CN101792809B

CN101792809B - 一种快速鉴定青蟹属4种青蟹的pcr方法

Info

Publication number: CN101792809B
Application number: CN2010101400126A
Authority: CN
Inventors: 马洪雨; 马凌波; 马春艳
Original assignee: East China Sea Fishery Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Current assignee: East China Sea Fishery Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority date: 2010-04-06
Filing date: 2010-04-06
Publication date: 2012-08-08
Anticipated expiration: 2030-04-06
Also published as: CN101792809A

Abstract

本发明涉及一种快速鉴定青蟹属4种青蟹的PCR方法，包括：(1)4种青蟹基因组DNA的提取；(2)根据4种青蟹的线粒体COI基因核苷酸序列，设计物种特异扩增引物；(3)青蟹属4种青蟹基因组DNA的PCR扩增；(4)最后用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，根据产物的不同大小便可快速鉴定出这4种青蟹。该方法操作简单，安全，扩增条带清晰，结果真实可靠，可快速鉴定出青蟹属4种青蟹，广泛应用于青蟹种质资源保护、管理及遗传育种等领域。

Description

一种快速鉴定青蟹属4种青蟹的PCR方法

技术领域

本发明属于海洋经济蟹类青蟹属的物种鉴定领域，特别涉及一种快速鉴定青蟹属4种青蟹的PCR方法。

背景技术

青蟹属(Scylla)属于节肢动物门(Arthropoda)、甲壳纲(Crustacea)、十足目(Decapoda)、梭子蟹科(Portunidae)，包括4个种：拟穴青蟹(Scylla paramamosain)、锯缘青蟹(Scyllaserrata)、榄绿青蟹(Scylla olivacea)及紫螯青蟹(Scylla tranquebarica)，主要分布于太平洋、印度洋的热带、亚热带和温带沿岸。在我国主要分布于东南沿海各省，以福建、广东和海南最多，是我国重要的养殖蟹类之一。为了鉴定和保护在我国广泛分布的青蟹资源，马凌波等(2006)利用线粒体COI基因序列对分布于我国东南沿海的青蟹的系统发生关系进行了研究，结果表明广泛分布于我国东南沿海的青蟹绝大多数为拟穴青蟹，而不是先前认为的锯缘青蟹。该研究结果同样被高天翔等(2007)和林琪等(2007)的研究所证实。

青蟹人工养殖及选择育种的重要前提是种质问题，即要搞清楚养殖对象的来源。到目前为止，对青蟹的研究主要集中在养殖生物学及繁殖生物学等方面。对遗传学方面的研究较少，主要集中在核外线粒体基因方面。林琪等(2007)对4种青蟹的表型特征进行了仔细对比研究，发现可以从头胸甲额缘4齿的长度、形状来区分。但这种方法只适用于对4种青蟹表型特征非常了解的专业人士，而对于不是专门搞青蟹分类研究的人员来讲，并不容易掌握。此外，Klinbunga等(2000)报道了能够鉴别3种青蟹的RAPD分子标记，但由于RAPD标记本身的不稳定性，导致该标记的重复性较差，故其鉴定的准确性并不高。因此，迫切需要一种能够快速、准确鉴定青蟹属4种青蟹的方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种快速鉴定青蟹属4种青蟹的PCR方法，该方法可快速、准确的鉴定青蟹属4种青蟹，具有操作简单，快速、准确、灵敏等优点，大大提高了鉴定工作的效率和准确性。本发明主要应用于青蟹种质资源保护、管理及遗传育种等领域。

本发明的一种快速鉴定青蟹属4种青蟹的PCR方法，包括：

(1)4种青蟹的基因组DNA的提取；

(2)线粒体COI基因序列分析及物种特异的引物设计

a.COI序列的获得及比对分析；

从公共数据库GenBank中下载四种青蟹的COI序列，利用DNAMAN 4.0生物学软件进行比对，并保留这4种青蟹共有的359个核苷酸序列，进一步查找物种特异的核苷酸位点；

b.物种特异的引物设计；

首先设计一对简并引物(Sc-F和Sc-R)，该引物能够在4种青蟹中扩增到相同片段长度的产物；然后，以物种特异的核苷酸位点作为引物的3’端分别设计3条物种特异的引物ScPa-R(拟穴青蟹)、ScSe-R(锯缘青蟹)、ScOl-R(榄绿青蟹)，这3条引物分别与简并引物Sc-F配对，可扩增出物种特异的PCR产物；

这些引物的序列及相应的产物大小分别为：

阳性对照的引物(简并引物)序列为：

上游引物：Sc-F：5’-gayacdcgagcytaytttacatc-3’

下游引物：Sc-R：5’-taggattwagrgayaaacckgtaaa-3’

产物大小：325bp；

拟穴青蟹特异的下游引物序列为：

ScPa-R：5’-aacatagtggaaatgggctatg-3’

产物大小：243bp；

gacacacgagcctattttacatcagcaacaataatcattgctgttccaacaggaatcaaaatttttagatgactaagaactcttcatggtacacaaattaattataggccttcaatattatgagctttaggatttatcttcttatttactgttgggggtcttacaggagttgttttagctaattcatcaattgacattattctccacgatacatactatgtcatagcccatttccactatgtt；

锯缘青蟹特异的下游引物序列为：

ScSe-R：5’-aataaatcctaaagcccataataca-3’

产物大小：138bp；

gatactcgagcttattttacatcggcaacaataattattgctgttcccacaggaattaaaattttcagatgacttagaactctccatggaacacaaattaattataggccttctgtattatgggctttaggatttatt；

榄绿青蟹特异的下游引物序列为：

ScOl-R：5’-GTGTCATGTAGGATAATATCGACG-3’

产物大小：212bp；

gatacgcgagcttactttacatcagcaacaataattattgctgtccccacgggtatcaaaatttttagatgacttagaacccttcatggaactcaaatcaactacaggccctcaatgctttgagccttaggttttatttttttattcactgtaggtggtcttaccggagtcgttctagctaactcatccgtcgatattatcctacatgacac；

(3)青蟹属4种青蟹基因组DNA的PCR扩增；

(4)PCR产物电泳检测及4种青蟹的鉴定。

所述步骤(1)中的基因组DNA的提取包括以下步骤：剪取4种青蟹100-150mg的肌肉组织，置于500μl组织提取液的中剪碎，加入终浓度为20mg/ml的蛋白酶K和终浓度为100μg/ml的RNaseA，55℃消化2-3个小时；用酚∶氯仿∶异戊醇混合液按体积比25∶24∶1抽提两次；然后用2倍体积的无水乙醇沉淀DNA，经70％乙醇洗涤和自然干燥后，溶解于TE中；最后将DNA浓度稀释为100ng/μl，并保存在-20℃备用。

所述步骤(3)中的青蟹属4种青蟹基因组DNA的PCR扩增的反应体系为25μl，包括基因组DNA模板1μl、上下游引物终浓度均为0.4μmol/L、Mg²⁺终浓度为1.5mmol/L、dNTP终浓度为0.2mmol/L、Tag DNA聚合酶0.75U、1×PCR buffer，最后补充灭菌双蒸水至总体积为25μl；反应程序为：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒、53℃退火50秒、72℃延伸50秒，30个循环；最后于72℃延伸7分钟。

所述步骤(4)中的PCR产物电泳检测及4种青蟹的鉴定：将PCR产物上样于1.5％的琼脂糖凝胶中进行电泳约15分钟，根据物种特异的扩增条带大小便可准确、快速地鉴定4种青蟹。

本发明的快速鉴定青蟹属4种青蟹的PCR方法应用于青蟹种质资源保护、管理及遗传育种等领域。

有益效果

本发明的检测方法可快速、准确的鉴定青蟹属4种青蟹，具有操作简单，快速、准确、灵敏等优点，大大提高了鉴定工作的效率和准确性。本发明主要应用于青蟹种质资源保护、管理及遗传育种等领域。

附图说明

图1为青蟹属4种青蟹的PCR电泳谱图；

其中，字母A对应的是阳性对照条带，字母B对应的是拟穴青蟹特异的条带，字母C对应的是榄绿青蟹特异的条带，字母D对应的是锯缘青蟹特异的条带。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

1、4种青蟹的基因组DNA的提取

剪取青蟹少量肌肉组织(约100-150mg)，置于500μl组织提取液(10mmol/L Tris-CI，pH8.0；100mmol/LEDTA，pH8.0；100mmol/LNaCl；0.5％SDS)的中剪碎，加入蛋白酶K(终浓度为20mg/ml)和RNase A(终浓度为100μg/ml)，充分混匀，55℃消化2-3个小时至澄清；用酚∶氯仿∶异戊醇混合液(体积比为25∶24∶1)抽提两次；然后用2倍体积的无水乙醇沉淀DNA，经70％乙醇洗涤和自然干燥后，溶解于50μL TE(10mmol/L Tris-HCl，pH8.0；10mmol/L EDTA，pH8.0)中；最后将DNA浓度稀释为100ng/μl，并保存在-20℃备用；

2、线粒体COI基因序列分析及物种特异的引物设计

从公共数据库GenBank中下载四种青蟹的COI序列，利用DNAMAN 4.0生物学软件进行比对分析，并保留这4种青蟹共有的359个核苷酸序列，进一步查找物种特异的核苷酸位点.首先设计一对简并引物(Sc-F和Sc-R)，该引物能够在4种青蟹中扩增到相同片段长度的产物，然后，以物种特异的核苷酸位点作为引物的3’端分别设计3条物种特异的引物ScPa-R(拟穴青蟹)、ScSe-R(锯缘青蟹)、ScOl-R(榄绿青蟹)，这3条引物分别与Sc-F配对，可扩增出物种特异的PCR产物(见表1，图1)；

表1用于鉴定4种青蟹的PCR引物

3、青蟹属4种青蟹基因组DNA的PCR扩增

PCR扩增的反应体系为25μl，包括基因组DNA模板1μl、上下游引物终浓度均为0.4μmol/L、Mg²⁺终浓度为1.5mmol/L、dNTP终浓度为0.2mmol/L、Tag DNA聚合酶0.75U、1×PCR buffer，最后补充灭菌双蒸水至总体积为25μl；反应程序为：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒、53℃退火50秒、72℃延伸50秒，30个循环；最后于72℃延伸7分钟；

4、PCR扩增产物及根据产物大小鉴定4种青蟹

将PCR产物上样于1.5％的琼脂糖凝胶中进行电泳，分子量标准为DL1000，电泳液为1×TBE，恒压140V，电泳约15分钟。在紫外灯下观察结果，阳性对照的扩增产物大小为325bp，拟穴青蟹的扩增产物大小为243bp，锯缘青蟹的扩增产物大小为138bp，榄绿青蟹的扩增产物大小为212bp，由于未发现紫螯青蟹的物种特异的核苷酸位点，故未设计其特异的引物，因此，无特异条带的个体便是紫螯青蟹(图1)。

SEQUENCE LISTING

<110>中国水产科学研究院东海水产研究所

<120>一种快速鉴定青蟹属4种青蟹的PCR方法

<160>8

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>prim_bind

<222>(1)..(23)

<223>根据线粒体COI基因设计的阳性对照的简并上游引物

<400>1

gayacdcgag cytaytttac atc 23

<210>2

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>prim_bind

<222>(1)..(25)

<223>根据线粒体COI基因设计的阳性对照的简并下游引物

<400>2

taggattwag rgayaaacck gtaaa 25

<210>3

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>prim_bind

<222>(1)..(22)

<223>根据线粒体COI基因设计的拟穴青蟹特异扩增的下游引物

<400>3

aacatagtgg aaatgggcta tg 22

<210>4

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>prim_bind

<222>(1)..(25)

<223>根据线粒体COI基因设计的锯缘青蟹特异扩增的下游引物

<400>4

aataaatcct aaagcccata ataca 25

<210>5

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>prim_bind

<222>(1)..(24)

<223>根据线粒体COI基因设计的榄绿青蟹特异扩增的下游引物

<400>5

gtgtcatgta ggataatatc gacg 24

<210>6

<211>243

<212>DNA

<213>拟穴青蟹(Scylla paramamosain)

<400>6

gacacacgag cctattttac atcagcaaca ataatcattg ctgttccaac aggaatcaaa 60

atttttagat gactaagaac tcttcatggt acacaaatta attataggcc ttcaatatta 120

tgagctttag gatttatctt cttatttact gttgggggtc ttacaggagt tgttttagct 180

aattcatcaa ttgacattat tctccacgat acatactatg tcatagccca tttccactat 240

gtt 243

<210>7

<211>138

<212>DNA

<213>锯缘青蟹(Scylla serrata)

<400>7

gatactcgag cttattttac atcggcaaca ataattattg ctgttcccac aggaattaaa 60

attttcagat gacttagaac tctccatgga acacaaatta attataggcc ttctgtatta 120

tgggctttag gatttatt 138

<210>8

<211>212

<212>DNA

<213>榄绿青蟹(Scylla olivacea)

<400>8

gatacgcgag cttactttac atcagcaaca ataattattg ctgtccccac gggtatcaaa 60

atttttagat gacttagaac ccttcatgga actcaaatca actacaggcc ctcaatgctt 120

tgagccttag gttttatttt tttattcact gtaggtggtc ttaccggagt cgttctagct 180

aactcatccg tcgatattat cctacatgac ac 212

Claims

1.一种快速鉴定青蟹属4种青蟹的PCR方法，包括：

(1)4种青蟹的基因组DNA的提取；

(2)线粒体COI基因序列分析及物种特异的引物设计

引物的序列及相应的产物大小分别为：

阳性对照的简并引物序列为：

上游引物：Sc-F：5’-gayacdcgagcytaytttacatc-3’

下游引物：Sc-R：5’-taggattwagrgayaaacckgtaaa-3’

产物大小：325bp；

拟穴青蟹特异的下游引物序列为：

ScPa-R：5’-aacatagtggaaatgggctatg-3’

产物大小：243bp；

锯缘青蟹特异的下游引物序列为：

ScSe-R：5’-aataaatcctaaagcccataataca-3’

产物大小：138bp；

榄绿青蟹特异的下游引物序列为：

ScOl-R：5’-gtgtcatgtaggataatatcgacg-3’

产物大小：212bp；

(3)青蟹属4种青蟹基因组DNA的PCR扩增；

(4)PCR产物电泳检测及4种青蟹的鉴定。

2.根据权利要求1所述的一种快速鉴定青蟹属4种青蟹的PCR方法，其特征在于：所述步骤(1)中的基因组DNA的提取包括以下步骤：剪取4种青蟹100-150mg的肌肉组织，置于500μl组织提取液的中剪碎，加入终浓度为20mg/ml的蛋白酶K和终浓度为100μg/ml的RNaseA，55℃消化2-3个小时；用酚∶氯仿∶异戊醇混合液按体积比25∶24∶1抽提两次；然后用2倍体积的无水乙醇沉淀DNA，经70％乙醇洗涤和自然干燥后，溶解于TE中；最后将DNA浓度稀释为100ng/μl，并保存在-20℃备用。

3.根据权利要求1所述的一种快速鉴定青蟹属4种青蟹的PCR方法，其特征在于：所述步骤(3)中的青蟹属4种青蟹基因组DNA的PCR扩增的反应体系为25μl，包括基因组DNA模板1μl、上下游引物终浓度均为0.4μmol/L、Mg²⁺终浓度为1.5mmol/L、dNTP终浓度为0.2mmol/L、Tag DNA聚合酶0.75U、1×PCR buffer，最后补充灭菌双蒸水至总体积为25μl；反应程序为：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒、53℃退火50秒、72℃延伸50秒，30个循环；最后于72℃延伸7分钟。

4.根据权利要求1所述的一种快速鉴定青蟹属4种青蟹的PCR方法，其特征在于：所述步骤(4)中的PCR产物电泳检测及4种青蟹的鉴定：将PCR产物上样于1.5％的琼脂糖凝胶中进行电泳约15分钟，根据物种特异的扩增条带大小便可鉴定出4种青蟹。

5.根据权利要求1所述的一种快速鉴定青蟹属4种青蟹的PCR方法，其特征在于：所述的快速鉴定方法应用于青蟹种质资源保护、管理及遗传育种领域。