CN106636072B - 一种用于动物类中药分子鉴定的通用dna提取方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于动物类中药分子鉴定的通用DNA提取方法，包括：步骤1、配制裂解液PE；步骤2、对动物类中药进行样品的预处理；步骤3、提取动物类中药的DNA；步骤3.1、将步骤2中经预处理的样品与步骤1中配制的裂解液PE混匀；步骤3.2、加入广谱蛋白酶，并使用酚氯仿抽提除去蛋白质等杂质；步骤3.3、使用沉淀剂得到动物类中药的DNA。本发明还公开了一种用于动物类中药分子鉴定的通用DNA提取试剂盒。本发明提供的DNA提取方法及试剂盒可用于除壳类、分泌物类、部分加工品外不同用药部位动物药的DNA提取，所获得DNA满足中药材分子鉴定后续实验要求，保障了中药材分子鉴定的推广应用。

Description

一种用于动物类中药分子鉴定的通用DNA提取方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种用于动物类中药分子鉴定的通用DNA提取方法及试剂盒。

背景技术

动物类中药是中医药的重要组成部分，据第三次全国中药资源普查结果，我国药用动物有1581种。目前，77种药用动物、50种动物药被收入2015版《中国药典》(一部)。动物药具有“活性强、疗效高、效益大”的特点，在临床上常用于治疗疑难杂症、急重病症。动物药多数来源复杂，多取自动物体某一部分，常存在较多破碎的器官、组织，给传统鉴别带来挑战。近年来药用野生动物资源日益减少，药材商品供应量不足，部分动物药材、饮片价格昂贵，药材市场中掺伪、造假现象时有发生，已严重影响了动物药的用药安全，动物药鉴定需要更多的技术手段，以保证临床安全使用。现代DNA分子鉴定技术具有准确、快速鉴定物种的特点，已广泛应用于中药材及中药制剂原料药的鉴定研究。DNA分子鉴定技术已成为中药材基原物种鉴定有力的科技支撑，为保障中药安全用药提供了有效工具。

获取高质量DNA是中药材分子鉴定的前提。目前，动物药DNA提取常使用试剂盒提取，需根据用药部位的不同选用不同的试剂盒：蛇类、蛤蚧、地龙等药材肌肉组织丰富，使用通用的动物组织DNA提取试剂盒可获得较高质量DNA；角类、骨甲类等药材因DNA含量较低，需使用专用的DNAout试剂盒提取DNA；但是，使用试剂盒提取复杂动物药DNA常受到限制，如桑螵蛸、哈蟆油等药材DNA较难获取，仅局限于基原物种的鉴定研究。同时，动物药DNA提取方法不统一阻碍了动物药DNA自动化提取的应用，限制了含混合动物药成分的中成药分子鉴定技术的发展。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明提供了一种用于动物类中药分子鉴定的通用DNA提取方法及试剂盒，建立了一种简便、经济、适用范围广的动物药DNA通用方法。

本发明的技术方案如下：

本发明一方面提供了一种用于动物类中药分子鉴定的通用DNA提取方法，包括以下步骤：

步骤1、配制裂解液PE；

步骤2、对动物类中药进行样品的预处理；

步骤3、提取动物类中药的DNA；

步骤3.1、将步骤2中经预处理的样品与步骤1中配制的裂解液PE混匀；

步骤3.2、加入广谱蛋白酶，并使用酚氯仿抽提除去蛋白质等杂质；

步骤3.3、使用沉淀剂得到动物类中药的DNA。

优选地，上述动物类中药包括全体类、骨甲类、角类、组织类和其他类的动物类中药，其中全体类的动物类中药为乌梢蛇、金钱白花蛇、蕲蛇、蛤蚧、水蛭、地龙、蜈蚣、僵蚕、海龙、海马、九香虫、土鳖虫、斑蝥或全蝎中的一种或几种；骨甲类的动物类中药为龟甲、鳖甲或穿山甲中的一种或几种；角类的动物类中药为水牛角、羚羊角、鹿角或鹿茸中的一种或几种；组织类的动物类中药为蝉蜕、蛇蜕或鸡内金中的一种或几种；其他类的动物类中药为哈蟆油或桑螵蛸中的一种或两种。

优选地，上述步骤2中，预处理包括以下步骤：

步骤a、对动物类中药进行表面清洁和灭菌；

步骤b、称取动物类中药；全体类、组织类的动物类中药剪碎后用DNA提取研磨仪研磨；角类、骨甲类的动物类中药用液氮充分研磨至细粉；哈蟆油使用研磨杵研碎。

优选地，步骤1中，裂解液PE含有0.15-0.35mol·L^-1EDTA。

更优选地，裂解液PE含有0.25mol·L^-1EDTA。

优选地，步骤1中，裂解液PE含有0.15-0.35mol·L^-1EDTA和0.2-0.5mol·L^-1NaCl。

更优选地，裂解液PE含有0.25mol·L^-1EDTA和0.2mol·L^-1NaCl。

优选地，步骤1中，裂解液PE含有1％SDS、0.03mol·L^-1Tris-HCl、0.15-0.35mol·L^-1EDTA和0.2-0.5mol·L^-1NaCl。

更优选地，裂解液PE含有1％SDS、0.03mol·L^-1Tris-HCl、0.25mol·L^-1EDTA和0.2mol·L^-1NaCl。

优选地，上述广谱蛋白酶为蛋白酶K或链霉蛋白酶E。

优选地，上述沉淀剂为70％乙醇或异丙醇。

本发明另一方面提供了一种用于动物类中药分子鉴定的通用DNA提取试剂盒，试剂盒至少包括裂解液PE。

优选地，裂解液PE含有0.15-0.35mol·L^-1EDTA。

更优选地，裂解液PE含有0.25mol·L^-1EDTA。

优选地，裂解液PE含有0.15-0.35mol·L^-1EDTA和0.2-0.5mol·L^-1NaCl。

更优选地，裂解液PE含有0.25mol·L^-1EDTA和0.2mol·L^-1NaCl。

优选地，裂解液PE含有1％SDS、0.03mol·L^-1Tris-HCl、0.15-0.35mol·L^-1EDTA和0.2-0.5mol·L^-1NaCl。

更优选地，裂解液PE含有1％SDS、0.03mol·L^-1Tris-HCl、0.25mol·L^-1EDTA和0.2mol·L^-1NaCl。

使用本发明提供的DNA提取方法及试剂盒制备得到的DNA浓度较高(全体类大于200ng/μL，角甲类大于40ng/μL)、质量优，并可实现对蝉蜕、哈蟆油等困难药材进行DNA提取，所获得的DNA均可用于PCR扩增，测序结果与《中国药典》动物药特征序列一致，优于现有商品试剂盒。本发明建立的DNA提取方法可用于除壳类、分泌物类、部分加工品外不同用药部位动物药的DNA提取，所获得DNA满足中药材核酸分子鉴定后续实验要求，保障了中药材核酸分子鉴定的推广应用。

以下将结合附图对本发明作进一步说明，以充分说明本发明的目的、技术特征和技术效果。

附图说明

图1示出了本发明较优实施例中以78份不同用药部位动物药DNA为模板进行PCR扩增的结果，其中M：DNA标记(Marker)；CK：阴性对照；1-3：乌梢蛇；4-6：金钱白花蛇；7-9：蕲蛇；10-12：蛤蚧；13-15：水蛭；16-18：地龙；19-21：蜈蚣；22-24：僵蚕；25-27：海龙；28-30：海马；31-33：九香虫；34-36土鳖虫；37-39：斑蝥；40-42：全蝎；43-45：龟甲；46-48：鳖甲；49-51：穿山甲；52-54：水牛角；55-57：羚羊角；58-60：鹿角；61-63：鹿茸；64-66：蝉蜕；67-69：蛇蜕；70-72：鸡内金；73-75：哈蟆油；76-78：桑螵蛸；

图2示出了以本发明较优实施例中的试剂盒与3种商品试剂盒提取的动物药DNA为模板进行PCR扩增的结果，其中A：本发明的试剂盒；B：Ⅰ号试剂盒；C：Ⅱ号试剂盒；D：Ⅲ号试剂盒；M：DNA标记(Marker)；CK：阴性对照；1：乌梢蛇；2：九香虫；3：鳖甲；4：水牛角；5：蝉蜕；6：哈蟆油。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

除壳类(如牡蛎等)、分泌物类(如麝香等)、部分加工品(如鹿角胶等)等动物药不适用于DNA分子鉴定技术外，本发明共收集不同用药部位的动物药26种，每种药材设3份重复，共78份样品，所有药材样品购自北京同仁堂(详见表1)。

表1不同用药部位动物药样品采集信息

药材名称	用药部位	药材名称	用药部位
				乌梢蛇	全体	全蝎	全体
金钱白花蛇	全体	龟甲	骨甲
				蕲蛇	全体	鳖甲	骨甲
蛤蚧	全体	穿山甲	骨甲
				水蛭	全体	水牛角	角
地龙	全体	羚羊角	角
				蜈蚣	全体	鹿角	角
僵蚕	全体	鹿茸	角
				海龙	全体	蝉蜕	组织
海马	全体	蛇蜕	组织
				九香虫	全体	鸡内金	组织
土鳖虫	全体	哈蟆油	其他
				斑蝥	全体	桑螵蛸	其他

在本实施例中DNA提取方法具体如下：

(1)配制裂解液PE，经过高温、高压灭菌后备用；

(2)进行样品预处理：取药材样品，使用75％乙醇(体积分数)擦拭样品表面，置于经紫外线消毒的通风橱内30min以使乙醇挥发。全体类、组织类、其他类药材称取20～30mg(哈蟆油称取5mg)；角类、骨甲类药材称取40～50mg。全体类、组织类药材用剪刀(已灭菌)剪碎，用DNA提取研磨仪(Retsch MM400，德国)研磨2min(30次/秒)；角类、骨甲类药材用液氮充分研磨至细粉；哈蟆油使用研磨杵研碎；

(3)DNA提取：

(a)将预处理好的样品移至离心管中，加入500μL的PE缓冲液，充分混匀，加入20μL的蛋白酶K(10mg/mL)溶液，震荡混匀后，56℃恒温水浴过夜；

(b)在水浴后的样品中加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，充分混匀，以12000rpm的转速离心5min；

(c)取上清液，加入氯仿：异戊醇(24：1)，充分混匀，以12000rpm的转速离心5min；

(d)取上清液，加入0.7倍－20℃预冷的异丙醇，混匀，在－20℃条件下放置30min，以12000rpm的转速离心5min，用移液枪吸去上清液；

(e)向沉淀中加入1mL－20℃预冷的70％乙醇洗涤沉淀2次；

(f)将乙醇吸出，将沉淀置于超净工作台吹干；

(g)加入50μL的dd H₂O(双蒸水)溶解沉淀，放入－20℃保存。

为获得适用于不同用药部位动物药DNA提取的裂解液配方，本发明基于SDS法对裂解液中EDTA浓度、配方组成进行了优化，如表2所示。

Ⅰ、EDTA浓度优化：分别配制含有不同浓度EDTA的裂解液PE，考察EDTA浓度对动物药DNA提取的影响；

Ⅱ、配方组成优选：在裂解液中分别加入或去除NaCl和Triton X-100考察是否可影响DNA得率。

值得注意的是，本实施例中着重从以上两个方面对裂解液配方进行优化，因此SDS、Tris-HCL、NaCl和TritonX-100使用了常规裂解液中的浓度，即1％SDS、0.03mol·L^{- 1}Tris-HCL、0.2mol·L^-1NaCl和1％TritonX-100，其在此仅作为示例目的，并非旨在限制本发明的范围。

表2裂解液PE配方优化

采用微量分光光度计(美国NanoDrop 2000)测定DNA浓度及OD_A260/A280，以评价DNA得率和纯度，结果如表3所示。

表3不同配方裂解液PE提取结果(DNA浓度n g/μL/OD_A260/A280)

乌梢蛇

九香虫

鳖甲

水牛角

蝉蜕

蛤蟆油

PE 1

33.9/1.56

24.5/1.55

9.7/1.40

25.1/1.47

14.3/1.58

16.3/1.31

PE 2

175.2/1.80

88.3/1.60

40.6/1.50

53.2/1.55

36.8/1.57

43.2/1.78

PE 3

457.2/1.90

268.9/1.91

63.1/1.60

73.3/1.61

52.3/1.61

71.9/1.89

PE 4

133.4/1.70

68.3/1.65

30.4/1.58

45.8/1.63

41.2/1.50

39.3/1.68

PE 5

38.2/1.39

7.1/1.40

11.1/1.34

11.3/1.42

9.6/1.40

11.2/1.30

PE 6

473.1/1.89

277.1/1.90

68.2/1.76

74.2/1.77

55.0/1.76

77/1.90

PE 7

431.3/1.84

263.3/1.87

65.7/1.61

68.9/1.60

42.9/1.61

73/1.81

上述结果表明，以0.15-0.35mol·L^-1EDTA配制的裂解液，尤其是0.25mol·L^{- 1}EDTA，适用于不同用药部位的动物药DNA提取；在裂解液中加入0.2mol·L^-1NaCl可提高DNA得率，1％Triton X-100的添加对DNA得率无显著影响。其中裂解液P E 6为最优配方：1％SDS、0.03mol·L^-1Tris-HCl、0.25mol·L^-1EDTA、0.2mol·L^-1NaCl。

采用本发明最优配方提取78份动物药DNA，测定DNA浓度和纯度，并进行了PCR扩增，因为PCR扩增对DNA模板的质量要求较高，因此PCR扩增成功率成为评判DNA质量的重要依据。结果显示，全体类药材、蛇蜕、桑螵蛸等药材DNA浓度均大于200ng/μL，OD_A260/A280均在1.80～2.04之间；角类、骨甲类、鸡内金、哈蟆油、蝉蜕等药材DNA浓度均大于40ng/μL，OD_A260/A280均在1.60～1.92之间；PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测均有明显条带，图1示出了78份不同用药部位动物药DNA模板PCR扩增结果；经测序分析，78份动物药样品均为2015版《中国药典》规定的基原物种，结果如表4所示。

表4本方法提取DNA浓度、纯度及基原物种

使用本方法与市售试剂盒提取动物类中药的DNA，并对其提取效果进行比较。

其中通用试剂盒选用进口、国产2类，进口试剂盒以DNeasy Blood&Tissue Kit(QIAGEN公司)为代表，国产试剂盒以血液/细胞、组织基因组DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)为代表，角甲类动物药选用柱式骨骼DNAout试剂盒(北京天恩泽基因科技有限公司)，3种试剂盒分别用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ符号代替。

分别使用本方法与Ⅰ号、Ⅱ号试剂盒提取乌梢蛇、九香虫、鳖甲、水牛角、蝉蜕、哈蟆油这6种动物类中药的DNA，Ⅲ号试剂盒提取鳖甲、水牛角DNA，试剂盒操作流程按照说明进行。采用微量分光光度计(美国NanoDrop 2000)测定DNA浓度及OD_A260/A280，以提取的DNA为模板进行PCR扩增；比较本方法与3种试剂盒提取的DNA浓度、纯度及PCR扩增成功率，结果如表5所示。

表5本方法与3种试剂盒提取的DNA质量比较

(DNA浓度ng/μL/OD_A260/A280)

	本方法	试剂盒I	试剂盒II	试剂盒Ⅲ
					乌梢蛇	473.1/1.89	167.3/1.66	70.6/1.61	——
九香虫	277.1/1.90	112.4/1.76	44.9/1.43	——
					鳖甲	68.2/1.76	16.5/1.36	12.2/1.31	43.6/1.59
水牛角	74.2/1.77	11.9/1.42	9.8/1.34	40.2/1.50
					蝉蜕	55.0/1.76	8.6/1.25	6.4/1.22	——
哈蟆油	77.0/1.90	5.7/1.24	2.8/1.03	——

注：“——”符号表示未使用该试剂盒提取此动物药DNA

上述结果显示，本方法提取的动物药DNA质量优于3种试剂盒。图2示出了本方法与3种商品试剂盒提取的动物药DNA为模板进行PCR扩增的结果。PCR扩增结果显示，本方法提取的DNA模板PCR扩增成功率最高，上述6种药材DNA样品PCR产物均有明亮清晰的条带；Ⅰ号、Ⅱ号试剂盒仅乌梢蛇、九香虫DNA扩增成功，Ⅲ号试剂盒提取的鳖甲、水牛角DNA可扩增成功。

本发明建立的DNA提取方法可用于除壳类、分泌物类、部分加工品外不同用药部位动物药的DNA提取，所获得DNA满足中药材分子鉴定后续实验要求。基于本方法对全体类(乌梢蛇、金钱白花蛇、蕲蛇、蛤蚧、水蛭、地龙、蜈蚣、僵蚕、海龙、海马、九香虫、土鳖虫、斑蝥、全蝎)、骨甲类(龟甲、鳖甲、穿山甲)、角类(水牛角、羚羊角、鹿角、鹿茸、组织类(蝉蜕、蛇蜕、鸡内金)、其他类(哈蟆油、桑螵蛸)不同入药部位的动物药DNA提取，DNA质量均满足DNA分子鉴定技术的要求。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (5)

1.一种用于动物类中药分子鉴定的通用DNA提取方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

步骤1、配制裂解液PE；

步骤2、对动物类中药进行样品的预处理；

步骤3、提取所述动物类中药的DNA；

步骤3.1、将步骤2中经预处理的所述样品与步骤1中配制的所述裂解液PE混匀；

步骤3.2、加入广谱蛋白酶，并使用酚氯仿抽提除去杂质；

步骤3.3、使用沉淀剂得到所述动物类中药的DNA；

所述动物类中药包括全体类、骨甲类、角类、组织类和其他类的动物类中药，其中所述全体类的动物类中药为乌梢蛇、金钱白花蛇、蕲蛇、蛤蚧、水蛭、地龙、蜈蚣、僵蚕、海龙、海马、九香虫、土鳖虫、斑蝥或全蝎中的一种或多种；所述骨甲类的动物类中药为龟甲、鳖甲或穿山甲中的一种或多种；所述角类的动物类中药为水牛角、羚羊角、鹿角中的一种或多种；所述组织类的动物类中药为蝉蜕、蛇蜕或鸡内金中的一种或多种；所述其他类的动物类中药为哈蟆油或桑螵蛸中的一种或两种；所述裂解液PE的配方：1％SDS、0.03mol·L^-1 Tris-HCl、0.25mol·L^-1EDTA和0.2mol·L^-1 NaCl；

所述预处理包括以下步骤：

步骤a、对所述动物类中药进行表面清洁和灭菌；

步骤b、称取所述动物类中药；全体类、组织类的动物类中药剪碎后用DNA提取研磨仪研磨；角类、骨甲类的动物类中药用液氮充分研磨至细粉；哈蟆油使用研磨杵研碎。

2.根据权利要求1所述的用于动物类中药分子鉴定的通用DNA提取方法，其特征在于，所述鹿角为鹿茸。

3.根据权利要求1所述的用于动物类中药分子鉴定的通用DNA提取方法，其特征在于，所述广谱蛋白酶为蛋白酶K或链霉蛋白酶E。

4.根据权利要求1所述的用于动物类中药分子鉴定的通用DNA提取方法，其特征在于，所述沉淀剂为70％乙醇或异丙醇。

5.一种用于动物类中药分子鉴定的通用DNA提取试剂盒，其特征在于，所述试剂盒至少包括裂解液PE；所述裂解液PE的配方：1％SDS、0.03mol·L^-1 Tris-HCl、0.25mol·L^-1 EDTA和0.2mol·L^-1 NaCl。

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