CN106381341B - 一种芋疫霉菌巢式pcr检测引物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种芋疫霉菌（Phytophthora colocasiae）巢式PCR检测方法，以样品DNA为模板，疫霉菌Ypt1基因通用引物ph1F/Yph2R进行巢式PCR第1轮扩增，再以巢式PCR第1轮扩增产物为模板，通过设计的一对鉴别芋疫霉菌的特异性引物PCOF/PCOR进行巢式PCR第2轮特异性扩增；第2轮扩增产物经凝胶电泳检测，如果存在327bp的DNA特异性条带，即为检测出芋疫霉菌，否则未检出。本发明所提供的芋疫霉菌巢式PCR检测方法具准确性高、特异性强、灵敏度高、检测过程操作简便快速等优点，可用于田间芋头疫病的早期诊断和病菌的监测和鉴定，克服了传统检测和鉴定方法步骤繁琐、周期长等问题。

Description

一种芋疫霉菌巢式PCR检测引物及其应用
技术领域
本发明涉及一种芋疫霉菌巢式PCR检测引物及其应用；专用于芋头疫霉菌快速、灵敏和特异的分子检测，同时可用于芋头疫病的早期诊断和病菌的监测和鉴定，属于农作物病害检测、鉴定及防治技术领域。
背景技术
由芋疫霉菌（Phytophthora colocasiae）侵染引起的芋头疫病是芋头栽培中的主要病害之一，在芋头产区广泛分布与发生。该病初侵染主要来源于带菌的种苗和遗留田间的病株，一般4月份开始零星发生，6-9月盛行，发病率一般为20%-35%，主要危害叶片、叶柄，严重时亦危害球茎，遇高温、雨天病斑快速发展，导致叶片大量腐烂、植株折倒枯死，造成芋头产量和品质下降，芋头受害之后，产量损失高达30%-40%。近年来，随着种植结构的调整及经济效益的提升，芋头种植面积不断扩大，但是由于连年种植，芋疫病呈逐年加重趋势。
芋疫霉菌具有很强的侵染性，一旦扩散蔓延则难以控制，如果能够在芋疫霉菌感染早期，及时、准确地进行检测鉴定，可以做到提前预防，如选择敏感有效的杀菌剂，对控制病情的流行大暴发具有重要意义。因此，建立一种能够快速、准确的监测和鉴别芋疫霉菌的检测方法对于我国芋头的安全生产具有重大的意义。
植物病原菌传统的检测方法是采用选择性培养基从土壤、植物组织或水体中分离菌株，再对这些菌株的形态等进行鉴定，来确定是否存在病原菌，或者用肉眼和借助显微镜技术对发病症状进行判定。传统的检测方法不仅费时、准确度低，而且要求检测人员要有丰富的经验，最重要一点是易遗漏潜育期或隐症的病害，以致延误病害的防治，导致病害的暴发，因此传统病原学检测方法已不能满足现代植物病理学研究的需要。
随着分子生物学技术的发展，应用PCR技术对病原菌进行特异、灵敏的快速分子检测的成功例子已越来越多。国内外已有学者主要利用rDNA/ITS序列设计特异引物来对植物病原菌进行快速检测、鉴定。然而疫霉属卵菌的分子检测技术研究结果表明，rDNA/ITS在疫霉属的近缘种之间变化很小，从ITS序列上设计引物很难将两个相似高的种区分开。因此要对疫霉属病原菌进行高灵敏性和特异性检测，应从疫霉菌其它基因上设计引物进行检测。目前用于疫霉菌分子检测的靶标基因主要有elicitin基因、β-tubulin、线粒体Cox1和Cox2编码基因以及可能编码储存蛋白的Lpv基因等。
已有研究表明，疫霉属中的Ras家族相关的Ypt1编码基因含有多个外显子和内含子，外显子具有保守性，而这些内含子在不同种之间具有多变性，非常适合于设计引物进行疫霉属卵菌近缘种的特异性分子检测、鉴定，目前尚无针对该靶标基因设计的特异性芋疫霉菌PCR检测引物的报道。本发明通过对疫霉属（Phytophthora）及其亲缘较近的Ypt1基因序列进行比对分析，设计出1对可用于特异性检测芋疫霉菌的PCR引物，为芋疫霉菌的准确鉴定和快速检测提供技术和方法，有利于及早有效地对芋头疫病采取防治措施。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中对芋疫霉菌检测和鉴定主要基于形态学特征，方法耗时长、程序繁琐、经验性强、准确度低，难以做到对病害发生的及时监测和控制病原菌的传播、流行的问题，以及现有分子检测中rDNA-ITS序列差异很小，以ITS为靶标设计的引物难以将一些近缘种的病原菌区分开的技术缺欠，提供了芋疫霉菌特异性PCR检测引物及其检测方法，利用本发明所述的PCR检测引物和检测方法检测芋疫霉菌准确性高、特异性强、灵敏度高、易于操作、检测时间短且结果可靠。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
1．芋疫霉菌巢式PCR特异性引物：
通过测定芋疫霉菌（Phytophthora colocasiae）和其它疫霉菌（Phytophthora spp）的Ypt1基因序列，对疫霉属不同种间Ypt1基因序列进行比对分析，设计出对芋疫霉菌具有特异性扩增作用的1对引物，即特异PCR检测引物的序列为：
上游引物PCOF：5'- AAGAGGTCCTGTGAGGTTCAA -3'，
下游引物PCOR：5'- AATCTCATGCAGCCACTGCT -3'；
对芋疫霉菌特异性扩增出327bp的产物。
2. 一种芋疫霉菌巢式PCR检测方法，包括以下步骤：
（1）提取待测样品基因组DNA。
用于检测病原菌纯培养物时，采用CTAB 法进行提取基因组DNA，具体方法如下：取少量菌丝粉于1.5 mL离心管中（菌丝粉刚盖过半圆形底部为宜），加入900 µL 2%CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）提取液（2% CTAB；100 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0；20 mmol/L EDTA，pH8.0；1.4 mol/L NaCl）和90 µL SDS（十二烷基苯磺酸钠）【注：CTAB，SDS需60℃预热】，使用振荡器振荡混匀，60℃水浴1h（DNA释放至缓冲液中），12000 r·min-1离心15 min；取上清液700 µL，加等体积酚、氯仿、异戊醇（25:24:1），轻轻振荡混匀，12000 r·min-1离心9min；取上清液500 µL，加入等体积氯仿再抽提一次，12000 r·min-1离心5 min；取上清液350 µL，加入1/10体积3 mol· L-1 NaAc和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀30 min，12000 r·min-1离心5 min；弃去上清液，加入700µL 冰70%乙醇进行洗涤（稍离心；倾掉上清液），在超净工作台上晾干无酒精味，加入30~60 µL TE（10 mmol/L Tris-HCl，0.1 mmol/L EDTA，pH8.0） 溶液进行溶解，得到 DNA 溶液，用紫外分光光度计检测 DNA 浓度并稀释至100 ng/µL待用。
用于检测芋头组织中存在芋疫霉菌时，采用NaOH快速裂解法提取DNA，具体过程如下：向每毫克植物组织中加入10µL 0.5 mol/L NaOH，在研钵中将组织充分磨碎成糊后转入1.5mL离心管中，12,000 rpm离心6 min，取上清液5 µl加入495µL 0.1 mol/L Tris-HCl（pH=8.0）混合均匀，取1.0 µL作为PCR模板进行扩增；
用于检测土壤样品中存在芋疫霉菌时，采用土壤DNA提取试剂盒，提取DNA。
（2）巢式PCR第1轮扩增：所用引物为：
ph1F：5'-CGACCATTGGCGTGGACTTT-3'，
Yph2R：5'-ACGTTCTCGCAGGCGTATCT-3'；
以步骤（1）提取的DNA为模板，利用Ypt1基因通用引物对ph1F/Yph2R进行第1轮PCR扩增；
PCR反应体系25 µL：2×Taq PCR Master Mix 12.5µL，10 µmol/L的ph1F /Yph2R引物各1.0µL，DNA模板1.0µL，用无菌超纯水补足至25 µL；
PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1 min、58℃退火30 S、72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸10 min；
（3）第2轮PCR扩增：所用引物对为权利要求1所述的PCOF/PCOR，待步骤（2）第一轮PCR扩增结束后，取1.0μl 第一轮PCR扩增产物稀释1-100倍为模板；
PCR反应体系25 µL：2×Taq PCR Master Mix 12.5µL，10 µmol/L的 PCOF/PCOR引物各1.0µL，DNA 模板1.0µL，用无菌超纯水补足至25 µL；
PCR条件为：扩增参数为95 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，58 ℃退火45 s，72℃延伸30 s，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min；
（4）取步骤（2）的PCR扩增产物5.0 µL用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳分离，4-5V/cm，电泳40min后经溴化乙锭染色于紫外灯下观察，根据扩增产物的有无及其片段大小对结果进行判断，如果能特异性地扩增出约327bp的产物，即可判断所述的检测样品中存在芋疫霉菌，否则所述的检测样品中未存在该菌。
本发明的显著优点
本发明与现有技术相比，具有以下的技术优势和有益效果：
1.特异性强、准确性高：本发明是根据疫霉菌Ypt1基因含有多个外显子和内含子，且其基因序列保守区和进化区相互间隔的特点，设计了对芋疫霉菌具有特异扩增作用的PCR引物，并已经对不同地理来源的芋疫霉菌和携带芋疫霉菌的植物组织进行了测试验证，只有芋疫霉菌和携带该病菌的样品能特异性地扩增出一条327bp的电泳条带，说明本发明所设计的引物具有很强的特异性和准确性。
2.灵敏度高：病原菌传统的检测方法是通过分离、纯化和形态学鉴定等步骤，这种传统方法的成功需要发病组织中积累到足够量的病原体才能成功。而本发明将设计的特异引物与Ypt1基因通用引物联合起来进行巢式PCR扩增后，对芋疫霉菌的检测灵敏度在DNA水平上可达到10fg/µL，比常规PCR检测提高了10000倍；
3.实用性好：芋疫霉菌的快速检测，具有重要的实际应用价值。传统的芋疫霉菌的检测方法一般是在芋头疫病出现症状后，借助其发病症状，对病原菌进行分离、纯化、鉴定等一系列繁琐的过程，所需时间较长；给快速而精确地检测病原物增加了难度，传统的方法由于不能在病害发病前期及时进行田间的病原菌动态的监测和检测，时常给农业生产的防治延误时机。本发明可对芋头植株组织中是否携带芋疫霉菌进行检测，如果能特异性地扩增出327bp的电泳条带，说明植物组织中存在芋疫霉菌，因此本发明可用于芋头疫病显症之前的早期监测，可为确定病害防治最佳时期和防治策略的制定提供科学依据，因此本发明具有较好的实用性；
4.操作简便、快速：应用本发明方法，对待测样品基因组DNA进行提取、PCR扩增和常规的琼脂糖电泳后即可判定结果，整个检测过程采用DNA快速提取方法，操作简单，无需对病原菌进行分离培养，大大缩短了检测时间，一般整个检测过程可在6小时内完成。
附图说明
图1为本发明引物对芋疫霉菌的特异PCR扩增图，图中：泳道M为2000bp Marker，泳道1-3为芋疫霉菌，泳道4-7分别为辣椒疫霉菌、晚疫病菌、大豆疫霉菌和豇豆疫霉菌，泳道8为阴性对照；
图2为本发明引物对芋疫霉菌的灵敏性检测扩增结果图，图2-a为单重PCR对芋疫霉菌的灵敏性检测结果，图2-b为巢式PCR对芋疫霉菌的灵敏性检测结果，图中泳道M为2000bp Marker，泳道1为100 ng，泳道2为10 ng，泳道3为1 ng，泳道4为100 pg，泳道5为10pg，泳道6为1 pg，泳道7为100 fg，泳道8为10 fg，泳道9为1 fg，泳道10为阴性对照；
图3为本发明检测方法对芋头植株组织和土壤样品带菌检测结果电泳图，图中泳道M为2000bp Marker，泳道1为阳性对照，泳道2 -3为自然发病的芋头疫病叶，泳道4为发病田块土壤，泳道5-6为健康芋头叶片，泳道7为高压灭菌土壤，泳道8为阴性对照。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步阐述， 但不用来限制本发明的范围。以下实施例均按照常规实验条件，或已发表相关文献中所述的操作技术规程，或按照厂商所建议的实验条件。
实施例 1：芋疫霉菌PCR检测引物的设计及引物对芋疫霉菌的特异性验证
1.芋疫霉菌基因组DNA的提取
采用CTAB 法提取不同地区来源的芋疫霉菌基因组 DNA，具体方法如下：取少量菌丝粉于1.5 mL离心管中（菌丝粉刚盖过半圆形底部为宜），加入900 µL 2%CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）提取液（2% CTAB；100 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0；20 mmol/L EDTA，pH8.0；1.4 mol/L NaCl）和90 µL SDS（十二烷基苯磺酸钠）【注：CTAB，SDS需60℃预热】，使用振荡器振荡混匀，60℃水浴1h（DNA释放至缓冲液中），12000 r·min-1离心15 min；取上清液700µL，加等体积酚、氯仿、异戊醇（25:24:1），轻轻振荡混匀，12000 r·min-1离心9 min；取上清液500 µL，加入等体积氯仿再抽提一次，12000 r·min-1离心5 min；取上清液350 µL，加入1/10体积3 mol·L-1 NaAc和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀30 min，12000 r·min-1离心5min；弃去上清液，加入700µL 冰70%乙醇进行洗涤（稍离心；倾掉上清液），在超净工作台上晾干无酒精味，加入30~60 µL TE（10 mmol/L Tris-HCl，0.1 mmol/L EDTA，pH 8.0） 溶液进行溶解，得到 DNA 溶液，用紫外分光光度计检测 DNA 浓度并稀释至100 ng/µL待用。
2.芋疫霉菌检测靶标Ypt1基因扩增及测序
以Ypt1基因通用引物ph1F/Yph2R对供试芋疫霉菌（P.colocasiae）的Ypt1基因进行扩增，PCR反应体系25 µL，包括2×Taq PCR Master Mix（北京天根生化科技有限公司）12.5µL，10 µmol/L的ph1F / Yph2R引物各1.0µL，DNA 模板1.0µL，用无菌超纯水补足至25µL。扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1 min、58℃退火30 S、72℃延伸1 min，35个循环，最后72℃延伸10 min。将PCR扩增产物送至上海生工生物工程有限公司进行测序。
3.芋疫霉菌特异引物的设计
将测序得到的芋疫霉菌（P.colocasiae）的Ypt1基因序列与GenBank中疫霉属18个不同种的Ypt1基因序列进行同源性比较分析，根据芋疫霉菌与其它种间的差异位点（在BioEdit中比对），用Primer Primer5软件设计 了芋疫霉菌（P.colocasiae）的特异性引物：
上游引物PCOF：5'- AAGAGGTCCTGTGAGGT TCAA -3'，
下游引物PCOR：5'- AATCTCATGCAGCCACTGCT -3'，
引物由上海生工生物工程有限公司合成。
4.芋疫霉菌特异性PCR检测方法的建立及引物特异性PCR验证
在已设计特异引物的基础上，通过PCR反应体系和扩增参数的优化，建立的芋疫霉菌PCR检测方法，PCR反应体系25 µL，包括2×Taq PCR Master Mix（北京天根生化科技有限公司）12.5µL，10 µmol/L的PCOF/PCOR引物各1.0µL，DNA 模板1.0µL，用无菌超纯水补足至25 µL。扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1 min、58℃退火45S、72℃延伸30 s，35个循环，最后72℃延伸10 min。以供试的芋疫霉菌及其它病原菌的基因组DNA为模板，采用已建立好的芋疫霉菌PCR检测扩增体系和扩增程序对芋疫霉菌引物PCOF/PCOR的特异性进行验证。取5 µL PCR产物进行1.5%琼脂糖电泳检测，经溴化乙锭染色后于紫外灯下观察，根据DNA条带的有无及大小对芋疫霉菌引物的特异性进行验证。
5.引物特异性验证结果
PCR扩增结果表明，引物PCOF/PCOR只能特异性地从供试的芋疫霉菌基因组DNA中扩增出大小约为327bp的条带（图1），而其它病原菌及阴性对照均无扩增条带。说明该对引物可以将芋疫霉菌与其它病原菌区分开来，具有种的特异性，可用于芋疫霉菌快速可靠的检测和鉴定。
实施例2：芋疫霉菌巢式PCR检测方法及灵敏度测定
1.常规PCR扩增
用无菌超纯水对芋疫霉菌基因组DNA进行稀释，配制成10倍数量级的系列浓度备用。使用本发明所述引物PCOF/PCOR对不同系列浓度的基因组DNA进行PCR扩增，评估该引物对芋疫霉菌基因组DNA检测的灵敏性，扩增反应体系和反应程序如下：PCR反应体系25 µL，包括2×Taq PCR Master Mix（北京天根生化科技有限公司）12.5µL，10 µmol/L的PCOF/PCOR引物各1.0µL，DNA 模板1.0µL，用无菌超纯水补足至25 µL。扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1 min、58℃退火45 S、72℃延伸1 min，35个循环，最后72℃延伸10 min。
巢式PCR扩增
（1）DNA模板的稀释：用无菌超纯水对芋疫霉菌基因组DNA进行稀释，配制成10倍数量级的系列浓度备用。
（2）巢式PCR第1轮扩增：以不同稀释浓度的DNA为模板，利用Ypt1基因通用引物ph1F/ph2R进行巢式PCR第1轮扩增，扩增反应体系和反应程序如下：PCR反应体系25 µL，包括2×Taq PCR Master Mix（北京天根生化科技有限公司）12.5µL，10 µmol/L的ph1F /Yph2R引物各1.0µL，DNA模板1.0µL，用无菌超纯水补足至25 µL。扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1 min、58℃退火30 S、72℃延伸1 min，35个循环，最后72℃延伸10 min。
（3）巢式PCR第2轮扩增：待第一轮PCR扩增结果后，取1.0μl 第一轮PCR产物为模板或稀释液与引物PCOF/PCOR组合进行巢式PCR第2轮扩增。PCR反应体系25 µL，包括2×TaqPCR Master Mix（北京天根生化科技有限公司）12.5µL，10 µmol/L的PCOF/PCOR引物各1.0µL，第一轮PCR产物1.0µL，用无菌超纯水补足至25 µL。扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1 min、58℃退火45 S、72℃延伸1 min，35个循环，最后72℃延伸10 min。
常规PCR和巢式PCR灵敏度比较：当以本发明所述引物PCOF/PCOR进行常规PCR扩增时，反应灵敏度可以达到100pg DNA 25μl-1反应体系（图2中的a）。进一步以Ypt1基因通用引物ph1F /Yph2R进行第一轮扩增得到的PCR产物作为模板，以PCOF/PCOR作为第二轮扩增引物进行巢式PCR扩增，从电泳图可以看出巢式PCR的特异性扩增条带比常规PCR要亮得多，能够使原来看不到条带的样品（10pg、1 pg、100fg、10fg/25μl反应体系）产生可见条带(图2中的b)，灵敏度达到10fg DNA 25μl-1反应体系，比常规PCR要提高10000倍左右。
实施例3：芋头发病叶片中芋疫霉菌的检测
发病叶片中芋疫霉菌DNA的提取：采用NaOH快速裂解法提取DNA，具体过程如下：向每毫克植物组织中加入10µL 0.5 mol/L NaOH，在研钵中将组织充分磨碎成糊后转入1.5mL离心管中，12,000 rpm离心6 min，取上清液5 µl加入495µL 0.1 mol/L Tris-HCl（pH=8.0）混合均匀，取1.0 µL作为PCR模板进行扩增。
巢式PCR扩增检测：以所提的DNA为模板，利用Ypt1基因通用引物ph1F/ph2R进行巢式PCR第1轮扩增，扩增反应体系和反应程序如下：PCR反应体系25 µL，包括2×Taq PCRMaster Mix（北京天根生化科技有限公司）12.5µL，10 µmol/L的ph1F /Yph2R引物各1.0µL，DNA模板1.0µL，用无菌超纯水补足至25 µL。扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min、58℃退火30 S、72℃延伸1 min，35个循环，最后72℃延伸10 min。待第一轮PCR扩增结束后，取1.0μl 第一轮PCR产物为模板或稀释液与引物PCOF/PCOR组合进行巢式PCR第2轮扩增。PCR反应体系25 µL，包括2×Taq PCR Master Mix（北京天根生化科技有限公司）12.5µL，10 µmol/L的PCOF/PCOR引物各1.0µL，第一轮PCR产物1.0µL，用无菌超纯水补足至25 µL。扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1 min、58℃退火45 S、72℃延伸1 min，35个循环，最后72℃延伸10 min。
结果检测：取巢式PCR第2轮扩增产物5.0 µL用1.5%琼脂糖电泳分离，电压为4-5V/cm，电泳结束经溴化乙锭染色后于紫外灯下观察，根据扩增产物的有无及其片段大小对结果进行判断，如果能特异性地扩增出约327bp的产物，即可判断发病叶片组织中带有芋疫霉菌。检测结果（图3）表明，芋头疫病发病症状典型的叶片组织中均可检测出芋疫霉菌，而健康叶片组织及阴性对照则无特异性条带出现，说明该套技术能用于芋头组织中芋疫霉菌的快速分子检测。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建省农业科学院植物保护研究所
<120> 一种芋疫霉菌巢式PCR检测引物及其应用
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aagaggtcct gtgaggttca a 21
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<400> 2
aatctcatgc agccactgct 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> ph1F
<400> 3
cgaccattgg cgtggacttt 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Yph2R
<400> 4
acgttctcgc aggcgtatct 20

Claims (2)

1.一种芋疫霉菌巢式PCR检测方法，其特征在于，包括以下具体步骤：
(1)提取待测样品基因组DNA；
(2)巢式PCR第1轮扩增：所用引物为：
ph1F：5′-CGACCATTGGCGTGGACTTT-3′，
Yph2R：5′-ACGTTCTCGCAGGCGTATCT-3′；
以步骤(1)提取的DNA为模板，利用Ypt1基因通用引物对ph1F/Yph2R进行第1轮PCR扩增；
PCR反应体系25L：2×TaqPCRMasterMix12.5L，10mol/L的ph1F/Yph2R引物各1.0L，DNA模板1.0L，用无菌超纯水补足至25L；
PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min、58℃退火30S、72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸10min；
(3)巢式PCR第2轮PCR扩增：所用引物对为：
PCOF：5′-AAGAGGTCCTGTGAGGTTCAA-3′，
PCOR：5′-AATCTCATGCAGCCACTGCT-3′，
待步骤(2)第一轮PCR扩增结束后，取1.0μl第一轮PCR扩增产物稀释1-100倍为模板；
PCR反应体系25L：2×TaqPCRMasterMix12.5L，10mol/L的PCOF/PCOR引物各1.0L，DNA模板1.0L，用无菌超纯水补足至25L；
PCR条件为：扩增参数为95℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火45s，72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃延伸10min；
(4)凝胶电泳检测：取5.0L步骤(3)第2轮PCR扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳分离，电压为4-5V/cm，电泳40min后经溴化乙锭染色于紫外灯下观察，根据扩增产物的有无及其片段大小对结果进行判断，如果能特异性地扩增出327bp的产物，即可判断所述的检测样品中存在芋疫霉菌；若无特异性条带则说明样品中无芋疫霉菌。
2.利用权利要求1所述的一种芋疫霉菌巢式PCR检测方法在芋头疫病的早期诊断和病菌的监测、鉴定上的应用。
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