CN113122615A

CN113122615A - 一种应用于绝对定量高通量测序的多重pcr扩增的单分子标签引物及其应用

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Publication number: CN113122615A
Application number: CN202110564426.XA
Authority: CN
Inventors: 朱方何; 袁光孝; 林东旭; 周怡; 任胜强; 陈杰
Original assignee: Guangzhou Sagene Biotech Corp
Current assignee: Hunan Saizhe Zhizao Technology Co ltd
Priority date: 2021-05-24
Filing date: 2021-05-24
Publication date: 2021-07-16
Anticipated expiration: 2041-05-24

Abstract

本发明提供了一种应用于绝对定量高通量测序的多重PCR扩增的单分子标签引物及其应用，所述单分子标签引物包括：5’端修饰基团、核苷酸片段和3’端修饰基团；所述5’端修饰基团包括UMI分子标签和通用引物接头，其中，所述UMI分子标签与核苷酸片段的5’端相连，所述通用引物接头与UMI分子标签5’端相连；所述核苷酸序列与目标序列匹配，用于扩增所述目标序列；所述3’端修饰基团包括RNA残基、DNA保护碱基和封闭基团，其中，所述RNA残基与核苷酸片段的3’端相连，所述DNA保护碱基与RNA残基相连，所述封闭基团与DNA保护碱基相连。所述单分子标签引物特异性好，扩增效率高，应用前景广阔。

Description

一种应用于绝对定量高通量测序的多重PCR扩增的单分子标签引物及其应用

技术领域

本发明属于分子检测技术领域，尤其涉及一种应用于绝对定量高通量测序的多重PCR扩增的单分子标签引物及其应用。

背景技术

病原微生物靶向捕获方法主要有两种：一是杂交捕获法，二是多重PCR扩增法。多重PCR扩增是指在一个反应体系中有2个以上的扩增子进行同时扩增。现有的多重PCR扩增法的主要流程为，针对某病灶样本常见的、明确的病原菌种进行多重引物设计，利用设计好的特异性多重引物在一个或多个反应管中进行第一轮多重PCR扩增，富集目标病原菌的靶区域序列；接着对扩增产物进行纯化，最后通过第二轮PCR扩增加上适合测序平台的接头序列，得到测序文库。

多重PCR扩增在单个反应中，引物的数量往往达到几百甚至几千条，必须优化每个引物集的反应程序及缓冲液各组分的比例、浓度才能保证在单个反应中正确扩增出各目标扩增子。但即使如此，多重PCR扩增依然无法很好的解决以下几类问题：引物之间形成二聚体从而相互干扰、非特异性扩增产生大量非目标扩增子影响后续的测序、重叠扩增干扰目标靶区域扩增、无法进行准确的定量、扩增均一性、扩展性及灵活性均较差等。

针对上述问题，目前也有一些针对性的改良方法，CN107532203B公开了一种重叠扩增子的选择性扩增的方法，其主要改进方案为，在正向引物F1的5’区添加一段非同源t2标签，F2中添加t1标签，反向引物R1中添加t1标签，R3中添加t3标签，依次类推；在扩增产物中，正向引物的t1与反向引物的t1反向互补，形成发夹结构，进而阻遏跨扩增子的非目标区域扩增，即达到重叠扩增子选择性扩增的目的。此技术可有效解决重叠扩增干扰目标靶区域扩增的问题，但复杂性很高，设计难度大，存在较大的局限性。

此外，CN106795569B又公开了一种减少引物二聚体扩增的方法，对多重引物进行改进设计，使扩增的非目的产物或引物二聚体产生反向互补杂交，有阻遏下一步的扩增的作用，从而达到减少多重扩增的引物二聚体、提高特异性扩增的目的。但同样的，此技术存在设计复杂，实现难度较大，同时还具有无法对多重扩增子进行准确定量及较难保证各扩增子均一扩增的缺陷，无法满足病原微生物多重扩增靶向测序并定量的应用。

目前出现的多重PCR改进技术往往只能解决部分问题，不能从整体改善扩增效果。因此，如何提供一种可以提高多重PCR扩增的方法，能够从整体上提高扩增效率，并具有良好的扩展性与灵活性，已成为亟待解决的问题。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种应用于绝对定量高通量测序的多重PCR扩增的单分子标签引物及其应用，本发明的利用单分子标签扩增引物，配合优化后的扩增反应体系，可以有效解决二聚体形成、非特异性扩增的问题，并且可以实现原始扩增模板的准确定量，稳定性及扩增均一性极好，具有广阔的应用前景。

为达此目的，本发明采用如下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种应用于绝对定量高通量测序的多重PCR扩增的单分子标签引物，所述单分子标签引物包括：5’端修饰基团、核苷酸片段和3’端修饰基团；

所述5’端修饰基团包括UMI分子标签和通用引物接头，其中，所述UMI分子标签与核苷酸片段的5’端相连，所述通用引物接头与UMI分子标签5’端相连；

所述核苷酸序列与目标序列匹配，用于扩增所述目标序列；

所述3’端修饰基团包括RNA残基、DNA保护碱基和封闭基团，其中，所述RNA残基与核苷酸片段的3’端相连，所述DNA保护碱基与RNA残基相连，所述封闭基团与DNA保护碱基相连。

本发明中，通过对扩增引物进行修饰，提升了多重PCR扩增的效率，其中，3’端修饰的RNA残基、DNA保护碱基和封闭基团可以降低引物分子之间二聚体的形成，并且可以极大地减少非特异性扩增的发生，对测序和分析的影响较小，并且也可以提升引物本身的稳定性；通过在5’端修饰UMI分子标签，可以实现扩增产物的绝对定量，进而对检测结果进行精确的分析；通过连接通用引物接头，扩增产物可以使用二代测序技术进行测序分析，检测及分析的效率较高；经过上述修饰后，扩增均一性良好，对引物间相互干扰的要求较低，降低了引物设计的难度，也可以根据目标需求随时增减或补充引物，适用性和灵活性更强。

本发明中，使用上述单分子标签引物扩增得到的产物既可以通过二代测序的方式进行分析，也可以通过常规的凝胶电泳的方式进行分析。

优选地，所述UMI分子标签包括随机碱基。

优选地，所述随机碱基的数量为2～15个，例如可以是2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个，优选为10个。

优选地，所述通用引物接头包括所述目标序列非同源序列的通用引物，优选为测序平台测序引物(reads)的部分或全部序列。

优选地，所述通用引物的长度为10～30bp，例如可以是10bp、11bp、12bp、13bp、14bp、15bp、16bp、17bp、18bp、19bp、20bp、21bp、22bp、23bp、24bp、25bp、26bp、27bp、28bp、29bp或30bp，优选为15～25bp。

优选地，所述RNA残基的数量为1～10个，例如可以是1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个。

优选地，所述RNA残基包括A、U、G或C中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述DNA保护碱基的数量为不少于1，例如可以是1个、5个、10个、15个、20个、25个或30个。

优选地，所述DNA保护碱基包括A、T、G或C中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述封闭基团包括C3间隔(C3-Spacer)、C5间隔(C5-Spacer)、C6间隔(C6-Spacer)、双脱氧胞苷(ddC)、氨基或碱基倒置中的任意一种或至少两种的组合。

本发明中，对核苷酸片段的序列不做限定，符合常规引物设计的原则即可，Tm值应在57～62℃之间，GC含量应在20％～85％之间，可根据多重引物设计软件进行批量引物设计，也可设计多个单条引物再进行组合。

第二方面，本发明提供了一种第一方面所述的应用于绝对定量高通量测序的多重PCR扩增的单分子标签引物的制备方法，所述制备方法包括：

合成核苷酸片段序列，将UMI分子标签和通用引物接头按顺序依次连接到所述核苷酸片段序列的5’端，再将RNA残基、DNA保护碱基和封闭基团按顺序依次连接到所述核苷酸片段序列的3’端，得到所述应用于绝对定量高通量测序的多重PCR扩增的单分子标签引物。

本发明中，所述应用于绝对定量高通量测序的多重PCR扩增的单分子标签引物的制备方法技术成熟，操作简单，生产效率高，成本低。

第三方面，本发明提供了一种应用于绝对定量高通量测序的多重PCR扩增的配套试剂，所述配套试剂包括第一方面所述的单分子标签引物。

优选地，所述配套试剂还包括扩增反应体系。

优选地，所述扩增反应体系包括酶和缓冲液。

优选地，所述酶包括单分子标签酶和扩增酶。

本发明中，所述单分子标签酶可以特异性识别引物中的RNA残基，并在引物与扩增模板100％特异性结合的情况下才被激活产生活性，对RNA残基进行消解，进而解除引物的封闭效果；所述扩增酶在单分子标签酶解除引物封闭效果后进行延伸扩增，以获得目标产物，所述扩增酶的扩增产物具有良好的保真性。单分子标签酶与扩增酶组合可以避免非特异性扩增的发生。

优选地，所述单分子标签酶为非温度失活酶，最佳活性温度为25～50℃，例如可以是25℃、30℃、35℃、40℃、45℃或50℃，优选为30～40℃。

优选地，所述单分子标签酶包括RNaseA、DpnII、RNaseH酶、RNaseH2酶或RNaseH3酶中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述扩增酶包括高保真PCR酶。

优选地，所述缓冲液的溶质包括氯化镁、dNTPs、硫酸铵、曲拉通、氯化钠、Tris-HCl、氯化钾或牛血清白蛋白中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述缓冲液的溶质包括氯化镁、dNTPs、硫酸铵、曲拉通、氯化钠、Tris-HCl、氯化钾和牛血清白蛋白。

优选地，所述氯化镁在所述缓冲液中的终浓度为0.5～10mM，例如可以是0.5mM、1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM或10mM，优选为5mM。

优选地，所述dNTPs在所述缓冲液中的终浓度为50～1000nM，例如可以是50nM、100nM、200nM、300nM、400nM、500nM、600nM、700nM、800nM、900nM或1000nM，优选为250nM。

优选地，所述硫酸铵在所述缓冲液中的终浓度为1～15mM，例如可以是1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM或15mM，优选为10mM。

优选地，所述曲拉通在所述缓冲液中的质量分数为0.01％～0.5％，例如可以是0.01％、0.05％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％或0.5％，优选为0.1％。

优选地，所述氯化钠在所述缓冲液中的终浓度为1～50mM，例如可以是1mM、5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM或50mM，优选为15mM。

优选地，所述Tris-HCl在所述缓冲液中的终浓度为1～50mM，例如可以是1mM、5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM或50mM，优选为20mM。

优选地，所述氯化钾在所述缓冲液中的终浓度为10～150mM，例如可以是10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、110mM、120mM、130mM、140mM或150mM，优选为80mM。

优选地，所述牛血清白蛋白在所述缓冲液中的质量浓度为0.1～1μg/μL，例如可以是0.1μg/μL、0.2μg/μL、0.3μg/μL、0.4μg/μL、0.5μg/μL、0.6μg/μL、0.7μg/μL、0.8μg/μL、0.9μg/μL或1μg/μL，优选为0.8μg/μL。

本发明中，曲拉通可以帮助降低引物二聚体的形成及非特异性扩增的发生，配合缓冲液中的其他组分及优化后的浓度，提高引物与扩增反应体系的适配性，扩增效率更好，结果更准确。

第四方面，本发明提供一种绝对定量高通量测序的多重PCR扩增方法，所述多重PCR扩增方法包括：

根据第二方面所述的制备方法合成应用于绝对定量高通量测序的多重PCR扩增的单分子标签引物，并配置成溶液；

配置缓冲液，加入酶，制成扩增反应体系；

使用单分子标签引物的溶液和扩增反应体系进行PCR扩增；

对扩增结果进行分析。

本发明中，所述绝对定量高通量测序的多重PCR扩增的新方法操作简单，使用方便，提高了检测效率，增加了检测的特异性，具有极高的应用价值。

优选地，所述PCR扩增的程序包括预变性、解除封闭和循环扩增。

优选地，所述解除封闭的程序包括：

30～40℃，1～10min，温度例如可以是30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃，时间例如可以是1min、2min、3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min或10min；

59～61℃，50～70s，温度例如可以是59℃、59.5℃、60℃、60.5℃或61℃，时间例如可以是50s、51s、52s、53s、54s、55s、56s、57s、58s、59s、60s、61s、62s、63s、64s、65s、66s、67s、68s、69s或70s。

本发明中，所述循环扩增的程序根据具体引物的Tm值及扩增产物的片段大小进行调整及确认，此处不做限定。

优选地，所述分析包括凝胶电泳分析和/或测序分析。

作为优选技术方案，本发明所述的绝对定量高通量测序的多重PCR扩增方法，包括以下步骤：

(1)合成核苷酸片段序列，将UMI分子标签和通用引物接头按顺序依次连接到所述核苷酸片段序列的5’端，再将RNA残基、DNA保护碱基和封闭基团按顺序依次连接到所述核苷酸片段序列的3’端，得到所述应用于绝对定量高通量测序的多重PCR扩增的单分子标签引物，并配置成溶液；

(2)使用去离子水配置含氯化镁、dNTPs、硫酸铵、曲拉通、氯化钠、Tris-HCl、氯化钾和牛血清白蛋白的缓冲液，加入单分子标签酶和扩增酶，制成扩增反应体系；

(3)使用单分子标签引物的溶液和扩增反应体系进行PCR扩增，所述PCR扩增的程序包括：

预变性：93～98℃，1～10min；

解除封闭：30～40℃，1～10min；59～61℃，50～70s；

循环扩增；

(4)对扩增结果进行凝胶电泳分析和/或测序分析。

第五方面，本发明提供了第一方面所述的应用于绝对定量高通量测序的多重PCR扩增的单分子标签引物、第二方面所述的应用于绝对定量高通量测序的多重PCR扩增的单分子标签引物的制备方法、第三方面所述的应用于绝对定量高通量测序的多重PCR扩增的配套试剂或第四方面所述的应用于绝对定量高通量测序的多重PCR扩增方法中的任意一种或至少两种的组合在制备应用于绝对定量高通量测序产品中的应用。

本发明中，所述应用于绝对定量高通量测序的多重PCR扩增方法中的单分子标签引物特异性良好，扩增效率高，稳定性好，容易制备；所述配套试剂缓冲液配方合理，进一步降低二聚体及非特异性扩增发生的概率，同时实现了绝对定量，结果准确，使用方便，检测效率高，具有极高的应用价值。

相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明通过在扩增引物的3’端依次修饰RNA残基、DNA保护碱基和封闭基团，可以避免引物之间形成二聚体及非特异性扩增的发生，引物本身的稳定性也得以提升；5’端修饰UMI分子标签以实现扩增产物的绝对定量，连接通用引物接头使扩增产物可以使用二代测序技术进行分析，结果分析准确；

(2)本发明所述应用于绝对定量高通量测序的多重PCR扩增方法中的配套试剂通过对扩增反应体系进行优化，提高了反应体系对单分子标签引物对的适配性，非特异性扩增及引物二聚体更少，扩增效率更高，结果更加准确；扩增结果具有极佳的均一性，可以保持模板目标物的相对比例，结果更接近实际情况；使用方便，容易操作，适用性强具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例5中的扩增结果图片，图中，M-标准DNA分子量marker，1-单分子标签引物扩增结果，2-未加样本模板的阴性对照组的扩增结果，3-未经修饰的核苷酸片段直接作为引物的条件对照组的扩增结果；

图2为本发明实施例6中的扩增结果图片，图中，M-标准DNA分子量marker，1-实验1组的扩增结果，2-实验2组的扩增结果，3-实验3组的扩增结果，4-实验4组的扩增结果，5-实验5组的扩增结果，6-实验6组的扩增结果；

图3为本发明实施例7中的扩增结果图片，图中，M-标准DNA分子量marker，1-使用本发明配套试剂的扩增结果，2-使用市售的扩增结果。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

以下实施例及对比例中，引物序列中不同的基团以“/”分隔开，其中按5’-3’的顺序依次为：通用引物接头/UMI分子标签/核苷酸序列/RNA残基/DNA保护碱基/封闭基团；

其中，

UMI分子标签均为随机的DNA碱基N，其中N代表A、T、G或C；

rA、rU、rG和rC分别代表RNA残基A、U、G和C；

封闭基团均为C3-Spacer。

原料：氯化钾、氯化钠、氯化镁、硫酸铵、曲拉通、牛血清白蛋白、dNTPs和Tris-HCl均购自Sigma。

耐热DpnII酶、RNaseH酶、耐热RNaseH2酶和Q5热启动高保真DNA聚合酶购自NEB；

市售试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；

血液样本、脑脊液样本及肺泡灌洗液样本来自南方医科大学附属医院科研合作样本。

实施例1

本实施例提供一组应用于绝对定量高通量测序的多重PCR扩增的单分子标签引物，所述单分子标签引物可以用于申克孢子丝菌、小孢根霉及米根霉的联合检测中。

所述单分子标签引物包括：5’端修饰基团、核苷酸片段和3’端修饰基团；

所述核苷酸序列与目标序列匹配，用于扩增所述目标序列；

所述3’端修饰基团包括RNA残基、DNA保护碱基和封闭基团，其中，所述RNA残基与核苷酸片段的3’端相连，所述DNA保护碱基与RNA残基相连，所述封闭基团与DNA保护碱基相连；

其中，UMI分子标签均为10个随机的DNA碱基N，其中N代表A、T、G或C；封闭基团均为C3-Spacer。

其中，检测申克孢子丝菌的单分子标签引物的序列如SEQ ID No.1～2所示；

检测小孢根霉的单分子标签引物的序列如SEQ ID No.3～4所示；

检测米根霉的单分子标签引物的序列如SEQ ID No.5～6所示。

SEQ ID No.1：

ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/ACTCTCATTACAATTCTCAAATC/rUrC/ACCGACTG/C3 Spacer；

SEQ ID No.2：

GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/TCCGACAGGAACGTCGATC/rArG/TACAGAGA/C3 Spacer；

SEQ ID No.3：

ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/ATTCGACCGCCTTACGCTG/rArG/TTACCAAA/C3 Spacer；

SEQ ID No.4：

GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/GCGTTCGTTCCGATCAGGAACGG/rGrC/CCATACGG/C3 Spacer；

SEQ ID No.5：

ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/ATTCGACCGCCTTACCCA/rCrC/GGAGGCCCA/C3 Spacer；

SEQ ID No.6：

GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/TCAGGAACGTCGATCC/rCrA/TTTTACCC/C3 Spacer。

上述单分子标签引物通过如下方法进行制备：

实施例2

本实施例提供一组应用于绝对定量高通量测序的多重PCR扩增的单分子标签引物，所述单分子标签引物可以用于多种病原微生物的联合检测中。

所述核苷酸序列与目标序列匹配，用于扩增所述目标序列；

其中，检测大肠埃希菌的单分子标签引物的序列如SEQ ID No.7～8所示；

检测侵蚀艾肯菌的单分子标签引物的序列如SEQ ID No.9～10所示；

检测奇异变形杆菌的单分子标签引物的序列如SEQ ID No.11～12所示；

检测鲍曼不动杆菌的单分子标签引物的序列如SEQ ID No.13～14所示；

检测布鲁氏菌的单分子标签引物的序列如SEQ ID No.15～16所示；

检测洛菲不动杆菌的单分子标签引物的序列如SEQ ID No.17～18所示；

检测产气肠杆菌的单分子标签引物的序列如SEQ ID No.19～20所示；

检测侵阴沟肠杆菌的单分子标签引物的序列如SEQ ID No.21～22所示；

检测流感嗜血杆菌的单分子标签引物的序列如SEQ ID No.23～24所示；

检测伴放线杆菌的单分子标签引物的序列如SEQ ID No.25～26所示；

检测铜绿假单胞菌的单分子标签引物的序列如SEQ ID No.27～28所示；

检测脑膜败血性黄杆菌的单分子标签引物的序列如SEQ ID No.29～30所示；

检测金氏金杆菌的单分子标签引物的序列如SEQ ID No.31～32所示；

检测肺炎克雷伯菌的单分子标签引物的序列如SEQ ID No.33～34所示；

检测类志贺邻单胞菌的单分子标签引物的序列如SEQ ID No.35～36所示；

检测黏液玫瑰单胞菌的单分子标签引物的序列如SEQ ID No.37～38所示；

检测齿垢密螺旋体的单分子标签引物的序列如SEQ ID No.39～40所示；

检测梅毒密螺旋体的单分子标签引物的序列如SEQ ID No.41～42所示；

检测奥斯陆莫拉菌的单分子标签引物的序列如SEQ ID No.43～44所示；

检测卡他莫拉菌的单分子标签引物的序列如SEQ ID No.45～46所示；

检测非液化莫拉菌的单分子标签引物的序列如SEQ ID No.47～48所示；

检测微黄奈瑟菌的单分子标签引物的序列如SEQ ID No.49～50所示；

检测脑膜炎奈瑟菌的单分子标签引物的序列如SEQ ID No.51～52所示；

检测浅黄奈瑟菌的单分子标签引物的序列如SEQ ID No.53～54所示；

检测干燥奈瑟菌的单分子标签引物的序列如SEQ ID No.55～56所示；

检测猕猴奈瑟菌的单分子标签引物的序列如SEQ ID No.57～58所示；

检测颊普雷沃菌的单分子标签引物的序列如SEQ ID No.59～60所示；

检测中间普雷沃菌的单分子标签引物的序列如SEQ ID No.61～62所示；

检测产黑色普雷沃菌的单分子标签引物的序列如SEQ ID No.63～64所示；

检测雷氏普罗维登斯菌的单分子标签引物的序列如SEQ ID No.65～66所示；

检测人心杆菌的单分子标签引物的序列如SEQ ID No.67～68所示；

检测黏质沙雷菌的单分子标签引物的序列如SEQ ID No.69～70所示；

以及内参1的单分子标签引物的序列如SEQ ID No.71～72所示；

内参2的单分子标签引物的序列如SEQ ID No.73～74所示；

外源质控1的单分子标签引物的序列如SEQ ID No.75～76所示；

外源质控2的单分子标签引物的序列如SEQ ID No.77～78所示。

SEQ ID No.7：

ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNAGCTTCCATGGGGATAGCTG/rtrC/ACCGACTG-C3 Spacer；

SEQ ID No.8：

GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNTAGGCAGACGTCTAGGCAGA/rArG/TACAG AGA-C3 Spacer；

SEQ ID No.9：

ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/GCGTGGCGTTTCAATGGAA/rArG/TTACCAAA/C3 Spacer；

SEQ ID No.10：

GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/GCGTTCGTCATTTGATTCGG/rGrC/CCATACGG/C3 Spacer；

SEQ ID No.11：

ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/GCATTCATCTGCCTATCCCCA/rCrC/GGAGGCCCA/C3 Spacer；

SEQ ID No.12：

GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/GCCTTTATCACCTCTCCCCC/rCrA/TTTTACCC/C3 Spacer；

SEQ ID No.13：

ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/CTACCTTCGATCGATCCCTCTCAGA/rCrA/GATTACTCTCAGA/C3 Spacer；

SEQ ID No.14：

GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/GCCCTCAACTGGTCCATGAA/rUrA/ACATAGAA/C3 Spacer；

SEQ ID No.15：

ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/CCTTGAGATGACCTGGGGTAAA/rGrA/TATCGGTAAA/C3 Spacer；

SEQ ID No.16：

GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/ACTCCTGGGAAGGTCTGTATT/rUrA/TAACATATT/C3 Spacer；

SEQ ID No.17：

ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/CAGGAACGTCGATCCCTGAG/rGrA/CATAGGAG/C3 Spacer；

SEQ ID No.18：

GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/GCTTCTTTTTCTGCGTCCCG/rGrC/ATGAACCG/C3 Spacer；

SEQ ID No.19：

ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/TGTTCTTCGTTTCCCCTTCCAA/rCrA/CAATATCCAA/C3 Spacer；

SEQ ID No.20：

GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/ATGAAACAGTTGGATAGTTTCTAGC/rGrC/TTCATATTTCTAGC/C3 Spacer；

SEQ ID No.21：

ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/GTCCGGGTTGTCAATCCCGT/rUrG/AGCAACGT/C3 Spacer；

SEQ ID No.22：

GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/CCTTGTATGAGTTCTTTTTCGTCAATG/rGrC/AACAGTTCGTCAATG/C3 Spacer；

SEQ ID No.23：

ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/GTCCCTACCTACCGGACCAC/rCrG/ACAGACAC/C3 Spacer；

SEQ ID No.24：

GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/CAAGCTATTGGAGAGTTTGCC/rCrA/CAAAGTGCC/C3 Spacer；

SEQ ID No.25：

ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/CCAGTTGAATGGCAAGTTGACA/rArC/TTAAAATGACA/C3 Spacer；

SEQ ID No.26：

GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/ACTCTCATTACAATTCTCAAATCATCA/rArC/ATAAACAAATCATCA/C3 Spacer；

SEQ ID No.27：

ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/TCAACTTCTTTCTCCCTAGCCAAC/rUrC/TTTAGAAGCCAAC/C3 Spacer；

SEQ ID No.28：

GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/GCAATTAGCGGACGAACTCG/rUrA/AAGCATCG/C3 Spacer；

SEQ ID No.29：

ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/AATCTTGTCCGTGGATGTTGA/rCrC/TACCGTTGA/C3 Spacer；

SEQ ID No.30：

GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/GAACTTTGTGGATCGGCGG/rCrG/AATTAGG/C3 Spacer；

SEQ ID No.31：

ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/ACGCAATCCTTTCTCGCGTA/rGrG/AGCTAGTA/C3 Spacer；

SEQ ID No.32：

GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/TGCATCATGAAATCACGAAAAAGTAAA/rGrC/AGCGAAAAAAGTAAA/C3 Spacer；SEQ ID No.33：

ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/GGGTACTCGGTTTTGGGGTA/rArC/TTTCTAGTA/C3 Spacer；

SEQ ID No.34：

GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/ACCAAAGCGGATATGGATGCTC/rGrC/TACGATGCT/C3 Spacer；

SEQ ID No.35：

ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/CGTCAAAGTGGCATTAAAGACAGT/rCrA/GATCAAGACAGT/C3 Spacer；

SEQ ID No.36：

GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/GTGGGTATTCCGCTGCACT/rArG/AAATGCT/C3 Spacer；

SEQ ID No.37：

ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/AGAGTCGCTGCAACCTCATC/rArG/CAAGAATC/C3 Spacer；

SEQ ID No.38：

GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/ATTCGACCGCCTTACGCTG/rCrA/CCCGATG/C3 Spacer；

SEQ ID No.39：

ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/TGACCAGAAACGCCTTGTACT/rCrG/TGCAGTACT/C3 Spacer；

SEQ ID No.40：

GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/AAAGAAGCGCGAGGAAGAGGT/rGrC/CCCCGAGG/C3 Spacer；

SEQ ID No.41：

ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/GTTAACTGACGCCACCCCC/rGrA/AATTACC/C3 Spacer；

SEQ ID No.42：

GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/CCCGTGAGCTTGCACCTTT/rGrC/TTCTGATT/C3 Spacer；

SEQ ID No.43：

ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/GTTGAGAGCAGGGCGGTTT/rUrC/AGGTGTT/C3 Spacer；

SEQ ID No.44：

GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/ACCCACAAGTGCCCGCAG/rCrA/TCTCAG/C3 Spacer；

SEQ ID No.45：

ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/CTGCGTCATCGTCCCGTG/rCrA/GAAAAG/C3 Spacer；

SEQ ID No.46：

GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/GTTCTTTCCTGGAGTACGTAGGTTC/rCrA/GCTGGGTAGGT/C3 Spacer；

SEQ ID No.47：

ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/AACTATGCGCGCTGGAAGATCA/rGrA/TCGTGGATCA/C3 Spacer；

SEQ ID No.48：

GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/TCGATCCATCACACCACCAC/rGrC/GTATACAC/C3 Spacer；

SEQ ID No.49：

ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/CCTTCGCACTTTCCCCCG/rCrG/TTATGAG/C3 Spacer；

SEQ ID No.50：

GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/CGCCAGTAAGGAAGTCGATAATG/rCrA/TGGCGATAATG/C3 Spacer；

SEQ ID No.51：

ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/CGTTCGACGCGTTTTCCAAC/rGrA/AGATGAAC/C3 Spacer；

SEQ ID No.52：

GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/CAGTCAGAGGGTAATGGCGG/rUrG/TTGGGACGG/C3 Spacer；

SEQ ID No.53：

ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/ACGAGCTAAAACACTTAGATGTTGC/rArC/CCGAGGATGTTGC/C3 Spacer；

SEQ ID No.54：

GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/GTGACGGCGAGATGTTCCTT/rArG/AGTGACT/C3 Spacer；

SEQ ID No.55：

ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/CTGCCTGTAGTCTTCTCGGC/rUrC/GTCAAGGC/C3 Spacer；

SEQ ID No.56：

GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/CAACGGTCACTTGTTTCCCC/rCrG/TTTTGAACCC/C3 Spacer；

SEQ ID No.57：

ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/TCGAAATCGGTGATGCGGTA/rCrG/GTCAAGTA/C3 Spacer；

SEQ ID No.58：

GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/TGTGGTTTAATTCCAAAGGCTCTTT/rCrG/TACCAGGCTCTTT/C3 Spacer；

SEQ ID No.59：

ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/CATCCCATGGTCGCTGCTT/rGrC/GGTTATT/C3 Spacer；

SEQ ID No.60：

GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/CCAACAAAGCTACGCCTACAATGG/rArG/CCCTAACAATG/C3 Spacer；

SEQ ID No.61：

ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/AGCTTCATCGATAGCATGTTGC/rArG/TTTATAGTTGC/C3 Spacer；

SEQ ID No.62：

GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/TGGTTTTCAGTACGCTCGGT/rCrA/GACTAGGT/C3 Spacer；

SEQ ID No.63：

ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/ACAGGTTACAATTGTCATGGCTTG/rCrA/TACCATGGCTTG/C3 Spacer；

SEQ ID No.64：

GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/GGCTCACTTGCACTCGCTC/rArC/GGTCAT/C3 Spacer；

SEQ ID No.65：

ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/TTAGTGGCAGTGCGTGACTT/rArC/AGCTACTT/C3 Spacer；

SEQ ID No.66：

GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/AGCTTGGTGTACATCCGGAA/rCrG/TTGAATGGAA/C3 Spacer；

SEQ ID No.67：

ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/ATCGCTGCAGCTTGACGTAA/rArC/GGAAATAA/C3 Spacer；

SEQ ID No.68：

GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/TTATCCGAGTTTTGTTTCTTTTGGC/rGrC/GACCACTTTTGGC/C3 Spacer；

SEQ ID No.69：

ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/GGAAGGCCGGCGCTATTC/rGrA/CCAAAC/C3 Spacer；

SEQ ID No.70：

GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/ACGTTTATTATTGCGTAAATCGTTAAG/rArG/CAATACTAATCGTTAAG/C3 Spacer；SEQ ID No.71：

ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/TGGAAGCCTATGAATGTTCTGAAAAA/rGrC/AGCAGTCTGAAAAA/C3 Spacer；

SEQ ID No.72：

GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/AAACAAGAATTGAAGTCCTAAAAAGGCT/rArG/CTGGACTAAAAAGGC/C3 Spacer；SEQ ID No.73：

ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/GCATTTTGGTCTTCTGTTTTGC/rArG/ACTA/C3 Spacer；

SEQ ID No.74：

GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/GCATTTTGGTCTTCTGTTTTGC/rArG/ACTA/C3 Spacer；

SEQ ID No.75：

ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/TCAGGTAACGAGGTCAATGC/rCrG/GTCA/C3 Spacer；

SEQ ID No.76：

GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/TCAGGTAACGAGGTCAATGC/rCrG/GTCA/C3 Spacer；

SEQ ID No.77：

ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/GGACTCCATTGTCAATCCCCA/rGrC/AGCCA/C3 Spacer；

SEQ ID No.78：

GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT/NNNNNNNNNN/TCATATATGTTGACATCTTGAGCAAAT/rArA/TCTGGAC/C3 Spacer。

上述单分子标签引物通过如下方法进行制备：

实施例3

本实施例提供一种应用于绝对定量高通量测序的多重PCR扩增的配套试剂，所述配套试剂包括实施例1中的应用于绝对定量高通量测序的多重PCR扩增的单分子标签引物、酶混合物和缓冲液，所述酶混合物为耐热DpnII酶、RNaseH酶、RNaseH2酶和Q5热启动高保真DNA聚合酶按质量比为1:1:1:3的混合物，所述缓冲液的溶质包括氯化镁、dNTPs、硫酸铵、曲拉通、氯化钠、Tris-HCl、氯化钾和牛血清白蛋白，其中氯化镁的终浓度为5mM，dNTPs的终浓度为250nM，硫酸铵的终浓度为10mM，曲拉通的质量分数为0.1％，氯化钠的终浓度为15mM，Tris-HCl的终浓度为20mM，氯化钾的终浓度为80mM，牛血清白蛋白的质量浓度为0.8μg/μL。

本发明所述应用于绝对定量高通量测序的多重PCR扩增的配套试剂特异性良好，能显著降低引物二聚体，高保真PCR酶可以避免扩增过程中引入错配及突变，并避免非特异性扩增的发生，配合优化后的扩增反应体系，进一步提高了配套试剂的特异性，应用价值极高。

实施例4

本实施例提供一种应用于绝对定量高通量测序的多重PCR扩增的配套试剂，所述配套试剂包括实施例2中的应用于绝对定量高通量测序的多重PCR扩增的单分子标签引物、酶混合物和缓冲液，所述酶混合物为耐热DpnII酶、RNaseH酶、RNaseH2酶和Q5热启动高保真DNA聚合酶按质量比为1:1:1:3的混合物，所述缓冲液的溶质包括氯化镁、dNTPs、硫酸铵、曲拉通、氯化钠、Tris-HCl、氯化钾和牛血清白蛋白，其中氯化镁的终浓度为5mM，dNTPs的终浓度为250nM，硫酸铵的终浓度为10mM，曲拉通的质量分数为0.1％，氯化钠的终浓度为15mM，Tris-HCl的终浓度为20mM，氯化钾的终浓度为80mM，牛血清白蛋白的质量浓度为0.8μg/μL。

本发明所述应用于绝对定量高通量测序的多重PCR扩增的配套试剂特异性良好，扩增效率高，扩增得到的产物可直接通过凝胶电泳进行半定量分析，也可以通过二代测序技术进行绝对定量分析，适用性强，具有广阔的应用前景。

实施例5

本实施例使用实施例3制备的应用于绝对定量高通量测序的多重PCR扩增的配套试剂，对人工合成的含申克孢子丝菌、小孢根霉及米根霉基因组模板的样品进行检测，具体过程包括PCR扩增和分析。

PCR扩增的体系如下：

PCR扩增的程序如下：

预变性：95℃，5min；

解除封闭：37℃，5min；60℃，60s；

循环扩增；95℃，30s；60℃，1min；72℃，1min，循环30次。

同时，使用去离子水代替样本模板进行扩增，作为阴性对照组；直接合成上述单分子标签引物中的核苷酸片段作为引物，不进行修饰，作为条件对照组，进行相同的扩增反应，扩增结果如图1所示。

由图1可以看出，使用单分子标签引物扩增的条带较亮，且无杂带，说明扩增效率较高，且无引物二聚体及非特异性扩增的产生；阴性对照无条带，证明扩增体系无污染；而使用未经修饰的引物的条件对照组的扩增条带亮度较暗，且存在许多扎带，说明其扩增效率较低，并且有引物二聚体及非特异扩增的产生。这说明本发明所述的单分子标签引物具有更优的性能。

实施例6

本实施例验证实施例3制备的应用于绝对定量高通量测序的多重PCR扩增的配套试剂的灵敏性及扩增均一性，具体包括如下步骤。

以人工合成的含申克孢子丝菌、小孢根霉及米根霉基因组模板的样品作为检测对象，设置3个平行的实验1～3组，使其中的模板的DNA总量的比值为2:1:1.5，再将每个组别中的模板分别稀释100倍，作为实验4～6组。对上述模板进行扩增，每个反应中加入模板5μL，其余的扩增体系及扩增条件与实施例5中相同，扩增结果如图2所示。

由图2可以看出，实验1～3组扩增产物的亮度比例接近于2:1:1.5，实验4～6组扩增产物的亮度比例也接近于2:1:1.5，同时，实验1组和实验4组、实验2组和实验5组以及实验3组和实验6组的条带亮度的比例也接近于100:1，与设置的样本浓度的比例相符，这说明本发明所述的应用于绝对定量高通量测序的多重PCR扩增的配套试剂具有良好的灵敏性、扩增均一性及扩增效率，检测结果更接近实际情况。

实施例7

本实施例对比本发明实施例3构建的应用于绝对定量高通量测序的多重PCR扩增的配套试剂和市售试剂盒的灵敏性和特异性。使用人工合成的含申克孢子丝菌、小孢根霉及米根霉基因组模板的样品作为模板，实验组使用实施例3构建的配套试剂；对照组使用市售试剂盒中的酶及缓冲液，直接使用未经修饰的核苷酸片段作为引物，扩增的体系及程序与实施例5相同，结果如图3所示。

由图3可知，本发明制备的配套试剂扩增效率良好，扩增产物条带较亮，且无杂带，而使用市售试剂盒扩增后则出现了大量的杂带及引物二聚体，并且影响了目标产物的扩增。上述结果进一步证明了本发明所述的应用于绝对定量高通量测序的多重PCR扩增的单分子标签引物具有良好的扩增效率及灵敏性，配合优化后的扩增反应体系，具有极好的特异性，适用性强，延展性好。

实施例8

本实施例使用实施例4构建的应用于绝对定量高通量测序的多重PCR扩增的配套试剂，对已经通过mNGS检验证明为阳性的血液样本、脑脊液样本及肺泡灌洗液样本各10例进行定量检测，同时使用500个拷贝的阳性质粒作为对照，验证定量结果的准确性，具体过程包括PCR扩增和建库分析。

PCR扩增的体系及程序与实施例5中相同。

建库分析包括以下步骤：

(1)将扩增产物用0.8×纯化磁珠进行扩增文库的纯化；

(2)将纯化后的扩增文库按照等摩尔数进行混合集中建库(pooling)，使文库浓度为1.9pmol/μL；

(3)所得文库用Illumina测序平台进行二代测序；

(4)对原始数据进行过滤，去除低质量数据；

(5)对过滤后的数据按不同索引(index)标签进行各样本数据拆分；

(6)拆分后的数据对UMI分子标签进行统计分析，去除相同UMI分子标签的阅读子(reads)；

(7)对拆分得到的包含唯一UMI分子标签的测序序列，与构建的病原微生物数据库进行比对分析，鉴定病原菌种，统计比对此菌种的UMI分子标签的个数，得出原始模板病原核酸片段的数量，进而推断样本中病原微生物拷贝数浓度。

检测结果如表1所示。

表1

由表1可知，使用本发明所述的应用于绝对定量高通量测序的多重PCR扩增的配套试剂成功检测到目标病原菌，与mNGS结果一致，检测结果准确；而根据分子标签数量进行绝对定量，500拷贝的阳性质粒定量结果介于495-505拷贝之间，显示出极佳的定量性能，准确性极高。

综上所述，本发明提供了一种绝对定量高通量测序的多重PCR扩增的新方法，通过对扩增引物的修饰，提升了多重PCR扩增反应的效率，降低了引物二聚体及非特异性扩增的发生，减少了对测序及分析的影响；配合优化后的扩增反应体系与配套试剂，使得本发明的可绝对定量高通量测序的多重PCR扩增方法具有良好的灵敏性、特异性和扩增均一性，扩增产物既可通过凝胶电泳进行半定量分析又可结合高通量测序技术进行绝对定量，使用方便，容易操作，适用性强，应用前景广阔。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

序列表

<110> 广州赛哲生物科技股份有限公司

<120> 一种应用于绝对定量高通量测序的多重PCR扩增的单分子标签引物及其应用

<130> 2021

<160> 78

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (32)..(41)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 1

actctttccc tacacgacgc tcttccgatc tnnnnnnnnn nactctcatt acaattctca 60

aatcucaccg actg 74

<210> 2

<211> 71

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (33)..(42)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 2

gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctnnnnnnnn nntccgacag gaacgtcgat 60

cagtacagag a 71

<210> 3

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (32)..(41)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 3

actctttccc tacacgacgc tcttccgatc tnnnnnnnnn nattcgaccg ccttacgctg 60

agttaccaaa 70

<210> 4

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (33)..(42)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 4

gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctnnnnnnnn nngcgttcgt tccgatcagg 60

aacgggccca tacgg 75

<210> 5

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (32)..(41)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 5

actctttccc tacacgacgc tcttccgatc tnnnnnnnnn nattcgaccg ccttacccac 60

cggaggccca 70

<210> 6

<211> 68

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (33)..(42)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 6

gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctnnnnnnnn nntcaggaac gtcgatccca 60

ttttaccc 68

<210> 7

<211> 71

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (32)..(41)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 7

actctttccc tacacgacgc tcttccgatc tnnnnnnnnn nagcttccat ggggatagct 60

gtcaccgact g 71

<210> 8

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (33)..(42)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 8

gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctnnnnnnnn nntaggcaga cgtctaggca 60

gaagtacaga ga 72

<210> 9

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (32)..(41)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 9

actctttccc tacacgacgc tcttccgatc tnnnnnnnnn ngcgtggcgt ttcaatggaa 60

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<210> 10

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<400> 10

gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctnnnnnnnn nngcgttcgt catttgattc 60

gggcccatac gg 72

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> n is a, c, g, t or u

<400> 11

actctttccc tacacgacgc tcttccgatc tnnnnnnnnn ngcattcatc tgcctatccc 60

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<210> 12

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<400> 12

gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctnnnnnnnn nngcctttat cacctctccc 60

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<210> 13

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列

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<222> (32)..(41)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 13

actctttccc tacacgacgc tcttccgatc tnnnnnnnnn nctaccttcg atcgatccct 60

ctcagacaga ttactctcag a 81

<210> 14

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

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<223> n is a, c, g, t or u

<400> 14

gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctnnnnnnnn nngccctcaa ctggtccatg 60

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<210> 15

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (32)..(41)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 15

actctttccc tacacgacgc tcttccgatc tnnnnnnnnn nccttgagat gacctggggt 60

aaagatatcg gtaaa 75

<210> 16

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (33)..(42)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 16

gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctnnnnnnnn nnactcctgg gaaggtctgt 60

attuataaca tatt 74

<210> 17

<211> 71

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (32)..(41)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 17

actctttccc tacacgacgc tcttccgatc tnnnnnnnnn ncaggaacgt cgatccctga 60

ggacatagga g 71

<210> 18

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (33)..(42)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 18

gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctnnnnnnnn nngcttcttt ttctgcgtcc 60

cggcatgaac cg 72

<210> 19

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (32)..(41)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 19

actctttccc tacacgacgc tcttccgatc tnnnnnnnnn ntgttcttcg tttccccttc 60

caacacaata tccaa 75

<210> 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (33)..(42)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 20

gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctnnnnnnnn nnatgaaaca gttggatagt 60

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (32)..(41)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 21

actctttccc tacacgacgc tcttccgatc tnnnnnnnnn ngtccgggtt gtcaatcccg 60

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<212> DNA

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<221> misc_feature

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<223> n is a, c, g, t or u

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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctnnnnnnnn nnccttgtat gagttctttt 60

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<212> DNA

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<221> misc_feature

<222> (32)..(41)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 23

actctttccc tacacgacgc tcttccgatc tnnnnnnnnn ngtccctacc taccggacca 60

ccgacagaca c 71

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<221> misc_feature

<222> (33)..(42)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 24

gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctnnnnnnnn nncaagctat tggagagttt 60

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<212> DNA

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actctttccc tacacgacgc tcttccgatc tnnnnnnnnn nccagttgaa tggcaagttg 60

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<212> DNA

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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctnnnnnnnn nnactctcat tacaattctc 60

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actctttccc tacacgacgc tcttccgatc tnnnnnnnnn ntcaacttct ttctccctag 60

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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctnnnnnnnn nngcaattag cggacgaact 60

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actctttccc tacacgacgc tcttccgatc tnnnnnnnnn naatcttgtc cgtggatgtt 60

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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctnnnnnnnn nnccaacaaa gctacgccta 60

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actctttccc tacacgacgc tcttccgatc tnnnnnnnnn natcgctgca gcttgacgta 60

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<212> DNA

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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctnnnnnnnn nnacgtttat tattgcgtaa 60

atcgttaaga gcaatactaa tcgttaag 88

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tgaaaaagca gcagtctgaa aaa 83

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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctnnnnnnnn nnaaacaaga attgaagtcc 60

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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctnnnnnnnn nngcattttg gtcttctgtt 60

ttgcagacta 70

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<212> DNA

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<221> misc_feature

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<223> n is a, c, g, t or u

<400> 75

actctttccc tacacgacgc tcttccgatc tnnnnnnnnn ntcaggtaac gaggtcaatg 60

ccggtca 67

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (33)..(42)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 76

gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctnnnnnnnn nntcaggtaa cgaggtcaat 60

gccggtca 68

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<212> DNA

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<221> misc_feature

<222> (32)..(41)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 77

actctttccc tacacgacgc tcttccgatc tnnnnnnnnn nggactccat tgtcaatccc 60

cagcagcca 69

<210> 78

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (33)..(42)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 78

gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctnnnnnnnn nntcatatat gttgacatct 60

tgagcaaata atctggac 78

Claims

1.一种应用于绝对定量高通量测序的多重PCR扩增的单分子标签引物，其特征在于，所述单分子标签引物包括：5’端修饰基团、核苷酸片段和3’端修饰基团；

所述核苷酸序列与目标序列匹配，用于扩增所述目标序列；

2.根据权利要求1所述的应用于绝对定量高通量测序的多重PCR扩增的单分子标签引物，其特征在于，所述UMI分子标签包括随机碱基；

优选地，所述随机碱基的数量为2～15个，优选为10个；

优选地，所述通用引物接头包括所述目标序列非同源序列的通用引物，优选为测序平台测序引物的部分或全部序列；

优选地，所述通用引物的长度为10～30bp，优选为15～25bp。

3.根据权利要求1或2所述的应用于绝对定量高通量测序的多重PCR扩增的单分子标签引物，其特征在于，所述RNA残基的数量为1～10个；

优选地，所述RNA残基包括A、U、G或C中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，所述DNA保护碱基的数量为不少于1；

优选地，所述DNA保护碱基包括A、T、G或C中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，所述封闭基团包括C3间隔、C5间隔、C6间隔、双脱氧胞苷、氨基或碱基倒置中的任意一种或至少两种的组合。

4.一种权利要求1～3任一项所述的应用于绝对定量高通量测序的多重PCR扩增的单分子标签引物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：

5.一种应用于绝对定量高通量测序的多重PCR扩增的配套试剂，其特征在于，所述配套试剂包括权利要求1～3任一项所述的应用于绝对定量高通量测序的多重PCR扩增的单分子标签引物；

优选地，所述配套试剂还包括扩增反应体系；

优选地，所述扩增反应体系包括酶和缓冲液。

6.根据权利要求5所述的应用于绝对定量高通量测序的多重PCR扩增的配套试剂，其特征在于，所述酶包括单分子标签酶和扩增酶；

优选地，所述单分子标签酶为非温度失活酶，最佳活性温度为25～50℃，优选为30～40℃；

优选地，所述单分子标签酶包括RNaseA、DpnII、RNaseH酶、RNaseH2酶或RNaseH3酶中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，所述扩增酶包括高保真PCR酶；

优选地，所述缓冲液的溶质包括氯化镁、dNTPs、硫酸铵、曲拉通、氯化钠、Tris-HCl、氯化钾或牛血清白蛋白中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，所述缓冲液的溶质包括氯化镁、dNTPs、硫酸铵、曲拉通、氯化钠、Tris-HCl、氯化钾和牛血清白蛋白；

优选地，所述氯化镁在所述缓冲液中的终浓度为0.5～10mM，优选为5mM；

优选地，所述dNTPs在所述缓冲液中的终浓度为50～1000nM，优选为250nM；

优选地，所述硫酸铵在所述缓冲液中的终浓度为1～15mM，优选为10mM；

优选地，所述曲拉通在所述缓冲液中的质量分数为0.01％～0.5％，优选为0.1％；

优选地，所述氯化钠在所述缓冲液中的终浓度为1～50mM，优选为15mM；

优选地，所述Tris-HCl在所述缓冲液中的终浓度为1～50mM，优选为20mM；

优选地，所述氯化钾在所述缓冲液中的终浓度为10～150mM，优选为80mM；

优选地，所述牛血清白蛋白在所述缓冲液中的质量浓度为0.1～1μg/μL，优选为0.8μg/μL。

7.一种绝对定量高通量测序的多重PCR扩增方法，其特征在于，所述多重PCR扩增方法包括：

根据权利要求4所述的制备方法合成应用于绝对定量高通量测序的多重PCR扩增的单分子标签引物，并配置成溶液；

配置缓冲液，加入酶，制成扩增反应体系；

使用单分子标签引物的溶液和扩增反应体系进行PCR扩增；

对扩增结果进行分析。

8.根据权利要求7所述的绝对定量高通量测序的多重PCR扩增方法，其特征在于，所述PCR扩增的程序包括预变性、解除封闭和循环扩增；

优选地，所述解除封闭的程序包括：

30～40℃，1～10min；

59～61℃，50～70s；

优选地，所述分析包括凝胶电泳分析和/或测序分析。

9.根据权利要求7或8所述的绝对定量高通量测序的多重PCR扩增方法，其特征在于，所述多重PCR扩增方法包括：

预变性：93～98℃，1～10min；

解除封闭：30～40℃，1～10min；59～61℃，50～70s；

循环扩增；

(4)对扩增结果进行凝胶电泳分析和/或测序分析。

10.权利要求1～3任一项所述的应用于绝对定量高通量测序的多重PCR扩增的单分子标签引物、权利要求4所述的应用于绝对定量高通量测序的多重PCR扩增的单分子标签引物的制备方法、权利要求5或6所述的应用于绝对定量高通量测序的多重PCR扩增的配套试剂或权利要求7～9任一项所述的应用于绝对定量高通量测序的多重PCR扩增方法中的任意一种或至少两种的组合在制备应用于绝对定量高通量测序产品中的应用。