CN103060332A - 一种拟穴青蟹线粒体全基因组dna及检测方法 - Google Patents

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马洪雨
马凌波
马春艳
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East China Sea Fishery Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
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Abstract

本发明涉及一种拟穴青蟹线粒体全基因组DNA及检测方法，该DNA分子为闭合环形结构，长度为15824bp；检测方法包括：（1）拟穴青蟹线粒体相关基因序列的收集及与近缘种线粒体全基因组序列的比对；（2）引物设计与PCR扩增；（3）PCR产物测序与序列组装。本发明获得了拟穴青蟹线粒体全基因组DNA序列。本发明的检测方法具有快速、低成本、容易掌握等优点，所获得的线粒体全基因组DNA可应用于拟穴青蟹遗传变异分析、种质资源鉴定与保护及系统发育等领域。

Description

一种拟穴青蟹线粒体全基因组DNA及检测方法
技术领域
本发明属于拟穴青蟹基因组学领域，特别是涉及一种拟穴青蟹线粒体全基因组DNA及检测方法。
背景技术
在绝大多数的多细胞动物中，线粒体基因组DNA为典型的闭合环状结构，长度在14~18kb之间，能够自主复制和转录。线粒体基因组通常编码37个基因，包括：13个蛋白编码基因、22个tRNA基因、2个rRNA基因，此外，还包含1个大的非编码区（control region）。线粒体全基因组不仅能够提供比单基因更多的遗传信息，而且能够揭示出基因组水平的特征，从而有助于更好的理解基因组进化与发育特点。到目前为止，学者们已经揭示了较多甲壳类动物的线粒体全基因组DNA信息，包括：斑节对虾、中国对虾、中华绒螯蟹、三疣梭子蟹、锯缘青蟹、日本蟳等。由于具有单倍性、低重组率、母性遗传及进化速率快等特点，线粒体DNA已经被广泛地应用于遗传学、系统进化学及物种鉴定等领域。
拟穴青蟹（Scyllaparamamosain）俗称青蟹，在我国主要分布于长江口及以南沿海海域，是我国重要的海洋渔业资源和海水养殖蟹类。拟穴青蟹具有体型大、生长速度快、肉味鲜美等优点，深受广大消费者青睐。近年来，我国拟穴青蟹的人工养殖年产量一直稳定在10万吨以上，保持了健康的发展势头。学者们围绕拟穴青蟹繁殖生物学、养殖生物学等方面已经开展了较多的研究工作。此外，开展了微卫星和SNPs分子标记研究，同时，还克隆了拟穴青蟹线粒体COI、12S rRNA和16S rRNA基因序列，并分别利用这3种基因标记分析了青蟹属4个种的系统进化关系。然而，单基因标记所揭示的遗传信息远低于全基因组所提供的信息，并且有可能对研究结果起误导作用。因此，有必要开展拟穴青蟹线粒体全基因组DNA研究，从基因组水平揭示其系统进化关系和种群遗传多样性水平。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种拟穴青蟹线粒体全基因组DNA及检测方法，该方法具有快速、低成本、容易掌握等优点，所获得的线粒体全基因组DNA可应用于拟穴青蟹遗传变异分析、种质资源鉴定与保护及系统发育等领域。
本发明的获得的拟穴青蟹线粒体全基因组DNA为闭合环形结构，长度为15824bp，具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
本发明的拟穴青蟹线粒体全基因组DNA的检测方法，包括：
（1）拟穴青蟹线粒体相关基因序列的收集与分析
可通过三种方法获得拟穴青蟹的线粒体相关基因序列：一是从测序获得的基因组文库或转录组文库中查找；二是从GenBank数据库中公开的拟穴青蟹基因序列中查找；三是若通过以上两种渠道无法获得相关基因序列，则可通过收集近缘种的线粒体序列进行同源比对，在保守区设计简并引物，然后以拟穴青蟹的DNA为模板进行PCR扩增，通过测序后获得拟穴青蟹线粒体部分基因序列。最后，将获得的部分基因序列与近缘种的线粒体全基因组序列进行比对，分析相关基因在近缘种的线粒体全基因组序列上的相对位置。
（2）引物设计与PCR扩增
根据拟穴青蟹线粒体基因在近缘种全基因组序列上的相对位置，以拟穴青蟹基因为模板设计引物，采用PCR方法扩增相邻的两个已知基因间的未知序列。PCR扩增反应体系为25μl，包括基因组DNA模板1μl、终浓度均为0.4μmol/L的上下游引物、终浓度为1.5mmol/L Mg2+、终浓度为0.2mmol/L dNTP、0.75U TagDNA聚合酶、1×PCR buffer，最后补充灭菌双蒸水至总体积为25μl；反应程序为：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒、特异性的退火温度退火50秒、72℃延伸50秒，35个循环；最后于72℃延伸5分钟。PCR反应完成后，采用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测产物的质量。
所述步骤（2）中的引物序列和退火温度如表1：
表1
Figure BDA00002612125200021
（3）PCR产物测序与序列组装
将上述PCR产物送测序公司进行双向、直接测序。将每个PCR产物的双向测序结果拼接为一条完整的序列。然后，以拟穴青蟹的近缘种锯缘青蟹和三疣梭子蟹的线粒体全基因组序列为参照物，将所有的线粒体相关基因进行组装。最后，将组装获得的拟穴青蟹线粒体全基因组DNA序列提交到GenBank数据库中（GenBank登陆号为：JX457150）。
所述步骤（1）中的近缘种为锯缘青蟹、榄绿青蟹、紫鳌青蟹、三疣梭子蟹或日本蟳。
本发明所获得的拟穴青蟹线粒体全基因组DNA可应用于拟穴青蟹种群遗传变异分析、种质资源鉴定与保护及系统发育等领域。
有益效果
（1）本发明的检测方法具有快速、低成本、容易掌握等优点，能够有效检测出拟穴青蟹的线粒体全基因组DNA序列，从而为拟穴青蟹分子遗传学及分子系统进化学研究提供有效的研究平台；
（2）本发明提供的拟穴青蟹全线粒体基因组DNA可应用于拟穴青蟹遗传变异分析、种质资源评估与保护及系统发育等领域。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
1、拟穴青蟹线粒体相关基因序列的收集与分析
首先，本发明一方面从测序获得的转录组文库中筛选拟穴青蟹线粒体相关基因序列，一方面从GenBank数据库中检索拟穴青蟹线粒体相关基因；然后，将收集到的线粒体相关基因序列与近缘种锯缘青蟹和三疣梭子蟹的线粒体全基因组序列进行比对，分析相关基因在近缘种线粒体全基因组序列上的相对位置。
2、引物设计与PCR扩增
根据拟穴青蟹线粒体基因在近缘种全基因组序列上的相对位置，以拟穴青蟹基因序列为模板设计引物，采用PCR方法扩增相邻两个基因间的未知序列。PCR扩增反应体系为25μl，包括基因组DNA模板1μl、终浓度均为0.4μmol/L的上下游引物、终浓度为1.5mmol/L Mg2+、终浓度为0.2mmol/LdNTP、0.75U Tag DNA聚合酶、1×PCR buffer，最后补充灭菌双蒸水至总体积为25μl；反应程序为：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒、特异性的退火温度退火50秒、72℃延伸50秒，35个循环；最后于72℃延伸5分钟。PCR反应完成后，采用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测产物的质量。
3、PCR产物测序与序列组装
将上述PCR产物送测序公司进行双向、直接测序。将每个PCR产物的双向测序结果拼接为一条完整的序列。然后以拟穴青蟹的近缘种锯缘青蟹和三疣梭子蟹的线粒体全基因组序列为模板，将所有的线粒体相关基因进行组装。最后，将组装获得的拟穴青蟹线粒体全基因组DNA序列提交到GenBank数据库中（GenBank登陆号为：JX457150）。
Figure IDA00002612125900021
Figure IDA00002612125900031
Figure IDA00002612125900041
Figure IDA00002612125900051
Figure IDA00002612125900071
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Figure IDA00002612125900091
Figure IDA00002612125900101
Figure IDA00002612125900111
Figure IDA00002612125900141

Claims (8)

1.一种拟穴青蟹全基因组DNA，其特征在于：所述DNA分子为闭合环形结构，长度为15824bp，具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
2.一种拟穴青蟹线粒体全基因组DNA的检测方法，包括：
（1）收集拟穴青蟹线粒体相关基因序列，并与近缘种的线粒体全基因组序列进行比对，分析相关基因在近缘种的线粒体全基因组序列上的相对位置；
（2）根据线粒体基因在近缘种全基因组序列上的相对位置设计引物，采用PCR方法扩增相邻的两个已知序列间的未知序列；
（3）对PCR产物进行测序、序列分析，将所有线粒体相关基因序列进行组装，获得全基因组DNA序列。
3.根据权利要求2所述的一种拟穴青蟹线粒体全基因组DNA的检测方法，其特征在于：所述步骤（1）中线粒体相关基因序列来源于测序获得的基因组文库或转录组文库、GenBank数据库中公开的拟穴青蟹线粒体基因序列；或通过近缘种的线粒体序列进行同源比对，并在保守区设计简并引物，然后以拟穴青蟹DNA为模板进行PCR扩增，测序后获得拟穴青蟹线粒体部分基因序列。
4.根据权利要求3所述的一种拟穴青蟹线粒体全基因组DNA的检测方法，其特征在于：所述步骤（1）中的近缘种为锯缘青蟹、榄绿青蟹、紫鳌青蟹、三疣梭子蟹或日本蟳。
5.根据权利要求2所述的一种拟穴青蟹线粒体全基因组DNA的检测方法，其特征在于：所述步骤（2）中的引物共3对，其引物序列和退火温度为：
Sp-ND3-5：F：GGAGCTTTAGAATGATCTAAGTAAT
R：AAAGTAGCAGATAAAGGTTGATTTG
退火温度为：53℃；
Sp-16-12S：F：AATTATCCCTGATACACAAGGTACA
R：TTAGTCTTGTCAGAGGAACCTGTT
退火温度为：55℃；
Sp-12-ND2：F：AAAGTATAACCGCAACTGCTGGCAC
R：TTAATTCAAACAGAACTAAAGAGAT
退火温度为：60℃。
6.根据权利要求2所述的一种拟穴青蟹线粒体全基因组DNA的检测方法，其特征在于：所述步骤（2）中的PCR扩增反应体系为25μl，包括基因组DNA模板1μl、终浓度均为0.4μmol/L的上下游引物、终浓度为1.5mmol/L Mg2+、终浓度为0.2mmol/LdNTP、0.75U Tag DNA聚合酶、1×PCR buffer，最后补充灭菌双蒸水至总体积为25μl；反应程序为：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒、特异性的退火温度退火50秒、72℃延伸50秒，35个循环；最后于72℃延伸5分钟。
7.根据权利要求2所述的一种拟穴青蟹线粒体全基因组DNA的检测方法，其特征在于：所述步骤（3）中的PCR产物的测序方法为双向、直接测序。
8.根据权利要求2所述的一种拟穴青蟹线粒体全基因组DNA的检测方法，其特征在于：所述步骤（3）中的组装方法是：以锯缘青蟹的线粒体全基因组DNA序列为参照物，将所有拟穴青蟹线粒体的基因序列进行拼接，获得拟穴青蟹线粒体全基因组DNA。
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