CN102586448B - 鹿茸毛细管电泳dna指纹图谱及鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及中药鉴定技术领域，具体为一种鹿茸毛细管电泳DNA指纹图谱及鉴定方法。鹿茸毛细管电泳DNA指纹图谱包括DNA提取、PCR扩增、PCR产物鉴定，最终构建鹿茸DNA指纹图谱；鹿茸DNA指纹鉴定方法包括鹿茸DNA标准指纹图谱的建立、样品DNA指纹图谱的建立、利用相似度软件进行结果鉴定。该指纹图谱及鉴定方法可用于鹿茸样品的鉴定。本发明能从遗传本质上对鹿茸进行真伪鉴定，鉴定方法具有简便、快速、结果可靠等优点。

Description

鹿茸毛细管电泳DNA指纹图谱及鉴定方法

技术领域

本发明涉及中药材鉴定技术，具体地说是一种鹿茸毛细管电泳DNA指纹图谱及鉴定方法。

背景技术

鹿茸为传统名贵中药材，《中国药典》(2010年版)规定其正品为鹿科动物梅花鹿Cervusnippon Temminck或马鹿Cervus elaphus Linnaeus的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角，有壮肾阳、益精血、强筋骨等功效。由于其价格昂贵、需求量大，市场上常有混伪品出现。目前，鹿茸主要依据外部形态、显微特征和理化性状等进行鉴别。虽然这些方法在一定程度上能对鹿茸的鉴别和质量评价提供依据，但需要丰富的鉴别经验，主观性较强。此外，由于鹿类中药材在干燥和制成饮片过程中性状的可塑性很大，导致理化性状鉴别效果不理想，难以满足对鹿茸鉴定的准确、快速和客观的要求。因此，为鹿茸的真伪鉴别提供一种简便实用、准确性高的方法尤为重要。

DNA指纹图谱是指具有种质特异性、能够鉴别生物个体之间差异的电泳图谱，具有特异性强、样品用量少等优点，非常适用于中药(尤其是名贵中药材)易混品种的鉴别。目前广泛应用于构建DNA指纹图谱的分子标记方法主要包括限制性内切酶酶切片段长度多态性(RFLP)分析、随机扩增DNA多态性(RAPD)分析、小卫星DNA(VNTR)技术、微卫星(SSR)技术和扩增片段长度多态性(AFLP)分析。由于RFLP、VNTR和SSR技术复杂且需要了解实验材料的遗传背景，AFLP已被申请专利保护，因此这些技术在生产和应用上均受到一定程度的限制。

而RAPD技术由于可以在没有任何分子生物学研究基础的情况下对某一物种进行DNA指纹图谱的构建和遗传多样性的研究，且多态性丰富、DNA用量少、经济简便，因而近年来在品种资源鉴定方面得到了广泛应用。目前，国内外已有利用RAPD技术构建物种DNA指纹图谱的相关研究报道，但这些研究普遍存在以下几点不足：

1.重复性和稳定性较差：许多因素均会影响RAPD分析的扩增结果，导致分析结果重复性和稳定性较差。

2.检测技术滞后：目前RAPD扩增产物分析主要采用琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳两种方法。琼脂糖凝胶电泳分辨率和灵敏度均较低，很大程度上掩盖了扩增产物的多态性，并且DNA的用量较大，使用的染料毒性也较大。聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率和灵敏度均较高，但操作繁琐(包括组装、灌胶、电泳、卸胶、染色等步骤)、耗时(整个过程需要几小时到几天)，使分析效率较低。因此，目前常用的检测技术尚不能满足RAPD扩增产物分析需要的高分辨率、高灵敏度、简便、快速等要求，缺乏合适的检测手段已严重制约了RAPD技术在构建物种DNA指纹图谱方面的应用。

3.鉴定方法不合理：目前利用RAPD技术对物种进行鉴定时，通常是在电泳图谱中选择部分具有代表性的扩增条带，根据这些条带的有、无进行鉴定。这种方法虽然使结果分析变得简单，但却降低了扩增产物的多态性，增加了假阳性结果出现的几率。而且人为的选择部分扩增条带而舍弃其它条带，还降低了分析结果的客观性。此外，这种鉴定方法只能反映扩增条带的有无，不能反映扩增条带强弱的区别。

由于上述原因，目前利用RAPD技术构建物种DNA指纹图谱及进行物种鉴定的相关报道只有理论研究意义，尚不能进行实际应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种鹿茸毛细管电泳DNA指纹图谱及鉴定方法，以解决现有技术的缺陷。本方法分辨率高、灵敏度高、操作简便、快速、安全、结果准确，能够用于鹿茸样品的鉴定。

本发明的目的是由以下技术方案来实现的：

一种鹿茸毛细管电泳DNA指纹图谱的建立方法，其特征是，它包含下述步骤：

1)DNA提取：取鹿茸片，按盐析法提取其线粒体DNA；

2)PCR扩增：对10-mer引物进行筛选，应用300对引物，对上述DNA进行扩增；

3)PCR产物鉴定：扩增产物进行毛细管电泳分析，记录电泳图谱；

4)鹿茸DNA指纹图谱的建立：根据电泳图谱中各引物的扩增情况，选择有代表性的多态性RAPD电泳图谱构建鹿茸DNA指纹图谱。

一种鹿茸DNA指纹鉴定方法，其特征是，它包含下述步骤：

1)先建立鹿茸DNA标准指纹图谱，方法如下：

(a)DNA提取：取鹿茸对照药材，按盐析法提取其线粒体DNA；

(b)PCR扩增：对10-mer引物进行筛选，应用300对引物，对上述DNA进行扩增；

(c)PCR产物鉴定：扩增产物进行毛细管电泳分析，记录电泳图谱；

(d)鹿茸DNA标准指纹图谱的建立：根据电泳图谱中各引物的扩增情况，选择有代表性的多态性RAPD电泳图谱构建鹿茸DNA标准指纹图谱；

2)测定样品DNA指纹图谱：以上述相同的方法测定待测鹿茸样品，得样品DNA指纹图谱；

3)结果鉴定：利用相似度分析软件比较样品DNA指纹图谱与鹿茸DNA标准指纹图谱的相似度，根据相似度对鹿茸样品进行真伪鉴定。

本发明与现有技术相比，具有以下优点：

1.本发明将RAPD技术简便易行、信息量大的特点和高效毛细管电泳快速、分辨率高、灵敏度高的特点结合起来，并将其用于中药材鹿茸的DNA指纹图谱及指纹鉴定方法的建立，这在鹿茸鉴定的应用方面属于首创。

2.本发明采用高效毛细管电泳技术分析RAPD扩增产物，与目前常用的琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳相比，高效毛细管电泳具有灵敏度高、分辨率高、分析速度快、重复性和稳定性好、样品用量小、成本低、不使用放射性同位素和剧毒试剂等优点。该方法克服了琼脂糖凝胶电泳分辨率和灵敏度低、DNA用量大的缺点和聚丙烯酰胺凝胶电泳操作繁琐、耗时长的缺点，是一种更适合于RAPD扩增产物分析的检测技术。

3.本发明以鹿茸对照药材的原始电泳图谱构建鹿茸DNA标准指纹图谱，不进行人为的删减或修改，保证了指纹图谱的完整性，使鉴定结果更准确和客观。

4.由于本发明DNA指纹图谱以图的形式表示，看起来比较直观、易懂；并由于对样品进行鉴定时利用相似度分析软件，根据相似度对鹿茸样品进行真伪鉴定，更容易实现自动化分析。

附图说明

图1鹿茸(梅花鹿)DNA标准指纹图谱

图2鹿茸(马鹿)DNA标准指纹图谱

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，下面实施例仅用于说明本发明而并非对本发明的限制。

实施例1

鹿茸毛细管电泳DNA指纹图谱的建立

1.DNA提取

取鹿茸片，用70％的酒精清洗3min，放在37℃烘箱中使酒精挥发，研磨成粉末，称0.1g细粉放入离心管中，加入500μL裂解液，15μL蛋白酶K(20mg/ml)和30μL 10％SDS，56℃水浴震荡过夜；取出加500μL饱和乙酸钠，振动10min，11000r/min离心10min，去沉淀，取上清再离心一次，然后取上清加等体积异丙醇，混匀，-20℃放置1h；取出配平，12000r/min离心10min，去上清留沉淀，干燥，沉淀中加入500μL 70％乙醇，10000r/min离心10min，去上清留沉淀，干燥；将提取的DNA用80μL双蒸水溶解，-20℃保存。

2.PCR扩增

用梅花鹿茸做模板对300个OPERON公司的10-mer引物进行筛选，从中选出15个扩增稳定、多态性丰富的引物，再分别对鹿茸样品进行扩增。

PCR反应体系为：10×PCR buffer(含Mg²⁺)3μl、dNTPs 2.4μl、引物1μl、0.2μg Taq DNA聚合酶、0.5μg DNA模板。

循环参数设置为：94℃预变性5min，94℃变性80sec，36℃退火1min，72℃延伸2min，45个循环后72℃延伸10min。首次循环95℃变性3min，4℃保存。

3.PCR产物鉴定

将步骤2中的PCR扩增产物进行毛细管电泳分析，具体步骤如下：

3.1仪器、试剂

安捷伦毛细管电泳系统(Agilent HP 3D/CE)；安捷伦DAD检测器(Agilent diode-arraydetector)；安捷伦化学工作站(Agilent ChemStation software package)。

羟丙基甲基纤维素(HPMC)、四丁基磷酸铵(TBAP)为色谱纯、乙二胺四乙酸(EDTA)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、磷酸二氢钠、氢氧化钠为分析纯、去离子水。梅花鹿鹿茸对照药材(吉林市鹿场提供并经吉林市药检所鉴定)，马鹿鹿茸对照药材(吉林市药检所提供并鉴定)，市售鹿茸(吉林市参茸市场随机采购)，常见伪品鹿茸(吉林市药检所和中国农科院左家特产研究所提供并经吉林市药检所鉴定)。

3.2样品处理

取上述PCR扩增产物10μl，用电泳缓冲液稀释10倍，经0.45μm微孔滤膜过滤，滤液作为供试品溶液。

3.3电泳条件

色谱柱：50cm×75μm，有效长度40cm的未涂层石英毛细管柱(河北永年锐沣色谱器件有限公司)；

电泳缓冲液：20mM磷酸盐缓冲液(pH 7.3)-15mM TBAP-2mM EDTA-1％(w/v)HPMC；

分离电压：-8KV；温度：25℃；检测波长；260nm；

进样条件：电动进样，-10kV，15S。

4.鹿茸DNA指纹图谱的建立

根据步骤3所得电泳图谱中各样品各引物的扩增情况，挑选具有代表性(稳定性和重复性良好、样品峰数量适中、分离度好、分析时间短且各样品彼此区别明显)的电泳图谱，构建鹿茸DNA指纹图谱。梅花鹿茸、马鹿茸及常见伪品鹿茸均有其特异的DNA指纹图谱，可以把它们彼此区分开。分别记录梅花鹿茸和马鹿茸的电泳图谱，作为鹿茸DNA标准指纹图谱，此标准指纹图谱可用于鹿茸样品的鉴定(见图1、图2)。

实施例2

将本发明的鹿茸DNA指纹鉴定方法用于某个鹿茸样品的鉴定

假设现有一批鹿茸样品不能确定是否是真正的梅花鹿茸，因此，按照如下方法对它进行鉴定。

鹿茸DNA标准指纹图谱建立以后，要对某个样品进行鉴定时，首先用盐析法提取其线粒体DNA；用提取的DNA作为模板，用筛选出的引物对其进行PCR扩增；扩增产物进行毛细管电泳分析并记录电泳图谱，即得该批待测样品的DNA指纹图谱；利用相似度分析软件比较待测样品DNA指纹图谱与梅花鹿茸DNA标准指纹图谱的相似度，根据相似度对待测样品进行鉴定。

鉴定结果：若二者相似度大于95％(含95％)，这批样品就是真正的梅花鹿茸；若二者相似度小于95％，那么这批样品就不是真正的梅花鹿茸。

实施例3

将本发明的鹿茸DNA指纹鉴定方法用于某个鹿茸样品的鉴定

假设现有一批鹿茸样品不能确定是否是真正的马鹿茸，因此，按照本发明的方法构建这批样品的DNA指纹图谱，然后利用相似度分析软件比较待测样品DNA指纹图谱与马鹿茸DNA标准指纹图谱的相似度，根据相似度对待测样品进行鉴定。

鉴定结果：若二者相似度大于95％(含95％)，这批样品就是真正的马鹿茸；若二者相似度小于95％，那么这批样品就不是真正的马鹿茸。

Claims (3)

1.一种鹿茸毛细管电泳DNA指纹图谱的建立方法，其特征是，它包含下述步骤：

1)DNA提取：取鹿茸片，按盐析法提取其线粒体DNA；

2)PCR扩增：对10-mer引物进行筛选，应用300对引物，对上述DNA进行扩增；

3)PCR产物鉴定：扩增产物进行毛细管电泳分析，记录电泳图谱，电泳条件如下：

色谱柱：50cm×75μm，有效长度40cm的未涂层石英毛细管柱；

电泳缓冲液：20mM磷酸盐缓冲液-15mM四丁基磷酸铵-2mM乙二胺四乙酸-1％(w/v)羟丙基甲基纤维素，所述磷酸盐缓冲液的pH值为7.3；

分离电压：-8kV；温度：25℃；检测波长：260nm；

进样条件：电动进样，-10kV，15S；

4)鹿茸DNA指纹图谱的建立：根据电泳图谱中各引物的扩增情况，选择有代表性的多态性RAPD电泳图谱构建鹿茸DNA指纹图谱。

2.一种鹿茸DNA指纹鉴定方法，其特征是，它包含下述步骤：

1)先建立鹿茸DNA标准指纹图谱，步骤如下：

(a)DNA提取：取鹿茸对照药材，按盐析法提取其线粒体DNA；

(b)PCR扩增：对10-mer引物进行筛选，应用300对引物，对上述DNA进行扩增；

(c)PCR产物鉴定：扩增产物进行毛细管电泳分析，记录电泳图谱，电泳条件如下：

色谱柱：50cm×75μm，有效长度40cm的未涂层石英毛细管柱；

电泳缓冲液：20mM磷酸盐缓冲液-15mM四丁基磷酸铵-2mM乙二胺四乙酸-1％(w/v)羟丙基甲基纤维素，所述磷酸盐缓冲液的pH值为7.3；

分离电压：-8kV；温度：25℃；检测波长：260nm；

进样条件：电动进样，-10kV，15S；

(d)鹿茸DNA标准指纹图谱的建立：根据电泳图谱中各引物的扩增情况，选择有代表性的多态性RAPD电泳图谱构建鹿茸DNA标准指纹图谱；

2)测定样品DNA指纹图谱：按照建立鹿茸DNA标准指纹图谱的步骤测定待测鹿茸样品，得样品DNA指纹图谱；

3)结果鉴定：利用相似度分析软件比较样品DNA指纹图谱与鹿茸DNA标准指纹图谱的相似度，根据相似度对鹿茸样品进行真伪鉴定。

3.如权利要求2所述的鹿茸DNA指纹鉴定方法，其特征是，所述鹿茸DNA标准指纹图谱为梅花鹿鹿茸DNA指纹图谱或马鹿鹿茸DNA指纹图谱。