CN107129985B - 用于蛤蚧干品肌肉组织dna高效提取的试剂盒、提取方法及应用 - Google Patents

用于蛤蚧干品肌肉组织dna高效提取的试剂盒、提取方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于蛤蚧干品肌肉组织DNA高效提取的试剂盒、提取方法及应用。所述试剂盒包括：裂解液、冲洗液1(含200mM Tris‑HCl的70％乙醇溶液)、冲洗液2(80％乙醇溶液)、蛋白酶K(20mg/mL)、DNA吸附柱。本发明为改良版SDS法，将SDS的浓度提高至15％，不加入氯化钠，避免裂解液过于黏稠，但仍能达到蛤蚧组织DNA提取的高盐环境。本发明的冲洗液1与现有冲洗液相比，能更好的减少DNA的损失，提高DNA的提取效率。本发明方法提取效率高，可实现1mg样品的DNA条形码鉴定；可避免因样本量少而无法鉴定或复核的情况，并适用于大量市场蛤蚧药材的DNA条形码鉴定工作。

Description

用于蛤蚧干品肌肉组织DNA高效提取的试剂盒、提取方法及 应用
技术领域
本发明涉及一种用于蛤蚧干品肌肉组织DNA高效提取的试剂盒、提取方法及应用，属于DNA提取技术领域。
背景技术
蛤蚧Gekko gecko Linnaeus，又名大壁虎、蛤蚧蛇、蛤蟹、仙蟾，为壁虎科Gekkonidae壁虎属Gekko动物。其干燥全体为我国名贵动物中药材，为历届药典所收载。现代医学研究表明，蛤蚧含有多种氨基酸、磷脂、脂肪酸、微量元素等成分，具有止咳平喘、化痰、调节脂质代谢、保肝、抗炎、抗氧化等作用。目前临床主要用于壮阳固精、平喘止咳等方面。
野生蛤蚧资源紧缺，早在1989年便被列为“国家二级保护动物”，市场蛤蚧药材多源于人工养殖。由于其独特的药用及保健价值，市场需求逐年增长，价格逐年增高，市场混伪品则禁而不绝。如：喜山鬣蜥，俗名藏蛤蚧，与正品蛤蚧形态相似，极易混淆；壁虎、无蹼壁虎俗称小蛤蚧，市场中存在以壁虎尾冒充蛤蚧尾销售的情况，而传统鉴定方法很难将其准确区分，严重威胁临床用药安全。目前，蛤蚧的具体有效成分尚未明确，因而，缺少准确可靠的化学鉴定方法；2014年，张红印等提出基于CO1序列的DNA条形码技术可实现蛤蚧药材及其混伪品的高效鉴别，为蛤蚧药材的鉴定研究提供了新思路。
DNA提取是DNA条形码技术的基础，也是其中的关键一环，提取动物样品DNA的常用方法有试剂盒法和SDS法，试剂盒法提取蛤蚧干品肌肉组织DNA时，取样量需加大为35mg，水浴时间延长至2小时(张红印等，基于COI条形码序列的蛤蚧及其混伪品的DNA分子鉴定，世界科学技术-中医药现代化，2014(2)：269-273)，且成本高，不适于大量样本的DNA条形码鉴定。一般的SDS法，常用的SDS浓度为0.5％、1％、5％、10％(童丽娟等，蜘蛛基因组DNA提取方法的比较，动物学杂志，2002，37(6)：53-55.；高丹丹等，动物肉制品基因组DNA的提取和纯化，食品科技，2007，32(8)：42-44；徐伟丽等，动物肌肉组织基因组DNA两种提取方法的比较，食品工业科技，2011(12)：81-84；刘娜等，动物肌肉组织DNA的提取方法及实时荧光定量PCR检测，食品工业科技，2016，37(18))，且取样量大，多为200mg，甚至500mg，裂解时间一般大于2小时，效率低。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于蛤蚧干品肌肉组织DNA高效提取的试剂盒、提取方法及应用，本试剂盒可用于1mg蛤蚧样品的DNA提取，并能满足下游PCR操作及测序；配方简单，成本低；操作简单迅速，适用于少量样品的DNA提取工作，为蛤蚧样品的快速鉴定提供技术支持。
本发明技术方案如下：
一种用于蛤蚧干品肌肉组织DNA高效提取试剂盒，包括：裂解液、冲洗液1、冲洗液2，其中所述裂解液、冲洗液的组成如下：
(1)裂解液：SDS的浓度为15％，Tris-HCl的浓度为50mM，EDTA-Na2的浓度为25mM，pH约为8.3；
(2)冲洗液1：含200mM Tris-HCl的70％乙醇溶液；
(3)冲洗液2：80％乙醇溶液。
进一步地，上述DNA高效提取试剂盒还包括氯仿-异戊醇(体积比24:1)、无水乙醇、重蒸水、蛋白酶K(20mg/mL)、DNA吸附柱等中的一种或几种。
本发明还包括上述DNA高效提取试剂盒在提取蛤蚧干品肌肉组织DNA上的应用。
本发明还提供使用上述DNA高效提取试剂盒提取蛤蚧干品肌肉组织DNA的方法，即一种提取蛤蚧干品肌肉组织DNA的方法，包括：取粉状蛤蚧组织1mg-30mg，加600μL裂解液和20μL蛋白酶K(20mg/mL)，混匀，56℃水浴1-4h(优选1-2h)。
具体地，上述提取蛤蚧干品肌肉组织DNA的方法，包括：取粉状蛤蚧组织1mg，加600μL裂解液和20μL蛋白酶K(20mg/mL)，混匀，56℃水浴1h。
或者，上述提取蛤蚧干品肌肉组织DNA的方法，包括：取粉状蛤蚧组织5mg-30mg，加600μL裂解液和20μL蛋白酶K(20mg/mL)，混匀，56℃水浴2h。
更具体地，上述提取蛤蚧干品肌肉组织DNA的方法，包括以下步骤：
(1)取洁净的蛤蚧干品，切取肌肉组织，粉碎或液氮研磨成粉；
(2)取粉状蛤蚧肌肉组织1mg-30mg，加600μL裂解液和20μL蛋白酶K(20mg/mL)，混匀，56℃水浴1-4h(优选1-2h)，期间每隔15min-30min轻轻摇匀一次；
(3)向上述裂解液水浴后混合液中加入600μL的氯仿-异戊醇(体积比24:1)，轻轻混匀5min，12000rpm离心5min；将上清液转移到离心管中；
(4)重复步骤(3)一次；
(5)向步骤(4)所得的上清液中加入600μL无水乙醇，摇匀，分次转移到DNA吸附柱上，12000rpm离心30S，倒掉收集管中的废液；
(6)向DNA吸附柱中加入500μL冲洗液1，静置2min，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；
(7)重复步骤(6)一次；
(8)向DNA吸附柱中加入500μL冲洗液2，静置2min，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；
(9)将DNA吸附柱12000rpm空转2min，弃掉收集管，转移到新的离心管中，并在通风橱中放置15min；
(10)将重蒸水预热至65℃，取80μL，分两次洗脱DNA，每次加入重蒸水后静置2min，12000rpm离心2min，洗脱，即得DNA。
所得DNA可放于-20℃冰箱保存备用。
本发明为改良版SDS法，将SDS的浓度提高至15％，不加入氯化钠，避免裂解液过于黏稠，但仍能达到蛤蚧组织DNA提取的高盐环境。本发明的冲洗液1为200mM Tris-HCl的70％乙醇溶液，与购买的试剂盒冲洗液相比，能更好的减少DNA的损失，提高DNA的提取效率。
本发明适用于蛤蚧干品肌肉组织的DNA提取，提取效率高，可实现1mg样品的DNA条形码鉴定；配方简单，成本低；操作方便；可避免因样本量少而无法鉴定或复核的情况，并适用于大量市场蛤蚧药材的DNA条形码鉴定工作。
附图说明
图1为实施例1不同取样量蛤蚧肌肉样品DNA的PCR产物电泳图。
图2为实施例2蛤蚧肌肉样品不同水浴时间提取DNA的PCR产物电泳图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular Cloning:a Laboratory Manual，2001)，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
以下所用裂解液、冲洗液的组成如下：
(1)裂解液：SDS的浓度为15％，Tris-HCl的浓度为50mM，EDTA-Na2的浓度为25mM，pH约为8.3；
(2)冲洗液1：含200mM Tris-HCl的70％乙醇溶液；
(3)冲洗液2：80％乙醇溶液。
实施例1
一种提取蛤蚧干品肌肉组织DNA的方法，包括以下步骤：
(1)将蛤蚧干品表面用酒精棉擦拭干净，切取肌肉组织，打粉或液氮研磨成粉；
(2)分别取粉状蛤蚧肌肉组织30mg、20mg、10mg、5mg、1mg，共5组，每组取6份，共5×6份，每份分别加600μL裂解液和20μL蛋白酶K(20mg/mL)，混匀，56℃水浴2h，期间每隔20min-30min轻轻摇匀一次；
(3)向上述裂解液水浴后混合液中加入600μL的氯仿-异戊醇(体积比24:1)，轻轻混匀5min，12000rpm离心5min；将上清液转移到离心管中；
(4)重复步骤(3)一次；
(5)向步骤(4)所得的上清液中加入600μL无水乙醇，摇匀，分次转移到DNA吸附柱上，12000rpm离心30S，倒掉收集管中的废液；
(6)向DNA吸附柱中加入500μL冲洗液1，静置2min，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；
(7)重复步骤(6)一次；
(8)向DNA吸附柱中加入500μL冲洗液2，静置2min，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；
(9)将DNA吸附柱12000rpm空转2min，弃掉收集管，转移到新的离心管中，并在通风橱中放置15min；
(10)将重蒸水预热至65℃，取80μL，分两次洗脱DNA，每次加入重蒸水后静置2min，12000rpm离心2min，洗脱，即得DNA。
将所得DNA放于-20℃冰箱保存备用。
以上5组蛤蚧肌肉组织提取的DNA的PCR产物电泳图见图1：
泳道A1，A2，A3，A4，A5，A6为30mg蛤蚧样品提取DNA的PCR产物电泳图；
泳道B1，B2，B3，B4，B5，B6为20mg蛤蚧样品提取DNA的PCR产物电泳图；
泳道C1，C2，C3，C4，C5，C6为10mg蛤蚧样品提取DNA的PCR产物电泳图；
泳道D1，D2，D3，D4，D5，D6为5mg蛤蚧样品提取DNA的PCR产物电泳图；
泳道E1，E2，E3，E4，E5，E6为1mg蛤蚧样品提取DNA的PCR产物电泳图。
注：PCR体系为25μL；模板为1μL；1％琼脂糖凝胶电泳检测。
图1表明：5组PCR产物电泳条带均清晰明亮，其中30mg组条带最亮；1mg组条带较其它组稍暗，即扩增效率相对较低，表明DNA模板量相对较少或质量稍差；5mg组条带亮且规则，表明扩增效果好。
据此可得，根据实施例1，1mg-30mg蛤蚧肌肉组织均能成功提取到适合PCR检测的DNA；而且，5mg-30mg的蛤蚧肌肉组织56℃水浴2h DNA提取效率较高。
实施例2
一种提取蛤蚧干品肌肉组织DNA的方法，与实施例1的区别仅在于：分别取粉状蛤蚧肌肉组织1mg共5×6份(5组，每组6份)，每份分别加600μL裂解液和20μL蛋白酶K(20mg/mL)，混匀，56℃分别水浴0.5h、1h、2h、3h、4h，期间每隔15min轻轻摇匀一次。
以上5份蛤蚧肌肉组织提取的DNA的PCR产物电泳图见图2：
泳道a1，a2，a3，a4，a5，a6为1mg蛤蚧样品水浴1h后提取DNA的PCR产物电泳图；
泳道b1，b2，b3，b4，b5，b6为1mg蛤蚧样品水浴2h后提取DNA的PCR产物电泳图；
泳道c1，c2，c3，c4，c5，c6为1mg蛤蚧样品水浴3h后提取DNA的PCR产物电泳图；
泳道d1，d2，d3，d4，d5，d6为1mg蛤蚧样品水浴4h后提取DNA的PCR产物电泳图；
泳道e1，e2，e3，e4，e5，e6为1mg蛤蚧样品水浴0.5h后提取DNA的PCR产物电泳图。
注：PCR体系为25μL；模板为1μL；1％琼脂糖凝胶电泳检测。
图2表明：5组PCR产物电泳条带均清晰明亮，但蛤蚧样品水浴1h组电泳条带最为规则明亮，表明所得DNA质量优，扩增效率高；水浴2h组较之稍暗，水浴4h组电泳条带明暗不一，主要原因可能为加热时间久，DNA降解，所得DNA质量相对差。
据此可得，根据实施例2，1mg蛤蚧肌肉组织水浴0.5h-4h均能成功提取到适合PCR检测的DNA；56℃水浴1h，所得DNA质量较优，扩增效率较高。
对比例1应用天根血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取蛤蚧DNA
(1)按实施例2相同的方法制备粉状蛤蚧肌肉组织样品，取样1mg，严格按照试剂盒说明书提取蛤蚧干品肌肉组织DNA；
(2)洗脱DNA操作与实施例1相同：将重蒸水预热至65℃，取80μL，分两次洗脱DNA，每次加入重蒸水后静置2min，12000rpm离心2min洗脱DNA。
实施例2(1mg水浴1h组)与对比例1提取蛤蚧DNA浓度比较：应用实施例2方法提取的DNA浓度明显高于对比例1(天根试剂盒组)，且两组结果具有极显著性差异。结果见表1。
表1不同提取方法提取1mg蛤蚧样品结果比较
Figure BDA0001317018850000071
注：DNA浓度经Qubit 3.0荧光定量仪测得
对比例2试剂盒冲洗液与本发明冲洗液效果比较
按对比例1方法(应用天根血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒)提取蛤蚧肌肉组织DNA，将DNA液稀释，
分别取50μL转入1.5mL EP管中，加500μL无水乙醇沉降DNA，过CB3柱；每组设5个重复；
试剂盒组(对比例1)：按照天根血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒说明书洗脱DNA：
加入500μL GD 12000rpm离心30s，弃废液；
加入600μL PW 12000rpm离心30s，弃废液；重复一次；
12000rpm空转2min；
取80μL预热至65℃的重蒸水，分两次洗脱DNA，每次加入重蒸水后静置2min，12000rpm离心2min洗脱DNA。
发明组(实施例2)：冲洗及洗脱DNA操作同实施例2。
试剂盒组和发明组冲洗DNA结果见表2。发明组DNA浓度明显高于试剂盒组，两组结果具有极显著性差异。由于两组洗脱的均为重沉降的DNA，排除了裂解液的影响，因此，可得出发明组冲洗液相较试剂盒组能更好的减少DNA的损失，提高DNA的回收率。
表2不同冲洗液冲洗DNA结果比较
Figure BDA0001317018850000081
注：DNA浓度经Qubit 3.0荧光定量仪测得
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (5)

1.一种提取蛤蚧干品肌肉组织DNA的方法，其特征在于，包括：取粉状蛤蚧组织1mg-30mg，加600μL裂解液和20μL浓度20mg/mL的蛋白酶K，混匀，56℃水浴1-2h；
所用裂解液：SDS的浓度为15％，Tris-HCl的浓度为50mM，EDTA-Na2的浓度为25mM，pH为8.3；
所用冲洗液1：含200mM Tris-HCl的70％乙醇溶液；
所用冲洗液2：80％乙醇溶液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括：取粉状蛤蚧组织1mg，加600μL裂解液和20μL浓度20mg/mL的蛋白酶K，混匀，56℃水浴1h。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括取粉状蛤蚧组织5mg-30mg，加600μL裂解液和20μL浓度20mg/mL的蛋白酶K，混匀，56℃水浴2h。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取洁净的蛤蚧干品，切取肌肉组织，粉碎或液氮研磨成粉；
(2)取粉状蛤蚧肌肉组织1mg-30mg，加600μL裂解液和20μL浓度20mg/mL蛋白酶K，混匀，56℃水浴1-2h，期间每隔15min-30min轻轻摇匀一次；
(3)向上述裂解液水浴后混合液中加入600μL体积比24:1的氯仿-异戊醇，轻轻混匀5min，12000rpm离心5min；将上清液转移到离心管中；
(4)重复步骤(3)一次；
(5)向步骤(4)所得的上清液中加入600μL无水乙醇，摇匀，分次转移到DNA吸附柱上，12000rpm离心30S，倒掉收集管中的废液；
(6)向DNA吸附柱中加入500μL冲洗液1，静置2min，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；
(7)重复步骤(6)一次；
(8)向DNA吸附柱中加入500μL冲洗液2，静置2min，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；
(9)将DNA吸附柱12000rpm空转2min，弃掉收集管，转移到新的离心管中，并在通风橱中放置15min；
(10)将重蒸水预热至65℃，取80μL，分两次洗脱DNA，每次加入重蒸水后静置2min，12000rpm离心2min，洗脱，即得DNA。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)包括：取粉状蛤蚧组织1mg，加600μL裂解液和20μL浓度20mg/mL的蛋白酶K，混匀，56℃水浴1h；
或者，步骤(2)包括：取粉状蛤蚧组织30mg，加600μL裂解液和20μL浓度20mg/mL的蛋白酶K，混匀，56℃水浴2h。
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