CN102424820B - 一种提取河蟹绒毛dna的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提取河蟹DNA的方法，其步骤包括：(1)绒毛剪取：剪取中华绒螯蟹螯足(蟹钳)上的绒毛少许，去离子水清洗两遍；(2)绒毛DNA提取：配制裂解缓冲液后，进行绒毛消化，离心，加饱和NaCl溶液和氯仿，离心，加异丙醇，离心沉淀DNA，洗涤，离心后烘干，加去离子水或TE溶液保存DNA。本发明方法可简便、快速、有效的提取河蟹绒毛DNA，提取的DNA质量高，不受蛋白质的污染，提取的绒毛DNA可用于分子生物学分析，从而为河蟹的遗传多样性研究、种质保护和资源利用提供一项技术手段，具有重大科学意义和实用价值。

Description

一种提取河蟹绒毛DNA的方法

技术领域

本发明涉及河蟹绒毛DNA的提取方法，具体地，涉及一种快速、方便、无损伤生物体的提取高质量DNA的方法。 

背景技术

河蟹包括中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)、日本绒螯蟹(Eriocheir japonica)和合浦绒螯蟹(Eriocheir hepuensis)等，它们均隶属于节肢动物门(Arthropoda)、甲壳纲(Crustaceae)、十足目(Decapoda)、方蟹科(Grapsidae)，绒螯蟹属(Eriocheir)。中华绒螯蟹是我国重要的经济甲壳动物和水产养殖对象，在我国自然分布广泛，但主要分布于长江、辽河以及瓯江流域。自20世纪80年代后期，河蟹的人工养殖和苗种培育迅猛发展，出现了中华绒鳌蟹盲目的人工移殖，已造成各水系绒鳌蟹种质资源混杂和性状衰退。鉴于此，为保证中华绒螯蟹宝贵物种资源的可持续利用，必须加强对其遗传资源的研究，分析其遗传多样性。 

然而，进行河蟹的遗传研究以及种质资源的提纯和复壮，需要对大量的河蟹样本进行分子生物学分析，而进行分子生物学分析工作的基础是获得良好的DNA以及RNA等样本。传统的河蟹DNA提取往往利用河蟹的肌肉进行细胞裂解消化，然后提取DNA，这种提取DNA的方法对河蟹具有很严重的损伤，往往会影响一些优质河蟹的后期育种工作，由于缺少了部分的步足，会导致河蟹的抱卵率低、成活率低、甚至死亡的现象，严重制约了河蟹的人工育苗技术，进而影响了河蟹的遗传改良工作。由此可见，开展河蟹无损伤的DNA提取方法十分重要。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：通过设计河蟹绒毛细胞的裂解缓冲液和饱和NaCL法提取河蟹基因组DNA，提供一种简便、快速、高效的提取河蟹绒毛DNA的方法，提取河蟹绒毛DNA质量高，可用于种质研究与遗传分析，既保障河蟹活体的无损伤，又满足了实验DNA样本的需求。 

本发明提供的技术方案是：一种提取河蟹DNA的方法，包括如下步骤： 

(1)剪取河蟹绒毛； 

(2)提取河蟹绒毛DNA，步骤如下： 

a.将第(1)步剪取的河蟹绒毛加裂解缓冲液和蛋白酶K进行消化，其中裂解缓冲液的成分与浓度为：0.05M EDTA，2％SDS，0.01M Tris-Cl，0.3M乙酸钠，10mg/ml DTT； 

b.将步骤a得到的消化液离心，取上清液加饱和NaCl溶液和氯仿，混匀； 

c.离心，取上清液加入异丙醇； 

d.离心沉淀DNA； 

e.洗涤DNA，轻摇混匀； 

f.离心，将沉淀DNA烘干； 

g.在烘干后的DNA加去离子水或TE溶液，并加入RNA酶去除DNA中的RNA，保存备用。 

所述的提取河蟹绒毛DNA的方法，第(1)步中，剪取河蟹螯足上的绒毛少许，剪取过程中尽量取靠近基部毛囊部的绒毛。 

所述的提取河蟹绒毛DNA的方法，步骤a中，优选地，河蟹绒毛的根数与加裂解缓冲液和蛋白酶K的量之间的关系是：河蟹绒毛15-20根，加500μL裂解缓冲液和浓度为20mg/ml的蛋白酶K 20μL，于56℃的的烘箱中过夜消化，至澄清的裂解缓冲液转变为混浊呈橙黄色为止。 

本发明具有如下优点： 

本发明方法是本发明人近几年在对中国各水系河蟹DNA提取的不断摸索过程中，选择河蟹绒毛作为提取DNA的材料，通过设计河蟹绒毛细胞的裂解缓冲液，利用河蟹鳌足上的绒毛通过饱和NaCL法提取河蟹基因组DNA可以满足不伤害河蟹自身，又能获得良好的DNA的要求，不仅在科学技术上，而且在河蟹种质资源保护与利用上均具有十分重要的意义和价值，而且对其它甲壳动物的DNA提取也具有借鉴作用。 

本发明方法可简便、快速、有效的提取河蟹绒毛DNA，提取的DNA质量高，不受蛋白质的污染，提取的绒毛DNA可用于分子生物学分析，从而为河蟹的遗传多样性研究、种质保护和资源利用提供一项技术手段，具有重大科学意义和实用价值。 

附图说明

图1为本发明提取DNA的电泳直接检测结果； 

图2为本发明提取DNA的微卫星引物PCR扩增检测结果。 

具体实施方式

一、绒毛采取 

1.剪取河蟹螯足(蟹钳)上的绒毛少许，剪取过程中尽量取靠近基部毛囊部的绒毛。 

2.剪取的绒毛用去离子水清洗两遍，去除绒毛上的灰土等杂质，洗净后的绒毛用于DNA直接提取，或保存于95％的酒精中备以后提取DNA。 

二、绒毛DNA提取 

1.裂解缓冲液配制：用去离子水配制的裂解缓冲液的成分与浓度为0.05MEDTA，2％SDS，0.01M Tris-Cl，0.3M乙酸钠，10mg/ml DTT。 

2.消化：取绒毛少许(15-20根左右)剪碎覆盖住1.5ml离心管底部，向离心管中加入500μL裂解缓冲液和20μL蛋白酶K(20mg/ml)，于56℃的的烘箱中过夜消化(14-15小时)，至澄清的裂解缓冲液转变为混浊呈橙黄色为止。若绒毛难消化可视情况酌量增加消化时间，但不需要绒毛全部消化。 

3.离心：将上述离心管于离心机中4000rpm，2min离心后，将上清液转入另一干净的离心管中。 

4.加饱和NaCl溶液：向离心管中加350μL饱和NaCl溶液，缓慢摇动10min，充分混合均匀； 

5.加入氯仿：往离心管中加于氯仿400μL，轻轻摇动混匀10min； 

6.离心：将离心管放入离心机内，室温12000rpm，离心20min，将上清液移入另一干净的离心管中。若离心后上下两层页面间杂质较多，可重复(3)、(4)步骤1-2次。 

7.加异丙醇：向离心管中加入450μL预冷(-20℃预冷)的异丙醇； 

8.离心沉淀DNA：4℃13000rpm，离心20min，倒掉上清液，沉淀DNA； 

9.洗涤：向离心管中加入800μL 75％(-20℃预冷)的酒精洗涤DNA，轻摇混匀； 

10.离心：4℃13000rpm，离心15min沉淀DNA； 

11.烘干：倒掉酒精，于37℃烘箱中烘干，使酒精挥发； 

12.DNA溶解保存：于烘干后的DNA加去离子水或TE溶液50μL，并加入RNA 酶0.5μL去除DNA中的RNA。 

三、DNA检测 

(一)紫外分光光度计检测 

取DNA溶液2μL，加入98μL去离子水稀释50倍后，用752型紫外分光光度计检测样品在OD值为260、280时的吸光光度值。DNA的纯度根据OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值确定。高质量的DNA溶液的OD₂₆₀/OD₂₈₀比值1.8-2.1之间。比值为2.0是高质量DNA的标志，说明DNA溶液未受到蛋白质的污染。 

上述主要检测DNA纯度，其扩增效果和使用效率情况还需作进一步检测，如电泳检测、PCR检测。 

(二)电泳检测 

取DNA溶液5μL，于1.5％琼脂糖凝胶电泳中检测，120V电压下电泳40min之后，经凝胶成像分析系统观察在点样点附件存在白色的DNA条带，说明DNA提取较好。如图1所示。 

(三)PCR检测 

以提取的DNA为模板，可用标记引物或基因序列引物进行检测，本方法介绍微卫星标记引物的检测方法，其它方法可参照此方法进行。 

1.PCR扩增 

PCR扩增反应体系：DNA模板(20ng/μL)1μL，PCR反应液(0.2μM dNTPs，1.5μM MgCl₂，0.5μM Taq DNA酶)5μL，引物(0.5μM)1μL，去离子水3μL。 

PCR反应程序为：94℃变性5min，然后35个循环，每个循环包括：94℃30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，最后72℃延伸10min。 

2.扩增产物检测 

PCR扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶电泳中检测，120V电压下电泳40min之后，经凝胶成像分析观察呈现引物所要求的扩增条带，说明DNA提取较好，可用于相关研究。图2为微卫星引物检测DNA提取情况。 

Claims (2)

1.一种提取河蟹DNA的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)剪取河蟹绒毛；

(2)提取河蟹绒毛DNA，步骤如下：

a.将第(1)步剪取的河蟹绒毛加裂解缓冲液和蛋白酶K进行消化，其中裂解缓冲液的成分与浓度为：0.05M EDTA，2％SDS，0.01M Tris-Cl，0.3M乙酸钠，10mg/mlDTT；河蟹绒毛的根数与加裂解缓冲液和蛋白酶K的量之间的关系是：河蟹绒毛15-20根，加500μL裂解缓冲液和浓度为20mg/ml的蛋白酶K 20μL，于56℃的烘箱中过夜消化，直至澄清的裂解缓冲液转变为混浊呈橙黄色为止；

b.将步骤a得到的消化液离心，取上清液加饱和NaCl溶液和氯仿，混匀；

c.离心，取上清液加入异丙醇；

d.离心沉淀DNA；

e.洗涤DNA，轻摇混匀；

f.离心，将沉淀DNA烘干；

g.在烘干后的DNA加去离子水或TE溶液，并加入RNA酶去除DNA中的RNA，保存备用。

2.根据权利要求1所述的提取河蟹DNA的方法，其特征在于：第(1)步中，在剪取河蟹螫足上的绒毛的过程中剪取靠近基部毛囊部的绒毛。 

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