CN103255220A

CN103255220A - 龟甲dna检测试剂盒及鉴定方法

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Publication number: CN103255220A
Application number: CN2013101788563A
Authority: CN
Inventors: 李明成; 苑广信; 张丽华; 夏薇; 王冰梅; 傅桂莲
Original assignee: JILIN LEIBO TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: JILIN LEIBO TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2013-05-04
Filing date: 2013-05-04
Publication date: 2013-08-21

Abstract

本发明涉及中药鉴定技术领域，具体为一种龟甲DNA检测试剂盒及鉴定方法。一种龟甲DNA检测试剂盒包括样本前处理液及脱钙液，线粒体DNA提取体系，PCR反应体系，结果观察体系四部分组成。一种龟甲DNA鉴定方法，包括检测样本前处理，线粒体DNA提取，PCR引物设计与合成，建立PCR反应，结果判定五步。判断标准为同时出现100bp和400bp条带为正品龟甲，只出现一条或不出现均为伪品龟甲本发明建立的多重PCR鉴定方法具有简便、快速、检测结果可靠等优点，能够准确同时区别鉴别龟甲和伪品的特异性。

Description

龟甲DNA检测试剂盒及鉴定方法

技术领域

本发明涉及中药材鉴定技术，具体地说是一种龟甲DNA检测试剂盒及鉴定方法。

背景技术

龟甲为龟科动物乌龟chinemysreevesii(Gray)的干燥腹甲及背甲。龟甲中含动物胶、角蛋白、脂肪、骨胶原、氨基酸，及钙、磷、锶、锌、铜等多种常量及微量元素，性平。有滋阴潜阳，益肾强骨，养血补心之功效；用于阴虚潮热，骨蒸盗汗，血虚伪黄，失眠健忘等症。为常用贵重药材。其药材主产于湖北、安徽、湖南、江苏、浙江等地。近年来，由于市场需求量大，货紧价高等原因，一些产自东南亚国家的龟甲也通过这种渠道汇入我国，致使基源混乱的现象呈现不断增加的趋势，直接影响到龟甲临床用药的安全、疗效。因此，开展科学的中药鉴定对于中药的临床及中药现代化事业的发展具有重大的意义。

传统鉴定方法主要是性状、显微、理化鉴定等。性状鉴定主要是形、色、气、味、质地等，该方法简便、快捷。显微鉴别是通过显微镜观察药材组织、细胞及后含物等特征来区分各类中药。对性状相似多来源生药及丸、散、片、丹等中成药方剂的鉴定有独到之处。对于有效成分或特征成分明确的中药则可运用理化鉴定的方法进行，通过物理或化学方法对药及其制剂中所含有的主要化学成分或特征成分进行定性和定量分析，用以达到鉴定药材真伪的目的。近年来，在薄层色谱、高效液相色谱、红外光谱、紫外光谱、气相色谱、质谱等方法广泛应用的基础上，气-质联用、各种色谱-光谱联用技术也被用于中药的理化鉴定。但是由于我国中药材种类繁多，许多药材的化学成分仍不明确，还有一些近缘物种的化学成分十分相似，这些药材在进行理化鉴定时仍有一定的局限性。

分子遗传标记技术开始与中药领域渗透，并快速融合、发展，其中DNA指纹图谱在中药材(除矿物药外)的鉴定方面具有专属性强，准确性高，重复性好等优点，从分子水平解决了以前中药鉴定中宏观鉴定水平上的不完善。现代分子生物学在中药的质量控制领域逐步扩大，方法逐渐完善，大大加快了中药现代化的进程。

线粒体是存在于真核细胞内的一种细胞器，线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)是一共价闭合的双链环状的遗传物质，具有分子量小、结构简单、易于分离、拷贝数高、突变率高、进化速度快、母性遗传、无组织特异性、高保守性等特点。其中细胞色素b(Cytochromeb，Cyt b)基因和细胞色素C氧化酶亚基I(Cytochrome c oxidase subunit I，Cox I)基因存在于所有动物中，进化速度适中，较短的一个片段就能包含从种内到种间信息，且其DNA序列很少存在插入和缺失，能够保证足够变异，是分析种内和近缘种间遗传多样性和进化关系的适当的DNA片段，可应用于生物的分类、系统发育和遗传多样性的研究。这两个片段的基因可被作为动物中物种鉴定标记进行研究，因此，以线粒体DNA分子特征为遗传标记的中药鉴定更为准确、可靠。

我们依托吉林省科技厅(2008年1月立项)和吉林省教育厅资助课题(2010年1月立项)：《中药DNA指纹检测试剂盒的研究与开发》(2012年5月吉林省科技厅鉴定成果)，基于线粒体DNA建立动物中药材的DNA指纹特征，成功开发出貂心、鹿鞭和鹿茸三种中药材DNA鉴定试剂盒。

课题组在发现貂心线粒体DNA的全部基因组前提下，利用貂心mtDNA独特的优势，应用DNA扩增技术及测序技术研究貂心线粒体DNA的基因组部分序列，设计的寡核苷酸片段可特异鉴定鸡心、鸭心、鹅心和兔心，成功发明了一种简便、快速、特异的鉴定貂心专利技术(貂心DNA检测试剂盒及鉴定方法，发明专利：ZL200810051643.3；2011.4授权)。相关成果发表在吉林大学学报《貂组织线粒体DNA及细胞色素b鉴定及特征》[2008，34(5)：790-793]，中国药学杂志《貂心线粒体mtDNA鉴定及特征分析》[2008，4(3)：182-185]。时珍国医国药杂志《貂心与其伪品的脱氧核糖核酸指纹特征研究》2010年04期

在此基础上，课题组应用分子生物学与中药鉴定的相融合的理论对龟甲的鉴定技术进行研究，主要应用线粒体DNA的Cyt b高保守性及特异性对龟甲进行鉴定。采用盐析法方法从龟甲中提取线粒体DNA，利用Genbank中的相关信息，根据龟甲与其他相关动物的线粒体DNA序列的差异，选取Cyt b基因序列，应用primer premier5.0引物设计软件设计龟甲一对特异性引物，进行PCR(聚合酶链式反应)扩增，此方法可从分子水平对龟甲鉴定提供依据。相关成果发表在中国药学杂志《中药材龟甲细胞色素b特异性鉴定研究》[2012，4(3)：182-185]。

此外，国内学者通过对细胞色素C氧化酶亚基I(Cytochrome c oxidase subunit I，CoxI)基因序列对比研究发现，动物Cox I基因序列种内变异很小，种间存在较多的变异位点，可以作为DNA标记鉴别龟甲【崔丽娜，杜鹤，孙佳明等：基于COI条形码序列的龟甲及其混伪品的DNA分子鉴定[J].吉林中医药，2012年第02期；王川易，郭宝林，肖培根.中药分子鉴定方法评述[J].中国中药杂志，2011，36(3)：237-242.；刘中权，王义权，周开亚，等.中药材龟甲及原动物的高特异性PCR鉴定研究[J].药学学报，1999，34(12)：941-945.】。但是，单独选择一个位点不能避免突变导致的变异。刘忠权等人利用位点特异性PCR技术，配合测序技术鉴别龟甲及其同科动物【刘忠权，王义权，周开亚，等.中药材龟甲及原动物的高特异性PCR鉴定研究[J].药学学报，1999，34(12)：941～945.；吴平，周开亚，徐珞珊，等.中药材龟甲的分子鉴定研究[J].药学学报，1998，33(4)：304-309.；刘忠权，周材权，王义权，等.分子遗传标记技术在中药材鉴定中的应用[J].世界科学技术-中医药现代化，2001，3(5)：26-28.】。实验证明了龟甲一些基因位点可以通过特异性PCR和测序技术进行鉴别。

本发明专利基于同时选择两个特异位点用于龟甲鉴别。从GenBank中下载正品龟甲源动物乌龟(AY676201.1)及其常见伪品源动物缅甸陆龟(DQ080043.1)，凹甲陆龟(EF661586.1)黄喉拟水龟(DQ453753.1)，三线闭壳龟(YP004062152.1)和黄额闭壳龟(YP003595317.1)Co I基因和Cyt b基因序列，进过DNA Star7.0软件比对后，利用Primer Premier5.0软件设计龟甲特异性引物，采用高通量技术分析两个基因具有鉴别序列片段作为鉴别点，再利用NCBI中的在线软件Primer-BLAST对设计的引物进行评估。

建立多重引物PCR(又称复合PCR)反应体系。多重PCR具有高效性特点，即在同一PCR反应管内同时检出多种目的基因，或对有多个型别的目的基因进行分型，特别是用一个样本就可检测多种项目。由于龟甲型别较多，种间存在较多的变异位点，多重PCR可提高其检出率并同时鉴定其型别及突变等。此外，多重PCR具有经济简便性特性，多种目的基因在同一反应管内同时检出，将大大的节省时间，节省试剂，节约经费开支。对中药材鉴定具有节约样本等优势，具有节省时间、降低成本和提高效率的特点。

发明内容

本发明专利采用生物信息学技术对龟甲线粒体DNA基因组进行筛选，利用Genbank中的相关信息，根据龟甲与其他相关动物的线粒体DNA序列的差异，选取Cox I和Cyt b基因序列，应用Primer premier5.0设计软件，设计可有效地区分龟甲和伪品的特异性DNA序列，利用多重PCR技术在一个反应体系中加入二对特异性引物，针对一个模板可扩增二个具有差异的目的片段。提供一种能够准确鉴别龟甲和伪品特异性分子标志，使用方便的龟甲和伪品多重PCR检测试剂盒，具有节省时间、降低成本和提高效率的特点，并提供其简便、快速、检测结果可靠的鉴定方法。

本发明的目的是由以下技术方案来实现的：

一种鉴别龟甲和伪品多重PCR检测试剂盒(体积自行决定)，其特征是，它包含：

1.样本前处理体系

(1)样本清洗液无菌去离子水。

(2)脱钙液0.5mol/L pH8.0EDTA。

2.线粒体DNA提取体系

(1)裂解液15m mol/L Tris-HCl(pH7.6)，15m mol/L Na₂EDTA，50m mol/L NaCl，2％SDS，20μg/mL蛋白酶K。

(2)沉淀液饱和NaAC，异丙醇。

(3)洗涤液70％乙醇。

3.PCR反应体系

(a)鉴定反应体系总体系为100μL，其中含有缓冲液10μL，12.5mM dNTP4～10μL，0.1mM龟甲Cox I引物和Cyt b引物各1.5～4.0μL，Taq DNA聚合酶2～10μL，待测样品DNA2～5μL，余为双蒸馏水；

(b)阳性对照反应体系总体系为100μL，其中含有缓冲液10μL，12.5mM dNTP4～10μL，0.1mM龟甲Cox I引物和Cyt b引物各1.5～4.0μL，Taq DNA聚合酶2～10μL，龟甲DNA2～5μL，余为双蒸馏水；

(c)阴性对照反应体系总体系为100μL，含有缓冲液10μL，12.5mM dNTP4～10μL，0.1mM龟甲Cox I引物和Cyt b引物各1.5～4.0μL，Taq DNA聚合酶2～10μL，伪品DNA中2～5μL，余为双蒸馏水；

4.结果观察体系

(1)观察载体1.5琼脂糖凝胶。

(2)标准分子量100～2000bp的DNA Marker(其它种类不限定，必须包含100bp和400bp)。

一种龟甲DNA鉴定方法，其特征是，它包含以下步骤：

1.检测样本前处理

每个样品取2g，刷洗干净后用前处理液冲洗干净，室温干燥，用紫外灯照射30min以上。使用研钵将样品研碎至2～3mm左右，置于离心管中，每份按质量体积比1∶20加入相应体积脱钙液，56℃水浴48h～60h，转速100r/min。每12h更换一次新鲜的脱钙液。脱钙后8000r/min离心5min弃上清，沉淀待用。

2.线粒体DNA提取

(1)样本裂解向经过前处理的样品中加入5ml裂解液，置于水浴锅中，56℃水浴过夜，转速100r/min。

(2)沉淀直接向裂解后的样品中加入2ml沉淀液，充分混匀，6,000r/min4℃离心10min，吸取上清，弃沉淀。向上清中加入等体积的预冷的异丙醇，混匀后，低温放置20～30min，12,000r/min4℃离心20min，弃上清，留沉淀。

(3)洗涤使用洗涤液洗涤沉淀两到三次，干燥沉淀干燥，溶于灭菌双蒸水中，-80℃保存，作为检测DNA模板。

3.PCR引物设计与合成

(1)设计龟甲线粒体DNA二对特异寡核苷酸引物，含有龟甲DNA序列，如下Primer1、Primer2：

Primer1(Cox I)

5′ CTAATCTGATACATCATGC 3′

5′ CGATAATTGGCCAGATAAGTC 3′

Primer2(Cyt b)

5′ ACATGGACCATTACCAC 3′

5′ TCGGAGATTAATACCAGAGTA 3′

(2)人工合成龟甲线粒体DNA二对特异寡核苷酸引物，委托上海生工或其它专业生物公司完成。

4.建立PCR反应

(1)鉴定反应总体系为100μL，其中含有缓冲液10μL，12.5mM dNTP4～10μL，0.1mM引物1和引物2各1.5～4.0μL，Taq DNA聚合酶2～10μL，待测样品DNA2～5μL，余为双蒸馏水。

(2)阳性对照反应总体系为100μL，其中含有缓冲液10μL，12.5mM dNTP4～10μL，0.1mM龟甲COX I引物和Cyt b引物各1.5～4.0μL，Taq DNA聚合酶2～10μL，龟甲DNA2～5μL，余为双蒸馏水。

(3)阴性对照反应总体系为100μL，含有缓冲液10μL，12.5mM dNTP4～10μL，0.1mM龟甲COX I引物和Cyt b引物各1.5～4.0μL，Taq DNA聚合酶2～10μL，伪品DNA中2～5μL，余为双蒸馏水。

(4)设计反应程序

分别将鉴别龟甲和伪品PCR检测试剂盒的(a)鉴定反应体系、(b)阳性对照反应体系和(c)阴性对照反应体系的总体系各100μL加入反应管中，置于PCR反应仪(市场有售，任意型号)中按下列程序进行：

94℃预变性3-7min，94℃30s，退火温度56℃1min-30s，72℃1min-30s，40个循环，72℃延伸5-8min，4℃。

5.结果判定

产物用1.5-1.8％琼脂糖凝胶(市场有售)电泳，分子量100-2000bp的DNA Marker(标准分子量，市场有售)作参照，凝胶成像分析系统(市场有售，可购买)观察和分析结果。同时出现100bp和400bp条带为正品龟甲，只出现一条或不出现均为伪品龟甲(图1)。

本发明的鉴别龟甲和伪品鉴定试剂盒是利用鉴别龟甲和伪品线粒体DNA与细胞色素b和c具有的种属特异性位点，能够准确同时区别鉴别龟甲和伪品的特异性；建立的多重PCR鉴定方法具有简便、快速、检测结果可靠等优点。

附图说明

图1为龟甲DNA检测试剂盒检测结果示意图。

其中：1.为标准分子量；2.为正品龟甲结果，表现出100bp和400bp；3.为阳性对照结果，表现出100bp和400bp；4.为阴性对照结果

图2实施例一龟甲试剂盒检测结果示意图。

其中：M：为标准分子量；Control：为阳性对照，同时扩增出100bp和400bp；1.为正品龟甲结果，表现出100bp和400bp；2为凹甲陆龟龟甲；3为黄额闭壳龟龟甲；4为马来闭壳龟龟甲；5.为阴性对照。

图3实施例二对市售鳖甲药材进行鉴定结果示意图。

其中：1.为标准分子量；2.为阳性对照，扩增出100bp和400bp；3.为正品龟甲结果，扩增出100bp和400bp；4-9：市售样品；10.鳖甲样品；11：为阴性结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，下面实施例仅用于说明本发明而并非对本发明的限制。

实施例一

1.检测样本前处理

检测样品(四种，1为龟甲正品，2为凹甲陆龟龟甲；3为黄额闭壳龟龟甲；4为马来闭壳龟龟甲，均为伪品，由中国药品生物制品检定所提供并鉴定)，每份取2g，刷洗干净后用前处理液冲洗干净，室温干燥，用紫外灯照射30min以上。使用研钵将样品研碎至2～3mm左右，置于离心管中，每份按质量体积比1∶20加入相应体积脱钙液，56℃水浴48hh，转速100r/min。每12h更换一次新鲜的脱钙液。脱钙后8000r/min离心5min弃上清，沉淀待用。

2.线粒体DNA提取

(2)沉淀直接向裂解后的样品中加入2ml沉淀液，充分混匀，6,000r/min4℃离心10min，吸取上清，弃沉淀。向上清中加入等体积的预冷的异丙醇，混匀后，低温放置30min，12,000r/min4℃离心20min，弃上清，留沉淀。

3.PCR引物设计与合成

Primer1(Cox I)

5′ CTAATCTGATACATCATGC 3′

5′ CGATAATTGGCCAGATAAGTC 3′

Primer2(Cyt b)

5′ ACATGGACCATTACCAC 3′

5′ TCGGAGATTAATACCAGAGTA 3′

(2)人工合成龟甲线粒体DNA二对特异寡核苷酸引物，采用ABI3900高通量合成仪。(委托上海生工完成)

4.建立PCR反应

(a)鉴定反应总体系为100μL，其中含有缓冲液10μL，12.5mM dNTP4μL，0.1mM引物1和引物2各2.0μL，Taq DNA聚合酶2μL，待测样品DNA2μL，余为双蒸馏水。

(b)阳性对照反应总体系为100μL，其中含有缓冲液10μL，12.5mM dNTP4μL，0.1mM龟甲COX I引物和Cyt b引物各2.0μL，Taq DNA聚合酶2μL，龟甲DNA2μL，余为双蒸馏水。

(c)阴性对照反应总体系为100μL，含有缓冲液10μL，12.5mM dNTP4μL，0.1mM龟甲COX I引物和Cyt b引物各2.0μL，Taq DNA聚合酶2μL，伪品DNA中2μL，余为双蒸馏水。

(4)设计反应程序

94℃预变性3-7min，94℃30s，退火温度56℃30s，72℃1min，40个循环，72℃延伸5min，4℃。

5.结果判定

PCR产物用1.5琼脂糖凝胶电泳，标准分子量100-2000bp的DNA Marker作参照，凝胶成像分析系统观察和分析结果(图2)。

实施例二对市售龟甲药材进行鉴定

1.材料：市售龟甲样品6种(标号4-9)。鳖甲样品1种(标号10)，龟甲正品1种(均由吉林市药品检定所提供并鉴定)。

2.方法

2.1检测样本前处理每份检测样品取2g，刷洗干净后用前处理液冲洗干净，室温干燥，用紫外灯照射30min以上。使用研钵将样品研碎至2～3mm左右，置于离心管中，每份按质量体积比1∶20加入相应体积脱钙液，56℃水浴48hh，转速100r/min。每12h更换一次新鲜的脱钙液。脱钙后8000r/min离心5min弃上清，沉淀待用。

2.2线粒体DNA提取

2.3PCR引物设计与合成

Primer1(Cox I)

5′ CTAATCTGATACATCATGC 3′

5′ CGATAATTGGCCAGATAAGTC 3′

Primer2(Cyt b)

5′ ACATGGACCATTACCAC 3′

5′ TCGGAGATTAATACCAGAGTA 3′

(2)人工合成龟甲线粒体DNA二对特异寡核苷酸引物，采用ABI3900高通量合成仪(委托上海生工完成)。

2.4建立PCR反应

(4)设计反应程序

94℃预变性5min，94℃30s，退火温度56℃30s，72℃1min，40个循环，72℃延伸5min，4℃。

3.结果判定

PCR产物用1.5琼脂糖凝胶电泳，标准分子量100-2000bp的DNA Marker作参照，凝胶成像分析系统观察和分析结果(图3)。

Claims

1.一种龟甲DNA检测试剂盒，其特征是，它包含样本前处理液及脱钙液、线粒体DNA提取体系、PCR反应体系、结果观察体系。

(1)样本前处理液及脱钙液

(a)前处理液：去离子水。

(b)脱钙液：0.5mol/L pH8.0EDTA。

(2)线粒体DNA提取体系

(a)裂解液：10m mol/L Tris-HCl(pH8.0)，10m mol/L EDTA(pH8.0)，100m mol/L NaCl，2％SDS，40μg/ml蛋白酶K，0.039mol/L DTT。

(b)沉淀液：饱和NaAC。

(c)洗涤液：70％乙醇。

(3)PCR反应体系

(a)鉴定反应体系：总体系为100μL，其中含有缓冲液10μL，12.5mM dNTP4～10μL，0.1mM龟甲COX I引物和cyt b引物各1.5～4.0μL，Taq DNA聚合酶2～10μL，待测样品DNA2～5μL，余为双蒸馏水；

(b)阳性对照反应体系：总体系为100μL，其中含有缓冲液10μL，12.5mM dNTP4～10μL，0.1mM龟甲COX I引物和cyt b引物各1.5～4.0μL，Taq DNA聚合酶2～10μL，中华龟龟甲DNA2～5μL，余为双蒸馏水；

(c)阴性对照反应体系：总体系为100μL，含有缓冲液10μL，12.5mM dNTP4～10μL，0.1mM龟甲COX I引物和cyt b引物各1.5～4.0μL，Taq DNA聚合酶2～10μL，伪品DNA中2～5μL，余为双蒸馏水；

(4)结果观察体系

(a)琼脂糖凝胶：1.5％琼脂糖。

(b)标准分子量：100～2000bp的DNA Marker(可以选用其它种类的标准分子量，要求最大的不能超过2000bp，要显示出100bp和400bp)。

2.龟甲DNA鉴定方法，其特征是，它包含检测样本前处理、线粒体DNA提取、PCR引物设计与合成、建立PCR反应、结果判定五个步骤。

(1)检测样本前处理

(2)线粒体DNA提取

(a)样本裂解向经过前处理的样品中加入5ml裂解液，置于水浴锅中，56℃水浴过夜，转速100r/min。

(b)沉淀直接向裂解后的样品中加入2ml沉淀液，充分混匀，6,000r/min4℃离心10min，吸取上清，弃沉淀。向上清中加入等体积的预冷的异丙醇，混匀后，低温放置20～30min，12,000r/min4℃离心20min，弃上清，留沉淀。

(c)洗涤使用洗涤液洗涤沉淀两到三次，干燥沉淀干燥，溶于灭菌双蒸水中，-80℃保存，作为检测DNA模板。

(3)PCR引物设计与合成

(a)设计龟甲线粒体DNA二对特异寡核苷酸引物，含有龟甲DNA序列，如下Primer1、Primer2：

Primer1(COX I)

5′ ATACATCCGATACAACAGC 3′

5′ GATAAATGGGAGATAAGTG 3′

Primer2(cyt b)

5′ ATCATCCGATCAATAACAG 3′

5′ AGGGAGAATAATAAAGTGAAA 3′

(b)人工合成龟甲线粒体DNA二对特异寡核苷酸引物，采用ABI3900高通量合成仪。(委托上海生工完成)

(4)建立PCR反应

(a)鉴定反应：总体系为100μL，其中含有缓冲液10μL，12.5mM dNTP4～10μL，0.1mM引物1和引物2各1.5～4.0μL，Taq DNA聚合酶2～10μL，待测样品DNA2～5μL，余为双蒸馏水。

(b)阳性对照反应：总体系为100μL，其中含有缓冲液10μL，12.5mM dNTP4～10μL，0.1mM龟甲COX I引物和cyt b引物各1.5～4.0μL，Taq DNA聚合酶2～10μL，中华龟龟甲DNA2～5μL，余为双蒸馏水。

(c)阴性对照反应：总体系为100μL，含有缓冲液10μL，12.5mM dNTP4～10μL，0.1mM龟甲COX I引物和cyt b引物各1.5～4.0μL，Taq DNA聚合酶2～10μL，伪品DNA中2～5μL，余为双蒸馏水。

(d)设计反应程序

94℃预变性3-7min，94℃30s，退火温度56℃30s，72℃1min，40个循环，72℃延伸5-8min，4℃。

(5)结果判定

产物用1.5琼脂糖凝胶电泳，分子量100-2000bp的DNA Marker(标准分子量，市场有售)作参照，凝胶成像分析系统(市场有售，可购买)观察和分析结果。同时出现100bp和400bp条带为正品龟甲，只出现一条或不出现均为伪品龟甲。

3.如权利要求1和权利要求2所述的一种龟甲DNA检测试剂盒及鉴定方法，其特征是，所述龟甲DNA检测试剂盒及鉴定方法为乌龟的干燥腹甲及背甲。

4.如权利要求2所述的龟甲DNA检测试剂盒的鉴定方法，其特征是，结果鉴定是利用比较样品PCR扩增片段DNA大小与DNA标准分子量的相同，根据出现判定标准完全一致对龟甲样品进行真伪鉴定。

5.一种权利要求1和权利要求2所述的一种龟甲DNA检测试剂盒及鉴定方法，可应用于龟甲样品的真伪鉴定。