JP2023052524A - 迅速な核酸抽出、精製および分析のためのシステムならびに方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明者は、核酸含有材料、特に、骨、歯および精液(性的暴行キットからの膣スワブを含む)から核酸を抽出し精製するための、より簡単でかつより迅速な方法を発見した。骨および歯については、ハンマーによって生成された単純な断片は、処理に適し、骨/歯の粉末は不必要である。1つの態様において、本発明は、核酸含有材料から核酸を抽出するための単純化され速い方法に指向される。もう一つの態様において、本発明は、核酸含有材料から核酸を抽出するための、単純化され迅速な方法を行なうためのキットである。さらにもう一つの態様において、本発明は、迅速な核酸分析、例えば、STRプロファイリングに基づいた迅速DNA鑑定のための統合方法であり、その試料の処理、DNA抽出、精製、増幅、分離、検出および分析は、速く、効率的で、かつ十分に統合された方法で生じる。
1つの態様において、本発明は、骨または歯から核酸を抽出するための単純化され速い方法であり、前記方法は、核酸抽出に適する形態の核酸含有材料試料を提供する工程、脱塩緩衝液、例えば、0.5M EDTA中で試料を激しく混合する工程、混合物を分離して、抽出された核酸を含む混合物の液体部分を得る工程を含む。
もう一つの態様において、本発明は、核酸含有材料、例えば、骨または歯から核酸を抽出するための単純化され速い方法を行なうためのキットである。
さらにもう一つの態様において、本発明は、骨または歯の試料からの核酸のSTRプロフィールの決定方法である。いくつかの具体例において、方法は、核酸抽出に適する形態の核酸含有材料を提供し;EDTAを添加し、核酸含有材料を脱塩して、混合物を得;前記混合物を激しく混合し;前記混合物を分離して、抽出された核酸を含む液体試料を得;液体上清のすべてではないならば、一部分をSTRプロフィールの十分に統合された核酸精製および生成に付すことを含む。
さらにもう一つの態様において、本発明は、骨または歯の試料からの核酸のSTRプロフィールを決定するためのキットである。いくつかの具体例において、キットは脱塩緩衝液として0.5M EDTA;迅速な核酸抽出方法を詳述する小冊子;およびLDC BCS中の抽出された核酸を分析するためのスワブを含み得る。
もう一つの態様において、本発明は精液試料からの核酸を分析するための方法である。精液試料はニートの精液またはファブリック上の精液汚れであり得る。別法として、精液試料は、個体から直接的または間接的に収集し得る。いくつかの例において、精液試料は法医学的な精液試料、例えば、ケースワーク精液試料であり得る。たとえ精液試料の形態が変化し得るとしても、精液試料がスワブヘッド上に収集し得る限りは、本発明は同様に適用可能である。
依然としてさらにもう一つの態様において、本発明は、精液試料からの核酸のSTRプロフィールを決定するためのキットである。1つの具体例において、キットは、DTTまたはTCEPの溶液、本願に開示されるような精液試料からの迅速核酸抽出方法を詳述する小冊子、およびIチップ中の抽出された核酸を収集および分析するために用いるスワブを含む。いくつかの例において、DTT溶液は、150mMに等しいまたはそれに近いDTT濃度を有し、TCEP溶液は、50mMに等しいまたはそれに近いTCEP濃度を有する。精液試料がファブリック上の精液汚れである場合、キットはファブリックから精液試料を収集するために、ツール、例えば、ナイフ、カミソリ刀、メスをさらに含み得る。また、キットは、滅菌水を含む滴瓶ボトルまたは滅菌水を含むアンプルを含む。いくつかの具体例において、キットを用いて、以下のSTR:D3S1358、TH01、D21S11、D18S51、Penta E、D5S818、D13S17、D7S820、D16D539、CSF1PO、PentaD、Am、vWA、D8S1179、TPOXおよびFGAのプロフィールを生成し得る。
抽出された核酸は、種々の核酸分析システム、例えば、ANDE(商標)迅速DNA分析システム(ANDE株式会社)で分析し得る。ANDE(商標)システムは、自動データ分析用の内蔵(on-board)エキスパートシステム・ソフトウェアを備えた完全自動システムである。システムは、約90分間で高DNA含量試料(例えば、バッカルスワブ)から、105分間でケースワーク、問題の現場取り込み(sensitive site exploitation)および集団災害試料(例えば、血痕、チューインガム、飲み物容器、衣類、ステアリングホイール、ドア取っ手、携帯電話およびキーボードのごとき触れられた物、肝臓、肺、脳、骨および歯)からのSTRプロフィールと呼ばれるものを生成することができる。システムは、高低DNA含量チップ(本明細書に引用された「Aチップ」および「Iチップ」)の使用のために設計されている。AチップおよびIチップ消耗品は、STR分析に必要とされたすべての試薬が予め工場にて詰められた「オール・イン・ワン」使い捨てカセットである。Aチップは、大量のDNAを含む試料、例えば、バッカルスワブのために設計され、また、Iチップは、典型的にはより小量のDNAを含む試料-例えば、小さな血液汚れ、吸殻タバコ、またはステアリングホイールスワブを含む試料のために設計されている。これらの消耗品は双方が、本明細書の教示を用いて調製された骨、歯、精液、および他の試料の処理に適する。骨中に存在するDNA量は、収集までのPMI、遺体の条件(例えば、分解した遺体、焼けた)、骨髄の存在または不存在、身体からの骨のタイプおよびドナーの年齢および健康を含めたいくつかの因子により影響され得る。比較的新鮮で無傷の骨は、環境または損傷に曝露されたより古いものより、より多量のDNAを含有し得るようである。
この実施例において、発明者らは、骨試料からの迅速な核酸抽出を行ない、スワブおよびANDEシステムにおけるIチップを用いる、抽出された核酸を分析した。
この実施例において、発明者らは、歯試料からの迅速な核酸抽出を行ない、スワブおよびLDC BCSシステムにおいて抽出した核酸を分析した。その手順は実施例1の改変である。1分間のボルテックス混合後、歯試料を56℃にて10分間インキュベートして、脱塩を増強した。その結果、発明者らは、歯試料から抽出した核酸のSTRプロフィールを得ることができた。図9を参照、これは歯根の200mgの凍結粉砕した歯粉末から抽出した核酸のSTRプロフィールを示す。
ケースワーク歯試料は、少なくとも2年間埋められ、焼けた身体から得られた。歯試料は、布および漂白剤で表面をこすりつつ、流水および抗菌性石鹸で洗浄した。次いで、試料を漂白剤-滅菌水-エタノールの濯ぎに付し、10分間乾燥させた。歯根はドレメル(dremel)を用いて、歯冠から分離させた。次いで、歯根を凍結粉砕し、200mgを脱塩した。
典型的には、精液試料は、1mL当たり約5000万個の細胞を含有する。氷上解凍後に、精液試料を含むチューブを注意深く開封し、試料を試料検索に先立って試料の均質性を保証するために上下にピペッティングすることにより、優しく混合した。1×PBS緩衝液中で10~100倍希釈した50μlの精液をANDEスワブ上にピペッティングした。そのウエブに、最終濃度が150mMのDL-ジチオトレイトール(DTT)(Sigma Aldrich; Catalog #43816)または50μlの50mMトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩(TCEP)(Sigma Aldrich; Catalog #646547)を添加し、Iチップにおける分析に先立って室温にて1~10分間インキュベートした。
この実施例において、発明者らは、精液試料からの迅速な核酸抽出を行ない、Iチップを用いてスワブ中の抽出された核酸を分析した。ここに、発明者らは、以下の工程1に記載したごとく調製された模擬の精液試料を用いた。ケースワーク精液試料について、この精液試料調製工程(工程1)をスキップした。
約100μlのニートの精液を綿ファブリックおよび/またはデニム上に移した。乾燥した汚れが肉眼で可視し得ないので、生物学的材料を正確な位置から収集することを保証するために、精液の汚れがまだ湿っている間に、汚れを取り巻く隣接した領域をマジックインキでマーキングした。ファブリック上の精液汚れを室温にて一晩乾燥させた。
この工程は、精液で汚されたファブリック片からDNA含有精液試料を収集するために行った。ファブリック片を無菌の作業スペース上に置いた。発明者らは、清潔なカミソリ刀または無菌の使い捨てのメスを用いて、ファブリック繊維の一群が形成されるまで、すべてのマークされた汚れたファブリックを徹底的にこすった。30mLの液滴瓶(drop-dispenser bottle)からの2~3滴の滅菌水で予め湿らせた(VWR;カタログを用いてDNA含有精液試料を収集した。#16354-421)。
発明者らは、ANDE Iチップを用いて、スワブ上の核酸を処理し分析した。具体的には、発明者らは、第1のスワブチャンバー(Iチップの頂部上に判明した)から保護プラスチックシールを除去し、ANDE装置の「試行を行う(Perform Run)」を選択し、続いてスワブキャップのみを用いて、スワブRFIDをスキャンするためにスクリーニングし、試料IDを入れ、次いで、スワブキャップが適所へ確実にカチッと嵌るまでスワブを押し下げることにより、スワブチャンバーにスワブを挿入した
性交後24時間、48時間および72時間の間隔でのいくつかのドナーペアからの膣スワブを処理し分析した。SAKプロトコールは図27にまとめられている。スワブは、ANDEのプロテイナーゼKおよび溶解溶液を含むチューブ1に入れた。次いで、試料を10秒間ボルテックス混合し、フラッシュスピン(flashspin)させた。スワブは、チューブ1に挿入した回転バスケットに手動で移し、5分間遠心分離した。この遠心分離時間を2分間まで低下することができる。遠心分離は、生物学的試料を含有し得るいずれかの残留液からスワブを除去する。次いで、乾燥したスワブを含む回転バスケットを取り出し、廃棄した。水相は、本質的に、溶解された上皮細胞を含有する女性画分である。女性画分を注意深くピペッティングし、もう一つの微量遠心チューブのチューブ2に移した。Iチップ中の女性画分の分析のために、5~10μlのその画分をANDEスワブ上に置いた。精子細胞は、存在する場合、チューブ1の底部にペレット化される。したがって、ペレットを乱さないか、誤ってそれを除去しないことが重要である。ピペットチップは、チューブの底部に触れるべきではなく、液体の約50μlを保持して、精子細胞試料損失を回避することができる。次いで、女性画分からの最小の液体を含むペレットは、チューブ1の1ミリリットルラインまでMgCl2およびCaCl2を含む洗浄緩衝液を加えることにより洗浄した。次いで、その混合物を5秒間ボルテックス混合し、20,000×gで2分間遠心分離して、精子を再ペレット化した。約50μlの水相を保持し、残りを廃棄した。次いで、均質化された精子は、2000U~10000Uのヌクレアーゼを含むチューブ3に移し;2000Uは、37Cでの10分間インキュベーションでこの作業について可溶性DNAを分解するのに十分な量である。その反応は、0.5M EDTAを含む20μlの停止液を加え、次いで、56Cで10分間のインキュベーションによりクエンチし;56Cでの3分間までのさらなる還元は、そのヌクレアーゼを非活性化するのに十分である。本発明において用いたヌクレアーゼは組み換えDNAseI(Sigma Aldrich; Catalog #04536282001)である。最後に、DL-ジチオトレイトール(DTT)(Sigma Aldrich; Catalog #43816)またはトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩(TCEP)(Sigma Aldrich; Catalog #646547)は、各々、150mM DTTおよび50mM TCEPに等しいまたはそれに近い最終濃度にて添加し、5秒間ボルテックス混合した。得られた溶液は男性画分であり、Iチップにおける分析のためのANDEスワブで収集することができる。
Claims (47)
- 骨または歯の試料からの核酸抽出方法であって、
a.核酸抽出に適する形態の試料を提供し;
b.脱塩緩衝液を核酸含有材料に添加して、混合物を得;
c.前記混合物を激しく混合し;次いで
d.前記混合物を分離して、液体上清を得、ここに、液体上清は抽出された核酸を含有する
ことを含む前記方法。 - 分離工程が、核酸を濃縮することを含まない、請求項1記載の方法。
- 前記試料が、核酸抽出に適する形態で提供されるように、粉末に摩砕されるか、または断片に打砕かれる、請求項1記載の方法。
- 前記試料が分解された骨または歯の試料である、請求項3記載の方法。
- 骨または歯の試料からの核酸抽出方法であって、
a.核酸抽出に適する形態の骨または歯の試料を提供し;
b.500μ1未満の0.SM EDTAまたは等価な脱塩緩衝液を核酸含有材料に添加して、混合物を得;
c.前記混合物を激しく混合し;
d.混合物を加熱に付すか、あるいは該加熱を付すことなく、少なくとも1分間前記混合物をインキュベートし;
e.前記混合物を分離して、濃縮なく液体上清を得、ここに、液体上清は抽出された核酸を含有する
ことを含む前記方法。 - 前記試料が、歯試料が核酸抽出に適する形態で提供されるように、粉末に摩砕されるか、または断片に打砕かれる、請求項5記載の方法。
- 前記試料が10mg未満の体積を有する、請求項5記載の方法。
- 前記試料が分解された骨または歯の試料である、請求項5記載の方法。
- 混合物を分離して液体上清を得る工程が、遠心分離によって達成される、請求項1記載の方法。
- 前記遠心分離が、20,000ref以上の速度での2分間以上である、請求項9記載の方法。
- 液体上清の一部分を核酸分析に付す工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 前記核酸分析が迅速DNA処理システムに液体上清の一部分を移すことを含む、請求項11記載の方法。
- 混合物を激しく混合する工程が、混合物を約30秒以上ボルテックス混合することにより実施される、請求項1記載の方法。
- 核酸含有材料からの迅速な核酸抽出用キットであって、
a.脱塩緩衝液;および
b.請求項1に記載の迅速な核酸抽出方法を詳述する小冊子
を含む前記キット。 - 迅速DNA分析システムに抽出された核酸を輸送するための媒体をさらに含む請求項14記載のキット。
- 骨および歯の試料を洗浄し清浄化する溶液をさらに含む請求項14記載のキット。
- 前記溶液が70%エタノールおよび10%漂白剤である、請求項16記載のキット。
- 前記脱塩緩衝液が0.5M EDTAである請求項14記載のキット。
- 骨または歯の試料からの核酸のSTRプロフィールを決定するための方法であって、
a.核酸抽出に適する形態の骨または歯を提供し;
b.脱塩緩衝液を骨または歯に添加して、混合物を得;
c.前記混合物を激しく混合し;
d.前記混合物を分離して、液体上清を得;ここに、液体上清は抽出された核酸を含有し;次いで、
e.液体上清の一部分を核酸分析に付して、骨または歯からの核酸のSTRプロフィールを決定する
ことを含む前記方法。 - 前記骨または歯の試料が、核酸抽出に適する形態で提供されるように粉末に摩砕されるか、または断片に打砕かれる、請求項19記載の方法。
- 前記試料が分解された骨または歯の試料である、請求項20記載の方法。
- 混合物を分離して、液体上清を得るための工程が、遠心分離によって達成される、請求項19記載の方法。
- 前記遠心分離が20,000rcf以上の速度での2分間以上である、請求項22記載の方法。
- 混合物を激しく混合する工程が、混合物を約30秒以上ボルテックス混合することにより、実施される、請求項19記載の方法。
- 前記核酸分析が、迅速DNA処理システムに液体上清の一部分を移すことを含む、請求項19記載の方法。
- 少なくとも7つのSTR遺伝子座が統合される、請求項25記載の方法。
- 前記脱塩緩衝液が0.5M EDTAである、請求項19記載の方法。
- 精液試料からの核酸のSTRプロフィールを決定するための方法であって、
a.スワブ上に精液試料を収集し;
b.適切な量の精子破壊剤をスワブヘッド上に適用し;次いで
c.迅速DNA処理システムにスワブを移す
ことを含む前記方法。 - 前記精液試料が、ニートの精液または精液汚れであり得る請求項28記載の方法。
- 精液破壊溶液が、DTTまたはTCEPであり、各々、約150mMまたは50mMの濃度を有し、かつDTTまたはTCEP溶液の適切な体積が50μlである、請求項28記載の方法。
- 少なくとも7つのSTR遺伝子座が、質問(interrogated)される、請求項28記載の方法。
- 骨または歯の試料からの核酸のSTRプロフィールを決定するためのキットであって、
a.脱塩溶液;
b.請求項19に記載の迅速な核酸抽出方法を詳述する小冊子;および
c.迅速DNA分析システムにおける抽出された核酸を分析するためのスワブ
を含む前記キット。 - 前記骨または歯の試料を洗浄し清浄化するための溶液をさらに含む請求項32記載のキット。
- 前記溶液が70%エタノールおよび10%漂白剤である請求項32記載のキット。
- 少なくとも7つのSTR遺伝子座が質問される請求項32記載のキット。
- 前記脱塩溶液が0.5M EDTAである請求項32記載のキット。
- 骨または歯の試料からの核酸のSTRプロフィールを決定するためのキットであって、
a.DTTまたはTCEP溶液;
b.請求項28に記載の迅速な核酸抽出方法を詳述する小冊子;および
c.迅速DNA分析システムにおける抽出された核酸を分析するためのスワブ
を含む前記キット。 - 前記DTTまたはTCEP溶液が、各々、150mMおよび50mMに等しいまたはそれに近い濃度を有する請求項37記載のキット。
- ファブリックまたは他の担体から精液試料を収集するためのツールをさらに含む請求項37記載のキット。
- 少なくとも7つのSTRが統合される請求項37記載のキット。
- 性交後の膣および膣頚部のスワブ中の女性上皮細胞から精子細胞を分離する方法であって、
a.スワブからの上皮細胞の溶解;
b.溶解された上皮細胞からの無傷の精子細胞の物理的分離;
c.無傷の精子細胞からの溶解された水性上皮画分の除去;
d.洗浄緩衝液による無傷の精子細胞の洗浄;
e.ヌクレアーゼ処理による細胞外DNAの分解;
f.ヌクレアーゼの不活性化;
g.精子破壊剤による精子細胞の溶解;
h.溶解した精子画分の収集
を含む前記方法。 - 性交後の膣または膣頚部のスワブからの核酸のSTRプロフィールを決定するためのキットであって、
a.溶解溶液、
b.回転バスケット、
c.洗浄緩衝液、
d.精子破壊剤、
e.試料収集および請求項41に記載の迅速な核酸抽出方法を詳述する小冊子、および;
f.抽出された核酸を輸送するための媒体
を含む前記キット。 - 少なくとも7つのSTRが質問される請求項42記載のキット。
- 精子を含有する疑いがある試料からの核酸抽出方法であって、
a.試料を第1の溶解溶液を含有する試料容器に挿入し、撹拌して、第1の混合物を作製し;
b.第1の混合物を遠心分離し;
c.緩衝液で前記第1の容器中のペレットを洗浄し;
d.第1の容器を第2の遠心分離に付し、前記試料中に存在するいずれの精子も再ペレット化し;
e.DNAを分解するのに十分な量でかつ十分な条件下で、ヌクレアーゼを含有する第2の容器に少なくとも一部分の精子を移し;
f.精子破壊剤を添加し;
g.さらなる処理のための破壊した精子画分を回収する
ことを含む前記方法。 - 前記試料が膣または膣頚部のスワブ試料を含み、破壊した精子画分が核酸の単数もしくは複数のドナーのSTRプロフィールを決定するさらなる分析のために移される、請求項44記載の方法。
- 核酸の単数もしくは複数のドナーのSTRプロフィールを決定する前記分析が、迅速DNA鑑定によって行なわれる、請求項45記載の方法。
- 前記迅速DNA鑑定が、データ分析用の完全自動エキスパートシステムを含む、請求項46記載の方法。
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