CN104031909A

CN104031909A - 一种酒精长期保存后河蟹基因组dna的高效提取方法

Info

Publication number: CN104031909A
Application number: CN201410292771.2A
Authority: CN
Inventors: 王成辉; 吴廉
Original assignee: Shanghai Maritime University
Current assignee: Shanghai Maritime University; Shanghai Ocean University
Priority date: 2014-06-27
Filing date: 2014-06-27
Publication date: 2014-09-10

Abstract

本发明公开了一种提取酒精长期保存后河蟹基因组DNA的方法，其步骤包括：（1）组织采取：剪取酒精保存的中华绒螯蟹第二步足肌肉少许，烘干酒精。（2）基因组DNA提取：配制裂解缓冲液后，水浴消化，离心，加饱和NaCl溶液和氯仿，离心，再加氯仿，离心，加异丙醇，离心沉淀DNA，洗涤，离心后烘干，加去离子水或TE溶液保存。本发明解决了酒精长期保存后的中华绒螯蟹DNA提取难题，本发明方法简便、有效的提取河蟹DNA，提取的DNA数量足、质量高，几乎不受蛋白质的污染，可用于后续多种分子生物学分析，从而为河蟹的遗传多样性研究、种质保护和资源利用提供一项技术手段，具重要科学意义和实用价值。

Description

一种酒精长期保存后河蟹基因组DNA的高效提取方法

技术领域

本发明涉及一种简便、快速、高质量提取酒精保存后的河蟹基因组DNA的方法。

背景技术

河蟹是我国淡水绒螯蟹的总称，包括中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）、日本绒螯蟹（Eriocheir japanicus）和合浦绒螯蟹（Eriocheir hepunensis）。它们均属节肢动物门（Arthropoda）、甲壳纲（Crustacca）、十足目（Decapo）、方蟹科（Grapsidae）、绒螯蟹属（Eriocheir）。中华绒螯蟹，是我国特有的水生经济动物，广泛分布于辽河、长江、瓯江、闽江等水系，此外在欧洲等地也有了广阔分布。日本绒螯蟹主要分布于日本本土、朝鲜半岛、俄罗斯的海参威等地区。合浦绒螯蟹分布于我国广西南流江水系（如合浦县）和珠江水系。在学术上，这三种绒螯蟹的分类地位与遗传进化关系长期以来为争论焦点之一。在养殖产业上，这三种绒螯蟹常发生不同程度的苗种交流与种源混杂。因而，在学术与产业界均要对这几种绒螯蟹进行遗传鉴别与种质区分，需经常用到其DNA进行遗传分析。

然而，针对河蟹种质资源相关研究中，获得良好实验材料DNA样本是遗传分析最为关键的首要任务。实际工作中，动物标本采集离实验室较远，通常采用酒精作为一种长久保护核酸的试剂广泛应用在科学工作中。因为它能有效的渗入到细胞中，从取材到提取过程中均能抑制DNA酶活性。酒精固定的样本，避免了组织腐烂，但易使DNA碎片化。相对河蟹标本而言，我们常常也是采用酒精进行保存。与其它用酒精保存的水产生物相比较，河蟹属于低等甲壳动物的特殊性，甲壳对肌肉组织有一定保护作用，造成酒精渗入肌肉组织的过程较为缓慢，而使肌肉组织在较短时间内得不到保存而存在一定程度的腐败，影响了DNA的保存完整性，最后造成后续DNA提取困难。此外，发明申请人在近10年的研究过程中，发现酒精保存的河蟹组织样本在提取DNA过程中的难度远高于鱼类等其它水产生物。因而，发明一种酒精长期保存后的河蟹DNA提取方法对我们的科学研究工作具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种酒精保存后的河蟹DNA的高效提取方法，是本发明人在实践中探索出的稳定技术，解决了酒精长期保存后的中华绒螯蟹DNA提取难题，通过该方法能保障酒精保存后的河蟹提取的DNA数量足、质量高，可用于后续相关种质研究与遗传分析，可满足分子生物学相关实验DNA样本的需求。

本发明提供的技术方案是：一种提取酒精长期保存后河蟹基因组的DNA方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）剪取肌肉组织；

（2）提取基因组DNA，步骤如下；

a. 将第（1）步剪取的河蟹肌肉置烘箱烘干酒精；将肌肉组织剪碎，再加裂解缓冲液和蛋白酶K进行消化，其中裂解缓冲液和蛋白酶K的成分和浓度为：含10mmol/L EDTA，0.1mol/LNaCl，0.01M Tris-Cl的STE缓冲液，10% SDS，20mg/mL的蛋白酶K；河蟹肌肉用量与加裂解缓冲液和蛋白酶K的量之间的关系是：河蟹肌肉10-30mg，加300-500μL STE，50-150μL SDS和10-30μL蛋白酶K，于50-60℃的水浴锅中消化，直至组织消化完全溶液变得清亮透明为止；

b. 将步骤a得到的消化液离心，取上清液加饱和NaCl溶液轻混匀；

c. 再加氯仿颠倒轻混匀；

d. 离心，取上清液再次加入氯仿；

e. 离心，取上清液加入异丙醇；

f. 离心沉淀DNA；

g. 洗涤DNA，轻摇混匀；

h. 离心，将沉淀DNA烘干；

i. 在烘干后的DNA加去离子水或TE溶液，并加入RNA酶去除DNA中的RNA，保存备用。

优选地：

在第（1）步中，在剪取河蟹第二步足上的肌肉的过程中纵向剪取肌肉，烘干酒精后然后用小剪刀将组织剪碎成粉末状。

在第（2）步中，消化时间20至30小时，需将肌肉组织消化完全至溶液清亮透明。

在第（2）步中，河蟹肌肉用量与加裂解缓冲液和蛋白酶K的量之间的关系是：河蟹肌肉20mg，加400μL STE，100μL SDS和20μL蛋白酶K。

在第（2）步中，水浴的温度为56℃。

本发明具有如下优点：

本发明方法是发明人在针对长期用酒精保存后的河蟹DNA提取的不断摸索过程中，选择河蟹步足肌肉作为提取DNA的材料，通过设计河蟹肌肉细胞的裂解缓冲液和实验步骤，以饱和NaCl法提取河蟹基因组DNA，解决了酒精长期保存后的中华绒螯蟹DNA提取难题，也为解决市场目前无专用试剂盒提取长期保存的低等甲壳动物的DNA提供了参考。该方法简便、有效的提取河蟹DNA，提取的DNA数量足、质量高，几乎不受蛋白质的污染，可用于后续多种分子生物学分析，从而为河蟹的遗传多样性研究、种质保护和资源利用提供一项技术手段，具重要科学意义和实用价值。

附图说明

图1为本发明提取DNA的电泳直接检测结果；

图2为本发明提取DNA的微卫星引物PCR扩增检测结果。

具体实施方式

本发明的具体实施方式如下：

一、组织采取

1．剪取酒精保存的河蟹第二步足上的肌肉少许，剪取过程中需纵向剪取肌肉。

2．剪取的肌肉先置37℃烘箱烘干酒精后（时长1小时），用小剪刀将肌肉剪成粉末状。（此步是关键步骤之一，时间不能超过1小时，若长造成干燥过度，影响DNA提取）

二、DNA提取

1. 裂解缓冲液配制：裂解缓冲液的成分与浓度为：STE(10mmol/L EDTA，0.1mol/L NaCl，0.01M Tris-Cl)，10%SDS，20mg/mL的蛋白酶K。

2. 消化：向离心管依次加入STE 400uL，SDS（10%）100uL，20uL蛋白酶K（20mg/mL）,涡旋振荡混匀15秒，简短离心后置56℃水浴锅约20小时至组织完全消化，溶液变得清亮透明。特别注意此步必须将肌肉组织消化完全至溶液清亮透明，才能达到满意效果。

3. 加饱和NaCl溶液：往消化液加入450uL 饱和Nacl颠倒轻混匀5分钟。

4. 加入氯仿：加入350uL氯仿上下颠倒轻柔混匀分钟。

5. 离心：将上步所得溶液室温离心，12000转/分钟，共离心10分钟。

6. 再次加氯仿：取上清液800uL转移至新的离心管，加入350uL氯仿轻柔混均；室温离心，12000转/分钟，共离心10分钟。

7. 加异丙醇：取上清液550uL转移至新的离心管，加入预冷异丙醇450uL（-20℃）上下颠倒至白色絮状沉淀出现。

8. 离心沉淀DNA：4℃离心，13000转/分钟，共离心20分钟。

9. 洗涤DNA：沿同一方向缓慢倒掉异丙醇，加入800uL 预冷75%乙醇（-20℃），轻柔混均后4℃离心，13000转/分钟，共离心15分钟。

10. 烘干溶解保存：沿同一方向缓慢倒掉乙醇，于37℃烘箱烘干DNA，加去离子水或TE溶液100μL溶解DNA，并加入RNA酶0.5μL去除DNA中的RNA。

三、DNA检测

1. 紫外分光光度计检测

取DNA溶液2μL，加入98μL去离子水稀释50倍后，用752型紫外分光光度计检测样品在OD值为260、280nm时的吸光光度值。DNA的纯度根据OD₂₆₀ / OD₂₈₀ 的比值确定。高质量的DNA溶液的OD₂₆₀ / OD₂₈₀比值1.8-2.1之间。

经检测，该方法提取的DNA样本的OD₂₆₀ / OD₂₈₀比值介于1.80-2.00之间，说明该方法提取的河蟹酒精保存的基因组DNA的质量好、纯度高。

上述主要检测DNA纯度，其扩增效果和使用效率情况还需作进一步检测，如电泳检测和PCR扩增检测等。

2. 电泳检测

取DNA溶液5μL，于1.5％琼脂糖凝胶电泳（电压120V，时间40min）后检测，经凝胶成像分析系统观察在点样点附件存在白色的DNA条带，说明DNA提取较好。具体如图1所示。

3. PCR检测

以提取的DNA为模板，选取部分标记引物或基因序列引物进行检测，本方法中使用微卫星标记引物的检测方法，其它方法可参照此方法进行。

（1）PCR扩增

PCR扩增反应体系：DNA模板（20 ng/μL）0.5μL，PCR 反应液 (0.2 μM dNTPs，1.5 μM MgCl₂， 0.5 μM Taq DNA酶) 5μL，引物(0.5 μM) 1μL，去离子水3.5μL。

PCR反应程序为：94℃变性5分钟，然后35个循环，每个循环包括：94℃ 30秒，56℃退火30秒，72℃延伸30秒，最后72℃延伸10分钟。

（2）扩增产物检测

PCR扩增产物在3%琼脂糖凝胶电泳中检测，120V电压下电泳60分钟后，经凝胶成像分析观察呈现引物所要求的扩增条带，说明DNA提取较好，可用于相关研究。图2为微卫星引物检测DNA提取情况。

Claims

1.一种提取酒精长期保存后河蟹基因组的DNA方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）剪取肌肉组织；

（2）提取基因组DNA，步骤如下；

将第（1）步剪取的河蟹肌肉置烘箱烘干酒精；将肌肉组织剪碎，再加裂解缓冲液和蛋白酶K进行消化，其中裂解缓冲液和蛋白酶K的成分和浓度为：含10mmol/L EDTA，0.1mol/LNaCl，0.01M Tris-Cl的STE缓冲液，10% SDS，20mg/mL的蛋白酶K；河蟹肌肉用量与加裂解缓冲液和蛋白酶K的量之间的关系是：河蟹肌肉10-30mg，加300-500μL STE，50-150μL SDS和10-30μL蛋白酶K，于50-60℃的水浴锅中消化，直至组织消化完全溶液变得清亮透明为止；

将步骤a得到的消化液离心，取上清液加饱和NaCl溶液轻混匀；

再加氯仿颠倒轻混匀；

离心，取上清液再次加入氯仿；

离心，取上清液加入异丙醇；

离心沉淀DNA；

洗涤DNA，轻摇混匀；

离心，将沉淀DNA烘干；

在烘干后的DNA加去离子水或TE溶液，并加入RNA酶去除DNA中的RNA，保存备用。

2.根据权利要求1所述的提取河蟹DNA的方法，其特征在于：第（1）步中，在剪取河蟹第二步足上的肌肉的过程中纵向剪取肌肉，烘干酒精后然后用小剪刀将组织剪碎成粉末状。

3.根据权利要求1所述的提取河蟹DNA的方法，其特征在于：第（2）步中，消化时间20至30小时，需将肌肉组织消化完全至溶液清亮透明。

4.根据权利要求1所述的提取河蟹DNA的方法，其特征在于：第（2）步中，河蟹肌肉用量与加裂解缓冲液和蛋白酶K的量之间的关系是：河蟹肌肉20mg，加400μL STE，100μL SDS和20μL蛋白酶K。

5.根据权利要求1所述的提取河蟹DNA的方法，其特征在于：第（2）步中，水浴的温度为56℃。