CN104611465A - 一种检测猪传染性胃肠炎病毒的荧光定量pcr试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测猪传染性胃肠炎病毒的荧光定量PCR试剂盒，它包括SEQ ID NO：1～2所示引物对，扩增猪传染性胃肠炎病毒基因。本发明检测试剂盒可以准确、有效的检测猪流行性腹猪传染性胃肠炎病毒，且特异性强、灵敏度高、耗时短，检测快速，应用前景良好。

Description

一种检测猪传染性胃肠炎病毒的荧光定量PCR试剂盒

技术领域

本发明涉及一种检测猪传染性胃肠炎病毒的荧光定量PCR试剂盒。

背景技术

猪传染性胃肠炎(TGEV)是一种高度接触传染性肠道疾病，不同日龄、品种的猪均可感染发病，对哺乳仔猪尤为严重，常导致整窝仔猪发病，发病率和死亡率高，病势依日龄而异，日龄越小，死亡率越高。两周龄以下仔猪发生呕吐，严重水样腹泻，有时呈喷射状，发生腹泻的猪圈有腥臭气味，猪全身被毛被粪便污染，粪便中含有未消化的凝乳片而呈现乳白色或灰白色；在发病后期的猪只粪便变粘稠，猪只消瘦，体重减轻；一般3-7天死亡，10日龄内的仔猪的死亡率可达80％-100％。育肥猪常引起整圈猪只发病，有水样腹泻，粪便中带有未消化的食物，猪圈中有腥臭味。一般一周可以恢复健康，病死率较低，但影响饲料报酬，对我国养猪业造成严重的经济损失。病死仔猪的主要剖检病理变化为：胃内容物常充满而显庞大，小肠肠管扩张，肠壁变薄呈半透明状；用手术剪剪开胃部可见有白色的乳凝块，胃底黏膜充血；小肠内容物呈黄绿色或灰白色，可见白色的乳凝块，有少量泡沫性粘液，小肠组织显微镜下可见小肠绒毛萎缩变短。

传统的检测方法如病毒分离鉴定和血清检查，往往耗时过长。公开号103740860A的专利申请公开了一种PCR检测猪传染性胃肠炎的方法，其能够检测的猪传染性胃肠炎的最低检测限为35fg/μL，即875copiess/μL，灵敏度低。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种特异性强、灵敏度高的可检测猪传染性胃肠炎病毒的试剂盒。

本发明检测猪传染性胃肠炎病毒的试剂盒，它包括SEQ ID NO：1～2所示引物对，扩增猪传染性胃肠炎病毒基因。

其中，所述猪传染性胃肠炎病毒的基因如SEQ ID NO：3所示。

其中，所述试剂盒还包括SEQ ID NO：3所示基因片段。

本发明还提供了SEQ ID NO：1～2所示引物对在扩增猪传染性胃肠炎病毒的基因中的用途。

其中，所述猪传染性胃肠炎病毒的基因如SEQ ID NO：3所示。

其中，所述试剂还包括SEQ ID NO：3所示基因片段。

本发明还提供了SEQ ID NO：1～2所示引物对在制备检测猪传染性胃肠炎病毒的试剂中的用途。

其中，所述检测猪传染性胃肠炎病毒的试剂是扩增猪传染性胃肠炎病毒的基因的试剂。

其中，所述猪传染性胃肠炎病毒的基因如SEQ ID NO：3所示。

本发明试剂盒可以有效检测猪传染性胃肠炎病毒，灵敏度高，最低检测浓度为6.37copies/μL，特异性强，耗时短，检测快速，具有良好的应用前景。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明权利要求书记载的内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1重组质粒TGEV-N的PCR结果(泳道4、5、6为目的N基因)。

图2荧光定量PCR退火温度优化溶解曲线图。

图3荧光定量PCR扩增曲线。

图4荧光定量PCR标准曲线。

图5荧光定量PCR特异性实验结果。

图6荧光定量PCR灵敏度试验结果。

具体实施方式

一、实验材料和仪器

1病毒及主要试剂与材料

市售TGEV弱毒疫苗参考株(CV777株)、猪流行性腹泻病病毒、猪轮状病毒、猪乙脑病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒，购自中国兽药监察所或由本实验室保存；大肠埃希菌DH5α由本实验室制备并保存；蓝白斑鉴定试剂盒、pMD19-T(Simple)、DL2000DNA Marker载体等购自大连宝生物有限公司；DNA凝胶回收试剂盒(200)、质粒小量提取试剂盒购自OMEGA生物技术公司；反转录试剂盒、2×Taq PCR MasterMix、RealMasterMix(SYBR Green)购自天根生物技术公司；其他化学试剂均为国产分析纯。临床腹泻病料来自四川各地发病猪场的疑似PEDV感染病料。

2主要仪器设备

MyCyclerTM PCR仪，日本TaKaRa公司；

POWER Pac TM凝胶电泳装置，上海BIO-RAD公司；

UNIVERSAL HOOD紫外凝胶成像系统，BIO-RAD，意大利产；

Mini Opticon实时荧光定量PCR系统，上海宝生物公司；

SCILOEEX D2008E离心机，上海安亭科学仪器厂；

309987-2997 CO2恒温培养箱，Thermo公司；

SW-CJ-2FD超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；

SmartSpec Plus Spectrophotometer(分光光度计)，BIO-RAD公司。

电热恒温水浴槽；振荡培养箱；漩涡振荡器。

3主要试剂配制

LB培养基

SOC培养基

实施例1本发明试剂盒的制备

1、材料和仪器

同前述实验材料和仪器。

2、实验方法

2.1荧光定量PCR引物设计

根据本实验室分离的TGEV SC-H株的全序列，应用生物信息学软件对TGEV全序列进行分析，选取TGEV SC-H株的N基因作为靶序列设计3对荧光定量引物(表1)，并送上海生工生物工程有限公司合成。

表1荧光定量RCR引物

2.2病毒RNA的提取及cDNA的合成

在超净工作台中，将TGEV弱毒疫苗取出一小块，用500μL超纯水稀释，抽取RNA。根据TIANGEN Total RNA Extraction kit使用说明进行。

(1)取250μL细胞液于EP管，加750μL RZ裂解液，振荡摇匀，15℃-30℃静置5min。

(2)4℃，12000r/m，离心5min。

(3)取上清于另一EP管中，加200μL氯仿，剧烈振荡15s，静置3min。

(4)4℃，12000r/m，离心10min，样品分三层，取上层水相转移到另一新EP管中。

(5)缓慢加0.5倍体积无水乙醇，混匀，将溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中。4℃，12000r/m离心30s。

(6)向吸附柱中加入500μL去蛋白液RD，4℃，12000r/m离心30s。

(7)向吸附柱中加入700μL漂洗液RW，室温静置2min。4℃，12000r/m离心30s，弃废液。

(8)再次加入500μL漂洗液RW，室温静置2min。4℃，12000r/m离心30s，弃废液。

(9)4℃，12000r/m空离2min。

(10)将吸附柱开盖，晾干5min。将吸附柱转入新EP管中，加30-80μLRNase free H2O，室温静置2min，4℃，12000r/m离心2min。

(11)吸出离心后的液体，再洗脱一次。

在0.2ml EP管中依次加入如下成分：总体系为10μL

反应条件：37℃，15min；82℃，5s。4℃保存。

2.3常规PCR鉴定

采用宝生物Prime STAR Max进行扩增，15μl体系如下：

反应条件：预变性95℃，5min；变性95℃，30s，退火57℃，30s，延伸72℃，50s，30个循环；终延伸72℃，10min，12℃保存。

PCR反应后，将产物加入2％琼脂糖凝胶，85V，25min，进行电泳。结束后于凝胶成像系统下观察扩增结果。

2.4PCR产物的胶回收

依据E.Z.N.A.Gel Extraction Kit胶回收试剂盒使用说明操作。

(1)切胶。将胶切开，放入已经称好重量的离心管中，再称取重量。

(2)向胶块中加入等量的Binding Buffer，45℃水浴使之充分溶解。

(3)将溶解完全的液体全部转入吸附柱中，10000r/min，离心1min；再将底部液体倒入吸附柱中，10000r/min，离心1min，弃废液。

(4)再加入300μL Binding Buffer，10000r/min，离心1min，弃废液。

(5)向吸附柱中加入700μL漂洗液SPW，12000r/min，弃废液。

(6)再次加入700μL漂洗液SPW，12000r/min，弃废液。

(7)将吸附柱放入收集管，12000r/min，空离2min，尽量出去漂洗液；空离后将吸附柱取出，开盖充分晾干。

(8)将吸附柱放入干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空加入30～50μL Elution Buffer，12000r/min，离心2min。

(9)取4μL回收液加入76μL超纯水中，混匀后测OD260和OD280。

2.5产物的连接与转化

2.5.1DH3α感受态细胞的制备

(1)将DH5α从-20℃冰箱取出，在LB固体培养基上划线，放入37℃孵育箱，培养过夜。

(2)将单个菌落接种到LB肉汤中，搅拌片刻，放入摇床培养，3～5小时候测OD600，当OD600在0.3～0.5之间时，放入冰水中停止培养。

(3)根据Competent Cell Preparation Kit感受态细胞制备说明书进行操作：

①取菌体培养液100ml于两个50ml离心管中。

②4℃，4000r/min，离心5min，弃上清。

③向离心管中分别加入5ml冰中预冷的Solution A，轻轻混匀，使沉淀悬浮，禁止剧烈振荡。

④4℃，4000r/min，离心5min，弃上清。

⑤向离心管中分别加入5ml冰中预冷的Solution B，轻轻混匀，分装到1.5ml离心管中，每管100μl，-80℃保存。

2.5.2目的片段的连接

根据pMD19-T(Simple)试剂盒连接目的片段，反应体系如下：

反应条件：16℃，12～16h过夜，4℃保存。

2.5.3质粒DNA的转化

(1)将-80℃保存的感受态细胞置于冰水中融化10min。

(2)向感受态细胞中加入2μL的质粒，轻轻混匀后放置在冰水中，20～30min。

(3)42℃水浴中放置90s后，立即于冰水中放置2min。

(4)加入600～800μL 37℃预热的SOC培养基，37摄氏度，180r，振荡培养1h。

(5)在LB平板中加入70μL的蓝白斑筛选试剂，超净工作台中避光放置45min。

(6)避光条件下，取80μl培养物均匀涂于Amp+的LB平板，在37℃孵育箱中静置10min后，避光倒置培养过夜。

2.5.4阳性质粒的筛选及鉴定

挑取平板上的单个白色菌落于Amp+的LB液体培养基中，37℃振荡培养12～16h。用目的基因特异性引物做菌液PCR鉴定。

2.5.5阳性质粒的抽提与鉴定

根据E.Z.N.A.Plasmid Mini KitⅠ质粒抽提试剂盒的说明进行质粒抽提，并送上海英骏工程股份有限公司测序。

2.6荧光定量PCR标准品的制备及退火温度的优化

用分光光度计测定TGEV重组阳性质粒在260nm和280nm处的吸光度，计算OD₂₆₀与OD₂₈₀之间的比值，检测核酸的纯度，选择核酸纯度最高的质粒制备荧光定量标准品。计算出质粒DNA的浓度，再用如下公式换算成拷贝数：

将质粒作10倍倍比稀释，浓度分别为：6.37×10⁹、6.37×10^8、6.37×10⁷、6.37×10⁶、6.37×10⁵、6.37×10⁴、6.37×10³、6.37×10²、6.37×10¹、6.37×10⁰拷贝/μL。

将6.37×10⁷、6.37×10⁶、6.37×10⁵、6.37×10⁴、6.37×10³、6.37×10²、6.37×10¹、6.37×10⁰拷贝/μL的质粒做3个重复，根据引物的Tm值，设温度梯度在55℃～61℃之间，进行荧光定量PCR。

荧光定量PCR反应体系如下，总体积为20μL：

反应条件：起始模板预变性95℃，1min；变性95℃，20sec；退火58℃，30sec；延伸68℃，30sec；35个循环。同时设立阴性对照。

2.7荧光定量PCR标准曲线的建立

将6.37×10⁷、6.37×10⁶、6.37×10⁵、6.37×10⁴、6.37×10³、6.37×10²拷贝/μL的质粒标准品进行荧光定量PCR，每个浓度做3个重复，并设立阴性对照。

3、实验结果

3.1菌液PCR结果

将连接转化后的阳性质粒进行菌液PCR后，电泳后得到的条带如图1：1、2、3号为1号引物构建的阳性质粒TGEV-N-1扩增出的目的条带，长度为236bp；4、5、6为2号引物构建的阳性质粒TGEV-N-2扩增出的条带，长度为186bp；7、8、9为3号引物构建的阳性质粒TGEV-N-3扩增出的条带，长度为236bp；1至9号条带均与目的片段长度一致。

3.2重组质粒测序结果

TGEV N基因测序结果，用BLAST比对后证实是TGEV N基因的部分序列，与目的序列一致。

TGEV-N-1:CCCATAACCCTCCAACAAGGTTCAAAATTTTGGAACTTATGTCCGAGAGACTTTGTACCCAAAGGAATAGGTAACAGGGATCAACAGATTGGTTATTGGAATAGACAAACTCGCTATCGCATGGTGAAGGGCCAACGTAAAGAGCTTCCTGAAAGGTGGTTCTTCTACTACTTAGGTACTGGACCTCATGCAGATGCCAAATTTAAAGATAAATTAGATGGAGTTGTCTGGGTTGC

TGEV-N-2(SEQ ID NO：3):

TGCCAAGCATTACCCACAACTGGCTGAATGTGTTCCATCTGTGTCTAGCATTCTGTTTGGAAGCTATTGGACTTCAAAGGAAGATGGCGACCAGATAGAAGTCACGTTCACACACAAATACCACTTGCCAAAGGATGATCCTAAGACTGGACAATTCCTTCAGCAGATTAATGCCTATGCTCGTCCA

TGEV-N-3:CCCATAACCCTCCAACAAGGTTCAAAATTTTGGAACTTATGTCCGAGAGACTTTGTACCCAAAGGAATAGGTAACAGGGATCAACAGATTGGTTATTGGAATAGACAAACTCGCTATCGCATGGTGAAGGGCCAACGTAAAGAGCTTCCTGAAAGGTGGTTCTTCTACTACTTAGGTACTGGACCTCATGCAGATGCCAAATTTAAAGATAAATTAGATGGAGTTGTCTGGGTTGC

3.3荧光定量PCR退火优化结果

结果如图2，当温度在57.4℃至58.8℃时，引物二聚体和非特异性产物的形成最少，因此选择58℃为荧光定量PCR的退火温度。

3.4荧光定量PCR标准曲线

分光光度计测定结果为：TGEV-N-1的OD₂₆₀与OD₂₈₀比值为1.75；TGEV-N-2的比值为1.99；TGEV-N-3的比值为1.82。结果显示TGEV-N-2的核酸纯度高并且浓度最高，同时也说明第二对引物(F2和R2F：GCCAAGCATTACCCACAAC；R：TGGACGAGCATAGGCATTA)可以更加有效地扩增TGEV的基因，因而选择质粒TGEV-N-2制备荧光定量PCR的标准品。

将质粒浓度换算成拷贝数为：6.37×10¹⁰拷贝/μL。当浓度在6.37×10⁷、6.37×10⁶、6.37×10⁵、6.37×10⁴、6.37×10³、6.37×10²拷贝/μL时建立的标准曲线较理想，扩增效率为101.8％，相关系数为0.992。建立的荧光定量PCR的扩增曲线如图3和标准曲线如图4所示。

实施例2特异性实验

一、试验方法

分别抽提猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病病毒(PEDV)、猪轮状病毒(PoRV)、日本乙型脑炎(JEV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)的基因，以第二对引物(F2和R2F：GCCAAGCATTACCCACAAC；R：TGGACGAGCATAGGCATTA)进行荧光定量PCR，以DEPC处理水作为空白对照。以验证本发明基因芯片和试剂盒的特异性。

荧光定量PCR反应体系如下，总体积为20μL：

反应条件：起始模板预变性95℃，1min；变性95℃，20sec；退火58℃，30sec；延伸68℃，30sec；35个循环。

二、结果

实验结果如图5所示，采用本发明方法检测，TGEV检测结果呈阳性，PEDV、PoRV、JEV、CSFV和PRRSV的检测结果均呈阴性。

本发明方法只会检出本发明猪传染性胃肠炎病毒，不会检出其他病毒，说明本发明试剂盒的特异性强。

实施例4灵敏度试验

一、试验方法

以浓度从6.37×10⁵、6.37×10⁴、6.37×10³、6.37×10²、6.37×10¹、6.37×10⁰拷贝/μL的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)质粒标准品为模板，以第二对引物(F2和R2F：GCCAAGCATTACCCACAAC；R：TGGACGAGCATAGGCATTA)进行进行荧光定量PCR，得出能检出的最低模板拷贝数，同时以DEPC处理水作为空白对照。

荧光定量PCR反应体系如下，总体积为20μL：

反应条件：起始模板预变性95℃，1min；变性95℃，20sec；退火58℃，30sec；延伸68℃，30sec；35个循环。

二、结果

结果如图6所示，

以浓度从6.37×10⁵、6.37×10⁴、6.37×10³、6.37×10²、6.37×10¹、6.37×10⁰拷贝/μL的质粒标准品为模板，进行荧光定量PCR，得出能检出的拷贝数下限为6.37×10⁰拷贝/μL。

实验结果说明，采用本发明试剂盒检测，TGEV的最低检测浓度为6.37×10⁰拷贝/μL，灵敏度高。

实施例5重复性试验

1、试验方法

选择同一批3个不同浓度的标准品进行批内重复试验，每个模板浓度做3个重复；再用不同批次这3个浓度的标准品为模板，在不同时间内进行批间重复试验，每个模板浓度做3个重复。对实验数据进行统计学分析，并计算出批内重复试验和批间重复试验的变异系数。实验均设立阴性对照。

以猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)质粒标准品为模板，以第二对引物(F2和R2F：GCCAAGCATTACCCACAAC；R：TGGACGAGCATAGGCATTA)进行进行荧光定量PCR。

荧光定量PCR反应体系如下，总体积为20μL：

反应条件：起始模板预变性95℃，1min；变性95℃，20sec；退火58℃，30sec；延伸68℃，30sec；35个循环。

2、实验结果

实验结果如表2～3所示：

表2荧光定量PCR重复性试验批内重复数据分析

表3荧光定量PCR重复性试验批间重复数据分析

由表2～3可以看出，采用本发明方法检测，重复性好。

实施例6临床检测

1、实验方法

以荧光定量PCR(F和R)为引物，采用荧光定量PCR方法对来自四川乐山、蒲江、茂县等地的仔猪腹泻病料进行检测，并对结果进行比较分析。

荧光定量PCR反应体系如下，总体积为20μL：

反应条件：起始模板预变性95℃，1min；变性95℃，20sec；退火58℃，30sec；延伸68℃，30sec；35个循环。

2、实验结果

用本试验建立的检测方法对来自四川彭州、蒲江、茂县、攀枝花、乐山、重庆涪陵、福建龙岩、山东肇东等地的46份腹泻病料进行检测，同时与常规PCR结果对比，其中荧光定量PCR检出阳性10份，常规RT-PCR检出阳性3份，荧光定量PCR阳性符合率为100％。常规PCR检出的阳性样品均包含在荧光定量PCR检出的样品中。本实验所建立的方法可用于临床样品检测，检测结果如下表4所示：

表4临床样品检测结果

表5.阳性样品的病毒含量

实验结果说明，本发明试剂盒可以有效检测临床样品中猪传染性胃肠炎病毒。

综上，本发明试剂盒可以有效检测猪传染性胃肠炎病毒，特异性强、灵敏度高、耗时短，检测快速，具有良好的应用前景。

Claims (9)

1.一种检测猪传染性胃肠炎病毒的试剂盒，其特征在于：它包括SEQ IDNO：1～2所示引物对，扩增猪传染性胃肠炎病毒基因。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述猪传染性胃肠炎病毒的基因如SEQ ID NO：3所示。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括SEQID NO：3所示基因片段。

4.SEQ ID NO：1～2所示引物对在制备检测猪传染性胃肠炎病毒的试剂中的用途。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述检测猪传染性胃肠炎病毒的试剂是扩增猪传染性胃肠炎病毒的基因的试剂。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述猪传染性胃肠炎病毒的基因如SEQ ID NO：3所示。

7.根据权利要求1所述的的用途，其特征在于：所述试剂还包括SEQ IDNO：3所示基因片段。

8.SEQ ID NO：1～2所示引物对在扩增猪传染性胃肠炎病毒的基因中的用途。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：所述猪传染性胃肠炎病毒的基因如SEQ ID NO：3所示。