CN112852930A - 一种抗干扰pcr的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗干扰PCR的方法，包括：S1、在一个PCR扩增体系中同时扩增待测基因和内参基因，内参基因和待测基因竞争性扩增，待测基因和内参基因的大小相差至少15％；S2、将PCR扩增后的产物进行电泳检测，若仅检测到内参基因的条带或内参基因的条带亮度显著高于另一条条带亮度时，说明待测基因为阴性；若同时检测到待测基因和内参基因的条带，且待测基因与内参基因的条带亮度比为1:1～0.5时，说明待测基因为阳性；若未检测到内参基因的条带，说明该PCR扩增体系存在问题。本发明避免了PCR判定待测基因阴阳性过程中假阴性或假阳性的情况，结果精确无误，广泛适用于动植物和微生物，并且操作简单方便、降低成本、节省时间。
Description
技术领域
本发明属于PCR领域，具体涉及一种抗干扰PCR的方法。
背景技术
PCR是生物学实验室最常用的一种基因检测方法，其特点是能将微量的DNA大幅增加因此具有高灵敏性。然而在PCR检测中容易出现气溶胶，器皿，环境污染造成结果模糊，难以给出确定判断。目前市场上有各种各样的抗污染制剂和严格的控制方法，但这些方法不光麻烦而且条件要求极高，且对于长时间扩增同一个基因的情况仍然容易出现严重污染的情况。
中国专利CN108085371A公开了一种判断PCR结果是否为假阳性的方法，先估算出在PCR体系内将要加入的目标基因模板分子数量；然后根据目标基因模板分子数量向PCR体系内添加内参模板，所述内参模板的分子数量控制在目标基因模板分子数量的1/n；所述内参模板和目标基因模板高度同源，使得PCR引物能够以相同效率扩增内参模板和目标基因模板，然后对扩增结果进行测序分析；当扩增结果以目标基因片段为主，说明样品为阳性；当扩增结果以内参模板为主，则说明样品为阴性。然而该方法仅可判断PCR结果是否为假阳性，无法判断出因PCR扩增体系出现问题导致的假阴性情况，并且该方法需进行测序分析，操作过程复杂且费时。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术存在的问题，提供了一种抗干扰PCR的方法，该方法操作过程简单方便、不增加成本并且可准确判断PCR的检测结果。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种抗干扰PCR的方法，包括以下步骤：
S1、在一个PCR扩增体系中同时扩增待测基因和内参基因，其中所述内参基因和所述待测基因竞争性扩增，且所述内参基因在该PCR扩增体系正常的情况下中一定能扩增出来，所述待测基因和所述内参基因的大小相差至少15％；
S2、将PCR扩增后的所述待测基因和所述内参基因进行琼脂糖凝胶电泳检测，若仅检测到所述内参基因的条带或所述内参基因的条带亮度高于另一条的条带亮度时，说明所述待测基因为阴性；
若同时检测到所述待测基因的条带和所述内参基因的条带，且所述待测基因的条带亮度与所述内参基因的条带亮度比为1:1～0.5时，说明所述待测基因为阳性；
若未检测到所述内参基因的条带，说明所述PCR扩增体系存在问题。
该方法的原理是：在同一个扩增体系中同时扩增待测基因和内参基因，待测基因和内参基因进行竞争性的扩增，并且内参基因在该扩增体系正常的情况下一定可以被扩增出来，因此将一定可扩增出来的内参基因作为对照。由于两个基因的大小相差至少15％，因此可通过琼脂糖凝胶电泳分离并直接观察是否存在两条亮度相同或相近的条带。如果未检测到内参基因的条带，则证明该扩增体系存在问题或者体系中的模板抑制扩增等，从而避免出现假阴性的情况。如果检测到待测基因和内参基因两条条带，且待测基因的条带亮度与内参基因的条带亮度比为1:1～0.5时，说明待测基因为阳性。如果只能检测到内参基因这一条条带或内参基因的条带亮度高于另一条的条带亮度时，说明待测基因为阴性。当待测基因为阴性，但样品中存在微量的核酸气溶胶污染时，由于模板中的核酸含量显著高于污染的核酸含量，因此引物主要对模板中核酸进行大量扩增得到了大量的内参基因，而污染的核酸的扩增被抑制，因此仅能观察到内参基因这一条条带或者内参基因的条带亮度显著高于另一条条带的亮度时，说明该待测基因为阴性，即避免由于核酸污染导致出现假阳性的情况。
优选地，步骤S1中，所述待测基因和所述内参基因的模板相同，但扩增引物不同。即在该PCR扩增体系中同时加入针对同一模板的两种不同引物，其中内参基因的引物在扩增体系正常的情况下，一定可扩增出该内参基因，因此可以内参基因的条带作为对照验证待测基因。
优选地，步骤S1中，所述待测基因和所述内参基因的模板不同，但扩增引物相同。即在该PCR扩增体系中以同一种扩增引物同时扩增两个不同长度不同的模板，其中内参基因的模板在扩增体系正常的情况下，一定可扩增出该内参基因，因此可以内参基因的条带作为对照验证待测基因。
优选地，步骤S1中，所述待测基因的条带亮度和所述内参基因的条带亮度的比值为1:1。所述待测基因的条带亮度和所述内参基因的条带亮度一致时更利于观察，当另一条条带的亮度低于所述内参基因的条带亮度时，说明存在核酸污染，所述待测基因为阴性。
优选地，所述待测基因和所述内参基因的模板相同，但扩增引物不同时，选取扩增效率一致的扩增引物。为保证待测基因的条带亮度和内参基因的条带亮度一致，因此选取的两种扩增引物的扩增效率应保持一致。
优选地，所述待测基因和所述内参基因的模板不同，但扩增引物相同时，调节所述内参基因的模板浓度使所述内参基因的条带亮度与所述待测基因的条带亮度相同，以保证待测基因的条带亮度和内参基因的条带亮度一致。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)该方法通过内参基因和待测基因的竞争性扩增，避免了PCR判定样品阴阳性过程中的假阴性或假阳性的情况，结果精确无误，广泛适用于动植物和微生物，尤其适用于基因组DNA的检测。
(2)该方法中由于内参基因和待测基因的片段大小存在差异，因此只需要通过琼脂糖凝胶电泳检测的方法就可检测待测基因，操作简单方便、降低成本、节省时间。
附图说明
图1为本发明实施例1中PCR扩增后的样品的电泳检测结果图；
图2为本发明实施例2中内参基因的模板梯度稀释后的电泳检测结果图；
图3为本发明实施例2中PCR扩增后的样品的电泳检测结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例提供了一种抗干扰PCR的方法，其中待测基因和内参基因的模板相同，但引物不同，具体操作方式如下：
S1、采用CTAB法提取水稻转基因植株的基因组DNA作为模板DNA；
S2、通过测定引物的扩增效率，选取扩增效率相同的两种引物，其中待测基因中目标片段的引物如序列表SEQ ID NO.1-2所示，具体为：
hyg(280)+：acggtgtcgtccatcacagtttgcc
hyg(280)-：ttccggaagtgcttgacattgggga
而内参基因的引物如序列表SEQ ID NO.3-4所示，具体为：
P+：gcagattcctccacaatctaacaatcc
P-：ctagagggagactgaaaaggaaggag
其中目标片段的引物可从转基因阳性水稻中扩增出289bp的目标基因，而内参基因的引物可从水稻基因组中扩增出400bp的内参基因。
S3、进行PCR扩增，其中PCR扩增体系为：H2O 5μl，Taq聚合酶MIX 10μl，P+1μl，P-1μl，hyg(280)+1μl，hyg(280)-1μl，模板DNA 1μl；PCR循环的过程为：95℃5min，95℃30s，58℃30s，72℃30s(30个循环)，72℃5min，14℃1s。
S4、将PCR扩增后的样品进行琼脂糖凝胶电泳检测，其结果如附图1所示。其中位于上方的条带为400bp的内参基因，下方的条带为289bp的目标基因。从左往右依次判断待测基因，其中第1-3、5-8和10泳道中待测基因为阳性，而第4、9、11泳道中待测基因为阴性。第4泳道中虽然有少量核酸污染，但是其条带亮度显著低于内参基因的条带亮度，因此检测为阴性，而无内参基因作为对照时，第4泳道的核酸污染会作为模板进行大量的合成，从而出现假阳性结果。即采用本申请所述的方法可有效检测PCR结果，避免假阳性现象并且操作简单快速。
实施例2
本实施例提供了一种抗干扰PCR的方法，其中待测基因和内参基因的模板不同，但扩增引物相同。具体操作方式如下：
S1、待测基因的模板基因序列如SEQ ID NO.5所示，而内参基因的模板基因序列如SEQ ID NO.6所示，其中内参基因的模板基因序列为人工合成的，其基因序列为待测基因的模板基因序列缺失第421-600bp处的碱基得到的。而该PCR扩增体系中的引物序列如SEQ IDNO.7-8所示，具体为：
P-F：tagtcgtgcccctctctaga
P-R：ggaacgccgatctagagaag
因此使用该引物可同时扩增待测基因的模板和内参基因的模板，得到两个基因片段，并且内参基因比待测基因小180bp。
S2、为避免内参基因的模板浓度过高导致出现假阴性的情况，因此对内参基因的模板进行1/2浓度的梯度稀释，并分别与阳性样品的模板同时进行PCR扩增。其中PCR扩增体系为：H2O 5μl，Taq聚合酶MIX 10μl，P-F 1μl，P-R 1μl，待测样品DNA 1μl，内参基因DNA 1μl；PCR循环的过程为：95℃5min，95℃30s，58℃30s，72℃30s(30个循环)，72℃5min，14℃1s。
结果如附图2所示，其中上方的条带为内参基因，下方条带为待测基因，其中从左往右的第2-7泳道中内参基因的条带分别是初始内参基因的模板稀释1/2-1/64倍的浓度，可以发现在第6泳道，即将初始内参基因的模板稀释1/32倍时，内参基因与待测基因的亮度一致，因此将该浓度的内参基因的模板作为参照。
S3、将稀释1/32倍的内参基因模板与待测样品的模板进行PCR扩增，扩增体系和循环过程如步骤S2所示。
S4、将PCR扩增后的样品进行琼脂糖凝胶电泳检测，其结果如附图3所示，其中上方的条带为内参基因，下方条带为待测样品基因，从左往右依次判断待测样品，其中第2、7、9-11泳道中有两条亮度相同的条带，因此其待测样品为阳性，第1、3-6、8泳道中仅有内参基因这一条条带，因此待测样品为阴性。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 湖北伯远合成生物科技有限公司
<120> 一种抗干扰PCR的方法
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<212> DNA
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<212> DNA
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ctagagggag actgaaaagg aaggag 26
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tctacagttt tatcttttta gtgtgcatgt gttctccttt ttttttgcaa atagcttcac 300
ctatataata cttcatccat tttattagta catccattta gggtttaggg ttaatggttt 360
ttatagacta atttttttag tacatctatt ttattctatt ttagcctcta aattaagaaa 420
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Claims (6)
1.一种抗干扰PCR的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、在一个PCR扩增体系中同时扩增待测基因和内参基因，其中所述内参基因和所述待测基因竞争性扩增，且所述内参基因在该PCR扩增体系正常的情况下一定能扩增出来，所述待测基因和所述内参基因的大小相差至少15％；
S2、将PCR扩增后的所述待测基因和所述内参基因进行琼脂糖凝胶电泳检测，若仅检测到所述内参基因的条带或所述内参基因的条带亮度高于另一条的条带亮度时，说明所述待测基因为阴性；
若同时检测到所述待测基因的条带和所述内参基因的条带，且所述待测基因的条带亮度与所述内参基因的条带亮度比为1:1～0.5时，说明所述待测基因为阳性；
若未检测到所述内参基因的条带，说明所述PCR扩增体系存在问题。
2.根据权利要求1所述的一种抗干扰PCR的方法，其特征在于，步骤S1中，所述待测基因和所述内参基因的模板相同，但扩增引物不同。
3.根据权利要求1所述的一种抗干扰PCR的方法，其特征在于，步骤S1中，所述待测基因和所述内参基因的模板不同，但扩增引物相同。
4.根据权利要求1所述的一种抗干扰PCR的方法，其特征在于，步骤S1中，所述待测基因的条带亮度和所述内参基因的条带亮度的比值为1:1。
5.根据权利要求4所述的一种抗干扰PCR的方法，其特征在于，所述待测基因和所述内参基因的模板相同，但扩增引物不同时，选取扩增效率一致的扩增引物。
6.根据权利要求4所述的一种抗干扰PCR的方法，其特征在于，所述待测基因和所述内参基因的模板不同，但扩增引物相同时，调节所述内参基因的模板浓度使所述内参基因的条带亮度与所述待测基因的条带亮度相同。
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