CN101321864A - 从来源于生物的试样采集dna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供从珍贵的来源于生物的试样在不混入杂质的情况下简便且高效地采集DNA的方法。DNA采集方法依次实施以下的步骤：(1)实施将由硬组织构成的来源于生物的试样整块地使用或者切断或粉碎后使用的片段化操作，以及随后向其添加EDTA的脱钙操作的预处理步骤；(2)向(1)得到的试样，加入溶解来源于生物的试样中的DNA－蛋白质的复合体的增溶剂缓冲液和蛋白质分解酶，调制DNA溶液的溶解步骤；(3)向(2)的复合体溶解液中，加入饱和三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐的苯酚缓冲液或者含碘化钠－异丙醇的水溶液来除去蛋白质后，分取DNA提取液的提取步骤；(4)将(3)的DNA提取液通过柱，纯化DNA的纯化步骤。
Description
技术领域
本发明涉及法医学的DNA(脱氧核糖核酸)鉴定中或生物学的基因研究中实施的从来源于生物的试样采集DNA的方法。
背景技术
为了使用活体组织鉴定亲子·兄弟姐妹的血缘关系，或者根据如事件·事故的死者的组织或阵亡者的陈年的遗骨等遗体组织确认身份，或者根据犯罪现场的毛发、体液或体液斑等遗留物收集确定犯人的证据而实施法医学的DNA鉴定。此外，为了进行人和动植物的基因测序、基因工程、分子生物学等生物学的基因研究而进行DNA分析。
实施这样的DNA鉴定等时，从来源于生物的试样采集DNA，所述生物的试样例如有生存或非生存的人的牙齿、骨、指甲等硬组织，体毛、皮肤、肌肉、内脏、血管等软组织，血液、淋巴液、唾液、精液、尿液等体液，体液斑或者生存或非生存的动植物的组织。
目前，例如从牙齿或骨采集DNA的情况下，采用如下的方法：通过依次用次氯酸钠水溶液、水、乙醇洗涤牙齿或骨，除去附着于表面的污染物质或异物。然后，干燥，粉碎后长时间用乙二胺四乙酸水溶液(EDTA)脱钙。脱钙后，用溶解液和蛋白质分解酶使试样溶解，用苯酚、氯仿、异戊醇的混合物提取DNA，从水层用乙醇使其沉淀，从而纯化并采集DNA。
作为简便的采集方法，日本专利特开2004-201525号公报中记载了向经粉碎的活体试样添加DNA提取试剂后，通过乙醇沉淀而纯化，回收DNA的方法。
Forensic Sciences 44(3)264-272，2003中记载了以下的例子：美国的2001年9月11日的世贸中心大楼的恐怖事件的遇难者的身份确认中采用的按照现有方法粉碎骨或牙齿后从劣化了的DNA对STR13基因座进行DNA检测。
通常，如果粉碎试样，则混入其它组织的DNA，如果用EDTA长时间脱钙，则DNA分解。此外，如果不进行除蛋白质处理或试样陈化，则混入阻碍DNA鉴定的蛋白质等杂质。另外，如果用乙醇使DNA沉淀，则损失珍贵的DNA。
发明的揭示
本发明是为了解决前述的课题而完成的，其目的在于提供从珍贵的来源于生物的试样在不混入杂质的情况下简便且高效地采集DNA的方法。
为了实现前述的目的而采用的DNA采集方法依次实施以下的步骤：
(1)实施将由硬组织构成的来源于生物的试样整块地使用或者切断或粉碎后使用的片段化操作，
以及随后向其添加EDTA的脱钙操作的预处理步骤；
(2)向(1)得到的试样，加入溶解来源于生物的试样中的DNA-蛋白质的复合体的增溶剂缓冲液和蛋白质分解酶，溶解DNA-蛋白质的复合体的溶解步骤；
(3)向(2)的复合体溶解液中，加入饱和三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐的苯酚缓冲液或者含碘化钠-异丙醇的水溶液来除去蛋白质后，分取DNA提取液的提取步骤；
(4)将(3)的DNA提取液通过柱，纯化DNA的纯化步骤。
根据该方法，将来源于生物的试样整块地使用，或者使用以远大于粉末的大小切断或粉碎而得的片段。因此，该方法与将试样完全粉末化的现有方法相比，可以高效地仅采集所需的来源于生物的试样的DNA，高精度地检测DNA。
DNA采集方法中，所述硬组织例如为牙齿或骨。
所述片段化操作理想的是，试样为牙齿的情况下整块地使用，或者试样为牙齿或骨的情况下，制成厚0.1～0.5cm的切片或至少粉碎成宽5mm左右的颗粒来使用，获得不含粉末的片段。
所述预处理步骤中，所述EDTA可以含有表面活性剂。
利用EDTA实施脱钙的同时，利用该水溶液中所含的表面活性剂促进脱钙，可使预处理步骤在短时间内完成，仅充分且高效地采集DNA。
所述表面活性剂较好是离子型表面活性剂。
更好是所述离子型表面活性剂为十二烷基硫酸钠(SDS)。
所述预处理步骤中，所述EDTA中的所述表面活性剂的浓度较好是0.1～0.5重量％。
所述预处理步骤中，更好是在所述EDTA中于20～60℃浸渍2小时～2天来进行所述脱钙操作。
所述预处理步骤中，特别好是在含有所述表面活性剂的所述EDTA中于37～60℃浸渍2小时～2天来进行所述脱钙操作。
所述预处理步骤中，所述来源于生物的试样可以是通过清洁操作清洁了的试样。
所述预处理步骤中，所述清洁操作较好是将所述来源于生物的试样依次用中性洗剂水溶液、水、乙醇洗涤后干燥。
所述溶解步骤中，较好是在所述复合体的溶解液中加入所述蛋白质分解酶，在37～65℃维持0.5～6小时，调制所述DNA溶液。
所述提取步骤中，较好是加入所述苯酚缓冲液后，将上清水层部分离，容量大时通过超滤浓缩，分取所述DNA提取液。
所述纯化步骤中，所述柱较好是硅膜柱、硅珠填充柱或碘化钠离心操作。
如果采用本发明的DNA采集方法，则不会混入附着于来源于生物的试样的异物和阻碍DNA鉴定的蛋白质等杂质，而且不进行DNA损失大的乙醇沉淀，可以简便、再现性好且高效地采集DNA。该方法不需要熟练技术，对于少量至大量的范围宽泛的试样或者多份的试样，也可以可靠地采集DNA。
如果像前述的Forensic Sciences 44(3)264-272，2003那样，按照现有方法粉碎骨或牙齿后从劣化了的DNA对STR13基因座进行检测，则记载显示可检测出所有的基因座的为27.2％。
相对地，如果采用本发明，对于从阵亡者遗骨的牙齿采集的60年前的DNA，获得约70％的总基因座检出率，若部分缺损，则可以获得约80％以上的检出率。因此，本发明是显著优于粉碎骨或牙齿的现有方法的DNA采集方法。
而且，由于完全不使用粉末状的来源于生物的试样，因此不会混入粉末状的来源于生物的试样产生的分解物或杂质，得到的DNA的纯度高。
劣化试样的脱钙中，如果使用含有表面活性剂的EDTA，则与仅采用EDTA的脱钙相比，在操作时间进一步缩短的同时，DNA的采集效率进一步提高。
此外，由于可以从珍贵的微量的来源于生物的试样获得高品质的DNA，因此DNA鉴定中不会发生误认。
附图的简单说明
图1为表示采用本发明的DNA采集方法的步骤的一例的图。
实施发明的最佳方式
以下，对本发明的DNA采集方法的实施例进行详细说明，但本发明的范围并不局限于这些实施例。
参照表示实施的一例的图1进行说明。DNA经过以下的步骤(1)～(4)来采集。
(1)预处理步骤
作为来源于生物的试样，可以使用存活的人的牙齿或骨或者遗骨。对来源于生物的试样实施擦拭、洗涤等处理进行清洁。具体来说，用在中性洗剂的水溶液中浸渍了的刷子擦去附着于牙齿或骨的表面的污染物，用水冲去中性洗剂。接着，用乙醇洗涤，通过吹风机或自然对流使其风干(图1(1.a))。
接着，将来源于生物的试样制成0.5cm左右大小的粒或切片使用，或者在试样为牙齿时整块地使用。由此，与将试样制成粉末的情况相比，可以防止其它组织的DNA的混入。试样为牙齿的情况下，将其牙根以0.1～0.2cm左右的厚度切片后，从一颗牙齿获得4～6块约60～120mg的切片。另一方面，试样为骨的情况下，在包含骨髓的状态下以0.15～0.2cm的厚度切成0.5cm见方左右的大小，获得约60～120mg的切片。作为来源于生物的试样，都使用1～4个切片即可，所以可以将残余部分按原样保存(图1(1.b))。
接着，在EDTA水溶液中于20～60℃浸渍2小时～2天来进行孵育，从而实施除去钙成分的脱钙。浸渍的温度和时间较好是根据来源于生物的试样的容量、形状和新旧程度来适当调整，更好是在37～60℃24小时以内。EDTA水溶液的浓度较好是0.2～0.5M，更好是以0.5M的浓度调至pH8.0(图1(1.c))。
(2)溶解步骤
向经脱钙的来源于生物的试样加入增溶剂缓冲液，使DNA-蛋白质的复合体溶解。增溶剂缓冲液为含有0.5～2.5重量％的去污剂的缓冲液，可以例举例如100mM氯化钠、10mM的Tris盐酸盐和2重量％作为去污剂的SDS的水溶液。
接着，在复合体的溶解液中加入蛋白质分解酶液，在37～65℃维持0.5～6小时的同时根据需要适当进行搅拌。对分解复合体中的蛋白质的蛋白质分解酶液没有特别限定，但特别好是蛋白酶K(图1(2.a))。
(3)提取步骤
向(2)的复合体溶解液中加入含有1mM的EDTA的10mM的Tris盐酸盐的饱和苯酚缓冲液(pH8.0)，例如TE饱和苯酚(纳卡莱泰思科株式会社(ナカライテスク株式会社)制，商品名)，除去蛋白质及其分解产物(图1(3.a))。
接着，将其离心分离，从其上清分离含有DNA的水层部。水层部在容量大的情况下，可以通过超滤、例如使用Centricon 30(阿米空公司(AmiconInc.)制；商品名)的离心法进行浓缩。藉此，分取DNA提取液(图1(3.b))。
(4)纯化步骤
将DNA提取液通过硅膜柱、例如QIAamp DNA血液迷你试剂盒(奇基株式会社(株式会社キアゲン)制，QIAamp为注册商标)附带的硅膜柱而进行纯化后，获得DNA(图1(4.a))。
另外，可以使用含有SDS的EDTA水溶液代替前述的(1)预处理步骤中使用的EDTA水溶液。该情况下，较好是在含有SDS的EDTA水溶液于37～60℃孵育2小时～2天，从而实施用于除去钙成分的脱钙。孵育的温度和时间较好是根据来源于生物的试样的容量、形状和新旧程度来适当调整，更好是24小时以内。EDTA水溶液的浓度较好是0.2～0.5M，更好是以0.5M的浓度调至pH8.0。SDS的浓度较好是0.1～0.5重量％(图1(1.c))。
可以使用硅珠填充柱、例如使用磁性硅珠的MagExtractor(东洋纺织株式会社(東洋紡绩株式会社)制：注册商标)代替硅膜柱。虽然收率稍有下降，但可以是苯酚-氯仿法。
以下，对于实际从来源于生物的试样采集DNA的例子进行说明。
(实施例1)
用在中性洗剂的水溶液中浸渍了的刷子擦去附着于牙齿表面的污染物，向牙齿浇无菌蒸馏水冲去中性洗剂，用乙醇冲洗牙齿，通过吹风机使其快速风干。
将牙齿置于边长约3cm的立方体木片的台座，在牙齿和台座间的间隙滴1～2滴aron alpha(东亚合成株式会社(東亜合成株式会社)制，注册商标)，将两者固定。在透明的塑料袋中，通过牙科用的圆盘磨床将牙根部分切成厚0.1cm以上的片，切出1～6片圆板状的片段。持切片晃动除去粉末后，获得不含粉末的切片。
将该1～6片切片放入50mL的培养试管，加入30～50mL 0.5M的EDTA(pH8.0)水溶液(和光纯药工业株式会社(和光纯薬工業株式会社)制；商品名)，再加入SDS至0.1重量％，在37～50℃孵育12小时，使其脱钙。将牙齿移至2mL的培养试管，用700μL 0.5M的EDTA(pH8.0)水溶液洗涤。将培养试管内的EDTA水溶液用移液管吸出。
向培养试管的牙齿加入100～200μL作为增溶剂缓冲液的溶解液(10mM的Tris盐酸盐、100mM的氯化钠、2重量％SDS)和20～40μL作为蛋白质分解酶液的20mg/mL的蛋白质酶K溶液(和光纯药工业株式会社(和光纯薬工業株式会社)制；商品名)，在50℃搅拌1～2小时进行孵育，再加入20～30μL蛋白质酶K溶液，在50℃搅拌1～2小时进行孵育。
在培养试管中，牙齿的各切片分别在确认一半以上可溶化后，加入与其同量的TE饱和苯酚(纳卡莱泰思科株式会社(ナカライテスク株式会社)制，商品名)，缓缓地倒转混合10～20次。然后，以13000rpm进行离心分离5分钟，将上清水层部移至另一2mL培养试管。水层部的容量大的情况下，通过使用Centricon 30(阿米空公司(Amicon Inc.)制；商品名)的超滤浓缩至100～300μL，获得DNA提取液。
使用QIAamp DNA血液迷你试剂盒(奇基株式会社(株式会社キアゲン)制，QIAamp为注册商标)，按照其操作步骤从DNA提取液纯化DNA。另外，最终的DNA的洗脱使用50μL QIAamp DNA血液迷你试剂盒(奇基株式会社(株式会社キアゲン)制，QIAamp为注册商标)附带的AE缓冲液。对于得到的DNA，进行了PCR和电泳，未发现杂质。
(实施例2)
用在中性洗剂的水溶液中浸渍了的刷子擦去附着于牙齿表面的污染物，向牙齿浇无菌蒸馏水冲去中性洗剂，用乙醇冲洗牙齿，通过吹风机使其快速风干。
将整颗牙齿放入50mL的培养试管，加入30～50mL 0.5M的EDTA(pH8.0)水溶液(和光纯药工业株式会社(和光纯薬工業株式会社)制；商品名)，再加入SDS至0.1重量％，在37～50℃孵育12小时，使其脱钙。将牙齿移至2mL的培养试管，用700μL 0.5M的EDTA(pH8.0)水溶液洗涤。将培养试管内的EDTA水溶液用移液管吸出。
向培养试管的牙齿加入100～200μL作为增溶剂缓冲液的溶解液(10mM的Tris盐酸盐、100mM的氯化钠、2重量％SDS)和20～40μL作为蛋白质分解酶液的20mg/mL的蛋白质酶K溶液(和光纯药工业株式会社(和光纯薬工業株式会社)制；商品名)，在50℃搅拌1～2小时进行孵育，再加入20～30μL蛋白质酶K溶液，在50℃搅拌1～2小时进行孵育。
在培养试管中，确认溶液的颜色变成浅黄色且牙齿可溶化后，加入与其同量的TE饱和苯酚(纳卡莱泰思科株式会社(ナカライテスク株式会社)制，商品名)，缓缓地倒转混合10～20次。然后，以13000rpm进行离心分离5分钟，将上清水层部移至另一2mL培养试管。水层部的容量大的情况下，通过使用Centricon 30(阿米空公司(Amicon Inc.)制；商品名)的超滤浓缩至100～300μL，获得DNA提取液。
使用QIAamp DNA血液迷你试剂盒(奇基株式会社(株式会社キアゲン)制，QIAamp为注册商标)，按照其操作步骤从DNA提取液纯化DNA。另外，最终的DNA的洗脱使用50μL QIAamp DNA血液迷你试剂盒(奇基株式会社(株式会社キアゲン)制，QIAamp为注册商标)附带的AE缓冲液。对于得到的DNA，进行了PCR和电泳，未发现杂质。
产业上利用的可能性
本发明的DNA的采集方法可以在从由阵亡者遗骨、古代遗迹的遗骨、灾害时的遗体、失踪者的遗体等获得的作为硬组织的牙齿或骨提取DNA时使用。如果采用本发明则可以提取高品质的DNA，所以可以在法医学的DNA鉴定或生物学的基因分析中获得正确的数据。
Claims (14)
1.DNA采集方法，其特征在于，依次实施以下的步骤：
(1)实施将由硬组织构成的来源于生物的试样整块地使用或者切断或粉碎后使用的片段化操作，
以及随后向其添加含有乙二胺四乙酸(EDTA)的水溶液的脱钙操作的预处理步骤；
(2)向(1)得到的试样，加入溶解来源于生物的试样中的DNA-蛋白质的复合体的增溶剂缓冲液和蛋白质分解酶，调制DNA-蛋白质的复合体的溶解液的溶解步骤；
(3)向(2)的复合体溶解液中，加入饱和三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐的苯酚缓冲液或者含碘化钠-异丙醇的水溶液来除去蛋白质后，分取DNA提取液的提取步骤；
(4)将(3)的DNA提取液通过柱，纯化DNA的纯化步骤。
2.如权利要求1所述的DNA采集方法，其特征在于，所述硬组织为牙齿或骨。
3.如权利要求2所述的DNA采集方法，其特征在于，所述片段化操作是，试样为牙齿的情况下整块地使用，或者试样为牙齿或骨的情况下，制成厚0.1～0.5cm的切片或至少粉碎成宽5mm左右的颗粒来使用，获得不含粉末的片段。
4.如权利要求1所述的DNA采集方法，其特征在于，所述预处理步骤中，所述EDTA含有表面活性剂。
5.如权利要求4所述的DNA采集方法，其特征在于，所述表面活性剂是离子型表面活性剂。
6.如权利要求5所述的DNA采集方法，其特征在于，所述离子型表面活性剂为十二烷基硫酸钠(SDS)。
7.如权利要求4所述的DNA采集方法，其特征在于，所述EDTA中的所述表面活性剂的浓度为0.1～0.5重量％。
8.如权利要求1所述的DNA采集方法，其特征在于，所述预处理步骤中，在所述EDTA中于20～60℃浸渍2小时～2天来进行所述脱钙操作。
9.如权利要求4所述的DNA采集方法，其特征在于，所述预处理步骤中，在含有所述表面活性剂的所述EDTA中于37～60℃浸渍2小时～2天来进行所述脱钙操作。
10.如权利要求1所述的DNA采集方法，其特征在于，所述预处理步骤中，所述来源于生物的试样是通过清洁操作清洁了的试样。
11.如权利要求10所述的DNA采集方法，其特征在于，所述清洁操作是将所述来源于生物的试样依次用中性洗剂水溶液、水、乙醇洗涤后，干燥。
12.如权利要求1所述的DNA采集方法，其特征在于，所述溶解步骤中，在所述复合体的溶解液中加入所述蛋白质分解酶，在37～65℃维持0.5～6小时，调制所述DNA溶液。
13.如权利要求1所述的DNA采集方法，其特征在于，所述提取步骤中，加入所述苯酚缓冲液后，将上清水层部分离，分取所述DNA提取液。
14.如权利要求1所述的DNA采集方法，其特征在于，所述纯化步骤中，所述柱是硅膜柱、硅珠填充柱或碘化钠离心操作。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103865921A (zh) * | 2014-02-27 | 2014-06-18 | 中国水产科学研究院珠江水产研究所 | 一种利用趾甲提取dna扩增三线闭壳龟线粒体全长的方法 |
| CN105420229A (zh) * | 2016-01-08 | 2016-03-23 | 中南大学 | 一种提取古代生物骨骼dna的裂解液及方法 |
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2006
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| CN103865921B (zh) * | 2014-02-27 | 2016-01-20 | 中国水产科学研究院珠江水产研究所 | 一种利用趾甲提取dna扩增三线闭壳龟线粒体全长的方法 |
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