CN102676689B

CN102676689B - 一种脊尾白虾微卫星标记的3重pcr检测方法

Info

Publication number: CN102676689B
Application number: CN2012101905859A
Authority: CN
Inventors: 刘萍; 李健; 贾舒雯
Original assignee: Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Current assignee: Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority date: 2012-06-11
Filing date: 2012-06-11
Publication date: 2013-09-18
Anticipated expiration: 2032-06-11
Also published as: CN102676689A

Abstract

本发明提供了一种脊尾白虾微卫星标记的3重PCR检测方法，它包括设计并合成3重PCR引物；提取基因组DNA；3重PCR反应；检测PCR产物；PCR反应包括3重PCR反应体系和3重PCR反应程序。本发明建立了进行脊尾白虾家系和亲子鉴定的3重PCR反应体系，实现了在一个PCR反应中同时检测3个微卫星位点，因此与原有的PCR方法相比效率提高了3倍。本发明具有高效、经济、简便易行等特点，可以在脊尾白虾遗传多样性分析、亲缘关系鉴定、家系管理和良种选育进行推广应用。

Description

一种脊尾白虾微卫星标记的3重PCR检测方法

技术领域

本发明涉及脊尾白虾微卫星标记的PCR检测方法，具体涉及一种脊尾白虾微卫星标记的3重PCR检测方法。

背景技术

微卫星(microsatellites)或称简单序列重复(simple sequence repeats,SSR)是指由1～6个核苷酸组成的简单串联重复DNA序列。迄今研究过的所有生物种类中都发现了它的存在，并且分布密度很大。由于微卫星广泛分布于基因组中，具有密度大、多态性丰富、高度杂合且稳定性好、遵循孟德尔分离定律共显性遗传、易于PCR扩增等特点，已成为近年来最引人注目的新型DNA标记，并广泛应用于生物资源的家系谱系认证、基因连锁分析、遗传图谱构建、种质鉴定、种群遗传多样性等许多研究领域。多重PCR(Multiplex PCR)是在同一个反应中同时扩增两个或多个位点的聚合链式反应。它具有提高效率，避免样品浪费，快速周转时间，并可大大节约实验成本的优点。

微卫星多重PCR技术在水产动物中已有广泛应用，主要进行亲子鉴定和遗传多样性分析，Patricia Novel等已在狼鲈(Dicentrarchus labrax)、

等在褐鳟(Salmo trutta)、Javier Porta等在塞内加尔鳎(Soleasenegalensis)、Yan Wang等在牡蛎(Crassostrea virginica Gmelin)、GAO Huan等在中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)、Yutao Li等在斑节对虾（Penaeusmonodon）和任宪云等在三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）中有相关报道。

随着脊尾白虾人工养殖业的迅速发展，其基础研究工作近年来逐渐开展起来，截止到目前为止，脊尾白虾还未见有微卫星多重PCR体系建立等方面的技术。

发明内容

针对现有技术中脊尾白虾基础研究工作缺失，给家系建立过程中遗传参数的评估带来困难等缺点，本发明提供了一种脊尾白虾微卫星标记的3重PCR检测方法，本发明在大量微卫星分子标记的基础上构建了3重PCR检测体系，大大缩短实验时间，提高了实验效率，所得结果可同时反映出脊尾白虾在多个微卫星位点的遗传变异。

为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：

一种脊尾白虾微卫星标记的3重PCR检测方法，它包括：(1)设计并合成3重PCR引物；(2)提取基因组DNA；(3)3重PCR反应；(4)检测PCR产物；其特征在于所述3重PCR反应包括3重PCR反应体系和3重PCR反应程序，所述3重PCR反应体系的引物为EC7、EC54和EC709的组合，所述各引物序列如下：

EC007 F:AATATGCAGTGGCAAGCT；

R:TTCCCATCATCTTCCTCC；

EC054 F:CTTTGCCCCTACTAACTGTTGC；

R:ACGACTGACCTGAGAAATCCCT；

EC709 F:GGCTGTCCCTTGGAACTA；

R:ACGAAATCCGAATAACCC。

进一步的，所述3重PCR反应体系为：10×Buffer 2.0μL；25mmol/L MgCl₂1.2μL；10mmol/L dNTP 1.5μL；所述5mmol/L引物EC007:F:1.5μL+R:1.5μL、EC054:F:05μL+R:0.5μL、EC709：F:1.5μL+R:1.5μL；50ng/μL脊尾白虾基因组DNA 2.0μL；5U/μLTaq聚合酶0.2μL；ddH₂O补充至20μL。

再进一步的，所述PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸45s，共进行25次循环；最后72℃延伸5min；4℃保存并结束反应。

其中，本发明采用琼脂糖凝胶电泳方法检测PCR产物。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：

1、微卫星标记由于其多态性丰富、易于检测、呈孟德尔共显性遗传等优点，是进行系谱分析和群体遗传多样性研究的一种比较理想的工具，但常规PCR扩增在一个脊尾白虾检测中只能获得1~2个点位基因。本发明所述检测方法是在多个多态性微卫星标记的基础上进行标记间组合、搭配以及实验方法优化，获得更简便、快捷的PCR检测方法，大大缩短了实验时间，它与常规的PCR方法相比效率提高了3倍左右，且所得结果可同时反映出脊尾白虾在多个微卫星位点的遗传变异。

2、本发明可以在脊尾白虾群体遗传多样性分析、亲子鉴定、家系管理和良种选育进行推广应用。

结合附图阅读本发明的具体实施方式后，本发明的其他特点和优点将变得更加清楚。

附图说明

图1是本发明的微卫星标记3重PCR检测方法对脊尾白虾8个个体的检测图谱，1-8是8个脊尾白虾个体，M为MD206-pBR322DNA/MspI DNA分子Marker。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。

实施例1

本发明提供的脊尾白虾微卫星标记的3重PCR构建方法如下：

1、以本发明提供的脊尾白虾微卫星富集文库中的微卫星核心序列为基础，使用Primer Premier 6.0软件在其微卫星核心序列的两端设计相应的PCR引物，获得一系列具有PCR扩增产物大小不等的SSR标记。

2、利用Primer Premier 6.0软件进行引物间的评价，对显示大部分的ΔG（能量变化的Gibbs）值在-4以上的引物选出备用，ΔG（能量变化的Gibbs）值在-4以上主要说明多重PCR体系中单对引物之间不易形成引物二聚体以及具有低发夹结构，以免影响PCR反应效率。通过对多对微卫星标记引物间的搭配、组合，对其进行多重PCR体系的构建及测试，并对PCR实验的反应条件和加样参数进行优化，从而建立了本发明所述的1组3重微卫星PCR检测方法。

本发明的一种脊尾白虾微卫星标记的3重PCR检测方法具体步骤如下：

(1)、本发明所选用的3种引物序列如下：

(2)、脊尾白虾基因组DNA提取：取脊尾白虾肌肉组织，采用苯酚/氯仿的方法提取脊尾白虾基因组DNA。1％琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA完整性，利用RNA/DNA分光光度仪进行基因组DNA浓度的检测并稀释成50ng/μl终浓度，-20℃保存备用。

(3)、PCR反应体系为：10×Buffer 2.0μL；25mmol/L MgCl₂1.2μL；10mmol/LdNTP 1.5μL；所述5mmol/L引物EC007:F:1.5μL+R:1.5μL、EC054:F:05μL+R:0.5μL、EC709：F:1.5μL+R:1.5μL；50ng/μL脊尾白虾基因组DNA 2.0μL；5U/μL Taq聚合酶0.2μL；ddH₂O补充至20μL。

常规PCR的反应程序：95℃预变性5min；95℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸45s，共进行25次循环；最后72℃延伸5min；4℃保存并结束反应。

(4)、PCR产物的检测：将PCR产物在6%的变性聚丙烯酰胺凝胶，12W恒功率电泳1-1.5小时进行分离。将胶板通过10%的冰醋酸溶液20min→蒸馏水6min→0.1%的硝酸银溶液25min→3%的碳酸钠溶液显色数分钟，终止反应。即可得到脊尾白虾EC007、EC054和EC709共3个基因位点的组合的具有高度多态性的图谱，实验结果如图1所示，图1中1-8为8个脊尾白虾个体采用本发明所述3重PCR检测方法的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。实验结果表明效果良好。

依据本发明提供的脊尾白虾微卫星标记3重PCR的引物组合和检测方法可以快速地检测脊尾白虾单个个体在3个微卫星区的遗传变异，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱直观地表现出个体的指纹图谱，本发明可用于脊尾白虾的亲子鉴定和遗传多样性分析等。本发明可广泛应用于脊尾白虾群体遗传标记筛选、系谱认证、遗传图谱构建等方面。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国水产科学研究院黄海水产研究所

<120> 一种脊尾白虾微卫星标记的3重PCR检测方法

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aatatgcagt ggcaagct 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ttcccatcat cttcctcc 18

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ctttgcccct actaactgtt gc 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

acgactgacc tgagaaatcc ct 22

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggctgtccct tggaacta 18

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

acgaaatccg aataaccc 18

Claims

1.一种脊尾白虾微卫星标记的3重PCR非诊断目的的检测方法，它包括：(1)设计并合成3重PCR引物；(2) 提取基因组DNA；(3)3重PCR反应；(4) 检测PCR产物；其特征在于所述3重PCR反应包括3重PCR反应体系和3重PCR反应程序，所述3重PCR反应体系的引物为EC007、EC054和EC709的组合，所述各引物序列如下：

EC007 F: AATATGCAGTGGCAAGCT；

R:TTCCCATCATCTTCCTCC；

EC054 F: CTTTGCCCCTACTAACTGTTGC；

R:ACGACTGACCTGAGAAATCCCT；

EC709 F: GGCTGTCCCTTGGAACTA；

R:ACGAAATCCGAATAACCC。

2.根据权利要求1所述的一种脊尾白虾微卫星标记的3重PCR非诊断目的的检测方法，其特征在于所述3重PCR反应体系为：10×Buffer 2.0μL；25mmol/L MgCl₂ 1.2μL；10mmol/L dNTP 1.5μL； 5mmol/L所述引物EC007: F: 1.5μL + R:1.5μL、EC054: F: 0.5μL + R:0.5μL、EC709：F: 1.5μL + R:1.5μL；50ng/μL脊尾白虾基因组DNA 2.0μL；5U/μL Taq 聚合酶0.2μL；ddH₂O补充至20μL。

3.根据权利要求1所述的一种脊尾白虾微卫星标记的3重PCR非诊断目的的检测方法，其特征在于所述PCR反应程序为：95 ℃预变性5min；95℃变性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸45 s，共进行25次循环；最后72℃延伸5min；4℃保存并结束反应。

4.根据权利要求1所述的一种脊尾白虾微卫星标记的3重PCR非诊断目的的检测方法，其特征在于采用琼脂糖凝胶电泳方法检测PCR产物。