CN108152382A - 鹿茸极薄片hplc标准指纹图谱及其构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了鹿茸极薄片HPLC标准指纹图谱及其构建方法，该构建方法，包括供试品溶液和对照品溶液的制备，采用线性梯度洗脱，流动相A为0.144％三氟乙酸水溶液，流动相B为0.1％三氟乙酸乙腈溶液；流速：0.8‑1.0mL/min；检测波长：265‑275nm，以高效液相色谱法进行测定，得鹿茸极薄片标准指纹图谱，该指纹图谱中有20个共有特征峰，其中3号峰为尿嘧啶，13号峰为腺苷，16号峰为酪氨酸。本发明方法及标准指纹图谱能全面、准确评价鹿茸极薄片的整体质量，有利于保证鹿茸极薄片的质量及药效。

Description

鹿茸极薄片HPLC标准指纹图谱及其构建方法
技术领域
本发明属于中药分析技术领域，特别是涉及一种测定鹿茸极薄片的高效液相色谱特征指纹图谱的方法。
背景技术
鹿茸为鹿科动物梅花鹿Cervus nippon Temminck或马鹿Cervus elaphusLinnaeus的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角，具壮肾阳，益精血，强筋骨，调冲任，托疮毒的功效，是中医治病保健的常用补益药材。
鹿茸极薄片为岭南地区的常用中药饮片，在广东鹿茸饮片市场上占主导地位。该饮片酒润及蒸制包扎的炮制工艺，为岭南地区炮制技术特色，历史较为悠久，已被纳入“岭南中药文化遗产”保护目录，并被收录于《广东省中药饮片炮制规范》“鹿茸片(薄片)”项下。鹿茸极薄片具有厚度为0.06～0.1mm的极薄片的外观性状特征。
鹿茸极薄片的性状和炮制加工方法都与《中国药典》收载的鹿茸片有较大的区别，具有一定炮制特色，但该特色炮制工艺现仍处于较为粗糙的状况，缺乏规范性和生产技术标准。而在质量标准方面，主要以《广东省中药饮片炮制规范》(2011版)第二册中“鹿茸片(薄片)”项下的质量标准为依据的，但该标准的性状鉴定内容不够具体，且缺乏相应的显微鉴别方法和指标成分含量测定，处于较不完善的状态，无法对岭南特色鹿茸极薄片进行完善的质量评价。
在指纹图谱方面，鹿茸已有不少研究。阎正等建立了鹿茸的毛细管电泳指纹图谱，并通过不同产地及种类保健品鹿茸指纹图谱的比较分析得出，多批样品的指纹图谱有2个峰为共有峰，不同产地的鹿茸有显著性差异，表明鹿茸的主要化学成分因产地不同有较大差异。周杰建立了鹿茸11批次样品的蛋白指纹图谱，发现梅花鹿茸比马鹿茸所含的主要成分含量高，鹿茸样品中所含蛋白成分相对稳定，但含量差别较大。武文等建立了鹿茸的柱前衍生化高效液相指纹图谱，为科学地评价及有效控制鹿茸质量提供了有效可靠的方法，该方法采用2， 4-二硝基氟苯(DNFB)为衍生化试剂对鹿茸药材进行处理，高效液相色谱条件为PhenomenexR Luna 5u C18(2)100R(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱，甲醇-醋酸钠缓冲液梯度洗脱，流速1. 0mL/min，柱温20℃，检测波长360nm。现有的鹿茸特征图谱是以《药典》中的炮制方法作为参考的，而岭南特色炮制的鹿茸极薄片并没有相对应的指纹图谱。
鹿茸中化学成分比较复杂，单一化学成分的含量测定难以评价其质量。目前鹿茸已有柱前衍生化高效液相等色谱指纹图谱的报道，但未见国内外有鹿茸极薄片指纹图谱的报道。
发明内容
本发明在继承的基础上对鹿茸片揭示了其主要成分特点，建立了鹿茸极薄片指纹图谱，并与《中国药典》2015年版一部的炮制的鹿茸片特征图谱进行比较，分析探讨其异同，阐述鹿茸极薄饮片之岭南特色，使鹿茸片质量可控、稳定、安全有效，更全面地反映鹿茸极薄片内在的质量。
本发明的目的在于提供一种鹿茸极薄片的指纹图谱及其构建方法。
本发明所采取的技术方案是：
鹿茸极薄片HPLC标准指纹图谱，该指纹图谱中有20个共有特征峰，分别记为1号峰～ 20号峰，其相对保留时间依次分别为：0.354min、0.900～0.901min、1.000min、1.140～1.145min、 1.487～1.490min、1.649～1.653min、1.770～1.774min、2.065～2.071min、2.210～2.216min、 2.584～2.593min、2.736～2.767min、2.921～2.949min、3.048～3.071min、3.253～3.272min、 3.438～3.458min、3.632～3.646min、3.704～3.720min、4.075～4.083min、4.956～4.965min、 5.045～5.055min。
进一步的，3号峰为尿嘧啶，13号峰为腺苷，16号峰为酪氨酸。
鹿茸极薄片HPLC标准指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：
1)制备鹿茸极薄片供试品溶液；
2)制备对照品溶液：精密称取尿嘧啶、腺苷、酪氨酸，盐酸水溶液溶解，分别制成浓度已知的对照品溶液；
3)鹿茸极薄片的HPLC指纹图谱的建立：分别吸取对照品溶液和供试品溶液，进样，用高效液相色谱仪测定，线性梯度洗脱程序如下：
0～10min，流动相A：100％→100％，流动相B：0％→0％；
10～25min，流动相A：100％→95％，流动相B：0％→5％；
25～30min，流动相A：95％→90％，流动相B：5％→10％；
30～50min，流动相A：90％→60％，流动相B：10％→40％；
50～55min，流动相A：60％→45％，流动相B：40％→55％；
55～65min，流动相A：45％→20％，流动相B：55％→80％；
65～70min，流动相A：20％→0％，流动相B：80％→100％；
70～75min，流动相A：0％→0％，流动相B：100％→100％；
4)鹿茸极薄片HPLC的标准指纹图谱：测定至少8批鹿茸极薄片样品供试品溶液的指纹图谱，由各指纹图谱中共有特征峰构成的指纹图谱为鹿茸极薄片HPLC的标准指纹图谱。
进一步的，步骤1)中制备鹿茸极薄片供试品溶液的具体操作为：取鹿茸极薄片样品粉碎，精密称取，加入0.08～0.12mol/L盐酸，使鹿茸极薄片的浓度为0.3～0.5g/mL，超声提取，放冷补重，离心，取上清，微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。
进一步的，所述超声提取的频率为230-260W，时间为1-2h。
进一步的，所述离心的转速为2500～3500rpm，离心时间为10～30min。
进一步的，步骤2)中，对照品溶液中尿嘧啶的浓度为10-30μg/ml、腺苷的浓度为10-30 μg/ml、酪氨酸的浓度为30-90μg/ml。
进一步的，步骤2)中，对照品溶液中尿嘧啶的浓度为15μg/ml、腺苷的浓度为20μg/ml、酪氨酸的浓度为48μg/ml。
进一步的，步骤3)中，高效液相色谱仪进行测定时的条件为：流动相A为0.144％三氟乙酸水溶液，流动相B为0.1％三氟乙酸乙腈溶液；流速：0.8-1.0mL/min；检测波长：265-275nm；柱温30-35℃；进样量25-30μL。
本发明的有益效果是：
(1)本发明的鹿茸极薄片的高效液相色谱特征指纹图谱有20个共有峰，共有峰的面积占总峰面积为98％以上，相似度在92％以上，该方法结果具有特征性，能全面检测出鹿茸极薄片中的主要有效成分，更有效的对药材进行质量监控。
(2)本发明应用尿嘧啶、腺苷、酪氨酸三个对照品溶液为主要检测指标，再加上以0.1mol/L盐酸水溶液为阴性对照品溶液，能有效检测洗脱过程中的杂峰，能够对鹿茸极薄片中进行精确的计算；令所得得到结果更加准确，精密度更高，且节约试剂。
(3)本发明方法操作简便、稳定、重复性好，能够对鹿茸极薄片进行更加完善的质量评价。所述检测方法可快速准确地鉴定出鹿茸极薄片，还可以区分鹿茸极薄片与其他鹿茸极薄片；该方法结果准确，精密度高，且节约试剂。
(4)本发明方法操作相比与已有的鹿茸薄片的检测操作而言，更加的简便、更加稳定、重复性更好，同时能够对鹿茸极薄片进行更加完善的质量评价。所述检测方法可快速准确地鉴定出鹿茸极薄片，还可以通过有效成分的含量区分鹿茸岭南特色饮片与其他鹿茸薄片。本发明将现有的鹿茸饮片指纹图谱进行了补充，确定了鹿茸岭南特色饮片具有的特征性，确立了鹿茸岭南特色饮片具体可行的检测方法，令其质量检测有据可依，可以全面检测出鹿茸极薄片中的主要有效成分，为鹿茸岭南特色饮片质量综合评价提供了一个参考标准，更有效地对鹿茸极薄片的质量进行监控。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1鹿茸极薄片HPLC标准指纹图谱及其构建方法
试剂：甘氨酸(批号：140689-201103，中国食品药品检定所提供)、水合茚三酮(AR天津市大茂化学试剂厂)、5-磺基水杨酸(AR天津市福晨化学试剂厂)、柠檬酸(AR天津市百世华工有限公司)、柠檬酸钠(AR天津市百世华工有限公司)和氢氧化钠(AR广州市化学试剂厂)。
对照品尿嘧啶(本实验室自制，高效液相色谱归一法确定其纯度为98％)、腺苷(110879-200202,中国药品制品检定所)、酪氨酸(140624-200805,中国药品生物制品检定所)。
高效液相色谱仪(LC-15C pump,SIL-10AF auto sampler,SPD-15C Essentia uv/vis DETECTOR)。
不同产地的鹿茸片饮片共15批，均由广州中医药大学高明副教授鉴定均为鹿科动物梅花鹿Cervus nippon Temminck或马鹿Cervus elaphus Linnaeus的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角所炮制加工而成的饮片。
表1.鹿茸饮片来源
方法：
(1)供试品溶液的制备
取表1中各鹿茸样品粉碎过80目筛，精密称定粉末1g，置100mL具塞三角锥形瓶中，分别加入0.1mol/L盐酸25mL，称重，240W超声提取1h，放冷补重，3000r/min离心10～15min，取上清液用0.45μm微孔滤膜滤过即可。
阴性对照供试品溶液：取0.1mol/L盐酸水溶液用0.45μm微孔滤膜滤过即可。
(2)对照品溶液的制备
分别取尿嘧啶、腺苷、酪氨酸对照品适量，精密称定，置100ml量瓶中，用0.1mol/L盐酸水溶液配成每毫升分别含尿嘧啶0.157mg，腺苷0.0113mg，酪氨酸0.0602mg的对照品贮备液。分别精密吸取各对照品贮备液1mL置10mL容量瓶中加入0.1mol/L盐酸定容至刻度即可。
(3)鹿茸极薄片HPLC处理：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液，分别进样25μl，用高效液相色谱仪测定，色谱柱：GRACE PrevailTM C18柱(250×4.6mm 5μm)；检测波长：270nm；柱温32℃；流速：0.9mL/min；进样量25μL，流动相A为0.144％三氟乙酸水溶液，流动相B为0.1％三氟乙酸乙腈溶液；线性梯度洗脱程序如下：
0～10min，流动相A：100％→100％，流动相B：0％→0％；
10～25min，流动相A：100％→95％，流动相B：0％→5％；
25～30min，流动相A：95％→90％，流动相B：5％→10％；
30～50min，流动相A：90％→60％，流动相B：10％→40％；
50～55min，流动相A：60％→45％，流动相B：40％→55％；
55～65min，流动相A：45％→20％，流动相B：55％→80％；
65～70min，流动相A：20％→0％，流动相B：80％→100％；
70～75min，流动相A：0％→0％，流动相B：100％→100％。
(4)鹿茸极薄片HPLC的标准指纹图谱：记录HPLC色谱图，采用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似性评价系统软件(2.0版)进行分析，比较供试品的指纹图谱和对照品的指纹图谱，确定各主要药材成分的色谱峰，生成共有模式指纹图谱，有20个共有峰，共有峰面积占总峰面积的98.7％，以尿嘧啶对照品相应色谱峰为参照峰，计算各色谱峰的相对保留时间，见表2(其20个共有峰，经指认3号峰为尿嘧啶，13号峰为腺苷，16号峰为酪氨酸)，即为鹿茸极薄片HPLC的标准指纹图谱。
表2.鹿茸极薄片指纹图谱共有峰相对保留时间(min)
根据以上结果，鹿茸极薄片HPLC的标准指纹图谱中有20个共有特征峰，分别记为1号峰～20号峰，其相对保留时间依次分别为：0.354min、0.900～0.901min、1.000min、1.140～ 1.145min、1.487～1.490min、1.649～1.653min、1.770～1.774min、2.065～2.071min、2.210～2.216 min、2.584～2.593min、2.736～2.767min、2.921～2.949min、3.048～3.071min、3.253～3.272min、 3.438～3.458min、3.632～3.646min、3.704～3.720min、4.075～4.083min、4.956～4.965min、 5.045～5.055min。其中3号峰为尿嘧啶，13号峰为腺苷，16号峰为酪氨酸。
实施例2专属性实验
取表1中J号鹿茸饮片，按实施例1所述的方法，另取阴性、尿嘧啶、腺苷、酪氨酸及其对混合对照品溶液进行色谱条件分析，结果表明该方法专属性良好，且色谱显示在分析时间55min后的色谱峰皆为溶剂峰，可剪切去除进行分析。
实施例3精密度检测
取表1中J号鹿茸饮片样品制备的供试品溶液连续进样5次，将测定图谱以中药色谱指纹图谱相似性评价系统软件进行分析(多点校正，中位数法)，结果相似度均为1.000，以尿嘧啶为参照峰，各色谱峰的相对保留时间的RSD小于0.30％，相对峰面积的RSD小于2.0％，表示仪器稳定，精密度良好
实施例4稳定性检测
取表1中J号鹿茸饮片样品制备的供试品溶液，分别在0,6,12,18,24h各进样1次，将测定图谱以中药色谱指纹图谱相似性评价系统软件进行分析(多点校正，中位数法)，结果相似度均为1.000，以尿嘧啶为参照峰，各色谱峰的相对保留时间的RSD小于0.33％，相对峰面积的RSD小于3.0％，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。
实施例5重复性检测
取表1中J号鹿茸饮片样品分别制备6份的供试品溶液，各进样1次，将测定图谱以中药色谱指纹图谱相似性评价系统软件进行分析(多点校正，中位数法)，结果相似度均为1.000，以尿嘧啶为参照峰，各色谱峰的相对保留时间的RSD小于0.30％，相对峰面积的RSD小于 3.0％，表明本发明方法重复性良好。
实施例6相似度评价
采用公认的国家药典委员会所颁布的指纹图谱相似度评价系统软件对所获得的鹿茸极薄片指纹图谱进行处理，结果见表3。
表3.10批鹿茸极薄片指纹图谱相似度
评价结果显示10批样品有较好的相似性，相似度均在0.930以上。结果提示不同购买地不同规格的鹿茸极薄片存在一定差异，但差异不大。
实施例7鹿茸极薄片指纹图谱与鹿茸片(药典)高效图谱的比较分析
鹿茸极薄片共性指纹图谱与5批鹿茸片(药典)液相图谱的相似度分析，结果见表4。
表4鹿茸极薄片与5批鹿茸片(药典)高效液相图谱相似度
评价结果显示5批鹿茸片样品的相似度存在一定差异，与鹿茸极薄片指纹图谱比较均在 0.918以下，提示不同购买地不同规格的鹿茸极薄片存在一定差异，但成分种类基本一致，只是部分成分含量存在差异。
实施例8鹿茸极薄片HPLC标准指纹图谱的构建方法
(1)供试品溶液的制备：取鹿茸片样品粉碎过80目筛，精密称定约1g，置于100mL具塞三角锥形瓶中，分别加入0.1mol/L盐酸30mL，称重，240W超声提取1h，放冷补重，3000r/min离心10min，取上清液用0.45μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液；
(2)对照品溶液的制备：精密称量尿嘧啶、腺苷、酪氨酸对照品，加0.1mol/L盐酸水溶液溶解，作为对照品溶液，所述对照品溶液中尿嘧啶的浓度为15μg/ml、腺苷的浓度为20μg/ml、酪氨酸的浓度为48μg/ml。
(3)分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪中，测定，得鹿茸片的指纹图谱(其20个共有峰。经指认3号峰为尿嘧啶，13号峰为腺苷，16号峰为酪氨酸)；
色谱条件为：色谱柱：GRACE PrevailTM C18柱(250×4.6mm 5μm)；检测器：紫外检测器，流速为：0.9mL/min；检测波长：271nm；柱温31℃；进样量28μL；流动相A为0.144％三氟乙酸水溶液，流动相B为0.1％三氟乙酸乙腈溶液；梯度洗脱程序为：
0～10min，流动相A：100％→100％，流动相B：0％→0％；
10～25min，流动相A：100％→96％，流动相B：0％→4％；
25～30min，流动相A：96％→89％，流动相B：4％→11％；
30～50min，流动相A：89％→59％，流动相B：11％→41％；
50～55min，流动相A：59％→45％，流动相B：41％→55％；
55～65min，流动相A：45％→19％，流动相B：55％→81％；
65～70min，流动相A：19％→0％，流动相B：81％→100％；
70～75min，流动相A：0％→0％，流动相B：100％→100％。
实施例9鹿茸极薄片HPLC标准指纹图谱的构建方法
(1)供试品溶液的制备：取鹿茸片样品粉碎过100目筛，精密称定约1g，置于100mL具塞三角锥形瓶中，分别加入0.1mol/L盐酸28mL，称重，220W超声提取2h，放冷补重，3000r/min离心25min，取上清液用0.45μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液；
(2)对照品溶液的制备：精密称量尿嘧啶、腺苷、酪氨酸对照品，加0.1mol/L盐酸水溶液溶解，作为对照品溶液，所述对照品溶液中尿嘧啶的浓度为30μg/ml、腺苷的浓度为25μg/ml、酪氨酸的浓度为90μg/ml。
(3)分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪中，测定，得鹿茸片的指纹图谱(其20个共有峰。经指认3号峰为尿嘧啶，13号峰为腺苷，16号峰为酪氨酸)；
色谱条件为：色谱柱：GRACE PrevailTM C18柱(250×4.6mm 5μm)；检测器：紫外检测器，流速为：1.0mL/min；检测波长：273nm；柱温32℃；进样量30μL；流动相A为0.144％三氟乙酸水溶液，流动相B为0.1％三氟乙酸乙腈溶液；梯度洗脱程序为：
0～10min，流动相A：100％→100％，流动相B：0％→0％；
10～25min，流动相A：100％→97％，流动相B：0％→3％；
25～30min，流动相A：97％→90％，流动相B：3％→10％；
30～50min，流动相A：90％→58％，流动相B：10％→42％；
50～55min，流动相A：58％→43％，流动相B：42％→57％；
55～65min，流动相A：43％→19％，流动相B：57％→81％；
65～70min，流动相A：19％→0％，流动相B：80％→100％；
70～75min，流动相A：0％→0％，流动相B：100％→100％。
实施例10鹿茸极薄片HPLC标准指纹图谱的构建方法
(1)供试品溶液的制备：取鹿茸片样品粉碎过80目筛，精密称定约1g，置于100mL具塞三角锥形瓶中，分别加入0.1mol/L盐酸25mL，称重，260W超声提取1h，放冷补重，3000r/min离心15min，取上清液用0.45μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液；
(2)对照品溶液的制备：精密称量尿嘧啶、腺苷、酪氨酸对照品，加0.1mol/L盐酸水溶液溶解，作为对照品溶液，所述对照品溶液中尿嘧啶的浓度为20μg/ml、腺苷的浓度为30μg/ml、酪氨酸的浓度为80μg/ml。
(3)分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪中，测定，得鹿茸片的指纹图谱(其20个共有峰。经指认3号峰为尿嘧啶，13号峰为腺苷，16号峰为酪氨酸)；
色谱条件为：色谱柱：GRACE PrevailTM C18柱(250×4.6mm 5μm)；检测器：紫外检测器，流速为：0.9mL/min；检测波长：270nm；柱温32℃；进样量25μL；流动相A为0.144％三氟乙酸水溶液，流动相B为0.1％三氟乙酸乙腈溶液；梯度洗脱程序为：
0～10min，流动相A：100％→100％，流动相B：0％→0％；
10～25min，流动相A：100％→95％，流动相B：0％→5％；
25～30min，流动相A：95％→90％，流动相B：5％→10％；
30～50min，流动相A：90％→60％，流动相B：10％→40％；
50～55min，流动相A：60％→45％，流动相B：40％→55％；
55～65min，流动相A：45％→20％，流动相B：55％→80％；
65～70min，流动相A：20％→0％，流动相B：80％→100％；
70～75min，流动相A：0％→0％，流动相B：100％→100％。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.鹿茸极薄片HPLC标准指纹图谱，其特征在于，该指纹图谱中有20个共有特征峰，分别记为1号峰～20号峰，其相对保留时间依次分别为：0.354min、0.900～0.901min、1.000min、1.140～1.145min、1.487～1.490min、1.649～1.653min、1.770～1.774min、2.065～2.071min、2.210～2.216min、2.584～2.593min、2.736～2.767min、2.921～2.949min、3.048～3.071min、3.253～3.272min、3.438～3.458min、3.632～3.646min、3.704～3.720min、4.075～4.083min、4.956～4.965min、5.045～5.055min。
2.根据权利要求1所述的鹿茸极薄片HPLC标准指纹图谱，其特征在于，3号峰为尿嘧啶，13号峰为腺苷，16号峰为酪氨酸。
3.权利要求1～2任一所述鹿茸极薄片HPLC标准指纹图谱的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)制备鹿茸极薄片供试品溶液；
2)制备对照品溶液：精密称取尿嘧啶、腺苷、酪氨酸，盐酸水溶液溶解，分别制成浓度已知的对照品溶液；
3)鹿茸极薄片的HPLC指纹图谱的建立：分别吸取对照品溶液和供试品溶液，进样，用高效液相色谱仪测定，线性梯度洗脱程序如下：
0～10min，流动相A：100％→100％，流动相B：0％→0％；
10～25min，流动相A：100％→95％，流动相B：0％→5％；
25～30min，流动相A：95％→90％，流动相B：5％→10％；
30～50min，流动相A：90％→60％，流动相B：10％→40％；
50～55min，流动相A：60％→45％，流动相B：40％→55％；
55～65min，流动相A：45％→20％，流动相B：55％→80％；
65～70min，流动相A：20％→0％，流动相B：80％→100％；
70～75min，流动相A：0％→0％，流动相B：100％→100％；
4)鹿茸极薄片HPLC的标准指纹图谱：测定至少8批鹿茸极薄片样品供试品溶液的指纹图谱，由各指纹图谱中共有特征峰构成的指纹图谱为鹿茸极薄片HPLC的标准指纹图谱。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：步骤1)中制备鹿茸极薄片供试品溶液的具体操作为：取鹿茸极薄片样品粉碎，精密称取，加入0.08～0.12mol/L盐酸，使鹿茸极薄片的浓度为0.3～0.5g/mL，超声提取，放冷补重，离心，取上清，微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于：所述超声提取的频率为230-260W，时间为1-2h。
6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于：所述离心的转速为2500～3500rpm，离心时间为10～30min。
7.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：步骤2)中，对照品溶液中尿嘧啶的浓度为10-30μg/ml、腺苷的浓度为10-30μg/ml、酪氨酸的浓度为30-90μg/ml。
8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于：步骤2)中，对照品溶液中尿嘧啶的浓度为15μg/ml、腺苷的浓度为20μg/ml、酪氨酸的浓度为48μg/ml。
9.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：步骤3)中，高效液相色谱仪进行测定时的条件为：流动相A为0.144％三氟乙酸水溶液，流动相B为0.1％三氟乙酸乙腈溶液；流速：0.8-1.0mL/min；检测波长：265-275nm；柱温30-35℃；进样量25-30μL。
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