CN108676895A

CN108676895A - 鹿胎多重pcr-rflp-ce dna指纹图谱及鉴定方法

Info

Publication number: CN108676895A
Application number: CN201810496611.8A
Authority: CN
Inventors: 周亭亭; 苑广信; 艾金霞; 王雪松; 王艳双
Original assignee: Beihua University
Current assignee: Beihua University
Priority date: 2018-05-22
Filing date: 2018-05-22
Publication date: 2018-10-19

Abstract

本发明公开了一种涉及中药材鹿胎的鉴定方法，具体是采用多重PCR（多重聚合酶链式反应）、RFLP（限制性片段长度多态性分析）结合CE（毛细管电泳技术）建立鹿胎DNA指纹图谱及鉴定方法。具有分辨率高、灵敏度高、高稳定性、操作简便、快速、成本低、易实现自动化分析等特点，能够应用于中药材鹿胎样品的真伪鉴定。

Description

鹿胎多重PCR-RFLP-CE DNA指纹图谱及鉴定方法

技术领域

本发明涉及中药材鉴定技术，具体是采用多重PCR（多重聚合酶链式反应）、RFLP（限制性片段长度多态性分析）结合CE（毛细管电泳技术）建立鹿胎DNA指纹图谱及鉴定方法。

背景技术

鹿胎属我国名贵中药材,性温，味甘咸，归肾经，属高级滋养补品。临床上用于调经散寒、补气溢血、美容养颜等。由于鹿胎成分复杂，没有明确的功效成分，很难对鹿胎及其伪品作出准确判断。且正品鹿胎价格高昂，不法商贩在利益驱使下以假充真、以次充好，导致鹿胎中药材市场混乱。

长久以来，鹿胎鉴定一直采用四大传统鉴定方法（基源鉴定、性状鉴定、显微鉴定和理化鉴定），这些方法的鉴定标识在生物学上均属于物种的表型鉴定，易受生长环境、发育阶段、采收季节、加工炮制等因素影响，具有很大的变异性和可塑性（即可伪造性），并且这些方法还存在主观性强（鉴定者的经验、理化鉴定标识成分选择是否合理等）、重复性和稳定性差等缺点，鉴定结果客观性和可靠性较差。例如：传统鉴别法是通过正伪品性状差异进行鉴别，简单易行，但主观性强，其准确度取决于鉴定者的经验，故分辨率较低；红外光谱法主要优点是不破坏样品、所提供的信息量大，而在图谱分析方面要求实验人员有较为丰富的经验；高效液相色谱法检测灵敏度较高，但分析成本以及仪器的日常维护费用都很高。因此，为鹿胎提供一种简单方便、准确精准的方法迫在眉睫。

DNA指纹鉴定是利用生物体内遗传信息载体（DNA）对物种进行鉴别的方法，在分子水平上检测被鉴定对象的遗传标记特征，具有高度的种质特异性，比传统方法更科学、客观和准确。《中国药典》（2010年版）中采用DNA指纹鉴定技术鉴别蕲蛇、鹿胎，更说明了DNA指纹鉴定技术可以作为中药材鉴定的法定依据。

线粒体是具有半自主性的细胞器，是细胞进行呼吸活动、产生能量的重要场所。mtDNA 系母系遗传，基因组结构高度保守，一级结构有很大的差异，有利于进行种内和种间的遗传变异和进化研究。开展mtDNA酶切、毛细管电泳图谱的研究，可以为线粒体基因定位、建立基因文库、比较不同来源mtDNA的差异、探索物种的起源和演化以及地理分布等提供非常有意义的资料，且关于鹿胎的mtDNA序列未见报道。Cytb位于线粒体内膜磷脂双层中，是参与氧化磷酸化合成ATP过程电子传递链中的重要物质，是线粒体自身编码的为数不多的功能蛋白。其基因进化速度适中，近年来被广泛应用于两栖类、鱼类等的系统发育、种类鉴别等的研究。

而DNA指纹图谱是对各种药材，尤其中药易混品种通过基因组序列分析，寻找其保守且特异的指纹区段，设计引物进行特异性扩增，从分子水平上对中药材进行鉴定及分析。本发明采用多重PCR（聚合酶链式反应）、RFLP（限制性片段长度多态性分析）结合毛细管电泳技术进行鹿胎DNA指纹图谱的建立。

近些年来，毛细管电泳技术越来越被人们所熟知，其优点为：（1）高效（塔板数目在105-106 片/m 间，当采用CGE 时，塔板数目可达107 片/m 以上）；（2）快速（一般在十几分钟内完成分离）；（3）微量（进样所需的样品体积为nL 级）；（4）多模式（根据需要选用不同的分离模式且仅需一台仪器即可）；（5）经济（实验消耗不过几毫升缓冲溶液，维持费用很低）；（6）自动（是目前自动化程度较高的分离方法）。

将荧光定量PCR结合毛细管电泳技术联合建立DNA指纹图谱与鉴定方法，无疑是强有力的方式。

发明内容

本发明的目的是提供一种多重PCR技术、RFLP技术结合毛细管电泳技术DNA指纹图谱及鉴定方法，以解决现有技术的缺陷。本方法分辨率高、灵敏度高、操作简便、快速、安全、结果准确，能够用于鹿胎样品的鉴定。

本发明的目的是由以下技术方案来实现的：

建立多重PCR-RFLP-毛细管电泳DNA指纹图谱及鉴定方法，包含下述步骤：

1)DNA提取：取鹿胎样品，按盐析法提取其DNA；

2)多重PCR扩增：A上游引物1ul；A下游引物1ul；B上游引物1ul；B下游引物1ul；Taq聚合酶12.5ul；所提取DNA样品2ul；ddH2O 6.5ul，总体积25ul。

3)PCR产物纯化：吸取稀释后的PCR产物1.0 μl注入进样板，加灭菌双蒸水9.0 μl使总体积至10 μl，离心。再加入30 μl乙醇乙酸钠，8℃、3600r/min离心30 min。弃上清液，加入50 μl 70％乙醇漂洗１次，置于室温晾干。

4)PCR产物鉴定：扩增产物进行RFLP（限制性片段长度多态性分析）鉴定。

5）将RFLP产物进行CE（毛细管电泳）分析，记录电泳图谱；并构建鹿胎多重PCR-RFLP-CE DNA指纹图谱。

鹿胎多重PCR-RFLP-CE DNA指纹鉴定方法包含下述步骤：

1)先建立鹿胎多重PCR-RFLP-CE DNA标准指纹图谱，方法如下：

a.DNA提取：取鹿胎样品，按盐析法提取其DNA；

b.A上游引物1ul；A下游引物1ul；B上游引物1ul；B下游引物1ul；Taq聚合酶12.5ul；所提取DNA样品2ul；ddH₂O 6.5ul，总体积25ul。

c.PCR产物纯化：吸取稀释后的PCR产物1.0 μl注入进样板，加灭菌双蒸水9.0 μl使总体积至10 μl，离心。再加入30 μl乙醇乙酸钠，8℃、3600r/min离心30 min。弃上清液，加入50 μl 70％乙醇漂洗１次，置于室温晾干。

d.PCR产物进行RFLP（限制性片段长度多态性分析）鉴定：RFLP鉴定体系为PCR产物5μl；SmaI 2μl；ddH₂O 13ul，总体积20ul。

e.将RFLP产物进行CE（毛细管电泳）分析，记录电泳图谱；并构建鹿胎多重PCR-RFLP-CE DNA指纹图谱。

2)测定样品DNA指纹图谱：以上述相同的方法测定待测鹿胎样品，得到样品多重PCR-RFLP-CE DNA指纹图谱；

3)结果鉴定：利用相似度分析软件比较样品DNA指纹图谱与鹿胎DNA标准指纹图谱的相似度，根据相似度对鹿胎样品进行真伪鉴定。

本发明与现有技术相比，具有以下优点：

1.本发明采用多重PCR具有高灵敏度、高效率、高覆盖率等特点，能够在提高通量的同时节省样品降低成本。该方法与传统PCR相比，具有扩增效率高，产物特异性高和经济简便的优点。

2.RFLP准确度很高，该技术的基本原理是利用特定的限制性内切核酸酶切割不同样品的基因组,产物由许多大小不等的片段组成,其中数目和各个片段的长度即可反映内切酶酶切位点在上的分布情况。碱基的互换、重排、缺失等变化均可导致不同个体等位基因间的限制性内切核酸酶识别位点发生改变,造成不同个体间限制性片段长度的差异。本发明中所用限制性内切酶为SmaI,其分子量较小。鹿胎线粒体DNA的Cytb区序列存在SmaI的限制性内切酶切位点，进而产生平末端的DNA段。该技术具有高可靠性和多样性。

3.本发明采用高效毛细管电泳技术分析RFLP鉴定产物，与目前常用的聚丙烯酰胺凝胶电泳相比，高效毛细管电泳具有灵敏度高、分辨率高、分析速度快、重复性和稳定性好、样品用量小、成本低、不使用放射性同位素和剧毒试剂等优点。

4.本发明将高灵敏度、高效率、高覆盖率的多重PCR技术、高准确度的RFLP技术与高效毛细管电泳快速、分辨率高、灵敏度高的优点结合起来，并将其用于中药材鹿胎的DNA指纹图谱及指纹鉴定方法的建立，这在鹿胎鉴定的应用方面属于首创，国内外尚未见报导。

5.本发明以鹿胎对照药材的原始电泳图谱构建鹿胎DNA标准指纹图谱，不进行人为的删减或修改，保证了指纹图谱的完整性和真实性，使鉴定结果更准确和客观。

6.由于本发明PCR-RFLP-CE DNA指纹图谱以图谱的形式表示，具有直观、易懂、易比较的特点；并由于对鹿胎样品进行鉴定时采用相似度分析软件，根据相似度对鹿胎样品进行真伪鉴定，更容易实现自动化分析，大大节省人力和物力。

附图说明

图1 鹿胎多重PCR-RFLP-CE DNA标准指纹图谱。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，下面实施例仅用于说明本发明而并非对本发明的限制。

实施例 1

鹿胎毛细管电泳多重PCR-RFLP-CE DNA指纹图谱的建立

1.DNA提取

取本品0.5g，置乳钵中，充分研磨使成粉末，取0.lg置1.5 m l离心管中，加入消化液275μl，在55℃水浴保温1小时，加入裂解缓冲液250μl，混匀，加到DNA纯化柱中，离心（10000转/1分钟）3分钟；弃去过滤液，加人洗脱液 800μl，离心(10000转/1分钟）1分钟；弃去过滤液，用上述洗脱液反复洗脱 3 次，每次离心(10000转/1分钟)1分钟；弃去过滤液，再离心2分钟，将DNA 纯化柱转移人另一离心管中，加入无菌双蒸水100μl，室温放置2分钟后，离心（10000转/1分钟）2分钟，取上清液，作为供试品溶液，置-20℃保存备用。

2.PCR扩增

A上游引物1ul；A下游引物1ul；B上游引物1ul；B下游引物1ul；Taq聚合酶12.5ul；所提取DNA样品2ul；ddH₂O 6.5ul，总体积25ul。

对上述DNA进行扩增；循环参数设置为：94℃预变性5min，94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环后72℃延伸10min。

3.RFLP鉴定

RFLP鉴定体系为PCR产物5μl；SmaI 2μl；ddH₂O 13ul，总体积20ul。将此体系放置于30℃ 2h。

4.RFLP产物分析

将步骤3中的RFLP产物进行毛细管电泳分析，具体步骤如下：

4.1仪器、试剂

ABI 3130XLDNA测序仪、乙酸钠（CH₃COONa）、乙二胺四乙酸(EDTA)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、磷酸二氢钠、氢氧化钠为分析纯、灭菌双蒸水。鹿胎对照药材，市售鹿胎(吉林市各大药店随机采购随机采购)，常见伪品鹿胎(吉林市食品药品检定所鉴定并提供)。

4.2电泳条件

15 kV下3 min；电进样1.6 kV下24 s；正式毛细管电泳15 kV下25 min.

5.记录鹿胎的电泳图谱，作为鹿胎 DNA 标准指纹图谱，此标准指纹图谱可用于鹿胎样品的鉴定(见图 1)。

实施例 2

将本发明的鹿胎多重PCR-RFLP-CE DNA指纹鉴定方法用于某个鹿胎样品的鉴定

假定现有一批鹿胎样品，但不能确定是否为正品鹿胎，故按照如下方法对其进行鉴定。鹿胎DNA标准指纹图谱建立以后，要对某个样品进行鉴定时，首先用盐析法提取其线粒体DNA；用提取的DNA作为模板，进行多重PCR扩增；扩增产物进行RFLP鉴定；将RFLP产物进行CE毛细管电泳分析并记录电泳图谱，即得该批待测样品的DNA指纹图谱；利用相似度分析软件比较待测样品DNA指纹图谱与鹿胎DNA标准指纹图谱的相似度，根据相似度对待测样品进行鉴定。

鉴定结果：若二者相似度大于90％(含90％)，该批样品为正品鹿胎；若二者相似度小于90％，则这批样品为伪品。

Claims

1.一种中药材鹿胎DNA鉴定方法，其特征在于：所述方法采用多重PCR（多重聚合酶链式反应）、RFLP（限制性片段长度多态性分析）结合CE（毛细管电泳技术）建立鹿胎DNA指纹图谱及鉴定方法，可以快速准确的鉴别鹿胎样品真伪。

2.一种如权利要求1中所述中药材鹿胎DNA鉴定方法，其特征在于：

包括以下步骤：

1)DNA提取：取鹿胎样品，按盐析法提取其DNA；

2)多重PCR扩增：A上游引物1ul；A下游引物1ul；B上游引物1ul；B下游引物1ul；Taq聚合酶12.5ul；所提取DNA样品2ul；ddH2O 6.5ul，总体积25ul；

3)PCR产物纯化：吸取稀释后的PCR产物1.0 μl注入进样板，加灭菌双蒸水9.0 μl使总体积至10 μl，离心；再加入30 μl乙醇乙酸钠，8℃、3600r/min离心30 min；弃上清液，加入50 μl 70％乙醇漂洗1次，置于室温晾干；

4)PCR产物鉴定：扩增产物进行RFLP（限制性片段长度多态性分析）鉴定；

5）将RFLP产物进行CE（毛细管电泳）分析，记录电泳图谱；并构建鹿胎多重PCR-RFLP-CEDNA指纹图谱。