CN107236023A - 一种用于检测结核感染的抗原组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测结核感染的抗原组合物及其应用。所述抗原组合物由CFP10抗原、ESAT6抗原、PPE抗原以及Ag85A抗原的抗原表位肽中的前三种或者全部四种组成。本发明中将该抗原组合物应用于制备结核检测与诊断试剂以及检测结核感染的试剂盒，利用该组合物刺激特异性T细胞，检测T细胞分泌的趋化因子，具有特异性强、灵敏度高的优势，而且对于结核感染尤其是自然感染和卡介苗接种等潜伏感染的诊断也具有较强的特异性。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测结核感染的抗原组合物及其应用，尤其涉及一种新型结核分枝杆菌抗原表位肽组合物及含其的试剂盒及用于制备结核感染的检测和诊断试剂的用途。
背景技术
在全世界结核病依然是危害人类健康的主要传染病之一，据世界卫生组织资料估计，每年新发结核病感染病例接近900多万，死亡病例一百多万。中国的结核病疫情相当严重，报告数据显示，全球54％的结核病例出现在中国、印度、印度尼西亚。WHO估算我国2014年的新发肺结核人数为93万，位居全球第三位。
早期诊断、选择药物进行治疗是控制结核病的关键。目前，临床诊断结核感染的方法有限，结核菌素实验(TST)是临床常用筛查结核的免疫学方法，具有操作简单，观察结果方便的优点，但其具有较高的假阳性，所以诊断意义有限；细菌学是诊断结核的金标准，但其培养时间长、灵敏度和阳性率低，不利于早期诊断和治疗；影像学作为辅助诊断疗法，对结核诊断的特异性较差；血清学检测如ELISA、金标等检测抗原或抗体，极难检测活性结核病，具有较高的假阴性和假阳性。
结核菌感染引起T细胞γ-干扰素释放试剂(IGRA)是近年发展起来的一种新方法，可用于诊断结核(TB)和潜伏结核感染(LTBI)，美国诊断IGRA可代替结核菌素皮试(TST)，英国相关指南推荐联用IGRA和TST。已研制开发成功的QuantiFeron-TB Gold和T-SPOT.B以RD1区编码的结核特异性抗原6KD早期分泌靶向抗原(ESAT-6)和10KD培养滤过蛋白(CFP-10)为刺激源，检测外周血中IFN-γ活化的巨噬细胞分泌的下游趋化因子γ-干扰素，其敏感度仅为80％。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为克服现有技术中存在的针对结核感染的检测方法中以抗原CFP10和ESAT6为刺激物的检测方法敏感度低以及特异性不强等缺陷，提供一种检测结核感染的抗原组合物、含其的检测结核感染的试剂盒及其在制备结核检测与诊断试剂中的应用。利用本发明抗原组合物刺激特异性T细胞，检测T细胞分泌的趋化因子，具有特异性强、灵敏度高的优势，而且对于结核感染尤其是自然感染和卡介苗接种等潜伏感染的诊断也具有较强的特异性。
在结核感染发生时，患者体内活化的T细胞被激活、特异的靶分子会发生上调，正是利用该医学常识对结核感染进行体外检测。本发明人为此反复试验和研究，从众多结核特异性抗原肽包括CFP10、ESAT6及其各种抗原表位肽中，意外地发现了PPE以及Ag85A作为新的抗原肽，与原有CFP10、ESAT6抗原肽及此4种抗原肽各自衍生肽特别是抗原表位肽中的两种或两种以上的组合，特别是选择以CFP10抗原表位肽、ESAT6抗原表位肽、PPE抗原表位肽以及Ag85A表位肽中的三种或者四种的组合物作为刺激源可以显著提高体外结核感染检测的灵敏度和特异性，减少由于低频率的单一抗原刺激特异性T细胞造成的假阴性。本发明人在特异性和敏感度等方面进行平衡，筛选出了最佳地抗原表位肽组合。
本发明解决上述技术问题的技术方案之一是：一种用于检测结核感染的抗原组合物，所述抗原组合物由以下(1)～(3)三种多肽或者(1)～(4)四种多肽组成：
(1)CFP10抗原的抗原表位肽；所述抗原表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
(2)ESAT6抗原的抗原表位肽；所述抗原表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
(3)PPE抗原的抗原表位肽；所述抗原表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
(4)Ag85A抗原的抗原表位肽；所述抗原表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明解决上述技术问题的技术方案之二是：一种编码上述抗原组合物的DNA分子。
本发明解决上述技术问题的技术方案之三是：一种含有上述DNA分子的重组表达载体；所述表达载体可以为细菌质粒、噬菌体和动植物病毒。较佳地，所述载体的骨架为质粒pET-28a。
本发明解决上述技术问题的技术方案之四是：一种含有上述重组表达载体的转基因细胞系或者重组菌。
本发明解决上述技术问题的技术方案之五是：一种用于检测结核感染的试剂盒，其包括上述抗原组合物。较佳地，所述试剂盒还包括至少一种反应液，所述反应液均包括一引物对和一探针，所述的引物对和探针针对结核分枝杆菌特异性T细胞分泌的下游趋化因子CXCL9、CXCL11或CXCL13的基因序列设计；其中，
针对趋化因子CXCL9设计的所述引物对的正向引物(引物1)是如SEQ ID NO.5所示序列的核酸，反向引物(引物2)是如SEQ ID NO.6所示序列的核酸，所述探针(探针1)的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
针对趋化因子CXCL11设计的所述引物对的正向引物(引物3)是如SEQ ID NO.8所示序列的核酸，反向引物(引物4)是如SEQ ID NO.9所示序列的核酸，所述探针(探针2)的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；或者
针对趋化因子CXCL13设计的所述引物对的正向引物(引物5)是如SEQ ID NO.11所示序列的核酸，反向引物(引物6)是如SEQ ID NO.12所示序列的核酸，所述探针(探针3)的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。
其中，引物1位于人的CXCL9基因序列的197-221位，引物2位于289-265位，扩增片段长度为93bp，所对应的探针位于234-260位；引物3位于人的CXCL11基因序列的113-136位，引物4位于255-230位，扩增片段长度为143bp，所对应的探针位于184-211位；引物5位于人的CXCL13基因序列的199-224位，引物6位于314-293位，扩增片段长度为116bp，所对应的探针位于226-249位。
更佳地，为使结果可靠，抗干扰能力更强，作为表达量参照，本发明选用管家基因作为内部参照，优选人β-globin(β-球蛋白)基因，所述反应液均还包括针对人β-globin基因设计的管家基因的一引物对和一探针；所述引物对中，正向引物(引物7)是如SEQ IDNO.14所示序列的核酸，反向引物(引物8)是如SEQ ID NO.15所示序列的核酸，所述探针(探针4)的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示。其中，引物7位于人β-globin基因组序列的HBB基因(62137-63742)的62627-62647位，引物8位于62756-62775位，扩增片段长度为149bp，所对应的探针位于β-globin基因序列反向序列的62731-62755位。
所述反应液均还可以包括PCR反应缓冲液和2’-脱氧核苷三磷酸；所述2’-脱氧核苷三磷酸的浓度优选为100mM。
本发明所述的试剂盒优选为实时荧光定量PCR(FQ-PCR)试剂盒。较佳地，所述试剂盒还可以包括普通PCR、荧光PCR、尤其FQ-PCR的其他常规试剂：EZ Taq混合液和阴性质控品等；所述EZ Taq混合液包括热启动Taq酶，浓度优选1-5U/μl。
本发明解决上述技术问题的技术方案之六是：上述抗原组合物在制备结核感染检测与诊断试剂中的应用；所述结核感染检测优选为体外检测结核感染引起的特异性T细胞免疫反应。较佳地，在该应用中，人的淋巴细胞经过上述抗原组合物刺激后，检测结核特异性T细胞分泌的细胞因子，所述细胞因子优选为趋化因子CXCL9、CXCL11或者CXCL13。更佳地，所述的结核感染检测与诊断采用实时荧光定量PCR法。
根据本发明，所述的结核感染可以为潜伏期结核感染；换言之，可用于包括潜伏期结核感染的全病程结核感染。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明利用三种或者四种抗原衍生的抗原表位肽组成的抗原组合物刺激特异性T细胞，检测T细胞分泌的趋化因子，降低了现有技术中以两种抗原作为刺激源刺激特异性T细胞时造成的假阴性，具有特异性强、灵敏度高的优势，而且对于结核感染尤其是自然感染和卡介苗接种等潜伏感染的诊断也具有较强的特异性。另外，本发明将趋化因子CXCL9、CXCL11以及CXCL13的核苷酸序列进行分析，特别设计适用本发明检测试剂盒的寡核苷酸引物和探针。使用这些引物和探针完成的实时定量检测，不仅操作简便、耗时短、特异性强，而且极大地提高了结核检测灵敏度，避免卡介苗或陈旧感染等的干扰导致假阳性而结果不准确，降低了模板使用量。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1抗原组合物的制备
1、抗原表位肽的制备
由金斯康科技(南京)有限公司合成序列如SEQ ID NO.1所示的CFP10抗原表位肽、序列如SEQ ID NO.2所示的ESAT6抗原表位肽、序列如SEQ ID NO.3所示的PPE抗原表位肽以及序列如SEQ ID NO.4所示的Ag85A抗原表位肽；所得抗原表位肽的存在状态为干粉。
4种不同的抗原表位肽还可以通过常规的手段进行重组表达，具体来说：将表位肽的基因片段插入pET-28a载体制备重组质粒，进而以BL-21DE宿主细菌可控表达、使用Ni-NTA镍柱纯化获得。
2、抗原组合物的制备
(1)将上述制备的4种不同的抗原表位肽干粉按照摩尔比1:1:1:1进行混合得“组合1”。
(2)将上述制备的CFP10抗原表位肽、ESAT6抗原表位肽以及PPE抗原表位肽干粉按照摩尔比1:1:1进行混合得“组合2”。
实施例2试剂盒各组成成分的制备以及试剂盒的组装
表1.各组分名称、浓度以及含量
上述反应缓冲液选用市售商品(购自上海多泽生物科技有限公司)，dNTP(购自上海兆维科技发展有限公司)，EZ Taq酶或混合液(购自上海多泽生物科技有限公司)，引物和探针(商业合成，英潍捷基(上海)贸易有限公司(ABI))。
(1)制备包括下列组成成份的试剂盒：
反应液1(650μl/管)1管：
PCR反应缓冲液、2’-脱氧核苷三磷酸、用于扩增CXCL9的正向引物(引物1)和反向引物(引物2)，寡核苷酸探针为探针1；用于管家基因人β-globin基因靶多核苷酸扩增的引物7和引物8，寡核苷酸探针为探针4。
反应液2(650μl/管)1管：
反应液2由如下组分组成：PCR反应缓冲液、2’-脱氧核苷三磷酸、用于CXCL11靶多核苷酸扩增的正向引物(引物3)和反向引物(引物4)，寡核苷酸探针为探针2；用于管家基因人β-globin基因靶多核苷酸扩增的引物7和引物8，寡核苷酸探针为探针4。
反应液3(650μl/管)1管：
反应液3由如下组分组成：PCR反应缓冲液、2’-脱氧核苷三磷酸、用于CXCL13靶多核苷酸扩增的正向引物(引物5)和反向引物(引物6)，寡核苷酸探针为探针3；用于管家基因人β-globin基因靶多核苷酸扩增的正向引物(引物7)和反向引物(引物8)，寡核苷酸探针为探针4。
EZ Taq酶混合液(150μl/管)1管：Taq酶。
表2EZ Taq酶混合液组成
标准液：阴性质控品(80μl/管)：纯化水。
结核抗原管(采血管1)：将实施例1制得的抗原组合物放到采血管中，每支采血管含有抗原组合物20μg(0.5mg/ml)和肝素钠干粉30IU(900IU/ml)。
本底对照管(采血管2)：采血管中只含有肝素钠干粉30IU(900IU/ml)。
反应液1与EZ Taq酶混合液、标准液以及结核抗原管和本底对照管作为体系I；
反应液2与EZ Taq酶混合液、标准液以及结核抗原管和本底对照管作为体系II；
反应液3与EZ Taq酶混合液、标准液以及结核抗原管和本底对照管作为体系III。
其中，引物1-8构成了各体系中的核酸扩增体系，探针1-4构成了各体系中的荧光检测体系；各引物和探针具体组成如下：
表3.各引物和探针具体组成
| 引物名称 | 核苷酸组成 | 序列号 |
| 引物1 | 5’-CCACCTACAATCCTTGAAAGACCTT-3’ | SEQ ID NO.5 |
| 引物2 | 5’-TGAACTCCATTCTTCAGTGTAGCAA-3’ | SEQ ID NO.6 |
| 引物3 | 5’-TCAATTTCCTTTCATGTTCAGCAT-3’ | SEQ ID NO.8 |
| 引物4 | 5’-ACACAATATCACAGCCAAGGCTATAG-3’ | SEQ ID NO.9 |
| 引物5 | 5’-GTCTTTATCCCTAGACGCTTCATTGA-3’ | SEQ ID NO.11 |
| 引物6 | 5’-GGGTCCACACACACAATTGACT-3’ | SEQ ID NO.12 |
| 引物7 | 5’-TTCCTCCTCCTGAGCAGT-3’ | SEQ ID NO.14 |
| 引物8 | 5’-AAGGTCATAACCTGGTTCATC-3’ | SEQ ID NO.15 |
| 探针1 | 5’-CCAAGCCCTTCCTGCGAGAAAATTGAA-3’ | SEQ ID NO.7 |
| 探针2 | 5’-CACCAGCAGCAACAGCAAAAAACAAACA-3’ | SEQ ID NO.10 |
| 探针3 | 5’-CGAATTCAAATCTTGCCCCGTGGG-3’ | SEQ ID NO.13 |
| 探针4 | 5’-CCCTGGCGTCGTGATTAGTGATGATGAAC-3’ | SEQ ID NO.16 |
上述探针1～3的5’端连接有报告基团FAM，3’端连接有淬灭基团BHQ MGB；探针4的5’端连接有报告基团VIC，3’端连接有淬灭基团BHQ MGB。
(2)试剂盒的组装
根据需求，可将EZ Taq酶混合液、标准液等试剂管以及结核抗原管和本底对照管分别与装有上述反应液1～3的单个离心管分隔包装组成分别测定趋化因子CXCL9、CXCL11、CXCL13的试剂盒；也可以将上述各试剂管以及采血管和2个以上分别装有不同的上述反应液1～3的离心管包装成双靶点或三靶点的试剂盒。
实施例3试剂盒的使用方法
1)抽取样本血液至本底对照管和结核抗原管中
样本采集、运送和保存：用一次性真空采血器，无菌操作，取待检个体血液样本，做好标示后将获取的血液样本置于低温冰箱(-70℃或-20℃)中冷冻保存。如集中检验，标本需在0℃以下环境中运送并于24小时内送达实验室。
临床抽取2ml样本血液加入本底对照管中，标记为本底对照样本；另抽取同一个体样本血液2ml，加入含有抗原组合物的结核抗原管中于35℃下刺激6h后，标记为结核抗原样本。
2)提取本底对照管和结核抗原管血液样本中的RNA
取两管中待测血样各300μl，用磁珠法同批次提取(提取试剂购自深圳市安必胜科技有限公司)血液样本mRNA，使用RNA逆转录试剂盒(购自宝生物工程(大连)有限公司)逆转录为cDNA，用分光光度计或类似的仪器确认cDNA的质量(OD260/280在1.8-2.0之间)。
3)将所述cDNA加入到反应液中，通过核酸扩增体系、用实时荧光PCR仪进行扩增反应，循环扩增待测样品中的靶多核苷酸；使所述荧光检测体系中的荧光发生基团与被扩增的靶多核苷酸序列间接结合。
将逆转录的每份结核抗原管cDNA和本底对照管cDNA分别置于3个PCR反应管或PCR板的3个孔中，每孔2μl。然后，在加入同一DNA样本的3个孔中各加入一种PCR反应液(反应液1、反应液2、反应液3)15μl，再在每个孔中加入3μl的EZ Taq酶混合液。混匀离心后，将PCR反应体系置于自动荧光检测热循环仪(ABI7500)上，选择FAM通道(Reporter:FAM,Quencher:none)收集特异扩增信号；选择VIC通道(Reporter:VIC,Quencher:none)检测内标；参比荧光(Passive Reference)设置为none；设置Sample Volume为20。按照仪器操作说明做好相应设置后开始试验。
具体PCR扩增反应体系、反应条件见表4和表5。
表4 PCR扩增反应体系
表5 PCR扩增反应条件
4)通过比较待检样本和本底对照样本的循环阈值判定荧光发生基团所产生的荧光量，从而确定靶多核苷酸的存在。
反应结束后保存检测数据文件，点选仪器的数据分析选项后可查看各个PCR反应体系的结果，如PCR扩增曲线，待检样本和本底对照样本的CT值等。
计算方法：
以扩增过程前3～15循环的荧光值的10倍标准差为阈值(threshold)，以荧光值超过阈值的循环数为阈值循环数(值)Ct值。若管家基因Ct值＞35，结果不可靠，请重新测定或观察血液本身是否存在问题。若管家基因Ct值≦35时进行以下计算：
本底对照管：△Ct A＝Ct值(目的基因)-Ct值(管家基因)
结核抗原管：△Ct B＝Ct值(目的基因)-Ct值(管家基因)
结果判读：T值＝△Ct B–△Ct A。
1.无效结果判定：与存在于体系Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中的寡核苷酸荧光探针1、探针2、探针3和探针4相关的扩增曲线不呈现“S”型或Ct值空白又或Ct值＞35的样本，报告为无效；
2.阳性结果判定：满足与体系Ⅰ或体系Ⅱ或体系Ⅲ中的寡核苷酸探针1、探针2、探针3和探针4相关的扩增曲线呈现“S”型且T值≤-1.04，报告为阳性；
3.阴性结果判定：属于无效结果判定和阳性结果判定以外的情况且T值＞-1.04。则报告为阴性(阴性对照品就是没有出现扩增，说明本实验体系未受到外界污染)。
实施例4使用本发明的试剂盒检测200例临床血液样本的结果与分析
本研究共涉及经过严格标准筛选的结核患者100例，非结核患者100例。
以来自(南京胸科医院)的200例血液样本，对本发明所述抗原诱导结果进行检测。所述病例样本筛选标准为：临床主治医生确诊的结核，包括潜伏期和非潜伏期的结核。非结核患者筛选标准为：确诊的非结核患者。同时，结核病例和非结核患者年龄在18-60岁之间，性别按照1:1随机挑选。
本发明所用血样为个体的静脉外周血，采样个体经主治医师体检合格后，实验者告知其具体流程及所需血液的数量，经个体同意并签署知情同意书，由临床医生对志愿者进行采血。采血时使用含有抗凝素的真空采血管，每个个体采血12ml。
实验过程：临床抽取2ml样本血液至本底对照管中，标记为本底对照样本；另抽取2ml血液样本，加入到含有20μg实施例1制备的抗原组合物的结核抗原管中，于35℃刺激6h后，标记为结核抗原样本。
将待检测血样取300μl，用磁珠法同批次提取血液样本mRNA，购买市售RNA逆转录试剂盒逆转录为cDNA，用分光光度计或类似的仪器确认cDNA的质量(OD260/280在1.8-2.0之间)，将逆转录的每份待检样本cDNA和本底对照样本cDNA分别置于3个PCR反应管或PCR板的3个孔中，每孔2μl。然后，在加入同一DNA样本的3个孔中各加入一种PCR反应液(反应液1、反应液2、反应液3)15μl，再在每个孔中加入3μl的EZ Taq酶混合液。具体PCR扩增反应体系和反应条件见表4、5。混匀离心后，将PCR反应体系置于自动荧光检测热循环仪上，选择FAM通道(Reporter:FAM,Quencher:none)收集特异扩增信号；选择VIC通道(Reporter:VIC,Quencher:none)检测内标；参比荧光(Passive Reference)设置为none；设置SampleVolume为20。按照仪器操作说明做好相应设置后开始试验。本试剂盒的所使用的反应条件(如表5所示)是：(1)95℃预变性5分钟；(2)95℃15秒；(3)58℃35秒；(4)72℃20秒；步骤(2)-(4)循环40次。
其中，抗原组合物为实施例1制备得到的两种抗原组合物，结果如下表所示：
表6抗原组合物检测结果
| 分组 | 对照组阳性率％ | 组合1阳性率％ | 组合2阳性率％ |
| 结核疾病组 | 75(75/100) | 80(82/100) | 76(76/100) |
| 非结核疾病组 | 10(10/100) | 8(8/100) | 9(9/100) |
其中，阳性率的计算方法为：结核疾病组中的：阳性数/病例数×100％，特异性的计算方法为：特异性为非结核疾病组中的：(病例数-阳性数)/病例数×100％；对照组所用抗原组合物来自上海复星长征医学科学有限公司的T-SPORT试剂盒，该抗原组合物由CFP10和ESAT6两种抗原组成。
结果显示，组合1和2检测结核的特异性分别为92％和91％，均高于对照组抗原组合物的特异性——90％；组合1和2抗原检测结核的灵敏度(阳性率)分别为80％和76％，均高于对照组抗原组合物的灵敏度——75％；组合1和2抗原检测结核的假阳性率分别为8％和9％，均低于对照组抗原组合物的假阳性率——10％。
对比例
样本血液的采集和处理，以及检测方法(包括RNA的提取和荧光实时定量PCR反应等)均同上述实施例；不同之处在于本对比例采用的抗原组合物不同于上述实施例，下述组合中不同表位肽之间的摩尔比为1:1:1或者1:1，具体如下：
组合3：CFP10、ESAT6以及Ag85A抗原表位肽；
组合4：CFP10、PPE以及Ag85A抗原表位肽；
组合5：ESAT6、PPE以及Ag85A抗原表位肽；
组合6：CFP10和Ag85A抗原表位肽；
组合7：CFP10和PPE抗原表位肽；
组合8：ESAT6和Ag85A抗原表位肽；
组合9：ESAT6和PPE抗原表位肽；
组合10：PPE和Ag85A抗原表位肽。
检测结果见表7和8。
表7含3种抗原表位肽的抗原组合物检测结果
| 分组 | 对照组阳性率％ | 组合3阳性率％ | 组合4阳性率％ | 组合5阳性率％ |
| 结核疾病组 | 75(75/100) | 75(75/100) | 72(72/100) | 71(71/100) |
| 非结核疾病组 | 10(10/100) | 10(10/100) | 11(11/100) | 13(13/100) |
表8含2种抗原表位肽的抗原组合物检测结果
其中，阳性率的计算方法为：结核疾病组中的：阳性数/病例数×100％，特异性的计算方法为：特异性为非结核疾病组中的：(病例数-阳性数)/病例数×100％；对照组所用抗原组合物来自上海复星长征医学科学有限公司的T-SPORT试剂盒，该抗原组合物由CFP10和ESAT6两种抗原组成。
结果显示：组合3～10检测结核的特异性分别为90％、89％、87％、84％、86％、84％、84％和83％，除对照3以外均低于对照组抗原组合物的特异性——90％；且组合3～10中，仅组合3的阳性率以及假阳性率与对照组相同，其余组合的灵敏度均低于对照组，且假阳性率均高于对照组。
<110> 苏州创澜生物科技有限公司
<120> 一种用于检测结核感染的抗原组合物及其应用
<130> P1611498C
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CFP10抗原表位肽
<400> 1
Gln Gly Gln Trp Arg Gly Ala Ala Gly Thr Ala Ala
1 5 10
<210> 2
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ESAT6抗原表位肽
<400> 2
Glu Leu Asn Asn Ala Leu
1 5
<210> 3
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PPE抗原表位肽
<400> 3
Ala Gly Trp Gln Thr Leu Ser Ala Ala Leu Asp Ala Gln Ala Val Glu
1 5 10 15
Leu Thr Ala Arg
20
<210> 4
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ag85A抗原表位肽
<400> 4
Arg His Val Lys Pro Thr Gly Ser Ala Val Val Gly Leu
1 5 10
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物1
<400> 5
ccacctacaa tccttgaaag acctt 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物2
<400> 6
tgaactccat tcttcagtgt agcaa 25
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 探针1
<400> 7
ccaagccctt cctgcgagaa aattgaa 27
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物3
<400> 8
tcaatttcct ttcatgttca gcat 24
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物4
<400> 9
acacaatatc acagccaagg ctatag 26
<210> 10
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 探针2
<400> 10
caccagcagc aacagcaaaa aacaaaca 28
<210> 11
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物5
<400> 11
gtctttatcc ctagacgctt cattga 26
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物6
<400> 12
gggtccacac acacaattga ct 22
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 探针3
<400> 13
cgaattcaaa tcttgccccg tggg 24
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物7
<400> 14
ttcctcctcc tgagcagt 18
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物8
<400> 15
aaggtcataa cctggttcat c 21
<210> 16
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 探针4
<400> 16
ccctggcgtc gtgattagtg atgatgaac 29
Claims (10)
1.一种用于检测结核感染的抗原组合物，其特征在于，所述抗原组合物由以下(1)～(3)三种多肽或者(1)～(4)四种多肽组成：
(1)CFP10抗原的抗原表位肽；所述抗原表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
(2)ESAT6抗原的抗原表位肽；所述抗原表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
(3)PPE抗原的抗原表位肽；所述抗原表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
(4)Ag85A抗原的抗原表位肽；所述抗原表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2.一种编码如权利要求1所述的抗原组合物的DNA分子。
3.一种含有如权利要求2所述的DNA分子的重组表达载体；较佳地，所述载体的骨架为质粒pET-28a。
4.一种含有如权利要求3所述的重组表达载体的转基因细胞系或者重组菌。
5.一种用于检测结核感染的试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求1所述的抗原组合物。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括至少一种反应液，所述反应液均包括一引物对和一探针，所述的引物对和探针针对结核分枝杆菌特异性T细胞分泌的下游趋化因子CXCL9、CXCL11或CXCL13的基因序列设计；其中，
针对趋化因子CXCL9设计的所述引物对的正向引物是如SEQ ID NO.5所示序列的核酸，反向引物是如SEQ ID NO.6所示序列的核酸，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
针对趋化因子CXCL11设计的所述引物对的正向引物是如SEQ ID NO.8所示序列的核酸，反向引物是如SEQ ID NO.9所示序列的核酸，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；或者
针对趋化因子CXCL13设计的所述引物对的正向引物是如SEQ ID NO.11所示序列的核酸，反向引物是如SEQ ID NO.12所示序列的核酸，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；
较佳地，所述反应液均还包括一管家基因的引物对和一探针；所述引物对中，正向引物是如SEQ ID NO.14所示序列的核酸，反向引物是如SEQ ID NO.15所示序列的核酸，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；
和/或，所述反应液均还包括PCR反应缓冲液和2’-脱氧核苷三磷酸；所述2’-脱氧核苷三磷酸的浓度优选为100mM。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒为实时荧光定量PCR试剂盒，优选用于潜伏期结核感染；和/或所述试剂盒还包括EZ Taq酶混合液和阴性质控品；所述EZTaq混合液包括热启动Taq酶，浓度优选1-5U/μl。
8.如权利要求1所述的抗原组合物在制备结核感染检测与诊断试剂中的应用；所述结核检测优选为体外检测结核感染引起的特异性T细胞免疫反应。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，人的淋巴细胞经过所述的抗原组合物刺激后，检测结核特异性T细胞分泌的细胞因子；较佳地，所述的细胞因子为趋化因子CXCL9、CXCL11或者CXCL13。
10.如权利要求8或者9所述的应用，其特征在于，所述的结核感染检测与诊断采用实时荧光定量PCR法；较佳地，所述结核感染为潜伏期结核感染。
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