CN102399900B - 基因多态检测方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种基因多态检测方法，包括以下步骤：针对目标基因设计多重PCR引物，每个目标基因包含限制性内切酶序列；设计内对照DNA片段，该内对照DNA片段包含目标基因的限制性内切酶序列；对待测样本进行多重PCR扩增；将PCR扩增产物和内对照DNA片段混匀，用限制性内切酶进行酶切；酶切产物经变性后，通过毛细管电泳将不同长度的片段分开，收集每个条带的位置信息及信号强度；计算样本每个目标基因片段酶切前后的峰高或面积比、以及内对照DNA片段酶切前后的峰高或面积比，得待测样本目标基因片段的遗传多态性。本发明还公开了一种基因多态检测试剂盒。本发明基因多态检测方法，能在一个反应体系中快速、精确地同时检测多个样本的多个目标基因的遗传多态性。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，应用于生物科学研究和临床分子诊断，具体涉及一种基因多态检测方法及试剂盒。
背景技术
基因多态性是指基因的碱基序列变化，比如一个碱基的插入、缺少或替换，一段DNA片段的插入、缺少、颠倒、重复等。单核苷酸多态性SNP是现在公认的第三代遗传标记，HAPMAP等生物信息数据库显示和预测人类基因组序列中每300个碱基序列中有一个SNP，单个核苷酸的变化如插入、缺失或替换可能会改变目标基因的正常功能从而导致相关疾病发生或相关表型的变化，因此基因多态性尤其是SNP的快速而准确的检测将有助于相关疾病的临床分子诊断或相关基因的科学研究。
从检测基因位点数目上，基因位点的具体检测方法可以分为三大类，一是全基因组水平上的高密度SNP高通量检测，二是对目标区域多个基因的SNP进行中通量的检测。第三类是少量或者单个基因的少量SNP位点的低通量检测。前者包括SNPScan、全基因组SNP芯片杂交等技术对成千上万甚至几百万个SNP位点进行检测(Sun M et al.，2009；HUGO Pan-AsianSNP Consortium et al.，2009；Jian-Wen Han et al.，2009)，这些技术主要研究基因组的代谢通路及基因家族相关的SNP全扫，用于发现有意义的新功能基因位点，但普遍存在检测周期长以及检测成本昂贵等缺点；中通量的SNP检测主要针对有限目标区段多个基因中几十个甚至几百个SNP的检测，包括微小测序技术、高温连接酶检测技术(LDR)(zhao zhang，etal，2009)、多重连接依赖探针扩增(MLPA)(Schouten et al.，2002)以及MassArray SNP检测技术(Sequenom Inc.，San Diego，CA)；低通量的SNP检测主要是针对感兴趣的几个目的基因的少量几个关键的SNP进行检测，包括直接测序SNP分型技术、taqMan探针、限制性内切酶反应(RFLP)、高分辨率融解曲线反应(HRM)。
但是，现有的低通量SNP分型技术都有其局限性，比如：直接测序SNP分型技术，准确性高，如果检测的几个SNP位点正好在一个测序单元内(长度小于600bp)，则检测方案相对可行，如果检测位点位置相差较远则其检测成本太高。TaqMan技术主要是基于特异性荧光探针，目的基因的检测序列与探针完全配对，则探针上的荧光基团淬灭发出相应的荧光信号，根据收集到的不同荧光信号确定基因的SNP类型，其每次实验只能检测一个基因位点，而且荧光信号成本昂贵。RFLP是基于将目的基因位点的特异性序列，采用限制性内切酶酶切，酶切产物跑琼脂糖胶电泳来区分不同长度片段，从而确定基因位点的单倍型。此方法每次实验也只能检测少量几个位点，而且跑琼脂糖胶电泳很难区分长度相近的酶切片段，并且电泳出来的胶图不精确，更重要的是有时候限制性内切酶的酶切效果不佳，难以区分酶能切动的纯合子和杂合子两种单倍型。高分辨率融解曲线反应(HRM)基于DNA不同碱基序列其融解温度不同，经过每0.1℃的升高，不同碱基序列的DNA双链在不同的温度下解链，在每个DNA扩增产物中嵌入荧光信号，收集解链时释放的荧光信号来确定基因的单倍型。HRM的缺点也在于每次反应只能检测一个样本的一个基因位点，而且通过融解曲线来判定基因型的准确度随温度梯度的分辨高低差异比较大。
发明内容
本发明要解决目前SNP分型方法精确度差、效率低、成本贵的技术问题，提供一种基因多态检测方法，该方法可以在一个反应体系中快速、准确地同时检测多个样本的多个目标基因的遗传多态性。
此外，还需要提供一种基因多态检测试剂盒。
为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：
在本发明的一个方面，提供了一种基因多态检测方法，包括以下步骤：
针对一个或多个目标基因设计多重PCR引物，每个目标基因包含限制性内切酶序列，每对引物中的一条具有信号标记；
针对每个目标基因包含的限制性内切酶序列，设计内对照DNA片段，该内对照DNA片段包含所述目标基因的限制性内切酶序列；
用所述PCR引物对待测样本进行多重PCR扩增；
将待测样本的PCR扩增产物和内对照DNA片段混匀，用所述限制性内切酶序列对应的限制性内切酶进行酶切；
酶切产物经变性后，通过毛细管电泳将不同长度的片段分开，收集每个条带的位置信息以及信号强度；
计算样本每个目标基因片段酶切前后的峰高或面积比、以及内对照DNA片段的酶切前后的峰高或面积比，将每个目标基因片段酶切前后的峰高或面积比值分别参照内对照DNA片段酶切前后的峰高或面积比值，获得待测样本目标基因片段的遗传多态性。
所述多重PCR引物中，各信号标记引物具有相同或不同的信号标记；相同信号标记的引物对应的扩增产物长度有至少1bp的差别。
所述信号标记包括荧光标记。
所述内对照DNA片段通过化学合成或PCR扩增制得。
在本发明的另一方面，还提供了一种基因多态检测试剂盒，主要包括有：
(A)针对一个或多个目标基因设计的多重PCR引物，每个目标基因包含限制性内切酶序列，每对引物中的一条具有信号标记；
(B)针对每个目标基因包含的限制性内切酶序列设计的内对照DNA片段，该内对照DNA片段包含所述目标基因的限制性内切酶序列；
(C)所述限制性内切酶序列对应的限制性内切酶。
本发明是在认真总结现有各种低通量SNP检测技术的优缺点的基础上再经过自主创新后开发成功，它综合了多重PCR、毛细管电泳精确分析DNA片段特征、混合不同样本相同基因位点PCR扩增不同长度片段一起酶切，以及引入限制性内切酶特异序列的内对照DNA片段来精确判断限制性内切酶的酶切效果，是一种简单快速、低成本、高精确的SNP检测方法，在未来临床疾病致病基因研究以及临床基因检测领域将会有广泛的应用前景。
本发明基因多态检测方法，主要具有以下优点：
1、多个样本多个基因位点同时检测：由于相同的基因位点扩增不同的DNA片段，混合均匀后一起酶切、毛细管电泳。一次酶切通常可以同时混合2-50个样本的PCR扩增产物；由于采用了多重PCR体系，一个PCR扩增反应通常可以同时扩增1-50个位点，也就意味着如果选用4个以上的基因位点，每个基因位点设计4个不同扩增长度，那么意味着一次反应可以同时检测16个以上目标基因位点；
2、高精确性：由于酶切底物中加入含有限制性内切酶的特异酶切位点的内对照DNA片段，解决了有些限制性内切酶酶切不完全的情况；
3、操作简单：只要将样本DNA进行多重PCR，之后将不同样本PCR产物混匀特异性酶切后直接跑毛细管电泳仪(如ABI测序仪)即可，整个实验过程仅需要一步PCR循环、一步酶切和一步毛细管电泳。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1是本发明同时检测一个遗传多态位点在多个样本中基因分型原理图；
图2是本发明同时检测一个样本中多个遗传多态位点基因分型原理图；
图3是本发明同时检测多个遗传多态位点在多个样本基因分型原理图；
图4是本发明实施例1检测四个样本同一个基因多态位点的毛细管电泳图；
图5是本发明实施例2三个样本中四个基因多态位点同时检测结果图。
具体实施方式
本发明的基因多态检测方法是基于限制性酶切RFLP原理并结合多重荧光PCR扩增以及毛细管电泳长度差异片段分离技术对一个或多个样本的一个或多个目标基因同时进行检测，并利用参照酶切序列对检测结果进行校正后获取目标基因的正确遗传多态性的检测方法，其主要检测过程如下(检测原理图参见图1-3)：
1)针对一个或多个目标基因以及参照酶切序列进行多重PCR引物设计，每对引物中的一条标上信号标记，该信号标记通常采用荧光标记，多重PCR引物中各荧光标记引物具有相同或不同的荧光，同种荧光引物对应的扩增产物长度必须有至少1bp以上的差别。
2)针对每种限制性内切酶的特异序列，设计内对照DNA片段，该内对照DNA片段包含目标基因的限制性内切酶序列，并通过化学合成或PCR扩增的方式制备该内对照DNA片段。
3)用上述设计的引物对待测样本进行多重荧光PCR扩增。
4)将不同样本的PCR扩增产物和内对照DNA片段混匀，在限制性内切酶的最适条件下酶切。
5)酶切产物通过变性、毛细管电泳将不同长度的片段分开，收集每个条带的位置信息以及荧光强度，这一步通常在测序仪上完成如美国应用生物公司的测序仪ABI3130以及ABI3730等。
6)由于不同基因的扩增产物在长度以及荧光标记上不同，而且同一基因位点上样本DNA以及内对照DNA扩增产物长度也不同，因此根据毛细管电泳峰形图可以明确每个基因位点上样本DNA以及内对照DNA各自酶切效果。由于内对照DNA片段含有样本DNA在每个目标基因位点上限制性内切酶的特异序列，因此样本DNA目标基因的酶切效率可以通过内对照DNA的酶切效率对比估算。分别计算样本DNA每个目标基因片段的酶切前后的峰高或面积比(U/C1)与内对照DNA片段的酶切前后的峰高或面积比(U/C2)。
7)将每个目标基因片段酶切前后的U/C1比值分别参照内对照DNA片段的U/C2比值，然后确定目标基因片段的遗传多态性。
8)如果检测的目标基因片段酶切效率高，限制性内切酶酶切完全，可获取更准确的结果。
实施例1利用本发明方法对一个基因多态位点多个样本同时检测：G蛋白β3亚单位基因C825T(chr12 rs5443)基因分型。
检测样本：4个样本
分析rs5443SNP位点前后500bp的序列特征，设定其限制性内切酶为：BseDI(fermentas公司提供)，酶切序列为rs5443附近碱基序列：
TGTGGGCTGCCCAGGTCTGATCCCTGACCCACTTGCCACCCGTGCCCTCAGTTCTTCCCCAATGGAGAGGCCATCTGCACGGGCTCGGATGACGCTTCCTGCCGCTTGTTTGACCTGCGGGCAGACCAGGAGCTGATCTGCTTCTCCCACGAGAGCATCATCTGCGGCATCACGTCYGTGGCCTTCTCCCTCAGTGGCCGCCTACTATTCGCTGGCTACGACGACTTCAACTGCAATGTCTGGGACTCCATGAAGTCTGAGCGTGTGGGTAAGGGCCAGCCCTGGCTGCTGCTTCCTCAGCTGGAAGGACCCTCCCCAGCCCTCCCTCCCCAT(SEQ ID NO：1)
引物序列：其中，[FAM]表示为荧光标记。
rs5443F1：[FAM]CACCCGTGCCCTCAGTTCTT(SEQ ID NO：2)
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rs5443R：GCCCTTACCCACACGCTCAG(SEQ ID NO：6)
实验体系及步骤：
(1)将样本大概定量，然后稀释至约10ng/μl作为待测DNA样本待用。
(2)配置PCR引物混合液，分别配置4对PCR引物：rs5443F1/R、rs5443F2/R、rs5443F3/R和rs5443F4/R，每条引物浓度各1μM。
(3)含限制性内切酶酶切特异序列的内对照DNA(标为iDNA)。
(4)多重PCR体系(20μl)配置
PCR程序：
(5)取不同样本扩增长度不同的DNA片段和内参照DNA片段各1μl混匀，按照BseDI最适酶切条件酶切。
酶切体系20ul：BseDI缓冲液2ul，BseDI酶0.4ul(10U/ul)，样本DNA模板(F1，F2，F3，F4四个样本的PCR扩增产物各1ul)4ul，内对照DNA模板1ul，ddH2O 12.6ul，在BseDI酶的最适酶切温度55℃下酶切2h。
(6)取1μl酶切产物产物用ddH2O稀释10倍，然后取1μl加入到8.8μl的Hi-Di(ABI)和0.2μl的LIZ500分子内标(ABI)中，95℃5min变性后，置于3130XL测序仪上进行毛细管电泳。
(7)结果使用GeneMapper4.0软件进行数据分析，读取峰高等数据。
实验结果如图4所示，四个样本加内对照DNA混合酶切的分型结果是：从内对照酶切后峰看，酶切效果接近100％，四个样本的基因型为F1：C/T；F2：C/C；F3：C/T；F4：T/T。
实施例2利用本发明方法对多个样本的多个基因多态位点同时检测：同时在三个样本中检测每个样本的LIPC、APOB、GCKR、LPL四个基因的遗传多态位点
四个基因多态位点的选择见下表1：
表1 实施例2检测的4个基因多态位点的信息表
四个基因遗传多态位点附近的序列信息、使用的限制性内切酶及引物信息如下：
1)rs1532085，LIPC
TGGGTGATTTTTCTCCCATTAACGTATCTCTCAATACTCAAAAAGTAATAACTTCTGAAGAATTGCACTTATCCAGGACAAACCGGATAGAGTAACTACAATTCTTCTTCCTTCAATATTCCACATGCTTCTCCTTCCCCAATGAAAGCAATCTTCTTTTTCTAATAGAGTTTGCTTCCATTTCTGTCTACCCCTCCCTCAAAAAAGAAAATTACAAGATTAGCTAAAAATTAGATTGCAGTATATTTCACAAGTTAGTACTTAACTGACCRCGTATTGATTCATGACGGTTAATATTGACTCC(SEQ ID NO：7)rs1532085：BstUI，CGCG
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2)rs1367117，APOB
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3)rs1260326，GCKR
GGGGAGGGGGAAATAGAATGGTTCAGAGGAGCTGTTGTTTTTCTGGGTCTTAGGGTACCTGCTCAGAGGGAGGGACGGGGTGAATATCCTGACTGGACCCCAGCCAGGGGAGCAGGAGGAACAGCTGCACAGCCAGCCTTTCGACTCTGATGCCCTCCCCTTCTCCTAGACAACCTCACGGAGGTGCAGACTATAGTGGAGCAGGTGAAAGAGAAGACCAACCACATCCAGGCCCTGGCACACAGCACCGTGGGTCAGACCTTGCYGGTGAGAGTCCAGCCGTGACAAAG(SEQ ID NO：17)
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rs1260326F3：[FAM]GGGGAGGGGGAAATAGAATGGT L＝290，266(SEQ ID NO：21)
4)rs1372344，LPL
AGCCTGGGCAACAAGAACAAAACTCCGTTTCAAATAAATAAATAAAATTWAAAAGGCACTGTATTTCTCTTTGTGTATTCATATGGATATCTATTTTGTAGCTACGAATGAAATACCAATTCCATTCAGAATAAGAGAAGGAAACAAATAAATTATATCACATAACACTTATCATTATACATGTCTTGGGAAGGATAACCATTCATTAGTTTAAGTTAAGTCTTCTGCTTCTATGATAAAGGTTAGTTTAGAAAGCCGGGGCTCAGTCTGCCTCTCCTGTAATATTCACACTGGATGTAATGGAAACAAAATCATAGGCATTAAGAGACTCTCTAAGAGTGTAGAATAAACTAACAAATGTGGTTACTCATGACAGGAAGGGTGAAAAAACTGAATTATTCAGGATAATGGTGAGCCTCCAAT(SEQ I D NO：22)
rs1372344：DraI TTTAAA
rs1372344F：gtttagcctgggcaacaagaacaaaa(SEQ ID NO：23)
rs1372344R1：[HEX]GAATATTACAGGAGAGGCAGACTGAGC L＝291，237(SEQ ID NO：24)
rs1372344R2：[HEX]CCCTTCCTGTCATGAGTAACCACA L＝386，332(SEQ ID NO：25)
rs1372344R3：[HEX]TTGGAGGCTCACCATTATCCTG L＝426，372(SEQ ID NO：26)
实验体系及步骤：
(1)将样本大概定量，然后稀释至约10ng/μl作为待测DNA样本待用。
(2)配置PCR引物混合液，分别含3个PCR引物混合液：
a：rs1532085F1/R、rs1367117F/R1、rs1260326F1/R、rs1372344F/R1；
b：rs1532085F2/R、rs1367117F/R2、rs1260326F2/R、rs1372344F/R2；
c：rs1532085F3/R、rs1367117F/R3、rs1260326F3/R、rs1372344F/R3；
每条引物浓度各1μM。
(3)含限制性内切酶酶切特异序列的内对照DNA(标为iDNA)。
(4)多重PCR体系(20μl)配置
PCR程序：
(5)取不同样本扩增长度不同的DNA片段和内参照DNA片段各1μl混匀，按照BstUI、BamHI、NaeI、DraI四种限制性内切酶的共同酶切效率最好的条件酶切。
酶切体系20ul：NEB缓冲液2ul；BstUI、BamHI、NaeI、DraI四酶各0.4ul(10U/ul)；样本DNA模板(不同样本在a、b、c三个多重PCR的扩增产物各1ul)3ul；内对照DNA模板1ul；ddH2O 12.4ul。
在四种酶的共同最优酶切温度55℃下酶切2h。
(6)取1μl酶切产物产物用ddH2O稀释10倍，然后取1μl加入到8.8μl的Hi-Di(ABI)和0.2μl的LIZ500分子内标(ABI)中，95℃5min变性后，置于3130XL测序仪上进行毛细管电泳。
(7)结果使用GeneMapper4.0软件进行数据分析，读取峰高等数据。
实验结果：
下表2为3个样本中4个基因毛细管电泳后的实际检测位置。
表2 3个样本4个基因多态位点实验检测信息
| SNP | Flou | ref_A | ref_B | F1A | F1B | F2A | F2B | F3A | F3B | NEB buffer | TM | activity |
| rs1532085 | FAM | 94 | 130 | 139 | 175 | 201 | 237 | 272 | 308 | buffer4 | 37℃ | 100％ |
| rs1367117 | FAM | 170 | 195 | 217 | 242 | 250 | 275 | 423 | 448 | buffer4 | 37℃ | 100％ |
| rs1260326 | FAM | 114 | 138 | 163 | 187 | 192 | 216 | 266 | 290 | buffer4 | 37℃ | 100％ |
| rs1372344 | HEX | 164 | 218 | 237 | 291 | 334 | 388 | 423 | 477 | buffer4 | 37℃ | 100％ |
注：如果酶切效率达到100％，就不需要内参DNA进行校正。
由表2和图5可以清楚的得到以下检测基因的分型结果。
F1样本四个基因多态位点分型结果：
rs1532085 A/A、rs1367117 T/T、rs1260326 C/C、rs1372344 A/T；
F2样本四个基因多态位点分型结果：
rs1532085 G/G、rs1367117 C/C、rs1260326 C/C、rs1372344 A/A；
F3样本四个基因多态位点分型结果：
rs1532085 G/G、rs1367117 T/T、rs1260326 C/C、rs1372344 A/T。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110>上海天昊生物科技有限公司
<120>基因多态检测方法及试剂盒
<160>26
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>333
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>1
tgtgggctgc ccaggtctga tccctgaccc acttgccacc cgtgccctca gttcttcccc 60
aatggagagg ccatctgcac gggctcggat gacgcttcct gccgcttgtt tgacctgcgg 120
gcagaccagg agctgatctg cttctcccac gagagcatca tctgcggcat cacgtcygtg 180
gccttctccc tcagtggccg cctactattc gctggctacg acgacttcaa ctgcaatgtc 240
tgggactcca tgaagtctga gcgtgtgggt aagggccagc cctggctgct gcttcctcag 300
ctggaaggac cctccccagc cctccctccc cat 333
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>引物
<400>2
cacccgtgcc ctcagttctt 20
<210>3
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(25)
<223>引物
<400>3
tttttcaccc gtgccctcag ttctt 25
<210>4
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(30)
<223>引物
<400>4
tttttttttt cacccgtgcc ctcagttctt 30
<210>5
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(35)
<223>引物
<400>5
tttttttttt tttttcaccc gtgccctcag ttctt 35
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>引物
<400>6
gcccttaccc acacgctcag 20
<210>7
<211>304
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>7
tgggtgattt ttctcccatt aacgtatctc tcaatactca aaaagtaata acttctgaag 60
aattgcactt atccaggaca aaccggatag agtaactaca attcttcttc cttcaatatt 120
ccacatgctt ctccttcccc aatgaaagca atcttctttt tctaatagag tttgcttcca 180
tttctgtcta cccctccctc aaaaaagaaa attacaagat tagctaaaaa ttagattgca 240
gtatatttca caagttagta cttaactgac crcgtattga ttcatgacgg ttaatattga 300
ctcc 304
<210>8
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(32)
<223>引物
<400>8
gtttggagtc aatattaacc gtcatgaatc aa 32
<210>9
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(23)
<223>引物
<400>9
cttccccaat gaaagcaatc ttc 23
<210>10
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(24)
<223>引物
<400>10
tccaggacaa accggataga gtaa 24
<210>11
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(26)
<223>引物
<400>11
tgggtgattt ttctcccatt aacgta 26
<210>12
<211>444
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>12
catcctgaag accagccagt ggaycctgaa agaggtgyat ggcttcaacc ctgagggcaa 60
agccttgctg aagaaaacca agaactctga ggagtttgct gcagccatgt ccaggtaagt 120
catgttgtac atgagcacac rcaygtgtgt gtgtccrctg aggtatgaay ttgtgtgttt 180
gcaccaggca cggatgtgac tgtaagtatt tgtattccgt atccatcgtg gatcagggaa 240
ttactgagtt ttcacaatca tcaaaaagag agaagcatta gttamcyttc cctagttagg 300
ttcctttaat tatcattttc atgtgtttct aaaaatctca tgctttaaac ttcttgagat 360
tataaaactg agatgctttg tttaaacaag tgaattctta tttaaagaac tagtcaagac 420
tagtgcttgg tggtctttgg tgtg 444
<210>13
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(27)
<223>引物
<400>13
gtttcatcct gaagaccagc cagtgga 27
<210>14
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(25)
<223>引物
<400>14
ttttgatcca cgatggatac ggaat 25
<210>15
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(30)
<223>引物
<400>15
tctctttttg atgattgtga aaactcagta 30
<210>16
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(22)
<223>引物
<400>16
cacaccaaag accaccaagc ac 22
<210>17
<211>290
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>17
ggggaggggg aaatagaatg gttcagagga gctgttgttt ttctgggtct tagggtacct 60
gctcagaggg agggacgggg tgaatatcct gactggaccc cagccagggg agcaggagga 120
acagctgcac agccagcctt tcgactctga tgccctcccc ttctcctaga caacctcacg 180
gaggtgcaga ctatagtgga gcaggtgaaa gagaagacca accacatcca ggccctggca 240
cacagcaccg tgggtcagac cttgcyggtg agagtccagc cgtgacaaag 290
<210>18
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(23)
<223>引物
<400>18
gtttgtcacg gctggactct cgc 23
<210>19
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(28)
<223>引物
<400>19
tttttttggg agggacgggg tgaatatc 28
<210>20
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(22)
<223>引物
<400>20
acggggtgaa tatcctgact gg 22
<210>21
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(22)
<223>引物
<400>21
ggggaggggg aaatagaatg gt 22
<210>22
<211>423
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>22
agcctgggca acaagaacaa aactccgttt caaataaata aataaaattw aaaaggcact 60
gtatttctct ttgtgtattc atatggatat ctattttgta gctacgaatg aaataccaat 120
tccattcaga ataagagaag gaaacaaata aattatatca cataacactt atcattatac 180
atgtcttggg aaggataacc attcattagt ttaagttaag tcttctgctt ctatgataaa 240
ggttagttta gaaagccggg gctcagtctg cctctcctgt aatattcaca ctggatgtaa 300
tggaaacaaa atcataggca ttaagagact ctctaagagt gtagaataaa ctaacaaatg 360
tggttactca tgacaggaag ggtgaaaaaa ctgaattatt caggataatg gtgagcctcc 420
aat 423
<210>23
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(26)
<223>引物
<400>23
gtttagcctg ggcaacaaga acaaaa 26
<210>24
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(27)
<223>引物
<400>24
gaatattaca ggagaggcag actgagc 27
<210>25
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(24)
<223>引物
<400>25
cccttcctgt catgagtaac caca 24
<210>26
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(22)
<223>引物
<400>26
ttggaggctc accattatcc tg 22
Claims (5)
1.一种基因多态检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
针对一个或多个目标基因设计多重PCR引物，每个目标基因包含限制性内切酶序列，每对引物中的一条具有信号标记,所述多重PCR引物中，各信号标记引物具有相同或不同的信号标记,相同信号标记的引物对应的扩增产物长度有至少1bp的差别；
针对每个目标基因包含的限制性内切酶序列，设计内对照DNA片段，该内对照DNA片段包含所述目标基因的限制性内切酶序列；
用所述PCR引物对待测样本进行多重PCR扩增；
将待测样本的PCR扩增产物和内对照DNA片段混匀，用所述限制性内切酶序列对应的限制性内切酶进行酶切；
酶切产物经变性后，通过毛细管电泳将不同长度的片段分开，收集每个条带的位置信息以及信号强度；
计算样本每个目标基因片段酶切前后的峰高或面积比、以及内对照DNA片段的酶切前后的峰高或面积比，将每个目标基因片段酶切前后的峰高或面积比值分别参照内对照DNA片段酶切前后的峰高或面积比值，获得待测样本目标基因片段的遗传多态性。
2.根据权利要求1所述的基因多态检测方法，其特征在于，所述信号标记包括荧光标记。
3.根据权利要求1所述的基因多态检测方法，其特征在于，所述内对照DNA片段通过化学合成或PCR扩增制得。
4.一种基因多态检测试剂盒，其特征在于，主要包括有：
（A）针对一个或多个目标基因设计的多重PCR引物，每个目标基因包含限制性内切酶序列，每对引物中的一条具有信号标记,所述多重PCR引物中，各信号标记引物具有相同或不同的信号标记,相同信号标记的引物对应的扩增产物长度有至少1bp的差别；
（B）针对每个目标基因包含的限制性内切酶序列设计的内对照DNA片段，该内对照DNA片段包含所述目标基因的限制性内切酶序列；
（C）所述限制性内切酶序列对应的限制性内切酶。
5.根据权利要求4所述的基因多态检测试剂盒，其特征在于，还包含有多重PCR反应缓冲液及限制性酶切缓冲液。
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|
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
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Date of cancellation: 20190517 Granted publication date: 20131030 Pledgee: Pudong Shanghai technology financing Company limited by guarantee Pledgor: Shanghai Genesky Bio-Tech Co., Ltd. Registration number: 2018310000015 |
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| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: Gene polymorphism detection method and kit Effective date of registration: 20190522 Granted publication date: 20131030 Pledgee: Pudong Shanghai technology financing Company limited by guarantee Pledgor: Shanghai Genesky Bio-Tech Co., Ltd. Registration number: 2019310000026 |
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| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PP01 | Preservation of patent right | ||
| PP01 | Preservation of patent right |
Effective date of registration: 20190613 Granted publication date: 20131030 |
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| PD01 | Discharge of preservation of patent | ||
| PD01 | Discharge of preservation of patent |
Date of cancellation: 20190816 Granted publication date: 20131030 |
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| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
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Date of cancellation: 20200108 Granted publication date: 20131030 Pledgee: Pudong Shanghai technology financing Company limited by guarantee Pledgor: Shanghai Genesky Bio-Tech Co., Ltd. Registration number: 2019310000026 |
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| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: Gene polymorphism detection method and kit Effective date of registration: 20200228 Granted publication date: 20131030 Pledgee: Pudong Shanghai technology financing Company limited by guarantee Pledgor: Shanghai Genesky Bio-Tech Co., Ltd. Registration number: Y2020310000005 |
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| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |
Date of cancellation: 20210115 Granted publication date: 20131030 Pledgee: Pudong Shanghai technology financing Company limited by guarantee Pledgor: SHANGHAI GENESKY BIOTECHNOLOGIES Inc. Registration number: Y2020310000005 |