，3.1～9.8μm×1.7～3.8μm，分生孢子梗具有瓶梗状结构，无色，基部膨大。
4.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，所述菌株的最适生长温度为15～30℃，最适pH为5～8。
5.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，所述菌株的ITS基因序列如SEQ ID NO：1所示，TEF1-α序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。
6.一种豆类苗期褐变模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将保藏编号为CGMCC No.20217的菌株接种在培养基上进行菌种扩繁；
(2)在扩繁后的菌种中加入无菌水，收集菌丝、分生孢子及分生孢子梗，得到菌液；
(3)将所述菌液接种于健康豆类茎秆内；
(4)观察接种后黄大豆植株的变化，若出现茎部变褐，叶片变色、叶脉间坏死、枯斑的褐变症状，则豆类苗期褐变模型构建成功。
7.根据权利要求6所述的一种豆类苗期褐变模型的构建方法，其特征在于，所述接种菌液的豆类植株在23～28℃光照12小时的环境中培养。
8.权利要求6或7所述方法构建得到的豆类苗期褐变模型在农药功能鉴定和/或筛选中的应用。
9.权利要求1～5任意一项所述菌株在鉴定豆类苗期茎杆部病害中的应用。
10.一种豆类苗期茎杆部病害的鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：挑取内部病变的茎秆残体培养病原菌，观察和/或检测病原菌，若与权利要求1～5任意一项所述菌株相同，则为豆类苗期褐变病。
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