CN102424820B - 一种提取河蟹绒毛dna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提取河蟹DNA的方法,其步骤包括:(1)绒毛剪取:剪取中华绒螯蟹螯足(蟹钳)上的绒毛少许,去离子水清洗两遍;(2)绒毛DNA提取:配制裂解缓冲液后,进行绒毛消化,离心,加饱和NaCl溶液和氯仿,离心,加异丙醇,离心沉淀DNA,洗涤,离心后烘干,加去离子水或TE溶液保存DNA。本发明方法可简便、快速、有效的提取河蟹绒毛DNA,提取的DNA质量高,不受蛋白质的污染,提取的绒毛DNA可用于分子生物学分析,从而为河蟹的遗传多样性研究、种质保护和资源利用提供一项技术手段,具有重大科学意义和实用价值。
Description
技术领域
本发明涉及河蟹绒毛DNA的提取方法,具体地,涉及一种快速、方便、无损伤生物体的提取高质量DNA的方法。
背景技术
河蟹包括中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)、日本绒螯蟹(Eriocheir japonica)和合浦绒螯蟹(Eriocheir hepuensis)等,它们均隶属于节肢动物门(Arthropoda)、甲壳纲(Crustaceae)、十足目(Decapoda)、方蟹科(Grapsidae),绒螯蟹属(Eriocheir)。中华绒螯蟹是我国重要的经济甲壳动物和水产养殖对象,在我国自然分布广泛,但主要分布于长江、辽河以及瓯江流域。自20世纪80年代后期,河蟹的人工养殖和苗种培育迅猛发展,出现了中华绒鳌蟹盲目的人工移殖,已造成各水系绒鳌蟹种质资源混杂和性状衰退。鉴于此,为保证中华绒螯蟹宝贵物种资源的可持续利用,必须加强对其遗传资源的研究,分析其遗传多样性。
然而,进行河蟹的遗传研究以及种质资源的提纯和复壮,需要对大量的河蟹样本进行分子生物学分析,而进行分子生物学分析工作的基础是获得良好的DNA以及RNA等样本。传统的河蟹DNA提取往往利用河蟹的肌肉进行细胞裂解消化,然后提取DNA,这种提取DNA的方法对河蟹具有很严重的损伤,往往会影响一些优质河蟹的后期育种工作,由于缺少了部分的步足,会导致河蟹的抱卵率低、成活率低、甚至死亡的现象,严重制约了河蟹的人工育苗技术,进而影响了河蟹的遗传改良工作。由此可见,开展河蟹无损伤的DNA提取方法十分重要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是:通过设计河蟹绒毛细胞的裂解缓冲液和饱和NaCL法提取河蟹基因组DNA,提供一种简便、快速、高效的提取河蟹绒毛DNA的方法,提取河蟹绒毛DNA质量高,可用于种质研究与遗传分析,既保障河蟹活体的无损伤,又满足了实验DNA样本的需求。
本发明提供的技术方案是:一种提取河蟹DNA的方法,包括如下步骤:
(1)剪取河蟹绒毛;
(2)提取河蟹绒毛DNA,步骤如下:
a.将第(1)步剪取的河蟹绒毛加裂解缓冲液和蛋白酶K进行消化,其中裂解缓冲液的成分与浓度为:0.05M EDTA,2%SDS,0.01M Tris-Cl,0.3M乙酸钠,10mg/ml DTT;
b.将步骤a得到的消化液离心,取上清液加饱和NaCl溶液和氯仿,混匀;
c.离心,取上清液加入异丙醇;
d.离心沉淀DNA;
e.洗涤DNA,轻摇混匀;
f.离心,将沉淀DNA烘干;
g.在烘干后的DNA加去离子水或TE溶液,并加入RNA酶去除DNA中的RNA,保存备用。
所述的提取河蟹绒毛DNA的方法,第(1)步中,剪取河蟹螯足上的绒毛少许,剪取过程中尽量取靠近基部毛囊部的绒毛。
所述的提取河蟹绒毛DNA的方法,步骤a中,优选地,河蟹绒毛的根数与加裂解缓冲液和蛋白酶K的量之间的关系是:河蟹绒毛15-20根,加500μL裂解缓冲液和浓度为20mg/ml的蛋白酶K 20μL,于56℃的的烘箱中过夜消化,至澄清的裂解缓冲液转变为混浊呈橙黄色为止。
本发明具有如下优点:
本发明方法是本发明人近几年在对中国各水系河蟹DNA提取的不断摸索过程中,选择河蟹绒毛作为提取DNA的材料,通过设计河蟹绒毛细胞的裂解缓冲液,利用河蟹鳌足上的绒毛通过饱和NaCL法提取河蟹基因组DNA可以满足不伤害河蟹自身,又能获得良好的DNA的要求,不仅在科学技术上,而且在河蟹种质资源保护与利用上均具有十分重要的意义和价值,而且对其它甲壳动物的DNA提取也具有借鉴作用。
本发明方法可简便、快速、有效的提取河蟹绒毛DNA,提取的DNA质量高,不受蛋白质的污染,提取的绒毛DNA可用于分子生物学分析,从而为河蟹的遗传多样性研究、种质保护和资源利用提供一项技术手段,具有重大科学意义和实用价值。
附图说明
图1为本发明提取DNA的电泳直接检测结果;
图2为本发明提取DNA的微卫星引物PCR扩增检测结果。
具体实施方式
一、绒毛采取
1.剪取河蟹螯足(蟹钳)上的绒毛少许,剪取过程中尽量取靠近基部毛囊部的绒毛。
2.剪取的绒毛用去离子水清洗两遍,去除绒毛上的灰土等杂质,洗净后的绒毛用于DNA直接提取,或保存于95%的酒精中备以后提取DNA。
二、绒毛DNA提取
1.裂解缓冲液配制:用去离子水配制的裂解缓冲液的成分与浓度为0.05MEDTA,2%SDS,0.01M Tris-Cl,0.3M乙酸钠,10mg/ml DTT。
2.消化:取绒毛少许(15-20根左右)剪碎覆盖住1.5ml离心管底部,向离心管中加入500μL裂解缓冲液和20μL蛋白酶K(20mg/ml),于56℃的的烘箱中过夜消化(14-15小时),至澄清的裂解缓冲液转变为混浊呈橙黄色为止。若绒毛难消化可视情况酌量增加消化时间,但不需要绒毛全部消化。
3.离心:将上述离心管于离心机中4000rpm,2min离心后,将上清液转入另一干净的离心管中。
4.加饱和NaCl溶液:向离心管中加350μL饱和NaCl溶液,缓慢摇动10min,充分混合均匀;
5.加入氯仿:往离心管中加于氯仿400μL,轻轻摇动混匀10min;
6.离心:将离心管放入离心机内,室温12000rpm,离心20min,将上清液移入另一干净的离心管中。若离心后上下两层页面间杂质较多,可重复(3)、(4)步骤1-2次。
7.加异丙醇:向离心管中加入450μL预冷(-20℃预冷)的异丙醇;
8.离心沉淀DNA:4℃13000rpm,离心20min,倒掉上清液,沉淀DNA;
9.洗涤:向离心管中加入800μL 75%(-20℃预冷)的酒精洗涤DNA,轻摇混匀;
10.离心:4℃13000rpm,离心15min沉淀DNA;
11.烘干:倒掉酒精,于37℃烘箱中烘干,使酒精挥发;
12.DNA溶解保存:于烘干后的DNA加去离子水或TE溶液50μL,并加入RNA 酶0.5μL去除DNA中的RNA。
三、DNA检测
(一)紫外分光光度计检测
取DNA溶液2μL,加入98μL去离子水稀释50倍后,用752型紫外分光光度计检测样品在OD值为260、280时的吸光光度值。DNA的纯度根据OD260/OD280的比值确定。高质量的DNA溶液的OD260/OD280比值1.8-2.1之间。比值为2.0是高质量DNA的标志,说明DNA溶液未受到蛋白质的污染。
上述主要检测DNA纯度,其扩增效果和使用效率情况还需作进一步检测,如电泳检测、PCR检测。
(二)电泳检测
取DNA溶液5μL,于1.5%琼脂糖凝胶电泳中检测,120V电压下电泳40min之后,经凝胶成像分析系统观察在点样点附件存在白色的DNA条带,说明DNA提取较好。如图1所示。
(三)PCR检测
以提取的DNA为模板,可用标记引物或基因序列引物进行检测,本方法介绍微卫星标记引物的检测方法,其它方法可参照此方法进行。
1.PCR扩增
PCR扩增反应体系:DNA模板(20ng/μL)1μL,PCR反应液(0.2μM dNTPs,1.5μM MgCl2,0.5μM Taq DNA酶)5μL,引物(0.5μM)1μL,去离子水3μL。
PCR反应程序为:94℃变性5min,然后35个循环,每个循环包括:94℃30s,58℃退火30s,72℃延伸30s,最后72℃延伸10min。
2.扩增产物检测
PCR扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳中检测,120V电压下电泳40min之后,经凝胶成像分析观察呈现引物所要求的扩增条带,说明DNA提取较好,可用于相关研究。图2为微卫星引物检测DNA提取情况。
Claims (2)
1.一种提取河蟹DNA的方法,其特征在于包括如下步骤:
(1)剪取河蟹绒毛;
(2)提取河蟹绒毛DNA,步骤如下:
a.将第(1)步剪取的河蟹绒毛加裂解缓冲液和蛋白酶K进行消化,其中裂解缓冲液的成分与浓度为:0.05M EDTA,2%SDS,0.01M Tris-Cl,0.3M乙酸钠,10mg/mlDTT;河蟹绒毛的根数与加裂解缓冲液和蛋白酶K的量之间的关系是:河蟹绒毛15-20根,加500μL裂解缓冲液和浓度为20mg/ml的蛋白酶K 20μL,于56℃的烘箱中过夜消化,直至澄清的裂解缓冲液转变为混浊呈橙黄色为止;
b.将步骤a得到的消化液离心,取上清液加饱和NaCl溶液和氯仿,混匀;
c.离心,取上清液加入异丙醇;
d.离心沉淀DNA;
e.洗涤DNA,轻摇混匀;
f.离心,将沉淀DNA烘干;
g.在烘干后的DNA加去离子水或TE溶液,并加入RNA酶去除DNA中的RNA,保存备用。
2.根据权利要求1所述的提取河蟹DNA的方法,其特征在于:第(1)步中,在剪取河蟹螫足上的绒毛的过程中剪取靠近基部毛囊部的绒毛。
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中华绒螯蟹不同组织中基因组DNA含量比较;张代臻等;《水产科学》;20090228;第28卷(第2期);103-104 * |
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