CN109234463A - 用于检测猪传染性胃肠炎病毒的引物及探针、荧光定量pcr试剂盒及方法和应用 - Google Patents
用于检测猪传染性胃肠炎病毒的引物及探针、荧光定量pcr试剂盒及方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于检测猪传染性胃肠炎病毒的引物及探针、荧光定量PCR试剂盒及方法和应用，其中，引物的核苷酸序列如下：上游引物：5'TTGTCTGGGTTGCCAAGGAT 3'，下游引物：5'TCATTATTAGCACCACGACTACCAA 3'；探针的序列如下：5'FAM‑CCATGAACAAACCAAC‑MGB 3'。本发明的有益效果是：使用本发明的试剂盒能够快速、准确地实现对猪传染性胃肠炎病毒的检测；该方法特异性强、灵敏度高、重复性好，为猪传染性胃肠炎病毒的实验室诊断及流行病学调查提供了快速、准确的检测手段。
Description
技术领域
本发明涉及病毒PCR检测技术领域，特别涉及一种用于检测猪传染性胃肠炎病毒的引物及探针、荧光定量PCR试剂盒及PCR检测体系构建方法和应用。
背景技术
猪传染性胃肠炎病毒（Porcine transmissible gastroenteritis virus，TGEV）,属于冠状病毒科,是猪传染性胃肠炎（TGE）的病原。TGE是一种高度传染性肠道疾病，各种年龄的猪都容易感染和发病，尤以引起2周龄以下仔猪呕吐、严重腹泻和高死亡率为特征。TGE在我国部分地区不时发生和流行，且TGEV常与其他病毒混合感染，对我国养猪业具有很大危害性。TGEV感染猪引起的腹泻症状与其他的猪腹泻类病毒症状非常相似，在临床上很难区分，必须依靠实验室检测进行确诊。因此，建立一种快速有效的TGEV特异性检测方法，对于TGEV的鉴别诊断及流行病学调查具有重要意义。
目前，TGEV临床样品常用的实验室诊断方法主要有RT-PCR、病毒分离鉴定以及序列测定等。这些常规方法操作繁琐并且检测耗时长，有的需要5-7天甚至更长的时间才能出结果。另外这些常规方法在用于TGEV检测时在特异性和敏感性方面存在不足，尤其体现在病毒感染初期病毒含量较低的时候。荧光定量PCR在常规PCR基础上引入了荧光探针，使得检测方法具有更高的特异性和敏感性，并且PCR结束后可以直接观察结果，无需进一步凝胶电泳。整个过程操作简单，用时短，已经越来越多的被应用于病原检测领域。
本发明根据GenBank中TGEV基因序列设计一对特异性引物和一条特异性TaqMan-MGB探针，建立了一种快速检测TGEV病毒载量的特异性TaqMan-MGB荧光定量PCR方法。通过对反应条件和反应体系的优化，使得该方法在3.15x102-3.15x109copies•μL-1范围内具有良好的线性关系，敏感性是常规PCR方法的100倍。利用所建立的荧光定量PCR方法可以在2-3h内快速准确地对样品中的TGEV进行检测，既能进行定性检测，又能准确定量。而且与常规PCR方法相比，该方法可对其结果进行实时监控，无需进一步进行凝胶电泳分析。该方法的建立为TGEV的实验室诊断及流行病学调查提供了快速、准确的检测手段。
发明内容
为了能够提供一种更加快速、特异及敏感的TGEV检测方法，为TGEV的快速特异性检测及其流行病学调查以及预防和控制我国TGEV的流行提供可靠的技术工具，本发明提供了一种用于检测TGEV的特异性引物及探针、荧光定量PCR试剂盒及方法和应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供了一种用于TGEV特异性检测用引物及探针，其中：
所述引物序列如下：
上游引物： 5' TTGTCTGGGTTGCCAAGGAT 3'，
下游引物： 5' TCATTATTAGCACCACGACTACCAA 3'；
所述探针序列如下所示：
5' FAM- CCATGAACAAACCAAC-MGB 3'。
为了更好的实现上述发明目的，本发明还提供了一种用于检测TGEV的荧光定量PCR检测试剂，所述试剂包括以下组分：反应混合液、水和用于TGEV特异性检测用引物和探针；
所述引物序列如下：
上游引物： 5' TTGTCTGGGTTGCCAAGGAT 3'，
下游引物： 5' TCATTATTAGCACCACGACTACCAA 3'；
所述探针序列如下所示：
5' FAM- CCATGAACAAACCAAC-MGB 3'。
其中，所述反应混合液为TaKaRa公司生产的Premix Ex Taq（Probe qPCR）。
所述水为TaKaRa公司生产的RNase-free Water。
一种制备检测TGEV的荧光定量PCR试剂盒，为含有上述的荧光定量PCR检测试剂的试剂盒。
所述引物和探针或所述试剂或所述试剂盒，在检测TGEV或制备检测TGEV检测产品中的应用。
为了更好的实现上述发明目的，本发明还提供了一种用于检测TGEV的荧光定量PCR检测体系的构建方法，所述构建方法包括：
（1）设计及合成引物和探针；其中，所述引物序列如下：
上游引物： 5' TTGTCTGGGTTGCCAAGGAT 3'，
下游引物： 5' TCATTATTAGCACCACGACTACCAA 3'；
所述探针序列如下所示：
5' FAM- CCATGAACAAACCAAC-MGB 3'；
（2）制备阳性质粒标准品；
（3）进行荧光定量PCR反应条件的优化，建立荧光定量PCR检测体系。
其中，所述步骤（2）具体为：
用DNA/RNA核酸共提试剂盒提取样品中的总RNA，取5.5μL总RNA、4μL 5×All-In-OneRT MasterMix和10.5μL RNase-free Water，混匀后进行反转录，反转录条件为25℃保持10min、42℃保持30min，所得产物为cDNA，可直接用于荧光定量PCR或置-20℃保存备用；
以上下游引物通过常规PCR扩增TGEV目的基因，产物经回收试剂盒纯化后连接pMD19-T载体，转化至E.coli DH5α大肠杆菌，通过序列测定获得阳性克隆质粒即为质粒标准品；测定DNA浓度后，换算成拷贝数，并稀释至1010copies•μL-1，-20℃保存，用前稀释作为质粒标准品。
所述步骤（3）中，优化后的反应条件为：95℃ 2min；95℃ 15sec，60℃ 35sec，40个循环。
所述步骤（3）中，所述荧光定量PCR检测体系共为25μL，含12.5μL 2×Premix ExTaq（Probe qPCR），10μL RNase-free water，0.5μL Probe（10μM），0.5μL Primer F（10μM），0.5μL Primer R（10μM），1μL质粒标准品。
为了更好的实现上述发明目的，本发明还提供了一种用于检测TGEV的荧光定量PCR检测方法，所述检测方法包括：
（1）设计及合成引物和探针；其中，所述引物序列如下：
上游引物： 5' TTGTCTGGGTTGCCAAGGAT 3'，
下游引物： 5' TCATTATTAGCACCACGACTACCAA 3'；
所述探针序列如下所示：
5' FAM- CCATGAACAAACCAAC-MGB 3'。
（2）制备阳性质粒标准品；
（3）进行荧光定量PCR反应条件的优化，建立荧光定量PCR检测体系；
（4）采用荧光定量PCR检测体系对病毒进行检测。
其中，所述步骤（2）具体为：
用DNA/RNA核酸共提试剂盒提取样品中的总RNA，取5.5μL总RNA、4μL 5×All-In-OneRT MasterMix和10.5μL RNase-free Water，混匀后进行反转录，反转录条件为25℃保持10min、42℃保持30min，所得产物为cDNA，可直接用于荧光定量PCR或置-20℃保存备用；
以上下游引物通过常规PCR扩增TGEV目的基因，产物经回收试剂盒纯化后连接pMD19-T载体，转化至E.coli DH5α大肠杆菌，通过序列测定获得阳性克隆质粒即为质粒标准品；测定DNA浓度后，换算成拷贝数，并稀释至1010copies•μL-1，-20℃保存，用前稀释作为质粒标准品。
所述步骤（3）中，优化后的反应条件为：95℃ 2min；95℃ 15sec，60℃ 35sec，40个循环。
所述步骤（3）中，所述荧光定量PCR检测体系共为25μL，含12.5μL 2×Premix ExTaq（Probe qPCR），10μL RNase-free water，0.5μL Probe（10μM），0.5μL Primer F（10μM），0.5μL Primer R（10μM），1μL质粒标准品。
本发明的有益效果是：本发明的引物和探针是根据GenBank中猪传染性胃肠炎病毒序列设计出的一对特异性引物和一条特异性TaqMan-MGB探针，并建立了一种快速、准确检测TGEV病毒载量的特异性TaqMan-MGB荧光定量PCR方法，使得该方法在3.15x102-3.15x109copies•μL-1范围内具有良好的线性关系，敏感性是常规PCR方法的100倍；而且与常规PCR方法相比，该方法可对其结果进行实时监控，无需进一步进行凝胶电泳分析；将待检样品提取RNA反转录成cDNA之后进行荧光定量PCR反应，可以在2-3h内快速准确地对样品中的TGEV进行检测，既能进行定性检测，又能准确定量；进一步地，通过试验表明，利用本发明引物和探针构建的荧光定量PCR检测方法，具有特异性强、灵敏度高、重复性好等优势，为TGEV的早期快速检测，及其流行病学调查以及预防和控制我国TGEV的流行提供快速、简便和可靠的技术工具。
附图说明
图1 为本发明实施例6中TGEV TaqMan-MGB荧光定量PCR动力学曲线图；其中，1-8分别为3.15x109-3.15x102copies•μL-1的标准品。
图2为本发明实施例6中TGEV TaqMan-MGB荧光定量PCR标准曲线图。
图3 为本发明实施例6中TGEV TaqMan-MGB荧光定量PCR特异性试验结果的示意图；其中，1：TGEV阳性样品；2-10分别为CSFV, PRRSV, PRV, PEDV, PDCoV, RV, PPV, PCV2和阴性对照。
图4 为本发明实施例6中TGEV常规PCR敏感性试验结果的示意图；其中，M：DL2000Marker；1-9分别为：稀释度为3.67×108-3.42×101copies•μL-1的TGEV cDNA和阴性对照。
具体实施方式
本发明根据GenBank中猪传染性胃肠炎病毒（Porcine deltacoronavirus, TGEV）基因序列设计一对特异性引物和一条特异性TaqMan-MGB探针，建立了一种快速检测TGEV病毒载量的特异性TaqMan-MGB荧光定量PCR方法。通过对反应条件和反应体系的优化，使得该方法在3.15x102-3.15x109copies•μL-1范围内具有良好的线性关系，敏感性是常规PCR方法的100倍。而且与常规PCR方法相比，该方法可对其结果进行实时监控，无需进一步进行凝胶电泳分析。
为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，对本方案进行阐述。
实施例1 引物及探针
本发明实施例提供了一种用于TGEV特异性检测用引物及探针，其中：
所述引物序列如下：
上游引物： 5' TTGTCTGGGTTGCCAAGGAT 3'，
下游引物： 5' TCATTATTAGCACCACGACTACCAA 3'；
所述探针序列如下所示：
5' FAM- CCATGAACAAACCAAC-MGB 3'。
实施例2 荧光定量PCR检测试剂
本发明实施例提供了一种用于检测TGEV的荧光定量PCR检测试剂，所述试剂包括以下组分：反应混合液、水和用于检测TGEV的引物和探针；其中，
所述引物序列如下：
上游引物： 5' TTGTCTGGGTTGCCAAGGAT 3'，
下游引物： 5' TCATTATTAGCACCACGACTACCAA 3'；
所述探针序列如下所示：
5' FAM- CCATGAACAAACCAAC-MGB 3'。
反应混合液为TaKaRa公司生产的Premix Ex Taq（Probe qPCR）；水为TaKaRa公司生产的RNase-free Water。
实施例3 荧光定量PCR试剂盒
本发明实施例提供了一种制备检测TGEV的荧光定量PCR试剂盒，具体为含有实施例2荧光定量PCR检测试剂的试剂盒。
实施例4 PCR检测体系的构建方法
本发明实施例提供了一种用于检测TGEV的荧光定量PCR检测体系的构建方法，构建方法包括：
（1）设计及合成引物和探针；
所述引物序列如下：
上游引物： 5' TTGTCTGGGTTGCCAAGGAT 3'，
下游引物： 5' TCATTATTAGCACCACGACTACCAA 3'；
所述探针序列如下所示：
5' FAM- CCATGAACAAACCAAC-MGB 3'；
（2）制备阳性质粒标准品；
（3）进行荧光定量PCR反应条件的优化，建立荧光定量PCR检测体系。
其中，所述步骤（2）具体为：
用DNA/RNA核酸共提试剂盒提取样品中的总RNA，取5.5μL总RNA、4μL 5×All-In-OneRT MasterMix和10.5μL RNase-free Water，混匀后进行反转录，反转录条件为25℃保持10min、42℃保持30min，所得产物为cDNA，可直接用于荧光定量PCR或置-20℃保存备用；
以上下游引物通过常规PCR扩增TGEV目的基因，产物经回收试剂盒纯化后连接pMD19-T载体，转化至E.coli DH5α大肠杆菌，通过序列测定获得阳性克隆质粒即为质粒标准品；测定DNA浓度后，换算成拷贝数，-20℃保存，用前稀释作为质粒标准品。
步骤（3）中，优化后的反应条件为：95℃ 2min；95℃ 15sec，60℃ 35sec，40个循环。
步骤（3）中，所述荧光定量PCR检测体系共为25μL，含12.5μL 2×Premix Ex Taq（Probe qPCR），10μL RNase-free water，0.5μL Probe（10μM），0.5μL Primer F（10μM），0.5μL Primer R（10μM），1μL质粒标准品。
实施例5 荧光定量PCR检测方法
本发明实施例提供了一种用于检测TGEV的荧光定量PCR检测方法，检测方法包括：
（1）设计及合成引物和探针；
所述引物序列如下：
上游引物： 5' TTGTCTGGGTTGCCAAGGAT 3'，
下游引物： 5' TCATTATTAGCACCACGACTACCAA 3'；
所述探针序列如下所示：
5' FAM- CCATGAACAAACCAAC-MGB 3'；
（2）制备阳性质粒标准品；
（3）进行荧光定量PCR反应条件的优化，建立荧光定量PCR检测体系；
（4）采用荧光定量PCR检测体系对病毒进行检测。
其中，所述步骤（2）具体为：
用DNA/RNA核酸共提试剂盒提取样品中的总RNA，取5.5μL总RNA、4μL 5×All-In-OneRT MasterMix和10.5μL RNase-free Water，混匀后进行反转录，反转录条件为25℃保持10min、42℃保持30min，所得产物为cDNA，可直接用于荧光定量PCR或置-20℃保存备用；
以上下游引物通过常规PCR扩增TGEV目的基因，产物经回收试剂盒纯化后连接pMD19-T载体，转化至E.coli DH5α大肠杆菌，通过序列测定获得阳性克隆质粒即为质粒标准品；测定DNA浓度后，换算成拷贝数，-20℃保存，用前稀释作为质粒标准品。
步骤（3）中，优化后的反应条件为：95℃ 2min；95℃ 15sec，60℃ 35sec，40个循环。
步骤（3）中，所述荧光定量PCR检测体系共为25μL，含12.5μL 2×Premix Ex Taq（Probe qPCR），10μL RNase-free water，0.5μL Probe（10μM），0.5μL Primer F（10μM），0.5μL Primer R（10μM），1μL质粒标准品。
实施例6 应用
本实施例提供了一种引物和探针、或荧光定量PCR检测试剂、或荧光定量PCR试剂盒，用于TGEV特异性检测的应用，具体如下：
1材料与方法
1.1仪器与试剂
CFX96荧光定量PCR仪购自Bio-Rad公司，紫外分光光度计购自Thermo公司；质粒提取试剂盒、DNA胶回收试剂购自AxyGen公司；DNA/RNA核酸共提试剂盒购自invitrogen公司；E.coli DH5α、Premix Ex Taq（Probe qPCR）、RNase-free Water购自TaKaRa公司。
1.2引物和探针
特异性引物对和TaqMan-MGB荧光探针具体如下：
引物对的序列如下：
上游引物： 5' TTGTCTGGGTTGCCAAGGAT 3'，
下游引物： 5' TCATTATTAGCACCACGACTACCAA 3'；
所述探针序列如下所示：
5' FAM- CCATGAACAAACCAAC-MGB 3'。
探针5'端标记的荧光报告基团是FAM，3'端标记荧光淬灭基团为 Non-fluorescent quencher和Minor Groove Binder (MGB)。
1.3病毒RNA提取、反转录和质粒标准品制备
用DNA/RNA核酸共提试剂盒提取样品中的总RNA，取5.5μL总RNA、4μL 5×All-In-OneRT MasterMix和10.5μL RNase-free Water，混匀后进行反转录，反转录条件为25℃保持10min、42℃保持30min，所得产物为cDNA，可直接用于荧光定量PCR或置-20℃保存备用；
以上下游引物通过常规PCR扩增TGEV目的基因，产物经回收试剂盒纯化后连接pMD19-T载体，转化至E.coli DH5α大肠杆菌，通过序列测定获得阳性克隆质粒即为质粒标准品；测定DNA浓度后，换算成拷贝数，-20℃保存，用前稀释作为质粒标准品。
1.4 荧光定量PCR反应条件的优化
以质粒标准品为模板，在不同退火温度下进行常规PCR反应，扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析，确定最佳的引物退火温度。应用矩阵法对荧光定量PCR的引物和探针浓度进行优化，以得到最佳的反应体系和反应条件。
1.5荧光定量PCR标准曲线的建立
将质粒标准品10倍倍比稀释至浓度范围为3.15x102-3.15x109copies•μL-1，进行荧光定量PCR检测，绘制标准曲线。
1.6 特异性试验
利用建立的荧光定量PCR方法对猪瘟病毒（CSFV），猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV），猪伪狂犬病毒（PRV），猪流行性腹泻病毒（PEDV），猪德尔塔冠状病毒（PDCoV），轮状病毒（RV），猪细小病毒（PPV）和猪圆环病毒2型（PCV2）等病毒的cDNA或DNA进行检测验证该方法的特异性。
1.7敏感性试验
将TGEV阳性cDNA按10倍倍比稀释至最低浓度为3.67x101copies•μL-1，以该cDNA为模板，进行常规PCR反应，上下游引物分别为5' GTACTGGACCTCATGCAGAT 3'和5'TTGAAGTCCAATAGCTTCCA 3'。取扩增产物10μL，用1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行分析，比较两种检测方法敏感性的差异。
1.8重复性试验
用5种浓度的标准品质粒分别进行4次批次内和批次间的重复性试验并且根据Ct值计算变异系数。
1.9对临床样品的检测
由新希望六和动保中心收集可疑TGEV临床样品80份，分别进行荧光定量PCR检测和常规PCR检测，比较分析结果。
2 结果
2.1 质粒标准品的制备
以上下游引物通过常规PCR扩增TGEV目的基因，产物经回收试剂盒纯化后连接pMD19-T载体，转化至E.coli DH5α大肠杆菌，通过序列测定获得阳性克隆质粒即为质粒标准品。测定DNA浓度后，换算成拷贝数，-20℃保存，用前稀释作为质粒标准品。
2.2荧光定量PCR反应条件的优化
通过对退火温度及引物与探针浓度的优化，最终确定了荧光定量PCR方法的最优反应条件。荧光定量PCR反应体系共为25μL，含12.5μL 2×Premix Ex Taq（Probe qPCR），10μLRNase-free water，0.5μL Probe（10μM），0.5μL Primer F（10μM），0.5μL Primer R（10μM），1μL质粒标准品。反应条件为：95℃ 1min；95℃ 10sec，60℃ 30sec，40个循环。
2.3 荧光定量PCR标准曲线的建立
取浓度为3.15x102-3.15x109copies•μL-1的标准品质粒为模板进行荧光定量PCR扩增并建立标准曲线。由图1和图2可知，线性关系良好，标准曲线建立成功，可用于临床检测。
2.4 特异性试验
用所建立的荧光定量PCR方法对CSFV，PRRSV，PRV，PEDV，PDCoV，RV，PPV和PCV2进行检测，检测结果均为阴性，说明所建立的荧光定量方法与这些病毒无交叉反应（图3），试验结果表明该方法具有良好的特异性。
2.5敏感性试验
荧光定量PCR方法能检出的DNA模板最低浓度为3.15x102copies•μL-1（图1），而常规PCR能检出的模板最低浓度为3.67×104copies•μL-1（图4），试验结果表明所建立的荧光定量PCR方法的敏感性是常规PCR方法的100倍左右。
2.6 重复性试验
用5种不同浓度的标准品分别进行批次内和批次间的重复性试验。试验结果表明，批次内和批次间重复性试验的变异系数均小于1.1%（表1），表明该方法具有良好的重复性与稳定性。
表1 TGEV TaqMan-MGB荧光定量PCR重复性试验结果
2.7 临床样品检测结果
对收集的疑似TGEV临床样品80份，分别进行荧光定量PCR检测和常规PCR检测。检测结果表明，荧光定量PCR方法阳性检出率（11.25%）比常规PCR方法（7.5%）更高（表2）。对临床样品的检测结果表明所建立的荧光定量方法比常规方法具有更高的敏感性，更适用于TGEV的临床检测，尤其是感染早期病毒含量较低时。
表2 临床样品检测结果
综上，通过上述将本发明的引物、探针应用于猪传染性胃肠炎病毒特异性检测以及样品结果，能够看出，采用本发明的引物、探针构建的荧光定量PCR检测方法与其它猪病病毒无交叉反应，具有良好的特异性；敏感性是常规PCR方法的100倍；利用所建立的荧光定量PCR方法可以在2-3h内快速准确地对样品中的TGEV进行检测，既能进行定性检测，又能准确定量。具有灵敏度高、特异性强、重复性好等优势，为TGEV的实验室诊断及流行病学调查提供了快速、准确的检测手段。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.用于检测猪传染性胃肠炎病毒的引物及探针，其特征在于，
所述引物序列如下所示：
上游引物： 5' TTGTCTGGGTTGCCAAGGAT 3'，
下游引物： 5' TCATTATTAGCACCACGACTACCAA 3'；
所述探针序列如下所示：
5' FAM- CCATGAACAAACCAAC-MGB 3'。
2.用于检测猪传染性胃肠炎病毒的荧光定量PCR检测试剂，其特征在于，所述试剂包括以下组分：反应混合液、水和用于检测猪传染性胃肠炎病毒的引物和探针；
所述引物序列如下：
上游引物： 5' TTGTCTGGGTTGCCAAGGAT 3'，
下游引物： 5' TCATTATTAGCACCACGACTACCAA 3'；
所述探针序列如下所示：
5' FAM- CCATGAACAAACCAAC-MGB 3'。
3.根据权利要求2所述的用于检测猪传染性胃肠炎病毒的荧光定量PCR检测试剂，其特征在于，所述反应混合液为TaKaRa公司生产的Premix Ex Taq（Probe qPCR）。
4.根据权利要求2或3所述的用于检测猪传染性胃肠炎病毒的PCR检测试剂，其特征在于，所述水为TaKaRa公司生产的RNase-free Water。
5.一种制备检测猪传染性胃肠炎病毒的荧光定量PCR试剂盒，为含有权利要求2-4任一项所述的荧光定量PCR检测试剂的试剂盒。
6.如权利要求1所述引物及探针、或如权利要求2-4任一项所述检测试剂、或如权利要求5所述试剂盒，在检测猪传染性胃肠炎病毒或制备检测猪传染性胃肠炎病毒检测产品中的应用。
7.用于检测猪传染性胃肠炎病毒的荧光定量PCR检测体系的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：
（1）设计合成引物和探针；其中，所述引物的核苷酸序列如下：
上游引物： 5' TTGTCTGGGTTGCCAAGGAT 3'，
下游引物： 5' TCATTATTAGCACCACGACTACCAA 3'；
所述探针序列如下所示：
5' FAM- CCATGAACAAACCAAC-MGB 3'；
（2）制备阳性质粒标准品；
（3）进行荧光定量PCR反应条件的优化，建立荧光定量PCR检测体系。
8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（2）具体为：
用DNA/RNA核酸共提试剂盒提取样品中的总RNA，取5.5μL总RNA、4μL 5×All-In-OneRT MasterMix和10.5μL RNase-free Water，混匀后进行反转录，反转录条件为25℃保持10min、42℃保持30min，所得产物为cDNA，可直接用于荧光定量PCR或置-20℃保存备用；
以上下游引物通过常规PCR扩增猪传染性胃肠炎病毒目的基因，产物经回收试剂盒纯化后连接pMD19-T载体，转化至E.coliDH5α大肠杆菌，通过序列测定获得阳性克隆质粒即为质粒标准品；测定DNA浓度后，换算成拷贝数，并稀释至1010copies•μL-1，-20℃保存，用前稀释作为质粒标准品。
9.根据权利要求7或8所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（3）中，优化后的反应条件为： 95℃ 2min；95℃ 15sec，60℃ 35sec，40个循环。
10.根据权利要求7-9任一项所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（3）中，所述荧光定量PCR检测体系共为25μL，含12.5μL 2×Premix Ex Taq（Probe qPCR），10μL RNase-freewater，0.5μL Probe（10μM），0.5μL Primer F（10μM），0.5μL Primer R（10μM），1μL质粒标准品。
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