WO2011147309A1 - 多重基因拷贝数检测试剂盒和方法 - Google Patents

多重基因拷贝数检测试剂盒和方法 Download PDF

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WO2011147309A1
WO2011147309A1 PCT/CN2011/074613 CN2011074613W WO2011147309A1 WO 2011147309 A1 WO2011147309 A1 WO 2011147309A1 CN 2011074613 W CN2011074613 W CN 2011074613W WO 2011147309 A1 WO2011147309 A1 WO 2011147309A1
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gene
internal control
copy number
primers
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PCT/CN2011/074613
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Inventor
姜正文
马瑞晓
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上海天昊生物科技有限公司
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification

Definitions

  • the invention belongs to the field of biotechnology and is applied to biological science research and clinical molecular diagnosis, and specifically relates to a multiplex gene copy number detection kit and method. Background technique
  • the gene copy number refers to the number of target gene fragments contained in a single cell or a single genome. Changes in the number of copies of the gene, such as deletions or duplications, may alter the normal function of the target gene, leading to changes in the relevant disease or related phenotype, so rapid and accurate detection of the gene copy number will contribute to the scientific study of the relevant gene.
  • Specific detection methods can be divided into two categories, one is the screening of gene copy number changes at the genome level, and the other is the copy number determination of the target region.
  • the former includes karyotype analysis, comparative genomic hybridization, and whole-genome SNP chip hybridization techniques. These techniques are mainly used to discover new variant regions, but generally have shortcomings such as low detection resolution, low accuracy, long detection period, and high detection cost.
  • Detection of limited target segments including real-time quantitative PCR (Bieche et al., 1998), multiplexable probe hybridization (MAPH) (Armour et al, 2000), short fluorescent fragment quantitative multiplex PCR (QMPSF) (Charbonnier et al., 2000), Multiplex Linkage-Dependent Probe Amplification (MLPA) (Schouten et al., 2002) and MassArray Absolute Copy Number Detection (Sequenom Inc., San Diego, CA).
  • MASH multiplexable probe hybridization
  • QMPSF short fluorescent fragment quantitative multiplex PCR
  • MLPA Multiplex Linkage-Dependent Probe Amplification
  • MassArray Absolute Copy Number Detection Sequenom Inc., San Diego, CA.
  • Real-time quantitative PCR technology is mainly based on the principle that the amount of amplified products in the PCR exponential phase is exponentially related to the amount of original template. If the amount of product of the PCR index amplification period is fixed, then the log amount of the original template amount (N0) is linearly related to the number of PCR cycles (Ct).
  • N0 the log amount of the original template amount
  • Ct the number of PCR cycles
  • the standard sample is subjected to gradient dilution, and the real-time quantitative PCR reaction of the target gene/reference gene is performed together with the sample to be tested, and a fluorescent signal positively correlated with the amount of the PCR product is collected, and each reaction is analyzed for a fixed fluorescence value in the exponential amplification period.
  • the Ct value using the linear relationship between the logarithmic value of the standard sample gene and the Ct value to obtain the target gene of the sample to be tested and the absolute number of the reference gene, and the absolute number of the target gene in the case where the copy number of the reference gene is known
  • the copy number of the target gene can be estimated by dividing the absolute number of molecules of the reference gene. This technique is widely used due to its simple operation and easy optimization of the reaction system. However, since the target gene and the reference gene react in different systems, the variance of the final result is large, especially It is not suitable for multi-copy number discrimination, and usually only one gene can be detected per reaction, so the detection flux is small.
  • Short fluorescent fragment quantitative multiplex PCR is a multiplex gene copy number detection technique.
  • Multiple target genes and reference gene fragments of different lengths were simultaneously amplified by a multiplex PCR reaction, and then the amount of amplification of each fragment was analyzed by capillary electrophoresis.
  • the amount of amplification of each target gene is first corrected by the amount of reference gene amplification, and then each sample to be tested can be estimated by comparing the difference between the test sample and the control sample of the known individual copy number in these correction values.
  • the copy number of the target gene is simple and rapid, and can realize multiple gene detection, thereby greatly increasing the detection flux and effectively reducing the detection cost.
  • Multiplex amplifiable probe hybridization is also a technique for simultaneous detection of multiple gene copy numbers.
  • the main principle is to use a batch of excess probes containing co-amplified primer sequences but different lengths of corresponding different gene fragments.
  • the sample DNA immobilized on the nylon membrane is hybridized, and after hybridization, the unbound probe is eluted, and then the binding probe is separated, and the binding probe is used as a template for PCR amplification with a universal primer, and the amplification product is capillary.
  • Electrophoresis for fragment separation and fluorescence signal collection, comparison of the reference sample and the amplification profile of the test sample can identify missing or repetitive gene loci.
  • the amplification consistency between different fragments is much higher than that of QMPSF, but the operation time is long, the system complexity is not conducive to high-throughput operation, and the binding efficiency of different probes is due to hybridization conditions.
  • the changes in the changes occur asynchronously or the amplification efficiency of different gene fragments may also change non-synchronously with the microenvironment of the PCR amplification.
  • the PCR platform effect may also attenuate the differences between the gene fragments of different copy numbers, resulting in detection variance. Large, the accuracy is reduced, and it is not conducive to the accurate determination of high copy number.
  • MPA Multiplex-dependent probe amplification
  • This pair of common sequences allows subsequent ligation products to be amplified with universal primers; probe pairs corresponding to multiple target genes Hybridization with the target sequence of the denatured sample DNA; the paired upstream and downstream probe pairs are ligated by the ligase; the ligated product is used as a template for PCR amplification using universal primers; the amplified product is subjected to capillary electrophoresis for fragment separation and fluorescence signal Collect, compare reference samples And the amplified profile of the test sample can identify missing or repetitive genetic loci.
  • Both MLPA and MAI3 ⁇ 4 can achieve the ability to analyze tens of sites simultaneously, and all of them use universal primer amplification.
  • MLPA amplification consistency between different fragments is much higher than that of QMPSF, but MLPA is simpler than MAI3 ⁇ 4 in operation.
  • MLPA technology is currently a relatively stable and widely used commercial technology, it still takes 2 working days to complete the whole process, and the hybridization efficiency of different probes will change asynchronously due to hybridization conditions and sample DNA quality differences. Or the amplification efficiency of different gene fragments may fluctuate depending on the PCR amplification microenvironment.
  • the PCR platform effect may also attenuate the difference between the gene fragments of different copy numbers, resulting in a large detection variance and a decrease in accuracy. Not conducive to the accurate determination of high copy number.
  • the PCR primers are the same, the amplification efficiency of the target gene fragment and the control gene fragment is similar, so the brightness ratio of the two amplification products corresponding to the electrophoresis band can be truly reflected.
  • the ratio of the amount of the control RNA to the target gene mRNA is misappropriated, so that the amount of the target gene mRNA can be well estimated based on the brightness ratio of the electrophoresis band and the amount of the internal control RNA.
  • the technique was improved and used to detect the quantification of target pathogenic microorganisms in samples (Hobson et al., 1997; Li and Drake, 2001).
  • MassArray copy number detection technology uses internal control competitive PCR, single base extension and extension product mass spectrometry to reduce the difference in fragment amplification efficiency and the impact of experimental operations and detection environment/instrument environment, thus reducing detection.
  • the resulting variance improves the accuracy of the test results.
  • the mass spectrum peak of the extension product is generally low. If the background noise and the sample/internal control DNA ratio are not well controlled, the accuracy of the result will be greatly reduced, and the whole process design requires multiple PCRs and purification. Process, experimental operation is cumbersome. Summary of the invention
  • a multiplex gene copy number detection kit comprising:
  • A multiplex PCR primers for the target gene to be tested, one or two of each pair of primers with a detectable label
  • B an internal control DNA fragment for different target genes to be tested, the internal control DNA fragment is highly consistent with the amplification product of the corresponding multiplex PCR primer in (A), and the sequence corresponding to the amplification product is deleted or inserted a few ( a sequence of, for example, 1-50 bases;
  • the above-mentioned fluorescently labeled multiplex PCR primers have different lengths corresponding to the amplification products, so that the amplification products do not overlap in any two product bands in the capillary electrophoresis analysis.
  • any two product bands differ by at least 2 bp.
  • the product bands for any two different genes of interest (or reference genes) differ by at least 5 bp, at least 10 bp, at least 15 bp or at least 20 bp.
  • the invention also provides a multiplex gene copy number detection kit, which mainly comprises:
  • the above-mentioned fluorescently labeled multiplex PCR primers have different lengths corresponding to the amplification products, so that the amplification products do not overlap in any two product bands in the capillary electrophoresis analysis.
  • the number of the deleted or inserted bases is 1-5, preferably two.
  • a multiplex PCR reaction buffer and a thermostable DNA polymerase or both premixed liquids are also included.
  • the number of multiplex genes is 2-20, preferably 3-15, more preferably 4-10.
  • the multiplex PCR primer comprises 2-20 pairs, preferably 3-15 pairs, more preferably 4-10 pairs of primers.
  • the detectable label comprises: a fluorophore, a quantum dot, or a combination thereof.
  • the kit further comprises: a buffer and a polymerase required for performing the PCR reaction.
  • a method for detecting multiple gene copy numbers which mainly comprises the following steps:
  • the DNA fragment is highly identical to the amplification product of the corresponding multiplex PCR primer in (1), and the sequence corresponding to the amplification product is deleted or a few (1-50) bases are inserted;
  • the electrophoresis is a denaturing capillary electrophoresis.
  • the step (5) further comprises the steps of: calculating a fluorescence peak height or area ratio of the sample strip/internal control DNA band of each gene locus, and then dividing the ratio of the target gene by The ratio of the reference gene is multiplied by the copy number of the reference gene to obtain the relative copy number of the target gene.
  • the number of the deleted or inserted bases is 1-5.
  • the number of the deleted or inserted bases is two.
  • a method for detecting a multiple gene copy number comprising the steps of: detecting using the multiplex gene copy number detection kit of the first aspect of the invention.
  • a method for detecting a multiple gene copy number comprising the steps of: (1) in a same PCR system, a sample to be tested is subjected to PCR amplification using a multiplex PCR primer to generate an amplification product.
  • the reaction system includes:
  • an internal control DNA fragment for the target gene and the reference gene to be tested the internal control DNA fragment is highly consistent with the amplification product of the target gene of the corresponding multiplex PCR primer, and the sequence corresponding to the amplification product is deleted or inserted a sequence of a few (1-50) bases; wherein, the number of the internal control DNA fragments is predetermined;
  • Copy number of target gene to be tested ( T ( S / I ) / R ( S / I ) ) XC;
  • T ( S /i) Ts/T i ;
  • Ts is the intensity of a detectable label of the amplified band of the target gene
  • T i is the intensity of the detectable label of the amplified band of the reference DNA within the target gene
  • Rs is the strength of a detectable label of the amplified band of the reference gene
  • T i is the intensity of the detectable label of the amplified band of the reference ⁇ within the reference gene
  • C is the copy number of the reference gene.
  • the number of target genes to be tested is 2-20, preferably 3-15, more preferably 4-10.
  • the method is for detecting a DNA sample comprising DNA samples from tissues, body fluids, urine, blood, and organs.
  • the sample is a human sample.
  • the detection is carried out by capillary electrophoresis in the step (2).
  • the detectable label comprises: a fluorophore, a quantum dot, or a combination thereof.
  • the fluorescent PCR reaction is carried out in the step (1).
  • the intensity of the detectable label is a peak height or a peak area.
  • kits of the first aspect of the invention for the preparation of a kit for detecting a disease abnormality in gene copy number or chromosome copy number.
  • the disease is selected from Table 1. It should be understood that within the scope of the present invention, the above various technical features of the present invention and the following (as in the embodiment) The various technical features specifically described in the description can be combined with one another to form a new or preferred technical solution. Due to space limitations, we will not repeat them here. DRAWINGS
  • FIG. 1 is a schematic diagram of the principle of the detection method of the present invention.
  • Figure 2 is a schematic view showing the results of the detection of the sample 1 in the first embodiment of the present invention
  • Fig. 3 is a view showing the results of the detection of the sample 2 in the embodiment 1 of the present invention. detailed description
  • the invention is based on earnestly summarizing the advantages and disadvantages of various multi-detection methods in the prior art, and after extensive and in-depth research, through the independent innovation and development, it combines the simple and rapid QMPSF-step PCR-step detection. As well as the high precision of multi-competitive PCR in MassArray absolute copy number detection technology, it is a simple, fast, high-throughput, high-precision advanced gene copy number detection technology, which will be widely used in the field of disease-causing gene research. Application prospects.
  • the invention also provides a multiplex gene copy number detection method, which is based on the principle of competitive PCR combined with multiplex PCR amplification and capillary electrophoresis length difference fragmentation technology to simultaneously quantify reference genes and multiple target genes, and utilize The reference gene corrects the detection result to obtain the correct copy number of the plurality of target genes,
  • the method further comprises the steps of: calculating a fluorescence peak height or an area ratio of the sample strip/internal control DNA strip of each gene locus, and then dividing the ratio of the target gene by the reference gene The ratio is then multiplied by the copy number of the reference gene to obtain the relative copy number of the target gene.
  • a preferred method for detecting multiple gene copies in a preferred embodiment of the present invention mainly comprises the following steps:
  • the amplified products are separated by different lengths by denaturing capillary electrophoresis, and the position information of each strip and the fluorescence intensity are collected; this step is usually performed on a sequencer such as ABI3130 and ABI3730 of Applied Bio Inc.;
  • the figure can clarify the amount of amplification product of each sample DNA and control ⁇ at each gene locus. Since the sample DNA and the control ⁇ are identical in amplification primers at each gene locus and there are only minor differences in the sequence, the amplification ratio of the sample to the internal control ⁇ can be estimated as the number of molecules in the sample ⁇ and the internal control ⁇ before the reaction. ratio.
  • the peak height or area ratio (S/I) of the sample peak (S peak) and the internal control peak (I peak) of each gene locus was calculated.
  • the S/I ratio of each target gene locus is divided by the S/I ratio of the reference gene and then multiplied by the copy number of the reference gene to obtain the relative copy number of the target gene (the reference gene copy number in the figure is 2).
  • the result in 7) can be further corrected by the detection result of the corresponding sample of the reference sample to obtain the exact copy number of the target gene.
  • the detection kits and detection methods of the present invention can be used to detect any disease that is abnormal in gene copy number or chromosome copy number.
  • Representative diseases include, but are not limited to, those selected from Table 1.
  • the genes or chromosome segments associated with these diseases are also listed in Table 1.
  • Table 1 Diseases associated with the number of copies and related genes or chromosome segments are also listed in Table 1.
  • Glutaric acidosis type I GCDH, ETFA, ETFB, ETFDH
  • RETT syndrome MECP2 CDKL5, F0XG1 hereditary nonpolyposis colorectal cancer MSH2, MLHU MSH6, PMS2 methylmalonic aciduria MUT neurofibromatosis NFU NF2
  • PCCA Propionic acidosis
  • PCCB polycystic kidney PKD1, PKD2 pyruvate kinase deficiency PKLR
  • Tuberous sclerosis TSC1, TSC2 Congenital hypothyroidism TSHR, PAX8, TSHB, NKX2-5 familial non-hemolytic jaundice syndrome UGT1A1
  • the multiplex gene copy number detection kit and detection method of the present invention mainly have the following advantages:
  • Rapid detection After obtaining the internal control DNA, the multiplex PCR is performed by mixing the sample DNA with the internal control DNA, and then the PCR product is directly applied to a capillary fluorescence electrophoresis apparatus (such as an ABI sequencer), and the whole experimental process is only A one-step PCR cycle and one-step capillary electrophoresis are required, which takes less than 4 hours;
  • a capillary fluorescence electrophoresis apparatus such as an ABI sequencer
  • the copy number detection of chromosome 21, X chromosome and Y chromosome was performed on two 21 trisomy patients using the multiplex gene copy number detection method of the present invention.
  • the reference gene is ribonuclease P subunit.
  • the three target genes are the calcineurin 1 regulator (RCAN1), the sex-determining region (SRY) on the Y chromosome, and the high diversity homeobox (HDX) on the X chromosome.
  • RCAN1 the calcineurin 1 regulator
  • SRY the sex-determining region
  • HDX high diversity homeobox
  • P0P1R GAGTCAGTTCAAATGCCTGCTCTT (SEQ ID NO: 10)
  • HDXF GTAAAAATTGCTTTCAGCTCATATTACAGTG (SEQ ID NO: 11)
  • HDXR [FAM] CAAGGGTTTCTGTGTGTTCAAGGTATTT (SEQ ID NO: 12)
  • RCAN1F [FAM] GCACTGGAAAATCCAGGCAGTT (SEQ ID NO: 15)
  • RCAN1R GGTGACAGCAGATTGAGCTGAGA (SEQ ID NO: 16)
  • Test samples Sample A is a male with a clinical karyotype of 21 trisomy, and sample B is a female with a clinical karyotype of 21 trisomy.
  • the PCR primer mixture was configured to contain 4 pairs of PCR primers P0P1F/R, legs F/R, RCAN1F/R and SRYF/R, each with a concentration of 2 ⁇ .
  • the internal control DNA was quantified by Biophotomerter 77i ⁇ (Eppendor) and averaged. Then, four internal control DNA mixtures were prepared at a final concentration of lng/ ⁇ ⁇ , and then the mixture was further diluted by 200. 000 times (labeled iDNA).
  • FIG. 1 CteY target gene 0 72 0.00 0.00 Target gene 2029 2' ⁇ -4. ⁇ '' 0.99 2,96
  • Figure 2 and Figure 3 are peak-shaped plots of sample ⁇ and sample , respectively, where I represents the internal control DNA, and S represents Sample DNA, Chr represents the chromosome, and the yellow peak is the internal standard.
  • Sample A contains 1 copy of ChrX and ChrY and 3 copies of Chr21, which are 21 trisomy, consistent with clinical findings.
  • Sample B contains 2 copies of ChrX, excluding ChrY and 3 copies of Chr21, which are 21 trisomy,

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Description

多重基因拷贝数检测试剂盒和方法
技术领域
本发明属于生物技术领域， 应用于生物科学研究和临床分子诊断， 具体地涉 及一种多重基因拷贝数检测试剂盒和方法。 背景技术
基因拷贝数是指单个细胞或单个基因组内所含目标基因片段的数目。 基因拷 贝数的变化如缺失或重复可能会改变目标基因的正常功能从而导致相关疾病发生 或相关表型的变化， 因此基因拷贝数的快速而准确的检测将有助于相关基因的科 学研究。
具体检测方法可以分为两大类， 一类是全基因组水平上的基因拷贝数变化区 域筛选， 另一类是对目标区域进行拷贝数测定。 前者包括细胞核型分析、 比较基 因组杂交以及全基因组 SNP芯片杂交技术等，这些技术主要用于发现新变异区域， 但普遍存在检测分辨率、 准确性偏低、 检测周期长以及检测成本高等缺点， 而后 者主要针对有限目标区段的检测， 包括实时定量 PCR技术（Bieche et al. , 1998)、 多重可扩增探针杂交（MAPH) (Armour et al， 2000)、 短荧光片断定量多重 PCR (QMPSF) (Charbonnier et al.， 2000) 、 多 重 连 接 依 赖 探 针 扩 增 (MLPA) (Schouten et al.， 2002)以及 MassArray绝对拷贝数检测技术（Sequenom Inc.， San Diego, CA)。
实时定量 PCR技术主要是基于在 PCR指数扩增期， 其扩增产物的量与原始模 板量成指数关系的原理发展而来的。 如果固定 PCR指数扩增期产物的量， 那么原 始模板量 (N0)对数值与 PCR循环数 (Ct)成线性关系。 利用该技术进行目标基因拷 贝数检测时，需要选取至少一个在所有待检样品中拷贝数保持稳定的参照基因（通 常每个基因组仅含一个拷贝）以及目标基因 /参照基因分子数量已知的标准样品。 对标准样品进行梯度稀释后与待检样品一起进行目标基因 /参照基因的实时定量 PCR反应， 收集与 PCR产物量成正相关的荧光信号， 分析每个反应在指数扩增期 某一固定荧光值对应的 Ct值， 利用标准样品基因分子数对数值与 Ct值的线性关 系曲线获取待检样品的目标基因以及参照基因的绝对分子数， 在参照基因拷贝数 已知情况下， 将目标基因绝对分子数除以参照基因的绝对分子数即可估计出目标 基因的拷贝数。 这种技术由于其操作简单以及反应体系易优化而获得广泛应用， 但由于目标基因与参照基因在不同体系中进行反应， 最后结果的方差较大， 尤其 不适合多拷贝数的区分， 而且通常情况下每个反应只能检测一个基因， 因此检测 通量较小。
短荧光片断定量多重 PCR (QMPSF)是一个多重基因拷贝数检测技术。 通过一个 多重荧光 PCR反应同时扩增不同长度的多个目标基因和参照基因片断， 然后利用 毛细管电泳分析各个片断的扩增量。 每个目标基因的扩增量先用参照基因扩增量 进行校正， 然后通过比较待检样品与已知各个基因拷贝数的对照样品在这些校正 值上的差异即可估计出待检样品每个目标基因的拷贝数。 该方法操作简单快速而 且能够实现多重基因检测从而大大提高检测通量并有效降低检测成本， 但是由于 不同基因片断扩增采用的是不同扩增引物而且不同 PCR片断的碱基组成和分子结 构不尽相同， 因此不同基因片断的扩增效率会随着模板量、 模板质量以及 PCR扩 增微环境的不同发生非同步变化， 而且 PCR平台效应可能会减弱不同拷贝数的基 因片断间差异， 这样最后的检测值的准确性会大大下降， 同样该方法由于方差偏 大不利于高拷贝数的准确确定。
多重可扩增探针杂交 (MAPH)也是一种能同时实现多基因拷贝数检测的技术， 其主要原理是将一批含共同扩增引物序列但长度不同的对应不同基因片段的过量 探针与固定在尼龙膜上的样本 DNA进行杂交， 杂交后将未结合上的探针洗脱， 然 后分离出结合探针， 以这些结合探针为模板用通用引物进行 PCR扩增， 扩增产物 用毛细管电泳进行片段分离和荧光信号收集， 比较参照样本以及检测样本的扩增 谱形可以确定缺失或重复的基因位点。 这种方法由于采用了通用引物， 不同片段 间的扩增一致性较 QMPSF大为提高， 但该操作过程时间长， 体系复杂不利于高通 量运行， 而且不同探针的结合效率会因为杂交条件的改变发生非同步改变或者不 同基因片断的扩增效率也会随 PCR扩增微环境的不同发生非同步变化， PCR平台 效应也可能会减弱不同拷贝数的基因片断间差异， 从而导致检测方差偏大， 准确 度下降， 而且也不利于高拷贝数的准确确定。
多重连接依赖探针扩增 (MLPA)是目前使用较为广泛的一种多重基因拷贝数 检测技术， 是 MRC-Hol land公司产品的主要技术基础。 该技术的操作过程如下： 针对每个位点设计两个探针， 一个是上游探针， 另一个是下游探针（其 5 ' 端须磷 酸化）， 这对探针可杂交到目标序列紧邻位置上， 所有位点的上游探针 5 ' 端和下 游探针 3 ' 端分别含一段共同序列， 这对共同序列使得随后连接产物可以用通用 引物扩增；对应多个目标基因的探针对与变性后的样本 DNA的目标序列进行杂交； 紧邻配对的上下游探针对被连接酶连接； 连接产物被作为模板用通用引物进行 PCR扩增； 扩增产物用毛细管电泳进行片段分离和荧光信号收集， 比较参照样本 以及检测样本的扩增谱形可以确定缺失或重复的基因位点。 MLPA与 MAI¾都能实 现同时分析几十位点的能力， 而且都采用了通用引物扩增， 不同片段间的扩增一 致性较 QMPSF大为提高， 但操作上 MLPA较 MAI¾简单。虽然 MLPA技术是目前较为 稳定而且被广泛使用的商业化技术， 但其整个过程完成仍然需要 2个工作日， 而 且不同探针的杂交连接效率会因为杂交连接条件以及样本 DNA质量差异发生非同 步改变或者不同基因片断的扩增效率也会随 PCR扩增微环境的不同发生波动， PCR 平台效应也可能会减弱不同拷贝数的基因片断间差异， 从而导致检测方差偏大， 准确度下降， 而且也不利于高拷贝数的准确确定。
竞争性 PCR最早是由 Wang等人于 1989发明用于目标基因表达量的确定， 其 基本原理是人工合成一段 RNA序列， 其两侧序列分别与目标基因序列相同， 但中 间序列与目标基因存在长度上的差异， 然后将梯度稀释的该 RNA序列作为内对照 分别与等量样本 mRNA混合用共同引物反转录后用共同引物同时扩增目标基因 mRNA和内对照 RNA反转录产物； 两种扩增产物由于在长度上存在差异所以可以用 琼脂糖电泳分开， 由于 PCR引物相同， 目标基因片段以及对照基因片段的扩增效 率类似， 因此两种扩增产物对应电泳条带的亮度比可以真实反映惨入内对照 RNA 与目标基因 mRNA的量比，这样根据电泳条带的亮度比以及内对照 RNA的惨入量可 以很好的估计目标基因 mRNA的量。 随后， 该技术经改进后被广泛应用于检测样本 中目标病原微生物的定量（Hobson et al. , 1997 ; Li and Drake, 2001)。
MassArray拷贝数检测技术由于采用了内对照竞争性 PCR、单碱基延伸以及延 伸产物质谱分离技术，降低了片段扩增效率差异以及实验操作和检测环境 /仪器等 外界环境的影响， 从而降低了检测结果方差， 提高了检测结果的准确性， 。 但该 技术由于采用质谱平台， 延伸产物质谱峰普遍比较低， 如果不能很好控制背景噪 音以及样本 /内对照 DNA量比， 结果的准确性会大大下降， 而且整个过程设计需要 多次 PCR以及纯化过程， 实验操作比较繁琐。 发明内容
本发明的目的之一在于克服现有技术的缺陷，提供一种多重基因拷贝数检测试 剂盒， 该试剂盒可以对多个目标基因同时进行拷贝数检测。 在本发明的第一方面， 提供了一种多重基因拷贝数检测试剂盒， 包括：
(A)针对待测的目标基因的多重 PCR引物，每对引物中的一条或二条带有可检 测标记物； (B)针对不同待测的目标基因的内对照 DNA片段， 该内对照 DNA片段与（A)中 对应的多重 PCR引物的扩增产物高度一致， 为对应扩增产物的序列缺失或插入少 数（如 1-50个）碱基的序列；
(C)针对参照基因的至少一对 PCR引物，每对引物中的一条或二条带有可检测 标记物；
(D)参照基因的内对照匪片段， 该内对照匪片段与（C)中对应的参照基因 (或其扩增产物）高度一致，为参照基因的序列缺失或插入少数（如 1-50个）碱基的 序列；
上述同种荧光标记的多重 PCR引物对应扩增产物的长度有差异， 以至于扩增 产物在毛细管电泳分析中任意两个产物条带不重叠。
在另一优选例中， 任意两个产物条带相差至少 2bp。 此外， 针对任意两个不 同目的基因（或参考基因）的产物条带相差至少 5bp、至少 10bp、至少 15bp或至少 20bp。
本发明还提供了一种多重基因拷贝数检测试剂盒， 主要包括有：
(A)针对待测的目标基因设计的多重 PCR引物，每对引物中的一条或二条具有 荧光标记；
(B)定量的针对不同待测的目标基因的内对照匪片段，该内对照 DNA片段与 (A)中对应的多重 PCR引物的扩增产物高度一致，为对应扩增产物的序列缺失或插 入少数（1-50个）碱基的序列；
(C)至少一对参照基因的多重 PCR引物，每对引物中的一条或二条具有荧光标 记；
(D)定量的参照基因的内对照匪片段， 该内对照匪片段与（C)中对应的参 照基因高度一致， 为参照基因的序列缺失或插入少数（1-50个）碱基的序列；
上述同种荧光标记的多重 PCR引物对应扩增产物的长度有差异， 以至于扩增 产物在毛细管电泳分析中任意两个产物条带不重叠。
在另一优选例中， 所述缺失或插入的碱基的个数为 1-5， 较佳地 2个。
在另一优选例中，还包含有多重 PCR反应缓冲液及热稳定 DNA聚合酶或两者 预混和液。
在另一优选例中， 多重基因的数量为 2-20个， 较佳地 3- 15个， 更佳地 4-10 个。
在另一优选例中， 多重 PCR引物包括 2-20对， 较佳地 3- 15对， 更佳地 4_10 对引物。 在另一优选例中， 所述的可检测标记物包括： 荧光团、 量子点或其组合。 在另一优选例中， 所述的试剂盒还包括： 进行 PCR反应所需的缓冲液和聚合 酶。
在本发明的第二方面， 提供了一种多重基因拷贝数检测方法， 主要包括以下 步骤:
( 1)针对待测的目标基因， 设计对应的多重 PCR引物， 每对引物中的一条或二 条具有荧光标记； 设计至少一对参照基因的多重 PCR引物； 每对引物中的一条或 二条具有荧光标记； 上述同种荧光标记的多重 PCR引物对应扩增产物的长度有差 ≠r ;
(2)设计针对不同待测的目标基因和参照基因的内对照 DNA片段， 所述内对照
DNA片段与（1)中对应的多重 PCR引物的扩增产物高度一致， 为对应扩增产物的序 列缺失或插入少数（1-50个）碱基的序列；
(3)对所有内对照 DNA片段严格定量；
(4)将每种内对照 DNA片段等量混合， 与所述多重 PCR引物对待测样品进行多 重荧光 PCR扩增；
(5)扩增产物通过毛细管电泳将不同长度的片段分开， 得到每个条带的位置信 息以及荧光强度。
在另一优选例中， 所述的电泳是变性毛细管电泳。
在另一优选例中， 步骤（5)之后还包括以下步骤： 计算每个基因位点的样本条 带 /内对照 DNA条带的荧光峰高或面积比，然后将目标基因的该比值除以参照基因 的该比值再乘以参照基因的拷贝数即得目标基因的相对拷贝数。
在另一优选例中， 所述缺失或插入的碱基的个数为 1-5。
在另一优选例中， 所述缺失或插入的碱基的个数为 2。
在本发明的第三方面， 提供了一种多重基因拷贝数检测方法， 包括步骤： 用 本发明第一方面所述的多重基因拷贝数检测试剂盒的进行检测。
在本发明的第四方面，提供了一种多重基因拷贝数检测方法，包括以下步骤： ( 1) 在同一 PCR体系中， 对待测样品， 用多重 PCR引物进行 PCR扩增， 从而 产生扩增产物， 其中所述反应体系中包括：
( i)针对待测的目标基因的多重 PCR引物，每对引物中的一条或二条带有可检 测标记物；
( i i)针对参照基因的至少一对 PCR引物； 每对引物中的一条或二条带有可检 测标记； 其中， （i )和（i i )中所述的各 PCR引物扩增出的对应的扩增产物的长度有差
Q
升；
( i i i )针对待测的目标基因和参照基因的内对照 DNA片段， 所述内对照 DNA 片段与对应的多重 PCR引物的目标基因的扩增产物高度一致， 为对应扩增产物的 序列缺失或插入少数（1-50个）碱基的序列； 其中， 所述内对照 DNA片段的数量是 预定的；
(2) 检测各扩增产物， 得到每个扩增产物条带的位置信息以及可检测标记物 的强度； 和
(3) 按下式确定待测的目标基因的拷贝数：
待测的目标基因的拷贝数 = ( T (S/I) /R (S/I) ) X C；
T (S/i) = Ts/T i ；
Figure imgf000008_0001
各式中，
Ts为该目标基因的扩增条带的可检测标记物的强度；
T i为该目标基因内参照 DNA的扩增条带的可检测标记物的强度；
Rs为参照基因的扩增条带的可检测标记物的强度；
T i为参照基因内参照匪的扩增条带的可检测标记物的强度；
C为参照基因的拷贝数。
在另一优选例中， 待测的目标基因的数量为 2-20个， 较佳地 3- 15个， 更佳 地 4- 10个。
在另一优选例中， 所述的方法用于检测 DNA样品， 所述样品包括来自组织、 体液、 尿液、 血液、 和器官的 DNA样品。
在另一优选例中， 所述的样品是人样品。
在另一优选例中， 步骤（2)中通过毛细管电泳进行检测。
在另一优选例中， 所述的可检测标记物包括： 荧光团、 量子点或其组合。 在另一优选例中， 步骤（1 )中为荧光 PCR反应。
在另一优选例中， 所述的可检测标记物的强度为峰高或峰面积。
在本发明的第五方面， 提供了本发明第一方面所述的试剂盒的用途， 它被用 于制备检测与基因拷贝数或染色体拷贝数异常的疾病的试剂盒。
在另一优选例中， 所述的疾病选自表 1。 应理解， 在本发明范围内中， 本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例） 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。 限于篇幅， 在此不再一一累述。 附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图 1是本发明所述检测方法的原理示意图；
图 2是本发明实施例 1中样品 1检测结果示意图；
图 3是本发明实施例 1中样品 2检测结果示意图。 具体实施方式
本发明是在认真总结现有技术中各种多重检测方法的优缺点的基础上再经过 广泛而深入的研究， 通过自主创新后开发成功的， 它综合了 QMPSF—步 PCR—步 检测的简单快速以及 MassArray绝对拷贝数检测技术中多重竞争性 PCR的高精度， 是一种简单快速、 高通量、 高精确的先进基因拷贝数检测技术， 在对疾病致病基 因研究等领域将会有广泛的应用前景。 本发明还提供一种多重基因拷贝数检测方法， 该方法是基于竞争性 PCR原理 并结合多重荧光 PCR扩增以及毛细管电泳长度差异片段分离技术对参照基因和多 个目标基因同时进行定量， 并利用参照基因对检测结果进行校正后获取多个目标 基因的正确拷贝数，
优选的， 步骤（5)之后还包括以下步骤： 计算每个基因位点的样本条带 /内对 照 DNA条带的荧光峰高或面积比， 然后将目标基因的该比值除以参照基因的该比 值再乘以参照基因的拷贝数即得目标基因的相对拷贝数。
如果存在目标基因拷贝数已知的参照样本， 可以将待测样本目标基因的相对 拷贝数除以参照样本对应目标基因的相对拷贝数再乘以参照样本该目标基因拷贝 数即得待测样本该目标基因的精确拷贝数。 本发明一个优选例中多重基因拷贝数检测方法， 参见图 1， 主要包括以下步 骤：
1 ) 针对多个目标基因以及参照基因进行多重 PCR 引物设计， 每对引物中 一条将标上荧光引物， 同种荧光引物对应扩增产物长度必须有差别；
2 ) 针对每个基因的扩增片段， 合成或克隆获得与对应引物扩增产物序列 对比缺失或插入 1-50个碱基的 DNA片段作为内对照 DNA， 并进行精确定量； 在图 1中， 内对照 DNA相对于样本 DNA片段缺 2个碱基；
3 ) 将适量样本匪与适量内对照 DNA混匀， 混入的每种内对照 DNA的分 子数量相等并估计与样本 DNA中参照基因的分子数量一致；
4 ) 对样本 /内对照 DNA混合物进行多重荧光 PCR扩增；
5 ) 扩增产物通过变性毛细管电泳将不同长度的片段分开， 收集每个条带 的位置信息以及荧光强度； 这一步通常在测序仪上完成如美国应用生物公司的测 序仪 ABI3130以及 ABI3730等；
6 ) 由于不同基因的扩增产物在长度以及荧光标记上不同， 而且同一基因 位点上样本匪以及内对照 DNA扩增产物长度也不同（附图中为 2bp差异）， 因此 根据毛细管电泳峰形图可以明确每个基因位点上样本 DNA以及对照匪各自扩增 产物量。 由于样本 DNA以及对照匪在每个基因位点上扩增引物一致而且序列上 仅有微量差异， 因此样本与内对照匪的扩增量比可以估计为反应前样本匪与 内对照匪的分子数量比。 计算每个基因位点的样本匪峰（S峰）与内对照匪 峰（I峰）的峰高或面积比（S/I)。
7 ) 将每个目标基因位点的 S/I 比值分别除以参照基因的 S/I 比值然后乘 以参照基因的拷贝数即可获得目标基因的相对拷贝数（附图中参照基因拷贝数为 2)。
8 ) 如果存在目标基因拷贝数已知的参照样本， 7)中的结果可以用参照样 本对应基因的检测结果进行进一步的校正， 获取目标基因的精确拷贝数。
本发明的检测试剂盒和检测方法可用于检测任何与基因拷贝数或染色体拷贝 数异常的疾病。 代表性的疾病包括（但并不限于）选自表 1的疾病。 与这些疾病相 关的基因或染色体区段也列于表 1。 表 1 与拷贝数量相关的疾病及相关的基因或染色体区段
Figure imgf000010_0001
ALZHEIMER病 APP、 PSENU PSEN2 , 精氨基琥珀酸血症 ASL
瓜氨酸血症 ASS
肝豆状核变性疾病 ATP7B
精子生成障碍 AZFc
遗传性乳癌与卵巢癌 BRCAU BRCA2、 RAD51C 生物素酰氨酶缺乏症 BTD
低钾性家族性周期性麻痹 CACNL1A3 , SCN4A
同型半胱氨酸尿 CBS
囊性纤维化 CFTR
急性白血病 C-MYC
婴儿骨皮质增生症 C0L1AU
成骨不全症 C0L1AU C0L1A2 , CRTAP、 LEPRE 1 家族性遗传性肾炎综合征 C0L4A5 , C0L4A3 , C0L4A4 高胱氨酸尿症 CTH
先天性肾上腺皮质增生症 CYP21A2 , CYP1 1A1 面-肩 -肱型肌营养不良症 D4Z4 repeat
BECKER型肌营养不良 DMD
Duchenne型肌营养不良 DMD
二氢嘧啶脱氢酶缺乏症 DPYD
月巿癌 EGFR 遗传性出血性毛细血管扩张综合征 ENG. ACVRL U SMAD4
血友病 A F8
血友病 B F9
酪氨酸血症 I型 FAH、 TAT、 HPD
Marfan综合征 FBN1
软骨发育低下 FGFR3
寻常型鱼鳞病 FLG
脆性 X综合征 FMR1
先天性眼球震颤 FRMD7 , GPR143 葡萄糖 -6-磷酸脫氫酶缺乏症 G6PD 典型半乳糖血症 GALT
戊二酸血症 I型 GCDH、 ETFA、 ETFB、 ETFDH
FABRY病 GLA 三功能蛋白缺乏症 HADHA、 HADHB α -地中海贫血 HBA1、 HBA2 β -地中海贫血 HBB 镰状细胞血症 HBB 乳腺 /胃癌 HER2
Tay-Sachs 病 HEXA -3-甲基戊二酰基辅酶 A裂解酶缺乏症 HMGCL
异戊酸血症 IVD 先天性 QT间期延长综合征 KCNQU KCNH2 、 SCN5A
RETT综合征 MECP2、 CDKL5 , F0XG1 遗传性非息肉病大肠癌 MSH2、 MLHU MSH6、 PMS2 甲基丙二酸尿症 MUT 神经纤维瘤病 NFU NF2、
肾消耗病 1 NPHP1
苯丙酮尿症 PAH-甲基巴豆酰 -辅酶 A羧化酶缺乏症 I 3MCC1
-甲基巴豆酰 -辅酶 A羧化酶缺乏症 I I 3MCC2
丙酸血症 PCCA、 PCCB 多囊肾 PKD1、 PKD2 丙酮酸激酶缺乏症 PKLR
N00NAN综合征 PTPN1 U S0S1 视网膜母细胞瘤 RBI 周期性高血钾性麻痹 SCN4A
肉毒碱摄取缺陷 SLC22A5
PENDRED综合征 SLC26A4 肌张力减退-胱氨酸尿综合征 SLC3AU PREPL
脊髓性肌萎缩症 SMN1 髓母细胞瘤 S翻、 BRCA2 子宫颈癌 TERC
结节性硬化症 TSC1、 TSC2 先天性甲状腺功能减退症 TSHR、 PAX8、 TSHB、 NKX2-5 家族性非溶血性黄疸综合征 UGT1A1
血管性血友病 VWF
17q21. 31缺失综合征 17q21. 31染色体区
Angelman综合征 15ql l. 2-ql3染色体区、 UBE3A
Prader-Wi l l i 综合征 15ql l-13染色体区
16pl l. 2缺失症候群 16pl l. 2染色体区
16pl3. 1缺失综合征 16pl3. 1染色体区
Smith- Magenis综合征 17pl l. 2染色体区
Mi ller-Dieker综合征 17pl3. 3染色体区
1ρ36缺失综合征 1ρ36染色体区 lq21. 1缺失 /重复综合征 lq21. 1染色体区
22ql l微缺失综合征 22ql l染色体区
Wolf-Hirschhorn综合征 4pl6. 3染色体区
Wi ll iams综合征 7ql l. 23染色体区
猫叫综合征 5p染色体区
Patau综合征 13号染色体
Edwards综合征 18号染色体
Down综合征 21号染色体
Kl inefelter综合征 X/Y性染色体
Turner综合征 X/Y性染色体
XXX综合征 X性染色体
XYY综合征 X/Y性染色体 本发明所述的多重基因拷贝数检测试剂盒和检测方法， 主要具有以下优点：
1、 快速检测： 在获得内对照 DNA后， 只要将样本 DNA与内对照 DNA混匀后进 行多重 PCR， 然后将 PCR产物直接上毛细管荧光电泳仪（如 ABI测序仪）即可， 整 个实验过程仅需要一步 PCR循环和一步毛细管电泳， 耗时不到 4个小时；
2、 多个基因位点同时检测： 由于采用了多重 PCR体系， 一个反应通常可以同 时扩增 12个位点以上， 也就意味着如果选用 2个参照基因， 那么一个反应可以同 时检测 10个以上目标基因位点；
3、高精确性： 由于目标基因片段与其内对照 DNA之间仅有少数几个碱基差别， 这两个模板的扩增效率将体现高度一致性， 因此最后的扩增产物真实的反应了扩 增前两个模板浓度比例， 根据本发明的预试验结果， 一个竞争性 PCR反应重复 3 次的标准方差在 5%之内， 而且如果将目标基因片段与内对照 DNA按不同稀释梯度 混合进行竞争性 PCR， 我们发现样本峰与内对照峰面积之比与两个模板的原始浓 度比的相关性达到 99. 9%以上。 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明 本发明而不用于限制本发明的范围。 下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件，例如 Sambrook等人， 分子克隆：实验室手册（New York： Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件， 或按照制造厂商所建议 的条件。 除非另外说明， 否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。 实施例 1
利用本发明所述多重基因拷贝数检测方法对两个 21三体患者进行 21号染色 体、 X染色体以及 Y染色体的拷贝数检测。
一： 构建多重基因拷贝数检测试剂盒：
目标基因序列及内对照 DNA序列信息：
选取了 3个目标基因和 1个参照基因做检测， 参照基因为核糖核酸酶 P亚基
(P0P1) , 3个目标基因为唐氏综合症关键区钙调磷酸 1调控子（RCAN1)、 Y染色体 上性别决定区（SRY)以及 X染色体上高多样同源框（HDX)。 这些基因对应扩增序列 的原序列与内对照 DNA序列信息见下面描述（下划线字体处为人参照序列与内对 照序列差别处）。 内对照 DNA由上海生工进行克隆合成。
P0P1基因
人参照序列， 253bp (SEQ ID NO: 1)
tgaaatgatgatctcatggttgaaatatgtttttcttttattgttttcttttcccttaaatgttct ctgtctttaattttactaTGACtggggaccttccagggccagacattgtgtaagatgctgggatagatga cttagatgtggtcaaagaagtacagggcactcaggaaacctctagaaggggtactgagctcagatgagaa aaatgaggccagcctcctgatggaagagcaggcatttgaactgactc
内对照 DNA序列， 251bp (SEQ ID NO: 2)
tgaaatgatgatctcatggttgaaatatgtttttcttttattgttttcttttcccttaaatgttct 一 —
Figure imgf000015_0001
@¾ TNV3H
TO
Figure imgf000015_0002
(s :ON ai Qas)dqose 'Ρϋ^参 Y
Figure imgf000015_0003
(e :ON ai Gas) ^LZ 6U Y
@¾XGH
CT9^0/TT01M3/I3d 60^ /ΐΐΟΖ OAV gcactggaaaatccaggcagttttaggccattttcacttttcaccctagtgtgagggtgaggcatg cggtttctcagatttaaattctgaataaaatttccccttaaatgatcttatctccaatatggtatagagt ttaatttatttgggaaggttcagaatgttgtacatttttgaaagctacatgttacatatgtgcgaagttt attttcagttttccactatttctctaattttagggtttcTGACtctaaaatcagatgtttttcacatcca gage tgctttaaatcc tec tcaccactccaccccctaacaact get tggttcccctctcagctcaatctg ctgtcacc
内对照 DNA序列， 352bp (SEQ ID NO : 8)
gcactggaaaatccaggcagttttaggccattttcacttttcaccctagtgtgagggtgaggcatgcggt ttctcagatttaaattctgaataaaatttccccttaaatgatcttatctccaatatggtatagagtttaa tttatttgggaaggttcagaatgttgtacatttttgaaagctacatgttacatatgtgcgaagtttattt tcagttttccactatttctctaattttagggtttcTCtctaaaatcagatgtttttcacatccagagctg
； gcttggttcccctctcagctcaatctgctgtca cc 引物序列： 其中， [FAM]表示为荧光标记。
POP IF: [FAM] TGAAATGATGATCTCATGGTTGAAA (SEQ ID NO: 9)
P0P1R: GAGTCAGTTCAAATGCCTGCTCTT (SEQ ID NO: 10)
HDXF: GTAAAAATTGCTTTCAGCTCATATTACAGTG (SEQ ID NO: 11)
HDXR: [FAM] CAAGGGTTTCTGTGTGTTCAAGGTATTT (SEQ ID NO: 12)
SRYF GCAAGTAGTCAACGTTACTGAATTACCA (SEQ ID NO: 13)
SRYR: [FAM] TTTCAGTGCAAAGGAAGGAAGAGC (SEQ ID NO: 14)
RCAN1F : [FAM] GCACTGGAAAATCCAGGCAGTT (SEQ ID NO: 15)
RCAN1R : GGTGACAGCAGATTGAGCTGAGA (SEQ ID NO: 16)
二： 检测样本： 样本 A为临床核型分析为 21三体的男性， 样本 B为临床核型 分析为 21三体的女性。
三： 检测方法
主要包括以下步骤：
( 1 ) 将临床上已经证明是 21 三体综合症的 2 个分别为男性和女性样本的 匪用 B i
Figure imgf000016_0001
(Eppendor)进行精确定量，然后稀释至 lOng/ μ 1作为 待测 DNA样本待用。
( 2 ) 配置 PCR引物混合液，分别含 4对 PCR引物 P0P1F/R、腿 F/R、RCAN1F/R 和 SRYF/R, 每条引物浓度各 2 μ Μ。 (3) 内对照 DNA用 Biophotomerter77i^(Eppendor)进行多次定量后取平均 值， 然后配置 4个内对照 DNA混合液， 终浓度均为 lng/μ ΐ, 然后将此混合液再 梯度稀释 200， 000倍（标为 iDNA)。 (4) 多重 PCR体系（20μ 1)配置：
lOxBuff er (Qiagen) 2μ 1
PCR引物混合液 2μ 1
MgCl2(25mM) 0.8μ 1
dNTP(lOmM) 0.4μ 1
样本 DNA 1 μ 1
iDNA 1 μ 1
HotstarTaq (5U/ μ 1， Qiagen) 0.2 μ 1
dd¾0 12.6μ 1 PCR程序：
95 °C 15min
94 °C 20s
64°C- -0.5°C/循环 40s χ 11循环
72 °C 2min
94 °C 20s Ί
58 °C 30s 丁 x 25 循环
72 °C 2min
60 °C 60min
4°C oo
(5) 取 1μ IPCR产物用 dd¾0稀释 10倍， 然后取 1μ 1 加入到 8.8μ 1 的 Hi- Di(ABI)和 0.2μ 1 1 的 LIZ500 分子内标（ΑΒΙ)中， 95°C 5min变性后， 置于 3130XL测序仪上进行毛细管电泳。
(6) 结果使用 GeneMapper4.0软件进行数据分析， 读取峰高等数据。
数据分析表 样本号 基国 基 H类别 I峰离' i峰离比 (S I) 拷臾数 样本 A POP! 参照基因 2290 3239 0.71 2
HDX Ch 目标基因 6^ 1761 0.38 1.08
S Y ChrY目标基因 129! 33 S 5 0.3 S 1.08 CA ! C -2 目标基因 240:6 21 1 3.15 样本 B POP! 参照基因 1544 2309 0,67 2
ΗΠΧ ChfX目标基因 "95 1163 0.68 2.04
CteY目标基因 0 72 0.00 0.00 目标基因 2029 2'ϋ-4.·'' 0.99 2,96 图 2和图 3分别为样品 Α和样品 Β的峰形图， 其中， I表示内对照 DNA， S表 示样本 DNA， Chr表示染色体， 黄色峰为分子内标。 四： 结论
样本 A含 1个拷贝 ChrX和 ChrY以及 3个拷贝 Chr21， 为 21三体男性， 与临 床检测结果一致。
样本 B含 2个拷贝 ChrX, 不含 ChrY以及 3个拷贝 Chr21， 为 21三体女性，
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考， 就如同每一篇文献被 单独引用作为参考那样。 此外应理解， 在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本 领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改， 这些等价形式同样落于本申请所 附权利要求书所限定的范围。

Claims

权 利 要 求
1.一种多重基因拷贝数检测试剂盒， 其特征是， 主要包括有：
(A)针对待测的目标基因设计的多重 PCR引物，每对引物中的一条或二条具有 荧光标记；
(B)定量的针对不同待测的目标基因的内对照匪片段，该内对照 DNA片段与 (A)中对应的多重 PCR引物的扩增产物高度一致，为对应扩增产物的序列缺失或插 入少数（1-50个）碱基的序列；
(C)至少一对参照基因的多重 PCR引物，每对引物中的一条或二条具有荧光标 记；
(D)定量的参照基因的内对照匪片段， 该内对照匪片段与（C)中对应的参 照基因高度一致， 为参照基因的序列缺失或插入少数（1-50个）碱基的序列； 上述同种荧光标记的多重 PCR引物对应扩增产物的长度有差异， 以至于扩增 产物在毛细管电泳分析中任意两个产物条带不重叠。
2. 根据权利要求 1所述的试剂盒， 其特征是， 所述缺失或插入的碱基的个 数为 1-5， 较佳地 2个。
3. 根据权利要求 1所述的试剂盒， 其特征是， 还包含有多重 PCR反应缓冲 液及热稳定匪聚合酶或两者预混和液。
4.一种多重基因拷贝数检测试剂盒， 其特征是， 包括：
(A)针对待测的目标基因的多重 PCR引物，每对引物中的一条或二条带有可检 测标记物；
(B)针对不同待测的目标基因的内对照 DNA片段， 该内对照匪片段与（A)中 对应的多重 PCR引物的扩增产物高度一致， 为对应扩增产物的序列缺失或插入少 数（1-50个）碱基的序列；
(C)针对参照基因的至少一对 PCR引物，每对引物中的一条或二条带有可检测 标记物；
(D)参照基因的内对照匪片段， 该内对照匪片段与（C)中对应的参照基因 (或其扩增产物）高度一致， 为参照基因的序列缺失或插入少数（1-50个）碱基的序 列；
上述同种荧光标记的多重 PCR引物对应扩增产物的长度有差异， 以至于扩增 产物在毛细管电泳分析中任意两个产物条带不重叠。
5. 一种多重基因拷贝数检测方法， 其特征是， 主要包括以下步骤：
(1)针对待测的目标基因， 设计对应的多重 PCR引物， 每对引物中的一条或二 条具有荧光标记； 设计至少一对参照基因的多重 PCR引物； 每对引物中的一条或 二条具有荧光标记； 上述同种荧光标记的多重 PCR引物对应扩增产物的长度有差 Q
(2)设计针对不同待测的目标基因和参照基因的内对照 DNA片段， 所述内对照 DNA片段与（1)中对应的多重 PCR引物的扩增产物高度一致， 为对应扩增产物的序 列缺失或插入少数（1-50个）碱基的序列；
(3)对所有内对照 DNA片段严格定量；
0 (4)将每种内对照 DNA片段等量混合， 与所述多重 PCR引物对待测样品进行多 重荧光 PCR扩增；
(5)扩增产物通过毛细管电泳将不同长度的片段分开， 得到每个条带的位置信 息以及荧光强度。
6. 根据权利要求 5所述的多重基因拷贝数检测方法， 其特征是， 步骤（5)之5 后还包括以下步骤：计算每个基因位点的样本条带 /内对照 DNA条带的荧光峰高或 面积比， 然后将目标基因的该比值除以参照基因的该比值再乘以参照基因的拷贝 数即得目标基因的相对拷贝数。
7. 根据权利要求 5所述的多重基因拷贝数检测方法， 其特征是， 所述缺失或 插入的碱基的个数为 1-5。
0 8.—种多重基因拷贝数检测方法， 其特征在于， 包括步骤： 用权利要求 1或
4所述的多重基因拷贝数检测试剂盒的进行检测。
9. 一种多重基因拷贝数检测方法， 其特征是， 主要包括以下步骤： (1) 在同一 PCR体系中， 对待测样品， 用多重 PCR引物进行 PCR扩增， 从而 产生扩增产物， 其中所述反应体系中包括：
5 (i)针对待测的目标基因的多重 PCR引物，每对引物中的一条或二条带有可检 测标记物；
(i i)针对参照基因的至少一对 PCR引物； 每对引物中的一条或二条带有可检 测标记；
其中， （i)和（i i)中所述的各 PCR引物扩增出的对应的扩增产物的长度有差0 异；
(i i i)针对待测的目标基因和参照基因的内对照 DNA片段， 所述内对照 DNA 片段与对应的多重 PCR引物的目标基因的扩增产物高度一致， 为对应扩增产物的 序列缺失或插入少数（1-50个）碱基的序列； 其中， 所述内对照 DNA片段的数量是 预定的；
(2) 检测各扩增产物， 得到每个扩增产物条带的位置信息以及可检测标记物 的强度； 和
(3) 按下式确定待测的目标基因的拷贝数：
待测的目标基因的拷贝数 = (T(s/I)/R(s/i) ) X C;
T(S/i) =Ts/Ti；
Figure imgf000021_0001
各式中，
Ts为该目标基因的扩增条带的可检测标记物的强度；
Ti为该目标基因内参照 DNA的扩增条带的可检测标记物的强度；
Rs为参照基因的扩增条带的可检测标记物的强度；
Ti为参照基因内参照匪的扩增条带的可检测标记物的强度；
C为参照基因的拷贝数。
10. 如权利要求 1或 4所述的试剂盒的用途， 其特征在于， 用于制备检测与 基因拷贝数或染色体拷贝数异常的疾病的试剂盒。
PCT/CN2011/074613 2010-05-24 2011-05-24 多重基因拷贝数检测试剂盒和方法 WO2011147309A1 (zh)

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