CN103865921B - 一种利用趾甲提取dna扩增三线闭壳龟线粒体全长的方法 - Google Patents

一种利用趾甲提取dna扩增三线闭壳龟线粒体全长的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN103865921B
CN103865921B CN201410068690.4A CN201410068690A CN103865921B CN 103865921 B CN103865921 B CN 103865921B CN 201410068690 A CN201410068690 A CN 201410068690A CN 103865921 B CN103865921 B CN 103865921B
Authority
CN
China
Prior art keywords
seqidno
plastosome
toenail
cuora trifasciata
cuora
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201410068690.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103865921A (zh
Inventor
朱新平
李伟
赵建
洪孝友
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Original Assignee
Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pearl River Fisheries Research Institute CAFS filed Critical Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Priority to CN201410068690.4A priority Critical patent/CN103865921B/zh
Publication of CN103865921A publication Critical patent/CN103865921A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103865921B publication Critical patent/CN103865921B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种利用趾甲提取DNA扩增三线闭壳龟线粒体全长的方法，含以下步骤：（1）选取三线闭壳龟的趾甲，预处理后，用MicroElute？Genomic？DNA？Kit试剂盒提取三线闭壳龟DNA；（2）设计能覆盖三线闭壳龟线粒体全基因组的16对引物，以步骤（1）中提取获得的三线闭壳龟DNA为模板，利用16对引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行测序和拼接后，首次扩增获得三线闭壳龟线粒体全长。该方法步骤简洁，成本低，属于非损伤性取样，能获得三线闭壳龟线粒体全序列。

Description

一种利用趾甲提取DNA扩增三线闭壳龟线粒体全长的方法
技术领域
本发明属于三线闭壳龟技术领域，具体涉及一种利用趾甲提取DNA扩增三线闭壳龟线粒体全长的方法。
背景技术
龟鳖类是较古老且形态最为特化的一支爬行动物，在地球上出现的最早记录是晚三叠纪，距今已有约2.2亿年的历史，被称为“活化石”。近几十年来，全世界由于非法捕杀和栖息地丧失而处境危险的龟鳖种类越来越多，绝大部分已被列入濒危野生动植物种国际贸易公约(CITES)附录中。特别是在亚洲，作为食物、传统药物和宠物贸易的受害者，多数龟鳖成员在野外几乎已绝迹，引发了国际关注的亚洲龟类危机（AsianTurtleCrisis）现象。2011年，国际生物保护学会(WCS)和龟生存联盟（TCC）共同发布了一个“TurtlesinTrouble”的专题，旨在引起全世界对龟鳖类生存现状的重视。报道指出如果没有强有力的保护措施，更多的淡水龟和海龟物种将在未来的十年里灭绝。
目前，关于龟鳖动物的研究主要集中在种质资源调查、形态学观察、增养殖研究以及进化和系统学关系等方面。涉及分子遗传、功能基因、物种鉴定和家系选育等分子生物学方面的研究比较少，远不及哺乳动物、两栖类、鸟类甚至鱼类研究的深入。造成这种状况的主要也是重要原因之一，就是研究样本特别是取样方式的限制。鉴于目前龟鳖的生存状态，龟鳖分子生物学研究的样本取样方式值得人们关注。
三线闭壳龟（Cuoratrifasciata）又名金钱龟，是样本珍贵、极度濒危的物种，被世界自然保护联盟（IUCN）列为极度濒危物种并被收录于濒危物种贸易公约（CITES）的附录II中。2006年以来，学术界关于三线闭壳龟（金钱龟）种的界定以及其与闭壳龟属其它成员之间的系统进化关系都一直存在争论。但由于非损伤性取样提取DNA的问题一直没有得到解决，因此对其的相关研究一直处于初级阶段，甚至三线闭壳龟的线粒体全序列至今没有报道。
目前，三线闭壳龟常用的取样方法有三种，即伤害性取样(destructivesampling)、非伤害性取样(nondestructivesampling)和非损伤性取样(noninvasivesampling)。对于一些样本珍贵、极度濒危甚至受法律保护的物种、需要大规模取样的研究或者长期跟踪的群体实验，非伤害性及非损伤性取样提取DNA用于后续的实验研究，则显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用趾甲提取DNA扩增三线闭壳龟线粒体全长的方法，该方法步骤简洁，成本低，属于非损伤性取样，能获得三线闭壳龟线粒体全序列。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：一种利用趾甲提取DNA扩增三线闭壳龟线粒体全长的方法，含以下步骤：
（1）选取三线闭壳龟的趾甲，预处理后，用MicroEluteGenomicDNAKit试剂盒提取三线闭壳龟DNA；
（2）设计能覆盖三线闭壳龟线粒体全基因组的16对引物，以步骤（1）中提取获得的三线闭壳龟DNA为模板，利用16对引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行测序和拼接后，首次扩增获得三线闭壳龟线粒体全长。
在上述步骤中：
本发明步骤（1）中所述的预处理包括采用无水乙醇浸泡三线闭壳龟的趾甲以及用1×PBS缓冲液浸泡步骤。
本发明步骤（1）中用MicroEluteGenomicDNAKit试剂盒提取三线闭壳龟DNA时，MicroEluteGenomicDNAKit试剂盒中TLBuffer初始加入量优选为210～220μL；消化时采用摇床气浴，温度优选为56～60℃，转速优选为60～70rpm/min，时间优选为3～5小时；洗脱液优选为无菌蒸馏水25～50μL，重复洗脱2次。
本发明步骤（1）中用MicroEluteGenomicDNAKit试剂盒提取三线闭壳龟DNA时，TLBuffer初始加入量较好为220μL，消化时采用摇床气浴，温度较好为56℃，转速较好为60rpm/min，时间较好为3～5小时，洗脱液较好为无菌蒸馏水25～50μL，重复洗脱2次。
本发明步骤（2）中所述的16对引物由以下序列所示的引物组成：SEQIDNo.1和SEQIDNo.2、SEQIDNo.3和SEQIDNo.4、SEQIDNo.5和SEQIDNo.6、SEQIDNo.7和SEQIDNo.8、SEQIDNo.9和SEQIDNo.10、SEQIDNo.11和SEQIDNo.12、SEQIDNo.13和SEQIDNo.14、SEQIDNo.15和SEQIDNo.16、SEQIDNo.17和SEQIDNo.18、SEQIDNo.19和SEQIDNo.20、SEQIDNo.21和SEQIDNo.22、SEQIDNo.23和SEQIDNo.24、SEQIDNo.25和SEQIDNo.26、SEQIDNo.27和SEQIDNo.28、SEQIDNo.29和SEQIDNo.30、SEQIDNo.31和SEQIDNo.32。
本发明步骤（2）中PCR扩增时PCR反应体系包括浓度为2.5mM的dNTP2.4μL，三线闭壳龟模板DNA1μL，浓度为10μmol的引物各0.5μL，Taq聚合酶0.5μL，10×Buffer4μL，加水至40μL。
本发明步骤（2）中PCR扩增时PCR反应条件为：95℃变性2min后，进行30个循环，每个循环的程序为：95℃变性30s，52℃～60℃退火30s，72℃延伸30s，最后72℃继续延伸10min。
本发明步骤（2）中获得的三线闭壳龟线粒体全长为16675bp，其核苷酸序列如SEQIDNo.33所示。
本发明以三线闭壳龟（Cuoratrifasciata）为对象，探讨了采集趾甲样本提取DNA作为分子生物学研究的可行性，并以趾甲提取的DNA为模板，首次扩增获得了三线闭壳龟完整线粒体基因组全序列，为三线闭壳龟的物种管理和保育研究以及其它龟鳖动物的相关研究和保护提供借鉴。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
（1）不受样本限制，活体和标本DNA含量都相对较高，可以满足实验需求；
（2）对标本外观影响不大，对动物个体无伤害或者伤害轻微，属于非伤害性取样或者非损伤性取样（半年内，所采集的240只个体无一例死亡）；
（3）保存运输简单，运输时间相对较长；
（4）提取方法简单，可使用试剂盒大批量的提取群体样本DNA；
（5）提取获得的DNA，可以扩增线粒体全序列；
（6）可修复性强、可再生、可多次取样，对试验样本珍贵或需要大量群体样本的采集实验来说，可以大量节约成本。
附图说明
图1是实施例1中趾甲DNA提取的电泳结果，N1-N8分别对应表2中的样本编号；
图2是实施例1中DNA样本梯度稀释TF片段PCR扩增结果，其中M为DL2000(Takara)1-6为N7稀释20、50、100、150、200倍，7-12为N3稀释20、50、100、150、200倍，13-18为N8稀释20、50、100、150、200倍。
具体实施方式
实施例1
本实施例提供的利用趾甲提取DNA扩增三线闭壳龟线粒体全长的方法，含以下步骤：
（1）趾甲取样
用手术剪剪取三线闭壳龟的趾甲，无水乙醇浸泡保存于-20℃，待用；
（2）基因组DNA的提取
提取DNA前，趾甲用1×PBS缓冲液4℃浸泡过夜，期间换洗2～3次。取样本趾甲各约10～20mg，用MicroEluteGenomicDNAKit（OMEGA，USA）试剂盒提取DNA，①将趾甲样本加入到1.5mL离心管中，加入210～220μL的TLBuffer；②将趾甲样本尽量剪碎，加入20μL的OB溶液；③置于温度为转速为60～70rpm/min的摇床气浴，56～60℃消化3～5小时；④20,000xg离心2min，取上清；⑤加入220μL的BLBuffer，混合后70℃水浴10min；⑥加入220μL无水乙醇，混合15秒后过结合柱，8,000xg离心1min，倒掉废液；⑦加入500μL的HBBuffer，8,000xg离心1min，倒掉废液；⑧加入650μL的DNAWashBuffer，8,000xg离心1min，倒掉废液，重复两次；⑨空柱36,000xg离心2min，空气中室温干燥3min；⑩无菌蒸馏水25～50μL，洗脱液DNA，可重复洗脱2次。
（3）DNA质量检测
提取的样本DNA使用0.7%琼脂糖凝胶电泳(样本DNA5μL，marker5μL)以及微型分光光度计（样本DNA1.6μL）检测样本DNA质量、纯度和浓度。
把样本DNA分别稀释20、50、100、150、200倍后，取1μL用一对转铁蛋白基因（Transferrin，TF）保守序列区的引物TFF(5′-GTAACCTGTGGACTTCCATTCC-3′)和TFR（5′-CAAATTTCATGACCACCTGCC-3′）做PCR检测，检测趾甲提取的DNA可稀释倍数，PCR反应结果使用1%琼脂糖凝胶电泳检测（样本DNA3uL，marker5uL）。
（4）线粒体DNA全序列扩增
根据已知的闭壳龟属其他物种(潘氏闭壳龟、金头闭壳龟、黄额闭壳龟、黄缘闭壳龟以及锯缘箱龟等)的线粒体全序列，用DNASTAR和ClustalX1.8进行对比，并用primer5.0设计连续的、有重叠区的、可覆盖三线闭壳龟线粒体全基因组的引物16对(见表1)考虑到当前的测序能力，PCR产物长度均不超过1600，PCR反应体系为40μL：dNTP(2.5mM)2.4μL，模板DNA1μL，引物(10μmol)各0.5μL，Taq聚合酶0.5μL，10×Buffer4μL，加水至40μL。PCR反应条件为：95℃变性2min后，进行30个循环，程序为：95℃变性30s，52℃-60℃退火30s，72℃延伸30s，最后72℃继续延伸10min。PCR反应产物使用1%琼脂糖凝胶电泳检测（样本DNA3uL，marker5uL），并经纯化试剂盒GelExtractPurificationKit(Omega,USA)纯化后,委托上海生工公司进行测序。
表1用premier5.0设计的可覆盖三线闭壳龟线粒体全基因组的引物
（5）序列分析
测序获得的序列片段信息使用EditSeq(DNASTAR)和测序峰图进行数据分析后，利用VectorNTI11.5进行序列拼接，得到三线闭壳龟线粒体基因组全序列。三线闭壳龟的粒体基因组全序列完整信息经sequin软件处理。
（6）结果
6.1趾甲DNA浓度与质量
表2样本提取DNA的纯度和浓度
注：N1-N8分别代表DNA质量检测中取得的部分样品样本，对应图1中的样品编号。
趾甲DNA提取的电泳结果见图1，从图1中可以看出，各泳道的主带都比较亮，降解情况比较轻微，DNA质量都比较理想，分光光度计检测趾甲DNA样本的纯度和浓度结果见表2；结果表明，11.2mg～25.5mg的趾甲可以得到浓度在100.12ng/μL～256.91ng/μL之间的50μL～100μLDNA溶液。
由图2可知，稀释趾甲DNA浓度以转铁蛋白TF基因的引物做PCR扩增反应，提取的趾甲DNA原液可稀释50～150倍，推断出由约10mg～25mg趾甲样本提取的DNA至少可以做5000～10000次普通的PCR扩增反应。
6.2线粒体基因组全序列
利用上述16对引物进行扩增,得到16个PCR产物，PCR产物长度与引物设计的预期产物长度一致。
测序后序列拼接首次获得三线闭壳龟线粒体基因组序列全长为16675bp，其核苷酸序列如SEQIDNo.33所示。
利用DNASTAR统计三线闭壳龟线粒体基因组各碱基含量分别为:A=33.85%,G=13.13%,C=26.19%，T=26.84%，AT的含量60.68%远高于GC含量高达39.32%。线粒体基因组包括37个基因：2个rRNA基因、22个tRNA基因(其中有两个tRNASer和两个tRNALeu)、13个蛋白质编码基因和1个非编码控制区(D-loop区)，且基因结构及排列顺序与大多数脊椎动物相似，相邻基因间有时稍有重叠（表3）。其中tRNAGln、tRNAAla、tRNAAsn、tRNACys、tRNATyr、tRNASer、tRNAGlu、tRNAPro和ND6基因位于L链，其余28个基因位于H链上。在tRNAAsn和tRNACys之间为一26bp的片段，可形成“茎-环”结构，是L链的复制起点(OL)。除COI以GTG为起始密码子外，其它均以ATG为起始密码子。有7个基因(ATP6、ATP8、COII、ND4、ND4L和ND5)以TAA为终止密码子，3个基因(ND1，ND2和ND3)以TAG为终止密码子，2个基因(COI和ND6)以AGG为终止密码子，此外还有2个基因(COIII和Cytb)以一个单独的T为终止信号。
三线闭壳龟线粒体DNA控制区（controlregion，CR）位于tRNApro和tRNAphe之间，长度为1156bp，各碱基含量分别为:A=33.91%，G=10.03%，T=39.79%，C=16.26%，AT的含量高达73.70%，其中G的含量最少。CR是mtDNA基因组中序列和长度变异最大、进化速率最高、最具多态的区域。试验分别识别了CR的三个特征区域：终止相关序列区（terminationassociatedsequence,TAS）,中央保守区（centralconservedsequenceblock,CD）和保守序列区（conservedsequenceblocks,CSB），并在CSB的3’端识别了不同类型的串联重复（见表3）。其中，TAS的核心序列为5’-TACAT-3’；CSB有3个保守序列框分别为：CSB1(5’-TTAATGCTTGTAAGACATA-3’),CSB2(5’-CTAAACCCCCCTACCCCCC-3’),andCSB3(5’-TCGTCAAACCCCTAAATCC-3’)；CD区含有一个保守序列框CSB-F(5’-AATCACGAGAGATAAGCAAC-3’)是识别TASandCSB的分界线。在三线闭壳龟CR的3’末端，还发现有丰富的微卫星序列，有一些特殊的基序(ATATT)n(n=49)，序列后紧跟二核苷酸微卫星序列（AT）n的重复单元（n＝9）。
表3三线闭壳龟线粒体全基因组特征
*代表重叠区域大的片段大小，负值代表重叠，正值代表间隔。HandL代表重链和轻链。
（7）结论
本实验采集三线闭壳龟的趾甲提取基因组DNA，11.2mg～25.5mg的趾甲可以得到浓度在100.12ng/μL～256.91ng/μL之间的DNA溶液50μL，经倍数稀释后，理论上可以做2500～7500次普通的PCR扩增反应。
本发明以三线闭壳龟标本趾甲提取的DNA为模板，利用16对引物扩增（PCR扩增的片段分布在约775bp-1524bp大小的位置），首次获得了三线闭壳龟的线粒体全序列，全长为16675bp，其核苷酸序列如SEQIDNo.33所示。结果显示，趾甲样本提取的DNA能完整的扩增拼接出线粒体的全序列，符合分子生物学的研究要求。
通过本发明的上述试验可以发现，趾甲虽然比组织样本DNA含量小，但其提取的量也足够满足实验需求。龟鳖类趾甲样本提取DNA有以下优点：（1）不受样本限制，活体和标本DNA含量都相对较高，可以满足实验需求。（2）对标本外观影响不大，对动物个体无伤害或者伤害轻微，属于非伤害性取样或者非损伤性取样（半年内，所采集的240只个体无一例死亡）。（3）保存运输简单，运输时间相对较长。（4）提取方法简单，可使用试剂盒大批量的提取群体样本DNA。（5）提取获得的DNA，可以扩增线粒体全序列。（6）可修复性强、可再生、可多次取样，对试验样本珍贵或需要大量群体样本的采集实验来说，可以大量节约成本。
以上列举具体实施例对本发明进行说明。需要指出的是，以上实施例只用于对本发明作进一步说明，不代表本发明的保护范围，其他人根据本发明的提示做出的非本质的修改和调整，仍属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种利用趾甲提取DNA扩增三线闭壳龟线粒体全长的方法，其特征是含以下步骤：
（1）选取三线闭壳龟的趾甲，预处理后，用MicroEluteGenomicDNAKit试剂盒提取三线闭壳龟DNA；
（2）设计能覆盖三线闭壳龟线粒体全基因组的16对引物，以步骤（1）中提取获得的三线闭壳龟DNA为模板，利用16对引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行测序和拼接后，首次扩增获得三线闭壳龟线粒体全长；
步骤（2）中所述的16对引物由以下序列所示的引物组成：SEQIDNo.1和SEQIDNo.2、SEQIDNo.3和SEQIDNo.4、SEQIDNo.5和SEQIDNo.6、SEQIDNo.7和SEQIDNo.8、SEQIDNo.9和SEQIDNo.10、SEQIDNo.11和SEQIDNo.12、SEQIDNo.13和SEQIDNo.14、SEQIDNo.15和SEQIDNo.16、SEQIDNo.17和SEQIDNo.18、SEQIDNo.19和SEQIDNo.20、SEQIDNo.21和SEQIDNo.22、SEQIDNo.23和SEQIDNo.24、SEQIDNo.25和SEQIDNo.26、SEQIDNo.27和SEQIDNo.28、SEQIDNo.29和SEQIDNo.30、SEQIDNo.31和SEQIDNo.32。
2.根据权利要求1所述的利用趾甲提取DNA扩增三线闭壳龟线粒体全长的方法，其特征是：步骤（1）中所述的预处理包括采用无水乙醇浸泡三线闭壳龟的趾甲以及用1×PBS缓冲液浸泡步骤。
3.根据权利要求1所述的利用趾甲提取DNA扩增三线闭壳龟线粒体全长的方法，其特征是：步骤（1）中用MicroEluteGenomicDNAKit试剂盒提取三线闭壳龟DNA时，MicroEluteGenomicDNAKit试剂盒中TLBuffer初始加入量为210~220μL；消化时采用摇床气浴，温度为56~60℃，转速为60~70rpm/min，时间为3~5小时；洗脱液为无菌蒸馏水25~50μL，重复洗脱2次。
4.根据权利要求1所述的利用趾甲提取DNA扩增三线闭壳龟线粒体全长的方法，其特征是：步骤（2）中PCR扩增时PCR反应体系包括浓度为2.5mM的dNTP2.4μL，三线闭壳龟模板DNA1μL，浓度为10μmol的引物各0.5μL，Taq聚合酶0.5μL，10×Buffer4μL，加水至40μL。
5.根据权利要求1所述的利用趾甲提取DNA扩增三线闭壳龟线粒体全长的方法，其特征是：步骤（2）中PCR扩增时PCR反应条件为：95℃变性2min后，进行30个循环，每个循环的程序为：95℃变性30s，52℃~60℃退火30s，72℃延伸30s，最后72℃继续延伸10min。
6.根据权利要求1所述的利用趾甲提取DNA扩增三线闭壳龟线粒体全长的方法，其特征是：步骤（2）中获得的三线闭壳龟线粒体全长为16675bp，其核苷酸序列如SEQIDNo.33所示。
CN201410068690.4A 2014-02-27 2014-02-27 一种利用趾甲提取dna扩增三线闭壳龟线粒体全长的方法 Expired - Fee Related CN103865921B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410068690.4A CN103865921B (zh) 2014-02-27 2014-02-27 一种利用趾甲提取dna扩增三线闭壳龟线粒体全长的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410068690.4A CN103865921B (zh) 2014-02-27 2014-02-27 一种利用趾甲提取dna扩增三线闭壳龟线粒体全长的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103865921A CN103865921A (zh) 2014-06-18
CN103865921B true CN103865921B (zh) 2016-01-20

Family

ID=50904931

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410068690.4A Expired - Fee Related CN103865921B (zh) 2014-02-27 2014-02-27 一种利用趾甲提取dna扩增三线闭壳龟线粒体全长的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103865921B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105506103B (zh) * 2015-12-28 2019-05-31 天津中医药大学 线粒体基因组扩增的通用引物混合物及其设计和扩增方法
CN105713973B (zh) * 2016-03-24 2019-04-26 中国水产科学研究院珠江水产研究所 一种利用线粒体D-loop区特异区域鉴定鼋的标记引物及方法
CN107513528A (zh) * 2017-10-16 2017-12-26 鲁东大学 一种江珧贝壳dna提取方法、鉴定引物及试剂盒
CN112680439A (zh) * 2021-01-20 2021-04-20 中国水产科学研究院珠江水产研究所 一种鼋基因组dna的提取方法及应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991008308A1 (en) * 1989-11-30 1991-06-13 Pharmacia Genetic Engineering, Inc. A new method for detecting a specific nucleic acid sequence in a sample of cells
CN101321864A (zh) * 2005-10-03 2008-12-10 国立大学法人信州大学 从来源于生物的试样采集dna的方法
CN103255220A (zh) * 2013-05-04 2013-08-21 吉林市雷博科技有限公司 龟甲dna检测试剂盒及鉴定方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991008308A1 (en) * 1989-11-30 1991-06-13 Pharmacia Genetic Engineering, Inc. A new method for detecting a specific nucleic acid sequence in a sample of cells
EP0504278A4 (en) * 1989-11-30 1993-06-09 Pharmacia Genetic Engineering, Inc. A new method for detecting a specific nucleic acid sequence in a sample of cells
CN101321864A (zh) * 2005-10-03 2008-12-10 国立大学法人信州大学 从来源于生物的试样采集dna的方法
CN103255220A (zh) * 2013-05-04 2013-08-21 吉林市雷博科技有限公司 龟甲dna检测试剂盒及鉴定方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MicroElute Genomic DNA Kit，Omega公司D3096 Manul;Omega公司;《Omega公司官网D3096 Manul》;20120814;全文 *
乌龟基因组提取方法和扩增的研究;曾柳根等;《第五届广东、湖南、江西、湖北四省动物学学术研讨会论文摘要汇编》;20081231;摘要 *
指甲DNA提取及其STR分型;刘开会等;《中国法医学杂志》;20030430;第18卷(第2期);第109页左栏 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN103865921A (zh) 2014-06-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Sahu et al. DNA extraction protocol for plants with high levels of secondary metabolites and polysaccharides without using liquid nitrogen and phenol
Statham et al. On the origin of a domesticated species: identifying the parent population of Russian silver foxes (Vulpes vulpes)
CN103865921B (zh) 一种利用趾甲提取dna扩增三线闭壳龟线粒体全长的方法
Lara Pinto et al. Novel viruses in salivary glands of mosquitoes from sylvatic Cerrado, Midwestern Brazil
CN103789301B (zh) 三疣梭子蟹微卫星标记的特异性引物及筛选方法
Branchiccela et al. Genetic changes in Apis mellifera after 40 years of Africanization
Reinartz et al. Population genetic analyses of Acipenser ruthenus as a prerequisite for the conservation of the uppermost Danube population
Sahara et al. Conserved synteny of genes between chromosome 15 of Bombyx mori and a chromosome of Manduca sexta shown by five-color BAC-FISH
Sefbom et al. Priority effects in a planktonic bloom-forming marine diatom
Wei et al. Echiuran Hox genes provide new insights into the correspondence between Hox subcluster organization and collinearity pattern
Kamau et al. Differential transcription of two highly divergent gut‐expressed Bm86 antigen gene homologues in the tick Rhipicephalus appendiculatus (Acari: Ixodida)
Casas et al. Sex-associated DNA markers from turbot
CN102876777A (zh) 鮸鱼est微卫星标记的特异引物及筛选方法
Fujii et al. Genetic and morphological assessments of hybridization between two non-native geoemydid turtles, Mauremys reevesii and Mauremys mutica, in northcentral Japan
Valente et al. Comparative cytogenetics of ten species of cichlid fishes (Teleostei, Cichlidae) from the Araguaia River system, Brazil, by conventional cytogenetic methods
Nirchio et al. Pseudoplatystoma metaense and P. orinocoense (Siluriformes: Pimelodidae) from the Orinoco basin, Venezuela: cytogenetic and molecular analyses
Liu et al. The complete mitochondrial genome of Greenidea ficicola (Hemiptera: Aphididae: Greenideinae), a pest of Ficus
CN106636319A (zh) 快速鉴别东白眉长臂猿和北白颊长臂猿的分子生物学方法
Keyvanshokooh et al. Genetic variation of Rutilus rutilus caspicus (Jakowlew 1870) populations in Iran based on random amplified polymorphic DNA markers: a preliminary study
CN107841565A (zh) 鉴别中华绒螯蟹的分子特异性标记引物及方法
Somura et al. Sequence analysis of mitochondrial DNAs of 12S rRNA, 16S rRNA, and cytochrome oxidase subunit 1 (COI) regions in slow lorises (Genus Nycticebus) may contribute to improved identification of confiscated specimens
Shinmura et al. The complete mitochondrial genome and genetic distinction of the Taiwanese honeybee, Apis cerana (Hymenoptera: Apidae)
Dong et al. Development of microsatellite markers for genetic analysis in the large scale loach Paramisgurnus dabryanus
Sun et al. Complete mitochondrial genome of Manispentadactylapentadactyla (Mammalia: Pholidota), an endemic subspecies of Chinese pangolin: mitogenome characterisation and phylogenetic implications
CN102676689B (zh) 一种脊尾白虾微卫星标记的3重pcr检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20160120

Termination date: 20170227