CN111850137A - 一种中华绒螯蟹血淋巴的直接pcr方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基因检测领域内的一种中华绒螯蟹血淋巴的直接PCR方法，包括如下步骤：消化液配制、血液采集、血液预处理和PCR扩增。消化液的组份及含量为：SDS 2.05‑3.05g、Tris 0.55‑0.75g、NaCl 10.50‑12.50g、EDTA 0.25‑0.45g和超纯水400‑500ml。血液采集的方式为：用规格为1ml的注射器呈45°倾斜角于中华绒螯蟹的第四步足基部处，插入基膜2‑4mm抽取30ul血淋巴。血液预处理的方式为：用注射器将30ul血淋巴注入规格为1.5ml的离心管中，再取100ul消化液注入离心管中吹打混匀，于56℃的烘箱中消化10min，完成消化后加入100ul酚氯仿异戊醇溶液，颠倒混匀乳化后于高速离心机中离心。本发明能够提供一种操作简单、成本低廉、安全无毒的基因检测手段，适用于中华绒螯蟹的分子辅助标记育种领域。
Description
技术领域
本发明属于基因检测领域，特别涉及一种中华绒螯蟹血淋巴的直接PCR方法。
背景技术
现有技术中，中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）俗称河蟹，该水生甲壳动物作为典型的水产经济物种，其快熟发展起始于90年代，到现如今河蟹年产量已达80万吨左右，然而河蟹产业发展相对陆生经济动物较为滞后，品种选育更甚。自中华绒螯蟹产业快速发展到现今诞生了5个中华绒螯蟹新品种（长江1号、长江2号、诺亚1号、光合1号、江海21）然而这些品种的育种方式均为选育和杂交相结合的传统选育手段，在高速发展的21世纪，人们对河蟹的需求逐渐从“养大蟹”转变为“养好蟹”，传统育种方式的产能已经不能满足人们对高品质河蟹产品的需求。因此，利用分子辅助标记育种的手段，培育安全、高效且杂交子代性状可控的优良新品种是国内中华绒螯蟹产业长足发展的必由之路，然而在分子辅助标记育种的工作前期需要对大量亲本进行基因型和表型的关联分析，进而获得可靠的育种标记。在这一过程中，快速获取大样本的遗传数据就显得至关重要，而传统的DNA提取方法在上千样本的提取中是一种费时费力且低效的手段，因此，研发血液快速直接PCR方法无疑能对中华绒螯蟹分子辅助标记育种研究提供助力。
虽然商业化的组织（血液）直接PCR试剂盒早已面世，但是其售价较高，单个样本的PCR扩增成本高达20-50元，这在大样本筛选的工作无疑会大量增加实验成本。此外在分子辅助标记育种中，无创或者低伤害采集繁殖亲本的组织进行遗传分析是必须的，传统的方法是采集中华绒螯蟹步足肌肉组织进行DNA提取，这无疑会对亲本造成较大伤害。因此，开发无创低害的组织（血液）采集方法对繁育亲本进行遗传分析是非常必要的。
发明内容
本发明的目的是提供一种中华绒螯蟹血淋巴的直接PCR方法，能够提供一种操作简单、成本低廉、安全无毒的基因检测手段，适用于中华绒螯蟹的分子辅助标记育种领域。
本发明的目的是这样实现的：一种中华绒螯蟹血淋巴的直接PCR方法，包括如下步骤：消化液配制、血液采集、血液预处理和PCR扩增。
作为本发明的进一步改进，所述消化液的组份及含量为：SDS 2.05-3.05g、Tris0.55-0.75g、NaCl 10.50-12.50g、EDTA 0.25-0.45g和超纯水400-500ml。分别称取SDS2.05-3.05 g、Tris 0.55-0.75 g、NaCl 10.50-12.50g和EDTA 0.25-0.45g，再量取400-500ml超纯水，将上述称取的物质放入超纯水中，并充分混合溶解。本消化液能有效快速消化甲壳动物血淋巴。
作为本发明的进一步改进，所述消化液配制完成后，用饱和NaOH溶液调整pH为8.0，再用0.22um孔径的滤膜进行过滤除菌备用。
作为本发明的进一步改进，所述血液采集的方式为：用规格为1ml的注射器呈45°倾斜角于中华绒螯蟹的第四步足基部处，插入基膜2-4mm抽取30ul血淋巴。实现最低创伤采集中华绒螯蟹亲本的血淋巴。
作为本发明的进一步改进，所述血液预处理的方式为：用注射器将30ul血淋巴注入规格为1.5ml的离心管中，再取100ul消化液注入离心管中吹打混匀，于56℃的烘箱中消化10min，完成消化后加入100ul 酚氯仿异戊醇溶液，颠倒混匀乳化后于高速离心机中离心。消化后的组织液经酚氯仿异戊醇溶液萃取得到的上清溶液可去除绝大部分影响直接PCR效果的蛋白、激素、糖类等杂质，PCR效果良好。
作为本发明的进一步改进，所述酚氯仿异戊醇溶液由苯酚、氯仿和异戊醇按25:24:1 的体积比混合而成，酚氯仿异戊醇溶液的pH=7.8。
作为本发明的进一步改进，所述高速离心机的离心速度为1200rpm/min，离心时间为3min，离心后的上清溶液作为PCR反应的模板，将剩余的上清溶液长期冷冻保存备用。
作为本发明的进一步改进， PCR反应的模板为1ul的上清溶液，并加入基因检测正反向引物：0.5ul（10um/ul），2x PCR MIX：10ul，ddH2O：8ul。
作为本发明的进一步改进，直接PCR的反应程序如下：
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：通过从中华绒螯蟹的第四步足基部抽取30ul血淋巴，再将血淋巴与消化液混合后进行消化，并且与酚氯仿异戊醇溶液混匀乳化后在离心机中离心，萃取得到的上清溶液可去除绝大部分影响直接PCR效果的蛋白、激素、糖类等杂质；预处理后的的血液再进行PCR反应，可以更清楚地得到中华绒螯蟹MSTN基因核酸片段扩增。
附图说明
图1为中华绒螯蟹MSTN基因核酸片段扩增。
具体实施方式
本发明的一种中华绒螯蟹血淋巴的直接PCR方法，包括如下步骤：
（1）消化液配制：所述消化液的组份及含量为：SDS 2.05-3.05g、Tris 0.55-0.75g、NaCl 10.50-12.50g、EDTA 0.25-0.45g和超纯水400-500ml。分别称取SDS 2.05-3.05 g、Tris 0.55-0.75 g、NaCl 10.50-12.50g和EDTA 0.25-0.45g，再量取400-500ml超纯水，将上述称取的物质放入超纯水中，并充分混合溶解。
进一步优选地，称取SDS 2.5g，Tris 0.6057g，NaCl 11.7g，EDTA 0.37224g，并量取500mL超纯水。所述消化液配制完成后，用饱和NaOH溶液调整pH为8.0，再用0.22um孔径的滤膜进行过滤除菌备用。
（2）血液采集：用规格为1ml的注射器呈45°倾斜角于中华绒螯蟹的第四步足基部处，插入基膜2-4mm抽取30ul血淋巴。
（3）血液预处理：用注射器将30ul血淋巴注入规格为1.5ml的离心管中，再取100ul消化液注入离心管中吹打混匀，于56℃的烘箱中消化10min，完成消化后加入100ul 酚氯仿异戊醇溶液，所述酚氯仿异戊醇溶液由苯酚、氯仿和异戊醇按25:24:1 的体积比混合而成，酚氯仿异戊醇溶液的pH=7.8；颠倒混匀乳化后于高速离心机中离心；
所述高速离心机的离心速度为1200rpm/min，离心时间为3min，离心后的上清溶液作为PCR反应的模板，将剩余的上清溶液长期冷冻保存备用；
（4）PCR扩增： PCR反应的模板为1ul的上清溶液，并加入基因检测正反向引物：0.5ul（10um/ul），2x PCR MIX：10ul，ddH2O：8ul。
直接PCR的反应程序如下：
中华绒螯蟹MSTN基因核酸片段扩增如图1所示。
本发明通过从中华绒螯蟹的第四步足基部抽取30ul血淋巴，再将血淋巴与消化液混合后进行消化，并且与酚氯仿异戊醇溶液混匀乳化后在离心机中离心，萃取得到的上清溶液可去除绝大部分影响直接PCR效果的蛋白、激素、糖类等杂质；预处理后的的血液再进行PCR反应，可以更清楚地得到中华绒螯蟹MSTN基因核酸片段扩增。
本发明并不局限于上述实施例，在本发明公开的技术方案的基础上，本领域的技术人员根据所公开的技术内容，不需要创造性的劳动就可以对其中的一些技术特征作出一些替换和变形，这些替换和变形均在本发明的保护范围内。
Claims (9)
1.一种中华绒螯蟹血淋巴的直接PCR方法，其特征在于包括如下步骤：消化液配制、血液采集、血液预处理和PCR扩增。
2.根据权利要求1所述的一种中华绒螯蟹血淋巴的直接PCR方法，其特征在于，所述消化液的组份及含量为：SDS 2.05-3.05g、Tris 0.55-0.75g、NaCl 10.50-12.50g、EDTA0.25-0.45g和超纯水400-500ml。
3.根据权利要求2所述的一种中华绒螯蟹血淋巴的直接PCR方法，其特征在于，所述消化液配制完成后，用饱和NaOH溶液调整pH为8.0，再用0.22um孔径的滤膜进行过滤除菌备用。
4.根据权利要求1-3任一项所述的一种中华绒螯蟹血淋巴的直接PCR方法，其特征在于，所述血液采集的方式为：用规格为1ml的注射器呈45°倾斜角于中华绒螯蟹的第四步足基部处，插入基膜2-4mm抽取30ul血淋巴。
5.根据权利要求4所述的一种中华绒螯蟹血淋巴的直接PCR方法，其特征在于，所述血液预处理的方式为：用注射器将30ul血淋巴注入规格为1.5ml的离心管中，再取100ul消化液注入离心管中吹打混匀，于56℃的烘箱中消化10min，完成消化后加入100ul 酚氯仿异戊醇溶液，颠倒混匀乳化后于高速离心机中离心。
6.根据权利要求5所述的一种中华绒螯蟹血淋巴的直接PCR方法，其特征在于，所述酚氯仿异戊醇溶液由苯酚、氯仿和异戊醇按25:24:1 的体积比混合而成，酚氯仿异戊醇溶液的pH=7.8。
7.根据权利要求5所述的一种中华绒螯蟹血淋巴的直接PCR方法，其特征在于，所述高速离心机的离心速度为1200rpm/min，离心时间为3min，离心后的上清溶液作为PCR反应的模板，将剩余的上清溶液长期冷冻保存备用。
8.根据权利要求7所述的一种中华绒螯蟹血淋巴的直接PCR方法，其特征在于， PCR反应的模板为1ul的上清溶液，并加入基因检测正反向引物：0.5ul（10um/ul），2x PCR MIX：10ul，ddH2O：8ul。
9.根据权利要求1-3任一项所述的一种中华绒螯蟹血淋巴的直接PCR方法，其特征在于，直接PCR的反应程序如下：
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