CN113215292A - 检测猪增生性肠病病原菌胞内劳森菌的TaqMan-LNA试剂盒及方法 - Google Patents

检测猪增生性肠病病原菌胞内劳森菌的TaqMan-LNA试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测猪增生性肠病病原菌胞内劳森菌的TaqMan‑LNA试剂盒及方法。本发明所提供的试剂盒中包括特异性检测猪增生性肠病病原菌胞内劳森菌的引物和探针，所述引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述探针的序列如SEQ ID NO.3所示。通过本发明所提供的引物和探针能够更灵敏，更稳定和更准确的检测胞内劳森菌。

Description

检测猪增生性肠病病原菌胞内劳森菌的TaqMan-LNA试剂盒及 方法
技术领域
本发明属于畜牧传染病病原检测技术领域，尤其涉及一种检测猪增生性肠病病原菌胞内劳森菌的TaqMan-LNA试剂盒及方法。
背景技术
猪增生性肠炎（porcine proliferative enteropathy, PPE）,又称猪回肠炎，是临床症状表现为慢性增生性肠炎和急性出血症候群的一种接触性肠道疾病。该病致死率较低，但对感染猪的体重、饲料转化率、空间利用率等带来影响，进而引起经济损失。PPE是由胞内劳森菌（Lawsona Intracellularis, LI）感染所致，该菌是一种专性胞内寄生菌，微量厌氧、具有典型三层外膜的革兰氏阴性弯曲、末端逐渐变细或呈钝圆，无纤毛、孢子，以二分裂方式在肠上皮细胞内复制。
猪增生性肠炎广泛流行于世界上的养猪国家，是最主要的猪肠道病毒之一，在猪群中主要通过粪便传播，其次，场内的设备、工具、人员及车辆等都可成为传播载体；猪群应激、频繁更换疫苗等均可诱发该病。
猪增生性肠炎的诊断，最初依靠临床症状观察与病理学检查，随着分子生物学的发展，PCR技术开始广泛应用于LI的检测。该方法特异性强、检测快速便捷，已成功应用于粪便及粘膜标本中胞内劳森菌的检测，同时也适用于多种组织中的劳森菌检测。目前已建立了多种基于PCR原理的胞内劳森菌检测方法，如巢式PCR、实时荧光定量PCR、多重PCR等。但是，这些方法依然存在敏感性，特异性，热稳定性较差的问题。因此，在此基础上，本发明建立了一种特异性更强、热稳定性更高的检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种特异性强，热稳定性高的检测胞内劳森菌的引物、探针，试剂盒和方法。
为实现上述目的，本发明提供了一种检测猪增生性肠炎胞内劳森菌的TaqMan-LNA探针荧光定量PCR引物和探针，所述引物的核苷酸序列如下所示：
上游引物：5’-CACCTGGACGATAACTGACACT-3’
下游引物：5’-TAACTCCCCAGCACCTAGCAC-3’
所述探针的核苷酸序列如下所示：
探针: 5’-CCCCaCGCTTTcGAGCCT-3’
优选地，所述探针的5’端使用HEX标记，所述引物的3’端使用BHQ1标记。
优选地，所述探针中小写字母表示的碱基为LNA碱基。
此外，本发明提供了一种检测猪增生性肠炎胞内劳森菌的TaqMan-LNA探针荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒含有权利要求1,2或3所述的引物和探针。
优选地，所述试剂盒还包括阳性标准品，所述阳性标准品为引物扩增出的劳森菌的DNA片段：
CACCTGGACGATAACTGACACTGAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGCTGGGGAGTTA。
除此之外，本发明提供了一种检测猪增生性肠炎胞内劳森菌的TaqMan-LNA探针荧光定量PCR方法，所述方法包括如下步骤：
（1）获取样品中的总DNA；
（2）使用阳性标准质粒进行荧光定量PCR反应，制作相应的标准曲线；
（3）使用权利要求1所述的上游引物，下游引物和探针进行荧光定量PCR反应，检测样品是否能够扩增出目的片段，并根据标准曲线计算宋DNA中的模板量；
上述方法用于非疾病的诊断和治疗。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）和步骤（3）中PCR反应的反应条件为：
37℃ 2min；95℃ 5min；95℃ 10s，60℃ 30s，40个循环。
优选地，所述步骤（2）和步骤（3）中PCR扩增体系为：
2×AceQ Universal U＋Probe Master Mix V2 10μL，
上游引物 0.4μL，
下游引物 0.4μL，
Taqman-LNA探针 0.2μL,
样品总DNA 1μL，
ddH2O 8μL。
本发明的有益效果是：
本发明经过充分的试验筛选和优化，提供了新的特异性检测猪增生性肠病病原菌胞内劳森菌的引物和探针，并且建立了新的Taqman-LNA荧光定量PCR检测胞内劳森菌的方法。本发明所提供的特异性检测猪增生性肠病病原菌胞内劳森菌的引物、探针和方法实现了更灵敏、更稳定、更准确的检测胞内劳森菌。
附图说明
图1 普通PCR目的片段扩增；
图2 阳性质粒和阴性对照扩增曲线
1-6为1.5×107-1.5×102copies/μL阳性质粒扩增曲线；7-9为1.5×101-1.5×100copies/μL阳性质粒及阴性对照扩增曲线；
图3 1.5×107-1.5×102copies/μL浓度阳性标准质粒构建的标准曲线；
图4 特异性检测结果；
图5 敏感性检测结果 1-6为1.5×106-1.5×101copies/μL；
图6 临床样品检测结果。
具体实施方式
为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，对本方案进行阐述。
实施例1
荧光定量PCR引物及TaqMan-LNA探针的设计与合成
本发明根据胞内劳森菌的核酸序列，设计用于检测胞内劳森菌的荧光定量PCR引物和探针；本发明通过对所设计的引物和探针进行大量的筛选，筛选出一组灵敏度高和特异性强的引物，具体序列如下：
上游引物：5’-CACCTGGACGATAACTGACACT-3’，SEQ ID NO.1;
下游引物：5’-TAACTCCCCAGCACCTAGCAC-3’, SEQ ID NO.2;
探针：5’-CCCCaCGCTTTcGAGCCT-3’, SEQ ID NO.3;
探针5’端使用HEX标记，3’端使用BHQ1标记，探针中使用小写字母表示的碱基为LNA碱基。
实施例2
验证引物的可用性并进行标准样品制备
（1）使用本发明涉及的荧光定量PCR引物进行普通PCR反应，验证引物的可用性。
普通PCR反应体系如下：
2×Rapid Taq Master Mix 25μL，
上游引物 2μL，
下游引物 2μL，
双蒸水 16μL，
模板 5μL。
普通反应PCR反应程序如下：
94℃ 5min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 40s共 35个循环；72℃ 7min，4℃保存。
使用2%琼脂糖凝胶进行PCR产物的电泳检测，电泳条件如下：恒压150V，30min，在1× TAE溶液中进行电泳；电泳结束后，取出凝胶置于凝胶成像仪中拍照并保存。
实验结果如图1所示，从图中可以看到大小为108bp的特异性目的条带，符合预期结果。
（2）将目的片段在紫外凝胶成像仪中切下，按照胶回收试剂盒说明书进行目的DNA的回收，将回收后的目的片段连接到PMD18-T载体上，再转化至DH5α感受态细胞中，在含0.1%氨苄霉素的LB平板上进行单克隆筛选与培养，取白色单一菌落进行扩大培养后，使用质粒提取试剂盒进行质粒抽提并送青岛擎科生物有限公司进行质粒测序。
目的DNA片段序列（108bp）为：
CACCTGGACGATAACTGACACTGAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGCTGGGGAGTTA
采用微量分光光度计进行标准质粒浓度检测，根据阿伏伽德罗常数：6.02×1023，计算标准品的拷贝数，进行10倍梯度稀释,保存备用。
实施例3 荧光定量PCR反应条件优化
根据 2×AceQ Universal U＋Probe Master Mix V2 荧光定量PCR酶所附带说明书中的推荐使用量，以20μL为体系，在相同模板量的情况下，采用矩阵法对探针及引物的使用量进行优化，以最低Ct值和最高荧光增加值为依据，同时参考扩增效率，确定引物与探针的最佳使用量。
对反应的退火温度进行进一步的优化，确定反应的最佳退火温度为60℃。
经条件优化，最终确定在反应体系为：
2×AceQ Universal U＋Probe Master Mix V2 10μL，
上游引物 0.4μL，
下游引物 0.4μL，
Taqman-LNA探针 0.2μL,
样品总DNA 1μL，
ddH2O 8μL。
反应条件为：37℃ 2min；95℃ 5min；95℃ 10s，60℃ 30s，40个循环。
实施例4
构建荧光定量PCR反应标准曲线
以10倍梯度稀释后的，浓度为1.50×107~1.50×100copies/μL的阳性质粒为模板，以优化的反应条件进行荧光定量PCR扩增，以1.50×107~1.50×102copies/μL的阳性质粒的Cq值与拷贝数的对数值进行标准曲线构建，标准曲线如图3所示。该曲线相关系数为0.997，大于0.99，符合应用要求。
实施例5
荧光定量PCR特异性检验
使用本发明所提供的引物和探针在优化后的反应体系和反应条件下对猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、经典猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、大肠杆菌，胞内劳森菌，同时设置水为模板作为阴性对照，检测本发明荧光定量PCR特异性。
实验结果如图4所示，可以看出仅胞内劳森菌出现特异性扩增曲线，其余常见猪病毒与细菌以及阴性对照均未出现扩增。
实施例6
荧光定量PCR敏感性检验
以1.5×107~1.5×100copies/μL浓度为模板，以优化的荧光定量PCR反应条件进行扩增，观察所能检测出的最低模板量。
经检测，如图2所示，以优化后的荧光定量PCR体系与程序进行检测，在1.5×101copies/μL仍有扩增曲线，表明所能检测到的最低模板拷贝量为1.5×101copies。
实施例7
荧光定量PCR重复性检验
（1）组内重复
在同一反应中将同一稀释度的质粒进行3次重复检测，输出Cq值，对同一稀释度质粒所得Cq值进行分析，计算变异系数。检测结果如表1所示。
表1组内重复性检测结果
Figure 532849DEST_PATH_IMAGE002
从表1中可以看出，各稀释度质粒的变异系数均小于0.01，表明该方法具有良好的组内重复性。
（2）组间重复性
在不同时间，同一反应条件下，不同时间对同一稀释度的质粒分别进行3次检测，输出Ct值，对同一稀释度质粒所得Ct值进行分析，计算变异系数。检测结果见表2。
表2组间重复性检测结果
Figure 981147DEST_PATH_IMAGE004
从表2中可以看出，各稀释度的变异系数均小于0.02，表明该方法具有良好的组间重复性。
实施例8
荧光定量PCR反应应用于临床样品检测
对送检的疑似胞内劳森菌感染的6份样品进行处理，使用DNA提取试剂盒进行核酸提取，以提取的核酸为模板，按照本发明所提供的荧光定量PCR方法进行检测。
检测结果如图5所示，从图中可以看出，3个样品出现扩增曲线，Cq值分别为21.05、29.01和29.24。说明本发明所提供的荧光定量PCR方法能够有效的用于临床样品检测。

Claims (8)

1.一种检测猪增生性肠炎胞内劳森菌的TaqMan-LNA探针荧光定量PCR引物和探针，所述引物的核苷酸序列如下所示：
上游引物：5’-CACCTGGACGATAACTGACACT-3’
下游引物：5’-TAACTCCCCAGCACCTAGCAC-3’
所述探针的核苷酸序列如下所示：
探针: 5’-CCCCaCGCTTTcGAGCCT-3’。
2.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，所述探针的5’端使用HEX标记，所述引物的3’端使用BHQ1标记。
3.根据权利要求2所述的引物和探针，其特征在于，所述探针中小写字母表示的碱基为LNA碱基。
4.一种检测猪增生性肠炎胞内劳森菌的TaqMan-LNA探针荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有权利要求1, 2或3所述的引物和探针。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性标准品，所述阳性标准品为引物扩增出的劳森菌的DNA片段：
CACCTGGACGATAACTGACACTGAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGCTGGGGAGTTA。
6.一种检测猪增生性肠炎胞内劳森菌的TaqMan-LNA探针荧光定量PCR方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
（1）获取样品中的总DNA；
（2）使用阳性标准质粒进行荧光定量PCR反应，制作相应的标准曲线；
（3）使用权利要求1所述的上游引物，下游引物和探针进行荧光定量PCR反应，检测样品是否能够扩增出目的片段，并根据标准曲线计算总DNA中的模板量；
上述方法用于非疾病的诊断和治疗。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）和步骤（3）中PCR反应的反应条件为：
37℃ 2min；95℃ 5min；95℃ 10s，60℃ 30s，40个循环。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）和步骤（3）中PCR扩增体系为：
2×AceQ Universal U＋Probe Master Mix V2 10μL，
上游引物 0.4μL，
下游引物 0.4μL，
Taqman-LNA探针 0.2μL,
样品总DNA 1μL，
ddH2O 8μL。
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