CN105238855A - 鹿茸dna鉴定试剂盒及鉴定方法 - Google Patents

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    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Abstract

本发明涉及中药鉴定技术领域，具体为一种鹿茸DNA检测试剂盒及鉴定方法。它包括：鹿茸线粒体DNA提取体系、PCR反应体系和结果观察体系三部分。鹿茸DNA鉴定方法包括线粒体DNA提取、PCR引物设计与合成、建立PCR反应程序及结果判定等步骤。本发明建立的多重PCR鉴定方法具有简便、快速、检测结果可靠等优点，能够准确地同时鉴别鹿茸和伪品。

Description

鹿茸DNA鉴定试剂盒及鉴定方法
技术领域
本发明涉及使用生物技术快速鉴定鹿茸（梅花鹿和马鹿）与其易混品种DNA鉴定试剂盒及鉴定方法。
背景技术
鹿茸为脊索动物门哺乳纲鹿科动物中雄鹿密生绒毛的幼角，我国有鹿科动物9属16种，每个种又有不同的亚种，《中华人民共和国药典》（2010年版）中规定仅梅花鹿（Cervusnippon）和马鹿（Cervuselaphus）的鹿茸为正品药材。梅花鹿茸主要产于吉林、辽宁等省，马鹿茸主要产于黑龙江、吉林、内蒙古、新疆、云南、甘肃等地。
鹿茸中的化学成分比较复杂，含氨基酸19种以上、磷脂成分10种、脂肪酸9种、糖脂、糖，固醇类、激素样物质、前列腺素、脑素、核糖核酸、去氧核糖核酸、三磷酸腺苷、硫酸软骨素、多胺、肽类、脂蛋白、维生素、酶类及各种微量元素等，其中明显有药理活性的组分主要是蛋白多肽类、甾体类和多胺类化合物。丰富的成分使鹿茸的药用价值很高，鹿茸入药已有2000多年的历史，始载于汉代的《神农本草经》。其后在历代本草中对鹿茸的药用均有收载，《本草纲目》记载：“生精补髓，养血益阴，强健筋骨。性味甘、咸、温。主治虚劳赢瘦、腰膝酸痛、心悸耳鸣、阳萎滑精、子宫虚冷、崩温带下等症”，现代药理学研究表明，鹿茸具有增强机体免疫、抗衰老、加速创伤愈合、促进骨质修复等功能。
鹿茸作为贵重药材，产源不足但需求量增加，使得不同渠道来源的伪品、混淆品和代用品在国内的药源市场屡见不鲜，如用蛋清、色素、骨块和动物毛皮加工成为伪品鹿茸片；未收入国家标准的驯鹿、豚鹿、爪哇鹿、坡鹿、鲇鹿、驼鹿、麋鹿、狍等的茸也进入商品市场，致使鹿茸商品来源复杂，药材市场极为混乱。这种伪品鹿茸的价格依旧昂贵却完全失去有效成分和药用效果，不仅延误病人的救治，而且降低人们对中药的信任，严重影响我国传统药学的发展，更制约着中国传统医药的规范化、标准化和国际化。
常用的鉴定鹿茸方法有性状鉴定、显微鉴定及理化鉴定等。性状鉴别主要是指从鹿茸的外观形态、气、味、色泽、质地以及断面的感观特征进行综合分析，方法简单，但经验在这种方法中的影响很大，主观性较强。即使进行了很详细的性状描述，再由其他人来判断也比较难。而且作为药材形态通常是不完整的，因此鉴定难度较大（常丽静等．梅花鹿鹿茸品质评定等级[J].吉林农业，2011，262(12)：204）。显微鉴定是利用显微镜观察药材的内部组织构造、细胞形态，已经有学者描述了鹿茸的表皮角质层、毛干直径、角化梭形细胞等显微特征，为鹿茸的鉴定提供依据，但这一方法不能揭示细胞内在信息，无法精准鉴别近缘物种（徐国钧等．中药材粉末显微鉴定[M]．北京：人民卫生出版社。1993：810）。理化鉴定是利用仪器对其有效成分进行分析，但鹿茸成分复杂，对极易混淆的近缘物种不易区分，难以达到药材质量控制的目的（阎正等．鹿茸的HPLC指纹图谱[J]．河北大学学报，2010，30(2)：l64-170）。
上述鉴定鹿茸的方法均存在一定的局限性，临床急需建立一套准确、有效、标准的鹿茸药材鉴定方法，实现鹿茸的真伪鉴定，确保药材质量，保障临床用药的安全性与准确性。
随着现代科学分析技术的发展，DNA分子遗传标记技术在中药材鉴定中经常被使用，这种标记技术具有多态性强、准确性高等优点。利用DNA分子标记技术对中药材鹿茸进行鉴别，直接从遗传物质DNA的核苷酸序列上检测遗传变异。因此，它是区别个体间遗传变异最彻底的分析方法，能提供基因组特异性区域完全的遗传信息。
鹿科线粒体DNA（mitochrondrialDNA,mtDNA）呈共价闭合环状，包括一条重链、一条轻链，是细胞核外具有自主复制、转录和翻译能力的遗传物质，与核DNA相比，具有分子结构简单、碱基突变率高、母性方式遗传、不同区域进化速度存在差异等特点。正是由于这些特点，使mtDNA成为一种有效的遗传标记，广泛地应用于鹿科动物类群识别、起源与分化、鹿产品鉴定等领域。
细胞色素b（cytochromeb，Cytb）位于线粒体内膜脂质双分子层中，是参与氧化磷酸化合成ATP过程电子传递链中的重要物质，是线粒体自身编码的为数不多的功能蛋白，其基因的进化速度适中，近年来被广泛应用于系统发育、种类鉴别等的研究。细胞色素C氧化酶亚基1（cytochromecoxidasesubunit1，COI）是线粒体中约650bp的一段序列，它的基因进化速度比Cytb基因更快，因此可以用来区分进化非常紧密的物种。这两个片段的基因可作为动物物种鉴定的标记。
我们依托吉林省科技厅（2008年1月立项）和吉林省教育厅资助课题（2010年1月立项）：《中药DNA指纹检测试剂盒的研究与开发》（2012年5月吉林省科技厅鉴定成果），基于线粒体DNA建立动物中药材的DNA指纹特征，成功开发出貂心、乌梢蛇中药材DNA鉴定试剂盒（李明成，张丽华等《貂心DNA检测试剂盒及鉴定方法》，发明专利：ZL200810051643.3；2011.4授权；张丽华,李明成,王冰梅.貂心线粒体mtDNA鉴定及特征分析[J].中国药学杂志，2008,43(22):1694-1696；于文静，周婷婷，张丽华，等.蕲蛇DNA检测试剂盒的评价及应用[J].中国药学杂志，2014,43(22):1694-1696，2010,21(4):937-938.）。
目前用DNA分子标记技术鉴别鹿茸，国内外虽有一些报导，但仍处于理论研究阶段，即使对鹿茸及其伪品DNA指纹技术方面虽有部分研究（张蓉等.鹿茸饮片的DNA条形码鉴别研究.中国药学杂志,2011,49(11):999-1002.），但其方法成本高，操作复杂，实际应用有困难。
课题组从事中药易混品种的鉴定工作多年，运用多重PCR技术已经成功鉴定中药材龟甲（刘桐辉，王锦，李明成.中药材龟甲细胞色素b基因特异性鉴定研究[J].中国药学杂志，2012,47(3):182-185；邓莹，张丽华，李明成.复合聚合酶链反应鉴别龟甲正品与伪品的特征[J].中国药学杂志，2014,49(12):1022-1026）。在此基础上，采用多重PCR技术进行鹿茸及其伪品的鉴别，解决了临床上难以鉴别鹿茸正品及伪品的难题。
多重PCR(multiplexPCR，MPCR)技术是Chamberian等在1988年率先提出的，指在同一反应体系中同时加入几对引物，使几个PCR同时完成。多重PCR可同时扩增多个目的基因，具有特异性强、效率高、成本低的优势，已经被广泛应用（PerssonS,Al-ShuweliS,YapiciS,etal.IdentificationofclinicalAeromonasspeciesbyrpoB/gyrBsequencinganddevelopmentofmultiplexPCRforthedetectionofA.hydrophila,A.caviae,A.veroniiandA.media.JClinMicrobiol.2014Nov19.pii:JCM.01963-14.）。由于鹿茸型别较多，种间存在较多的变异位点，多重PCR可提高其检出率并同时鉴定其型别及突变等。
发明内容
本发明专利采用生物信息学技术对鹿茸线粒体DNA基因组进行筛选，利用Genbank中的相关信息，根据梅花鹿茸与其他相关动物的线粒体DNA序列的差异，选取COXⅠ和CytB基因序列，应用primerpremier5.0设计软件，设计可有效地区分鹿茸和伪品的特异性DNA序列，利用多重PCR技术在一个反应体系中加入两对特异性引物，针对一个模板可扩增两个具有差异的目的片段。提供一种可鉴定鹿茸与其易混品种的多重PCR鉴定试剂盒，以解决现有技术的缺陷。本方法操作简便、快速有效、结果稳定准确，能够用于鹿茸样品的鉴定。
本发明的目的是由以下技术方案来实现的：
一种鉴别鹿茸及其伪品的多重PCR检测试剂盒，它包含：
1.DNA提取体系
（1）样本裂解将待检样品用70%酒精清洗3min，37℃烘箱中挥发酒精，用剪刀剪碎至1mm3左右。称取样品0.1g放入离心管中，加入500μl裂解液、15μl蛋白酶K（20mg/ml）和30μl10%SDS(十二烷基磺酸钠)，混匀后置于56℃水浴振荡16～18h，转速100r/min。
（2）沉淀直接向裂解后的样品中加入500μl沉淀液（主要含有NaAC），充分混匀，11,000r/min4℃离心10min，取上清液加入等体积的异丙醇，-20℃放置1h，11,000r/min4℃离心10min，弃上清，留沉淀。
（3）洗涤使用洗涤液（主要含有70%乙醇）洗涤沉淀两到三次，干燥沉淀，溶于灭菌双蒸水中，-80℃保存，作为检测DNA模板。
鹿茸PCR反应体系
（1）鹿茸鉴定体系总体系为25μl，含有2×TaqPCRMasterMix12.5μl，12.5nmol·L-1鹿茸CytB引物及CytC引物各2μl，待检样本DNA提取液0.5μl，余为双蒸馏水。
（2）鹿茸阳性对照体系总体系为25μl，含有2×TaqPCRMasterMix12.5μl，12.5nmol·L-1鹿茸CytB引物及CytC引物各2μl，鹿茸DNA提取液0.5μl，余为双蒸馏水。
（3）鹿茸阴性对照体系总体系为25μl，含有2×TaqPCRMasterMix12.5μl，12.5nmol·L-1鹿茸CytB引物及CytC引物各2μl，鹿茸伪品DNA提取液0.5μl，余为双蒸馏水。
（4）设计反应程序将试剂盒的鹿茸鉴定体系、鹿茸阳性对照体系和鹿茸阴性对照体系各25μL加入反应管中，置于PCR反应仪中按下列程序进行：95℃预变性5min，95℃变性30s，退火温度58℃30s，72℃30s，循环反应30次，72℃延伸10min。
结果观察体系
取PCR扩增后的反应管中液体10~15μl，点在经含EB染色剂的2%的琼脂糖凝胶点样孔中，电泳20~30min（10V/cm），至蓝色指示剂距点样孔2~4cm时结束电泳。将凝胶置于紫外分析仪上观察，若在与阳性对照同一位置（300bp~600bp）处出现两条条带且阴性对照无条带，则样品为正品鹿茸。
鹿茸DNA鉴定方法，它包含以下步骤：
1.线粒体DNA提取
（1）样本裂解将待检样品用70%酒精清洗3min，37℃烘箱中挥发酒精，用剪刀剪碎。称取鹿茸样品剪碎至1mm3左右。称取样品0.1g放入离心管中，加入500μl裂解液、15μl蛋白酶K（20mg/ml）和30μl10%SDS(十二烷基磺酸钠)，混匀后置于56℃水浴振荡16～18h，转速100r/min。
（2）沉淀直接向裂解后的样品中加入500μl沉淀液（主要含有NaAC），充分混匀，11,000r/min4℃离心10min，取上清液加入等体积的异丙醇，-20℃放置1h，11,000r/min4℃离心10min，弃上清，留沉淀。
（3）洗涤使用洗涤液（主要含有70%乙醇）洗涤沉淀两到三次，干燥沉淀，溶于灭菌双蒸水中，-80℃保存，作为检测DNA模板。
引物设计与合成
（1）利用PrimerPrimer5.0软件设计梅花鹿线粒体细胞色素B及细胞色素C的DNA特异寡核苷酸引物，序列如下：
CytB：5`-TTTTCCTCTGTCACCCAT-3`
5`-ATAGCGAGTGCTGCGATG-3`
CytC：5`-ACACCCTAATCAACTGGC-3`
5`-AAGAAAGAAGGAGGGAGG-3`
（2）送由生工生物工程(上海)股份有限公司完成引物合成。
建立PCR反应
（1）鹿茸鉴定反应总体系为25μl，含有2×TaqPCRMasterMix12.5μl，12.5nmol·L-1鹿茸CytB引物及CytC引物各2μl，待检样本DNA提取液0.5μl，余为双蒸馏水。
（2）鹿茸阳性对照反应总体系为25μl，含有2×TaqPCRMasterMix12.5μl，12.5nmol·L-1鹿茸CytB引物及CytC引物各2μl，鹿茸DNA提取液0.5μl，余为双蒸馏水。
（3）鹿茸阴性对照反应总体系为25μl，含有2×TaqPCRMasterMix12.5μl，12.5nmol·L-1鹿茸CytB引物及CytC引物各2μl，鹿茸伪品DNA提取液0.5μl，余为双蒸馏水。
（4）设计反应程序将试剂盒的（1）鹿茸鉴定体系、（2）鹿茸阳性对照体系和（3）鹿茸阴性对照体系各25μL加入反应管中，置于PCR反应仪中按下列程序进行：95℃预变性5min，95℃变性30s，退火温度58℃30s，72℃30s，循环反应30次，72℃延伸10min，4℃。
结果判定
取PCR扩增后的反应管中液体10~15μl，点在经含EB染色剂的2%的琼脂糖凝胶点样孔中，电泳20~30min（10V/cm），至蓝色指示剂距点样孔2~4cm时结束电泳。将凝胶置于紫外分析仪上观察，若在与阳性对照同一位置（300bp~600bp）处出现两条条带且阴性对照无条带，则样品为正品鹿茸（图1）。
本发明的鹿茸鉴定试剂盒和鉴定方法与已发表的鹿茸鉴定方法相比，本发明在利用鹿茸DNA具有种属特异性的基础上，发明了区别鹿茸及其易混品种的试剂盒和鉴定方法，具有简便、快速、特异等优点。
具体实施方式
下面结合具体实施例子对本发明作进一步说明，下面实施例子仅用于说明本发明而并非对本发明的限制。
实施例1
1.线粒体DNA提取
（1）样本裂解将待检样品用70%酒精清洗3min，37℃烘箱中挥发酒精，用剪刀剪碎。称取鹿茸样品剪碎至1mm3左右。称取样品0.1g放入离心管中，加入500μl裂解液、15μl蛋白酶K（20mg/ml）和30μl10%SDS(十二烷基磺酸钠)，混匀后置于56℃水浴振荡16～18h，转速100r/min。
（2）沉淀直接向裂解后的样品中加入500μl沉淀液（主要含有NaAC），充分混匀，11,000r/min4℃离心10min，取上清液加入等体积的异丙醇，-20℃放置1h，11，000r/min4℃离心10min，弃上清，留沉淀。
（3）洗涤使用洗涤液（主要含有70%乙醇）洗涤沉淀两到三次，干燥沉淀，溶于灭菌双蒸水中，-80℃保存，作为检测DNA模板。
引物设计与合成
（1）利用PrimerPrimer5.0软件设计梅花鹿线粒体细胞色素B及细胞色素C的DNA特异寡核苷酸引物，序列如下：
CytB：5`-TTTTCCTCTGTCACCCAT-3`
5`-ATAGCGAGTGCTGCGATG-3`
CytC：5`-ACACCCTAATCAACTGGC-3`
5`-AAGAAAGAAGGAGGGAGG-3`
（2）送由生工生物工程(上海)股份有限公司完成引物合成。
建立PCR反应
（1）鹿茸鉴定反应总体系为25μl，含有2×TaqPCRMasterMix12.5μl，12.5nmol·L-1鹿茸CytB引物及CytC引物各2μl，待检样本DNA提取液0.5μl，余为双蒸馏水。
（2）鹿茸阳性对照反应总体系为25μl，含有2×TaqPCRMasterMix12.5μl，12.5nmol·L-1鹿茸CytB引物及CytC引物各2μl，鹿茸DNA提取液0.5μl，余为双蒸馏水。
（3）鹿茸阴性对照反应总体系为25μl，含有2×TaqPCRMasterMix12.5μl，12.5nmol·L-1鹿茸CytB引物及CytC引物各2μl，鹿茸伪品DNA提取液0.5μl，余为双蒸馏水。
（4）设计反应程序将试剂盒的（1）鹿茸鉴定体系、（2）鹿茸阳性对照体系和（3）鹿茸阴性对照体系各25μL加入反应管中，置于PCR反应仪中按下列程序进行：95℃预变性5min，95℃变性30s，退火温度58℃30s，72℃30s，循环反应30次，72℃延伸10min。
结果判定
取PCR扩增后的反应管中液体10~15μl，点在经含EB染色剂的2%的琼脂糖凝胶点样孔中，电泳20~30min（10V/cm），至蓝色指示剂距点样孔2~4cm时结束电泳。将凝胶置于紫外分析仪上观察，若在与阳性对照同一位置（300bp~600bp）处出现两条条带且阴性对照无条带，则样品为正品鹿茸（图2）。
实施例2对市售鹿茸药材进行鉴定
1.材料
市售鹿茸样品7种，鹿茸正品1种（由吉林市药品检定所提供并鉴定）。
方法
2.1线粒体DNA提取
（1）样本裂解将待检样品用70%酒精清洗3min，37℃烘箱中挥发酒精，用剪刀剪碎。称取鹿茸样品剪碎至1mm3左右。称取样品0.1g放入离心管中，加入500μl裂解液、15μl蛋白酶K（20mg/ml）和30μl10%SDS(十二烷基磺酸钠)，混匀后置于56℃水浴振荡16～18h，转速100r/min。
（2）沉淀直接向裂解后的样品中加入500μl沉淀液（主要含有NaAC），充分混匀，11,000r/min4℃离心10min，取上清液加入等体积的异丙醇，-20℃放置1h，11，000r/min4℃离心10min，弃上清，留沉淀。
（3）洗涤使用洗涤液（主要含有70%乙醇）洗涤沉淀两到三次，干燥沉淀，溶于灭菌双蒸水中，-80℃保存，作为检测DNA模板。
引物设计与合成
（1）利用PrimerPrimer5.0软件设计梅花鹿线粒体细胞色素B及细胞色素C的DNA特异寡核苷酸引物，序列如下：
CytB：5`-TTTTCCTCTGTCACCCAT-3`
5`-ATAGCGAGTGCTGCGATG-3`
CytC：5`-ACACCCTAATCAACTGGC-3`
5`-AAGAAAGAAGGAGGGAGG-3`
（2）送由生工生物工程(上海)股份有限公司完成引物合成。
建立PCR反应
（1）鹿茸鉴定反应总体系为25μl，含有2×TaqPCRMasterMix12.5μl，12.5nmol·L-1鹿茸CytB引物及CytC引物各2μl，待检样本DNA提取液0.5μl，余为双蒸馏水。
（2）鹿茸阳性对照反应总体系为25μl，含有2×TaqPCRMasterMix12.5μl，12.5nmol·L-1鹿茸CytB引物及CytC引物各2μl，鹿茸DNA提取液0.5μl，余为双蒸馏水。
（3）鹿茸阴性对照反应总体系为25μl，含有2×TaqPCRMasterMix12.5μl，12.5nmol·L-1鹿茸CytB引物及CytC引物各2μl，鹿茸伪品DNA提取液0.5μl，余为双蒸馏水。
（4）设计反应程序将试剂盒的鹿茸鉴定体系、鹿茸阳性对照体系和鹿茸阴性对照体系各25μL加入反应管中，置于PCR反应仪中按下列程序进行：95℃预变性5min，95℃变性30s，退火温度58℃30s，72℃30s，循环反应30次，72℃延伸10min。
结果判定
取PCR扩增后的反应管中液体10~15μl，点在经含EB染色剂的2%的琼脂糖凝胶点样孔中，电泳20~30min（10V/cm），至蓝色指示剂距点样孔2~4cm时结束电泳。将凝胶置于紫外分析仪上观察，若在与阳性对照同一位置（300bp~600bp）处出现两条条带且阴性对照无条带，则样品为正品鹿茸（图3）。
附图说明
图1是鹿茸试剂盒检测结果示意图；图2是实施例一鹿茸试剂盒检测结果示意图；图3是实施例二对市售鹿茸药材进行鉴定结果示意图。

Claims (9)

1.一、一种鹿茸DNA检测试剂盒：DNA提取体系：裂解液、沉淀液、洗涤液；PCR反应体系：鹿茸鉴定体系、阳性对照体系、阴性对照体系及结果观察体系。
2.二、鹿茸DNA鉴定方法，它包含线粒体DNA提取、PCR引物设计与合成、建立PCR反应、结果判定四个步骤：
线粒体DNA提取
（1）样本裂解：将待检样品用70%酒精清洗3min，37℃烘箱中挥发酒精，用剪刀剪碎；称取鹿茸样品剪碎至1mm3左右；称取样品0.1g放入离心管中，加入500ul裂解液、15ul蛋白酶K（20mg/ml）和30ul10%SDS(十二烷基磺酸钠)，混匀后置于56℃水浴振荡16～18h，转速100r/min；
（2）沉淀：直接向裂解后的样品中加入500ul沉淀液（主要含有NaAC），充分混匀，11,000r/min4℃离心10min，取上清液加入等体积的异丙醇，-20℃放置1h，11，000r/min4℃离心10min，弃上清，留沉淀；
（3）洗涤：使用洗涤液（主要含有70%乙醇）洗涤沉淀两到三次，干燥沉淀，溶于灭菌双蒸水中，-80℃保存，作为检测DNA模板。
3.引物设计与合成
（1）利用PrimerPrimer5.0软件设计梅花鹿线粒体细胞色素B及细胞色素C的DNA特异寡核苷酸引物，序列如下：
CytB：5`-TTTTCCTCTGTCACCCAT-3`
5`-ATAGCGAGTGCTGCGATG-3`
CytC：5`-ACACCCTAATCAACTGGC-3`
5`-AAGAAAGAAGGAGGGAGG-3`
（2）送由生工生物工程(上海)股份有限公司完成引物合成。
4.建立PCR反应
（1）鹿茸鉴定反应：总体系为25μl，含有2×TaqPCRMasterMix12.5μl，12.5nmol·L-1鹿茸CytB引物及CytC引物各2μl，待检样本DNA提取液0.5μl，余为双蒸馏水；
（2）鹿茸阳性对照反应：总体系为25μl，含有2×TaqPCRMasterMix12.5μl，12.5nmol·L-1鹿茸CytB引物及CytC引物各2μl，鹿茸DNA提取液0.5μl，余为双蒸馏水；
（3）鹿茸阴性对照反应：总体系为25μl，含有2×TaqPCRMasterMix12.5μl，12.5nmol·L-1鹿茸CytB引物及CytC引物各2μl，鹿茸伪品DNA提取液0.5μl，余为双蒸馏水；
（4）设计反应程序：将试剂盒的（1）鹿茸鉴定体系、（2）鹿茸阳性对照体系和（3）鹿茸阴性对照体系各25μL加入反应管中，置于PCR反应仪中按下列程序进行：95℃预变性5min，95℃变性30s，退火温度58℃30s，72℃30s，循环反应30次，72℃延伸10min，4℃。
5.结果判定
取PCR扩增后的反应管中液体10~15μl，点在经含EB染色剂的2%的琼脂糖凝胶点样孔中，电泳20~30min（10V/cm），至蓝色指示剂距点样孔2~4cm时结束电泳。
6.将凝胶置于紫外分析仪上观察，若在与阳性对照同一位置（300bp~600bp）处出现两条条带且阴性对照无条带，则样品为正品鹿茸。
7.三、如权利要求一和权利要求二所述的一种鹿茸DNA检测试剂盒及鉴定方法，其特征是，所述鹿茸DNA检测试剂盒及鉴定方法为梅花鹿茸或马鹿茸。
8.四、如权利要求二所述的鹿茸DNA检测试剂盒的鉴定方法，其特征是，结果鉴定是利用比较样品PCR扩增片段DNA大小与DNA标准分子量的相同，根据出现判定标准完全一致对鹿茸样品进行真伪鉴定。
9.五、一种权利要求一和权利要求二所述的一种鹿茸DNA检测试剂盒及鉴定方法，可应用于鹿茸样品的真伪鉴定。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106755556A (zh) * 2017-03-23 2017-05-31 山东省农业科学院生物技术研究中心 一种用于鉴别五灵脂的引物组、试剂盒及检测方法
CN106987586A (zh) * 2017-03-22 2017-07-28 山西省中医药研究院 一种动物角类药材角质层的dna提取方法
CN107523637A (zh) * 2017-10-11 2017-12-29 中国中医科学院中药研究所 基于coi与sry序列建立鉴别梅花鹿、马鹿或其杂交鹿的方法
CN108152382A (zh) * 2017-11-03 2018-06-12 广州市药材公司中药饮片厂 鹿茸极薄片hplc标准指纹图谱及其构建方法
CN108676895A (zh) * 2018-05-22 2018-10-19 北华大学 鹿胎多重pcr-rflp-ce dna指纹图谱及鉴定方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101270357A (zh) * 2008-03-11 2008-09-24 华东理工大学 一种从深度加工型中药或中药材中提取dna的方法
CN102191309A (zh) * 2010-03-01 2011-09-21 北华大学 柴胡dna鉴定试剂盒及鉴定方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101270357A (zh) * 2008-03-11 2008-09-24 华东理工大学 一种从深度加工型中药或中药材中提取dna的方法
CN102191309A (zh) * 2010-03-01 2011-09-21 北华大学 柴胡dna鉴定试剂盒及鉴定方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LIJUN GAO ET AL: "Development of multiplex PCR assay for authentication of Cornu Cervi Pantotrichum in traditional Chinese medicine based on cytochrome b and C oxidase subunit 1 genes", 《MITOCHONDRIAL DNA》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106987586A (zh) * 2017-03-22 2017-07-28 山西省中医药研究院 一种动物角类药材角质层的dna提取方法
CN106987586B (zh) * 2017-03-22 2020-10-16 山西省中医药研究院 一种动物角类药材角质层的dna提取方法
CN106755556A (zh) * 2017-03-23 2017-05-31 山东省农业科学院生物技术研究中心 一种用于鉴别五灵脂的引物组、试剂盒及检测方法
CN107523637A (zh) * 2017-10-11 2017-12-29 中国中医科学院中药研究所 基于coi与sry序列建立鉴别梅花鹿、马鹿或其杂交鹿的方法
CN107523637B (zh) * 2017-10-11 2021-01-01 中国中医科学院中药研究所 基于coi与sry序列建立鉴别梅花鹿、马鹿或其杂交鹿的方法
CN108152382A (zh) * 2017-11-03 2018-06-12 广州市药材公司中药饮片厂 鹿茸极薄片hplc标准指纹图谱及其构建方法
CN108676895A (zh) * 2018-05-22 2018-10-19 北华大学 鹿胎多重pcr-rflp-ce dna指纹图谱及鉴定方法

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