CN102424864B - 基于微卫星座位多态性的中国树鼩分子遗传标识方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于微卫星座位多态性的中国树鼩分子遗传标识方法，属生物高技术领域。本发明将微卫星引物标记荧光(5′-FAM)，再进行PCR扩增，使PCR产物带有5′-FAM荧光标记。将PCR产物与分子内标混合，经DNA全自动测序仪的扫描检测后，通过不同等位基因扩增片段与分子内标的相对位置而识别出目的片段的长度大小，达到基因分型的目的。通过计算杂合度及各项法医学鉴定指数，能对个体识别和群体多样性、品系纯度评估。本发明也能够通过10％的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离PCR扩增产物，依据不同大小的等位基因片段判别不同基因型。本发明具有简单、快速、灵敏和适用的特点，对于树鼩资源遗传多样性评估、品种品系的分子标记辅助选育和个体识别具有重要意义。
Description
技术领域：
本发明涉及一种基于微卫星座位多态性的中国树鼩分子遗传标识方法，属生物高技术领域。
背景技术：
中国树鼩(Tupaia belangeri chinensis)，隶属于树鼩目(Scandentia)，树鼩科(Tupaiidae)，树鼩属(Tupaia)动物。形似松鼠，同时具有食虫目(Insectivora)和灵长类(Primates)动物的一些特征。树鼩吻部较长，指(趾)端具爪，齿式和食性等特征与食虫目动物相似，而其发达的大脑、头骨结构、中耳部结构、肌群组成和肠胃道结构等与灵长类动物相似，因此其系统分类地位一直是分类学上争论的话题。上世纪80年代，根据树鼩众多形态系统发生和分子系统发生的研究，一些学者提出建立树鼩目，将其置于食虫目与灵长目之间。现有遗传学证据表明树鼩和灵长类动物关系密切，是其近亲。
由于树鼩个体小，饲养繁殖周期短，成本低，且具有多种自发性疾病，在疾病和正常情况下都表现出诸多与灵长类动物相似的特征，已被大量运用于生物医学研究，并有望在某些方面替代数量日趋减少的濒危的非人灵长类实验动物。目前，树鼩被广泛运用于近视、肝炎、肝癌、抑郁症、糖尿病和微生物感染等疾病的研究，实验用树鼩呈现了供不应求的状态。虽然树鼩的人工饲养繁殖工作早在19世纪80年初就已开展，但到目前为止，依然没有建立一个纯的实验品系，且缺少一种能用于个体识别和纯系评估的分子遗传标识系统。现有文献报道中所用的树鼩大多是野外捕获的，或者是捕获后只经过短期的室内驯养。然而，野外生存的树鼩种群存在丰富的遗传多样性，这导致不同实验所采用的树鼩的遗传背景存在较大差异，往往研究结果出现巨大差异。为了更好地推进新型实验动物树鼩的模式化和遗传背景清晰的品系的创制，合理开发利用树鼩资源，建立一套树鼩个体识别和纯系评定的遗传标识系统尤为迫切。
用于遗传分析的分子标记有多种，如限制性长度片段多态(Restriction FragmentLength Polymorphism，RFLP)，随机扩增多态性DNA(RandomAmplified PolymorphicDNA，RAPD)，数目可变串联重复多态(Variable Number Tandem Repeat，VNTR)和微卫星(microsatellite)。微卫星又称为简单重复序列(Simple Sequence Repeat，SSR)或短片段重复序列(Short Tandem Repeat，STR)，是由1-6bp的碱基作为核心重复单元，串联重复形成的一类DNA序列。由于微卫星广泛且较均匀地分布在基因组中(约30-50kb就存在一个微卫星DNA)，具有丰富的多态性、信息含量大、呈共显性、符合孟德尔遗传规律等特点，被广泛运用于连锁图谱构建、种群遗传多样性分析、品种品系的选择和建立、以及不同品系间亲缘关系界定、个体识别和亲权鉴定等。要评估建立的树鼩品种或品系是否遗传背景清晰，首先需要检测一套分子遗传标记。因此，本发明针对现有技术的不足，提出一种基于微卫星座位多态性的中国树鼩分子遗传标识方法。
经文献检索，未见与本发明树鼩微卫星遗传标记相同的公开文献报道。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种基于微卫星座位多态性的中国树鼩分子遗传标识方法，用于检测树鼩种群杂合度、群体结构、个体识别和亲权鉴定。
本发明以Ensembl数据库下载的树鼩基因组序列为模板，搜寻微卫星序列，用Primerpremier5软件设计用于扩增微卫星序列的引物对。经PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳，不断优化扩增条件，最后得到12对具有等位基因多态性和特异性扩增的树鼩微卫星序列的引物。这12个树鼩微卫星座位的扩增引物信息、微卫星序列的重复元件、扩增片段长度范围以及扩增条件列于表1中。基于全自动测序仪的DNA片段分析(GENESCAN)原理，将每对引物的正向引物用5′-FAM标记后，利用优化好的扩增条件，再次进行PCR扩增，并将PCR产物与一定量的分子内标混合，分别在ABI PRISM3730型或其他型号全自动测序仪(Applied Biosystems)上扫描检测。具有多态性的微卫星位点扩增出的PCR产物依据长度的不同，在电泳中显示出不同的迁移率，其带有的FAM标记荧光信号在电泳过程中被测序仪检测。依据分子内标的条带数与片段大小，我们利用相关软件即能判读出目的片段的大小。
表1.中国树鼩12个多态性微卫星座位的引物序列、产物长度、扩增条件及重复元件
a：PCR反应体系中含10％DMSO；b：51.2指以51.2度为退火温度，35次循环；c：(64～60)-1／cycle58：30cycles为初始的几个循环是以64度为退火温度，每一循环退火温度降一度，再以58度为退火温度循环30次
本发明利用GENESCAN的方法，用开发出的12个中国树鼩微卫星座位的引物进行树鼩种群杂合度检测，具体步骤如下：
(1)DNA提取：使用常规酚／氯仿法或吸附柱法从树鼩组织(耳、肌肉等)或血液提取基因组DNA。
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，进行PCR反应；
PCR反应体系：总体系为20μL，包含50ng基因组DNA，10mM Tris-HCl(pH8.3)，不同浓度的MgCl2(表1)，50mMKCl，0.5U TaKaRarTaq，200μM dNTP，正向和反向引物各0.2μM；
不同位点的PCR反应程序在94℃，预变性5min以及最后的72℃延伸5min外，其余采用表1中的参数；
(3)PCR产物检测：取PCR产物3μL在1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，电泳缓冲液为1×TAE，150V恒压电泳15min，溴化乙啶染色5min，凝胶成像系统下观察拍照。
(4)稀释PCR产物：按照琼脂糖凝胶检测的结果，将PCR产物用灭菌蒸馏水稀释至1ng／μL；
(5)样品上样前准备：取1μL稀释后PCR产物，加入到含有
(Applied Biosystems)和Hi-DiTM甲酰胺(Applied Biosystems)的9μL混合液中，充分混匀；95℃预变性5min后迅速置于冰上；
(6)上样检测：将处理后的样品用ABI PRISM3730或其他型号全自动测序仪(Applied Biosystems)进行扫描检测；
(7)数据读取：使用Genemarker V1.6(SoftGenetics LLC，State.College，PA)或者Genemapper(Applied Biosystems)软件判读基因型；
(8)在没有荧光标定和检测条件下，对上述步骤(1)至(7)，采用各微卫星引物对按照上述PCR扩增条件直接扩增基因组DNA，通过10％的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离PCR扩增产物，依据电泳胶上不同等位基因片段大小的不同，判别出不同基因型；
(9)数据分析：使用POPgene1.32或者GENEPOP软件计算树鼩微卫星等位基因频率，种群杂合度；用PowerStats V1.2软件计算多态信息含量，个体识别率，非父排除率，亲权指数；用Cervus3.0软件计算空等位基因频率，个体相似率，同胞相似率，及亲权鉴定有关的指标。
本发明所阐述的12个呈现多态的树鼩微卫星座位及其扩增和检测引物，通过荧光标记引物和GENESCAN的方法扫描检测，能快速、准确、灵敏地判别不同树鼩个体基因组微卫星的长度多态，从而进行相关的遗传学、法医学以及保护生物学的研究。仪器设备要求不高，在没有荧光标记引物和全自动测序仪检测的情况下，也能够通过10％浓度的聚丙烯酰胺凝胶电泳来分离和识别不同等位基因。该方法适合于大规模的树鼩个体识别、亲权鉴定和遗传多样性评估分析。本发明作为分子遗传标识技术，对于树鼩品种品系的评价、个体识别和资源保护具有重要的意义。
附图说明：
图1为用本发明涉及的12个中国树鼩多态性微卫星座位(TB1、TB3)经GENESCAN方法得到的等位基因识别示意图以及相应的克隆测序验证微卫星序列图。
图2为用本发明涉及的12个中国树鼩多态性微卫星座位(TB6、TB8)经GENESCAN方法得到的等位基因识别示意图以及相应的克隆测序验证微卫星序列图。
图3为用本发明涉及的12个中国树鼩多态性微卫星座位(TB9、TB12)经GENESCAN方法得到的等位基因识别示意图以及相应的克隆测序验证微卫星序列图。
图4为用本发明涉及的12个中国树鼩多态性微卫星座位(TB14、TB15)经GENESCAN方法得到的等位基因识别示意图以及相应的克隆测序验证微卫星序列图。
图5为用本发明涉及的12个中国树鼩多态性微卫星座位(TB16、TB17)经GENESCAN方法得到的等位基因识别示意图以及相应的克隆测序验证微卫星序列图。
图6为用本发明涉及的12个中国树鼩多态性微卫星座位(TB18、TB20)经GENESCAN方法得到的等位基因识别示意图以及相应的克隆测序验证微卫星序列图。
图7为用本发明微卫星座位(TB3和TB9两个座位的PCR产物混合物)使用GENESCAN方法得到的等位基因识别示意图。
具体实施方案：
1、引物设计
根据Ensembl数据库树鼩基因组序列，使用Primer premier5软件，依据微卫星座位两端的侧翼序列设计引物对。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。引物序列及扩增产物片段大小见表1。
2、样本采集
采集野外捕获的117个树鼩的肌肉组织或者血液。
3样品基因组DNA提取
使用天根血液／细胞／组织基因组DNA提取试剂盒或常规酚／氯仿法提取树鼩组织或血液基因组DNA。
4、优化PCR扩增体系和参数
PCR反应体系：总体系为20μL，包含50ng基因组DNA，10mM Tris-HCl(pH8.3)，1.0-1.8mM MgCl2，50mM KCl，0.5U TaKaRa rTaq，200μM dNTP，上游引物和下游引物各0.2μM。
PCR反应程序：94℃，预变性5min；94℃变性30s，55℃退火20s，72℃延伸30s，重复30个循环；72℃延伸5min。
取PCR产物4μL在10％的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，电泳缓冲液为1×TBE，100V恒压电泳60min，溴化乙啶染色3min.凝胶成像系统下观察拍照。根据成像结果，对不同微卫星位点的反应体系和程序进行调整，以达到最适反应。不同微卫星位点调整后的PCR参数列于表1中。
5、5′-FAM标记引物合成
筛选具有多态性的微卫星座位，并将每个座位的上游引物送上海杰瑞生物工程有限公司合成带5′-FAM标记的引物。采用第4步中优化好的PCR产应体系和反应程序，对117个树鼩的基因组DNA进行PCR扩增分析。
6、5′-FAM标记的PCR产物检测
取标记好的PCR产物2μL在1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，电泳缓冲液为1×TAE，150V恒压电泳15min，溴化乙啶染色5min，凝胶成像系统下观察拍照。
7、样品上样前准备
将PCR产物稀释至1ng／μL，并取1μL稀释后的产物，加入含有
(Applied Biosystems)和Hi-DiTM甲酰胺(Applied Biosystems)的9μL混合液中，充分混匀；95℃预变性5min后迅速置于冰上。
8、上样检测
将处理后的样品分别上样到ABI PRISM3730或者其他型号全自动测序仪(AppliedBiosystems)进行扫描检测。
9、数据读取
使用Genemarker V1.6(SoftGenetics LLC，State.College，PA)或者是Genemapper(Applied Biosystems)软件判读基因型。
10、数据分析
使用POPgene1.32或者GENEPOP软件计算树鼩微卫星等位基因频率，杂合度；用PowerStats V1.2软件计算多态信息含量，个体识别率，非父排除率，亲权指数；用Cervus3.0软件计算空等位基因频率，个体相似率，同胞相似率，及亲权鉴定有关的指标。
使用GENESCAN方法扫描时，分子内标
(Applied Biosystems)表现为16条橙色的峰，分别代表是35bp、50bp、75bp、100bp、139bp、150bp、160bp、200bp、250bp、300bp、340bp、350bp、400bp、450bp、490bp和500bp大小片段所在峰；蓝色峰为扩增出的不同片段长度的微卫星条带峰，双峰显示该样本DNA在该微卫星座位上为杂合子，单峰则为纯合子(图1)。使用GENESCAN的方法进行扫描时，也能将产物长度差别较大微卫星座位的产物混合后上样检测(图2)。
在没有荧光标定和检测条件下，对上述步骤(1)至(9)，采用各微卫星引物对按照上述PCR扩增条件直接扩增基因组DNA，通过10％的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离PCR扩增产物，依据电泳胶上不同等位基因片段大小的不同，判别出不同基因型。
依据开发的这12个微卫星座位对117只来自昆明地区的野生树鼩进行了分析。遗传多样性信息列在表2中。个体识别率、亲权鉴定指数列在表3中。
表2.12对微卫星引物扩增117份中国树鼩样本的遗传多样性信息
Na：观察等位基因数；Ne：有效等位基因数；Ho：观察杂合度；He：期望杂合度；PIC：多态信息含量。
Claims (1)
1.一种基于微卫星座位多态性的中国树鼩分子遗传标识方法，其特征在于该方法的具体步骤如下：
A、使用酚/氯仿法或试剂盒提取法从树鼩组织或血液中提取基因组DNA；
B、以步骤A提取的基因组DNA为模板，扩增各微卫星位点的各个上游引物标记5′-FAM，进行PCR反应；PCR反应引物和扩增条件如下：
a：PCR反应体系中含10％DMSO；b：51.2指以51.2度为退火温度，35次循环；c：64～60℃-1/cycle58：30cycles为初始的几个循环是以64度为退火温度，每一循环退火温度降一度，再以58度为退火温度度循环30次
PCR反应体系：总体系为20μL，包含50ng基因组DNA，pH为8.3的10mMTris-HCl，上表中不同浓度的MgCl2，50mM KCl，0.5U TaKaRa rTaq，200μMdNTP，上游和下游引物各0.2μM；
不同位点的PCR反应程序在94℃，预变性5min以及最后的72℃延伸5min外，其余采用上表中的参数；
C、PCR产物检测：取PCR产物2μL在1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，电泳缓冲液为1×TAE，150V恒压电泳15min，溴化乙啶染色5min，凝胶成像系统下观察拍照；
D、样品上样前准备：按照琼脂糖凝胶检测的结果，将PCR产物稀释至1ng/μL，取1μL稀释后PCR产物，加入到含有GeneScanTM-500
和Hi-DiTM甲酰胺的9μL混合液中，充分混匀；95℃预变性5min后迅速置于冰上；
E、上样检测：将处理后的样品分别上样到ABI PRISM3730型或其他型号DNA全自动测序仪进行扫描检测；
F、数据读取：使用Genemarker V1.6或Genemapper软件判读基因型；
G、在没有荧光标定和检测条件下，对上述步骤A至B，采用各微卫星引物对按照上述PCR扩增条件直接扩增基因组DNA，通过10％的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离PCR扩增产物，依据电泳胶上不同等位基因片段大小的不同，判别出不同基因型；
H、数据分析：使用POPgene1.32或POPGENE软件计算树鼩微卫星等位基因频率，种群杂合度；用PowerStats V1.2软件计算多态信息含量，个体识别率，非父排除率，亲权指数；用Cervus3.0软件计算无效等位基因频率，相似率，同胞相似率、及亲权鉴定有关的指标。
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| Female-biased dispersal and gene flow in a behaviorally monogamous mammal,the large treeshrew(Tupaia tana);Munshi-South J et al;《PLoS ONE》;20080917;第3卷(第9期);e3228 * |
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| Munshi-South J et al.Isolation and characterization of polymorphic microsatellite loci in Bomean treeshrews(Tupaia spp).《Mol Ecol Notes》.2006,第6卷(第3期), |
| Munshi-SouthJetal.Female-biaseddispersalandgeneflowinabehaviorallymonogamousmammal the large treeshrew(Tupaia tana).《PLoS ONE》.2008 |
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