CN102559909A - 一种悬钩子属植物中期染色体荧光原位杂交方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种悬钩子属原位杂交方法，包括制片、制备探针、杂交前预处理、制备杂交液、制片变性、杂交和检测七个步骤。其中，制片采用根尖压片法，制片前处理时用2％纤维素酶和2％果胶酶在37℃下酶解细胞壁1.5h，探针采用单色标记，杂交前杂交液需在100℃变性5min，杂交时在37℃温育18h。本发明所述的杂交方法能有效消除背景干扰，提高检测灵敏度和准确性。本发明适用以45S rDNA、5S rDNA和悬钩子属植物基因组为探针的悬钩子属植物的染色体原位杂交。

Description

一种悬钩子属植物中期染色体荧光原位杂交方法

技术领域

本发明属于细胞遗传学和分子生物学领域，涉及一种悬钩子属植物中期染色体荧光原位杂交方法。

背景技术

荧光原位杂交(FISH)技术是70年代初开始发展起来的一种重要的非放射性原位杂交技术。它的基本原理是将DNA用特殊修饰的核苷酸分子标记(如biotin-dUTP或digoxigenin-dUTP)，根据核酸分子碱基互补配对原则与染色体上相应的序列杂交。进行原位杂交时，先用高温或碱处理DNA分子，使之发生变性；当温度下降或pH值恢复到中性，变性的DNA会按照碱基互补配对的原则，重新形成氢键恢复到原来的双链结构。如果两条单链的来源不同，只有它们之间的碱基序列是同源互补或部分同源互补时，才能全部或部分复性，产生分子杂交。由于探针带有荧光物质，因此杂交的位点可直接在荧光显微镜下观察到。利用该技术可以检测DNA序列在染色体或DNA纤维上的定位、定性、相对定量分析。

随着技术的发展与不断完善，荧光原位杂交在植物上应用于研究的优越性越来越明显：(1)与用放射性物质来标记探针的分子原位杂交相比，它不需要反射性同位素，安全可靠，不需特殊方法处理，检测时间短，背景清晰，检测灵敏度高，底物可长期贮存而不失活；(2)与其它非放射性原位杂交技术相比，它可用不同荧光素标记的探针与同一目的DNA进行杂交，即进行多重标记，一次定位多个DNA序列；(3)杂交信号可逐级放大，进行定量或非定量分析，并且可听过计算机软件图像分析系统检测并处理杂交微弱的信号，使其可视化更强。

因此，以45S rDNA、5S rDNA或植物全基因组为探针的荧光原位杂交在研究动植物系统发育与进化、识别个别染色体、提高同源染色体配对准确性、进一步阐明染色体结构变异等重要的遗传学问题以及鉴定杂种和检测后代外源染色体或染色体片段存在与否等研究领域具有重要应用。

发明内容

本发明的目的在于克服上述技术缺陷，提供一种悬钩子属植物中期染色体荧光原位杂交方法。本发明的杂交方法是采用中期染色体作为靶DNA，进行原位杂交。其技术方案为：

一种悬钩子属植物中期染色体荧光原位杂交方法，包括以下步骤：

1)制片：取悬钩子根尖，预处理，固定，然后用1mol·L^-1HCl在60±0.5℃下解离40s，压片，液氮冻片，干燥；

2)制备探针：提取选自悬钩子植物基因组DNA或通过PCR，得到目的片段45S rDNA或5S rDNA，用荧光素进行标记，制得探针；

3)杂交前预处理：依次用2％纤维素酶和2％果胶酶混合液、100μg·mL^-1的DNase-freeRNase A、1mg·mL^-1的蛋白酶K和45％醋酸处理，再用4％多聚甲醛固定，然后依次用75％、95％、100％乙醇脱水，晾干；

4)制备杂交液：杂交液总体积为30μL：100％去离子甲酰胺15μL；50％硫酸葡聚糖6μL；20×标准柠檬酸盐3μL；10％十二烷基磺酸钠1μL；荧光素标记的探针3μL；封阻DNA1μL；不足30μL时用灭菌去离子水补足；将杂交液混匀，于100℃变性5min，转入冰上处理至少10min；

5)制片变性：将制片于70％甲酰胺中70℃变性3min，转入经-20℃冰冻的75％、95％、100％乙醇脱水，晾干；

6)杂交：将杂交液滴于制片上，加盖玻片，封片，于37℃细胞恒温培养箱中杂交过夜；

7)检测：用标准柠檬酸钠盐洗脱，然后加与标记用的荧光素匹配的抗体衬染，观察荧光信号，采集并加工杂交图像。

其中上述步骤1)中所述的预处理是用0.002mol·L^-18-羟基喹啉在4℃下处理4h或重蒸馏水在4℃下处理24h，固定是采用卡诺氏固定液I(无水乙醇∶乙酸＝3∶1，v/v)在4℃下固定24h，压片是用45％乙酸处理。

步骤2)中所述荧光素选用地高辛，所述探针的浓度为20～100ng·μL^-1。

步骤3)中所述的2％纤维素酶和2％果胶酶混合液处理是在37℃下温育1.5h，DNase-freeRNaseA处理是在37℃下温育1h，蛋白酶K处理是在37℃下温育30min，45％醋酸处理是在室温下处理5min，多聚甲醛处理是在室温下固定10min，乙醇脱水时间为每级5min。

步骤4)中所述的杂交液变性是在PCR仪或沸水中进行。

步骤5)中所述的70％甲酰胺是用2×标准柠檬酸盐稀释，所述的-20℃冰冻乙醇脱水时间为每级5min。

步骤6)中所述的杂交过夜是密封避光，杂交时间为18h。

步骤6)中杂交通常在37℃下进行，为了提高特异性，可以适当提高杂交温度到40℃。

步骤7)中所述的洗脱是用20％甲酰胺0.1×SSC 42℃处理制片10min，再依次用2×SSC缓冲液和0.2％Tween(用2×SSC稀释)洗5min，标记用的荧光素匹配的抗体浓度为5μg·mL^-1，在37℃下处理1h。

进一步优选，步骤7)中所述的洗脱及荧光信号观察均须在避光条件下操作。

本发明一种悬钩子属植物中期染色体荧光原位杂交方法，采用中期染色体作为靶DNA，进行荧光原位杂交和基因组原位杂交。

本发明所述方法操作过程中，取含有中期染色体的细胞制片：可以用体细胞来制片，制片时要选择细胞分裂旺盛的组织来制片，保证有大量的中期细胞。对于悬钩子属来说，可以采取悬钩子属的根尖制片。首先通过茎扦插繁殖获取不定根，取3-5个节位的嫩梢或硬枝，扦插与塑料大棚以蛭石为基质的插床中，进行常规管理，待不定根至1-2cm时，取健壮插穗的正在生长的根尖。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明采用中期染色体荧光原位杂交，采用本发明所述的杂交方法流程能有效消除背景干扰，检测灵敏度和准确度高。

1、本发明所述方法采用根尖压片法制备染色体，相较于酶解去壁低渗法，该方法简便、快捷。获得的染色体能够满足原位杂交的要求。

2、本发明方法在装片前处理中，采用2％纤维素酶和果胶酶混合液酶解细胞壁，使染色体尽可能裸露，有效去除细胞浆中的RNA和蛋白质，减少探针与核酸和蛋白质的非特异性结合，减少标记探针杂交背景干扰，从而增强杂交信号。

3、采用本发明的方法缩短杂交时间至18小时，实验流程相对简化，整个实验能在2天内完成。

附图说明

图1是探针为45S rDNA与该属植物染色体荧光原位杂交的镜检图片；

图2是探针为5S rDNA与该属植物染色体荧光原位杂交的镜检图片；

图3是探针为该属植物基因组与该属植物染色体荧光原位杂交的镜检图片。

具体实施方式

下面结合附图与具体实施例对本发明作进一步详细地说明。

一种悬钩子属植物中期染色体荧光原位杂交方法，包括以下步骤：

1)制片

(1)中期染色体制片取自含有有丝分裂中期的体细胞的根尖。通过茎扦插繁殖获取不定根，取3-5个节位的嫩梢或硬枝，扦插于塑料大棚以蛭石为基质的插床中，进行常规管理，待不定根长至1-2cm时，取健壮插穗的正在生长的根尖；用0.002mol·L^-18-羟基喹啉4℃下预处理4h；将根尖置于卡诺氏固定液I(无水乙醇∶乙酸＝3∶1，v/v)在4℃下固定24h；将其置于70％的乙醇中，冰箱中4℃长期保存备用。

(2)从70％乙醇中取出固定好的根尖，流水冲洗约3min，吸水纸吸干，放入小试管中，加约5ml的1mol·L^-1的HCl于60±0.5℃水浴解离约40s，然后快速将HCl溶液用胶头吸管吸出，以终止解离，用重蒸馏水轻轻洗涤3次，保存在重蒸馏水中备用。

(3)取根尖置于载玻片上，用刀片切除根冠，再切分生区置于载片上，用镊子或解剖针将材料分割成若干小块，并用解剖针轻轻涂匀；然后加1滴45％醋酸于材料上。用解剖针轻轻涂抹根尖，使小块尽可能分散在染液中。然后盖上盖玻片。将载片平置于酒精灯上来回轻轻晃动，即用酒精灯微微烘烤处理的材料，烘烤1min。将小片滤纸条折叠，用指头压住覆有滤纸条盖玻片的两个角，以免盖片移动。用解剖针头对准材料轻轻敲击盖玻片，使材料分散为一薄层为止。然后在显微镜上观察，看材料是否分散以及是否有分裂相，最后用大拇指紧压该有盖玻片的装片处。

(4)镜检观察，用奥林巴斯BX-51型显微镜观察，选择分散良好且分裂相多的中期染色体制片于-70℃液氮冻片5min，迅速揭片，空气干燥后置于-20℃备用。

2)制备探针

(1)以45S rDNA重复序列或5S rDNA重复序列为探针

A.探针为45S rDNA重复序列，使用的引物为：

5’TCCTCCGCTTATTGATATGC3’(上游引物)，

5’GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG3’(下游引物)，

PCR产物长度为700bp。

B.探针为5S rDNA重复序列，使用的引物为：

5’CGGTGCATTAATGCTGGTAT3’(上游引物)

5’CCCATCCGTGTACTACTCTC3’(下游引物)

PCR产物长度为700bp。采用PCR法标记。

C.PCR法标记探针：地高辛标记物为digoxigenin-11dUTP，采用PCR DIG ProbeSynthesis Kit(Roche)试剂盒标记，标记扩增最适体系为：10ng树莓DNA模板，0.2μM eachPrimer，0.1mM dNTP，0.1mM DIG-dNTP，0.75U Enzyme Mix，5μL PCR Buffer with Mg²⁺，加ddH₂O至总体积50μL。PCR程序为：95℃预变性2min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，30次循环，最后72℃延伸7min，4℃保存。经电泳检测得到的探针长度约400bp，浓度约为50ng·μL^-1。

(2)以悬钩子属植物全基因组为探针

提取基因组DNA：

A.取悬钩子植物材料幼嫩叶片0.5-1.0g，加少许PVP(聚乙烯吡咯烷酮)与Vc的研钵中加液氮迅速研磨成粉末转入1.5mL离心管中，加入600μL冰冻的提取介质一(1mol·L^-1Tris-HCl 20mL，0.5mol·L^-1 EDTA 10mL，5mol·L^-1 NaCl 1mL，定容至100mL)，在0℃下放置10min；

B.在4℃下12,000r·min^-1离心10min，收集沉淀；

C.加入65℃预热的提取介质二(1mol·L^-1 Tris-HCl 10mL，0.5mol·L^-1 EDTA 4mL，5mol·L^-1 NaCl 28mL，CTAB 2g定容至100mL，用前加入2％β-巯基乙醇)，65℃水浴1h，其间不时轻轻摇动；

D.加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1，v/v)，萃取10min，4℃下12,000r·min^-1离心10min。

E.将上清转入到另一洁净的离心管中，重复步骤D；

F.将上清液转入到另一洁净的离心管中，加入等体积经-20℃预冷的异丙醇混匀，若无絮状沉淀析出，可放入-20℃冰箱30min后取出，4℃下5,000r·min^-1离心10min，收集沉淀；

G.弃上清，加入75％乙醇清洗2-3次，再用无水乙醇清洗一次，置于通风处晾干；

H.待DNA完全干燥后加入适量ddH₂O于4℃溶解；

I.部分样品在核酸蛋白分析仪上测定DNA的浓度和纯度，1％琼脂糖电泳检测DNA的完整性，其余置于-20℃保存备用。

缺口平移法标记探针：将1μg的模板DNA用灭菌双蒸水稀释到16μL；加入4μL的地高辛Dig-Nick Translation Mix，混匀后短暂瞬时离心；于15℃温浴90min；取3μL标记产物在95℃变性3min，立即冰浴3min，在1.5％的琼脂糖凝胶，100V电压下，电泳60min，检测探针片段的长度：I若长度在200-500bp，则加1μL的反应终止液(0.5mol·L^-1EDTA，pH 8.0)，然后在65℃温浴10min终止反应；II若长度＞500bp，则继续孵育，直至片段长度集中在200-500bp。

3)杂交前预处理：将制片从-20℃中取出晾干，滴加2％纤维素酶(Cellulase R-10)和2％果胶酶(Pectinase Y-23)混合液数滴，盖上盖片，37℃处理1.5h，再用2×SSC(0.3mol·L^-1NaCl与0.03mol·L^-1柠檬酸三钠)缓冲液漂去盖片，用2×SSC缓冲液洗制片2×5min(洗涤2次，每次5min)，滴加100μg·mL^-1DNase-free RNaseA(Sangon，上海)数滴，盖上盖片，37℃处理1h(DNase-free RNase A用2×SSC缓冲液配制，用前沸水中煮5min，以灭活DNase活性)，2×SSC缓冲液漂去盖片，2×SSC缓冲液洗制片2×5min；滴加1mg·mL^-1蛋白酶K(Proteinase K，Sangon，上海)数滴，盖上盖片，37℃温育30min，2×SSC缓冲液漂去盖片，2×SSC缓冲液洗制片2×5min；45％醋酸室温处理5min，用2×SSC缓冲液洗制片2×5min；转入4％多聚甲醛中常温下固定10min；迅速转入75％、95％、100％乙醇梯度逐级脱水5min，晾干载片。

4)制备杂交液：杂交液总体积为30μL。

杂交混合液须在使用前新配制，其组成如下：50％去离子甲酰胺(用于防止高温对染色体形态和结构的损害及脱落)；10％硫酸葡聚糖(与水结合减少杂交液容积，提高探针的有效浓度)；2×SSC(0.3mol·L^-1NaCl与0.03mol·L^-1柠檬酸三钠的盐溶液，用于浸润染色体DNA)；0.3％的10％SDS；50～100ng探针；10～100倍封阻DNA(鲑鱼精DNA)。

具体来说，杂交液的组成如下：去离子甲酰胺15μL；50％硫酸葡聚糖6μL；20×SSC 3μL；10％SDS 1μL；地高辛标记的45S rDNA探针3μL；鲑鱼精DNA 1μL；灭菌的去离子水1μL。将杂交液在涡流混合器上混匀，此步骤很重要，，接着置于PCR仪上在100℃变性5min，迅速转入冰上处理至少10min。

5)制片变性：制片于70％甲酰胺2×SSC中70℃变性3min，迅速转入经-20℃冰冻的75％、95％、100％乙醇中梯度逐级脱水5min，晾干载片。为了避免变性后的DNA单链在长时间室温下复性，晾干时间不宜过长，应少于20min。

6)杂交：加上述变性的杂交混合液30μL于载片上，盖上盖玻片，密封避光。转入37℃细胞恒温培养箱，杂交过夜，为了保证杂交的充分和检测到的信号的强度，杂交时间为18h。

7)检测：杂交载片先用2×SSC漂洗去盖片，再用20％甲酰胺0.1×SSC 42℃处理制片10min，依次用2×SSC缓冲液和0.2％Tween，用2×SSC稀释，洗5min；然后加5μg·mL^-1Avidin-FITC(Roche)，50μL/片，37℃处理1h，用2×SSC缓冲液洗2×5min，晾干载片。制片用1μg·mL^-1DAPI复染，封片。最后用安装有CCD摄像头的Olympus BX-51plus荧光显微镜观察荧光信号，用DP controller成像系统软件进行原位杂交图像的摄取和采集，Imagepro-Plus和Photoshop7.0软件处理图片。具体请见图1-图2，其中图1是探针为45S rDNA与该属植物染色体荧光原位杂交的镜检图片，信号在彩色照片中显示为绿色；图2是探针为5S rDNA与该属植物染色体荧光原位杂交的镜检图片，信号在彩色照片中显示为绿色；图3是探针为该属植物基因组与该属植物染色体荧光原位杂交的镜检图片，信号在彩色照片中显示为绿色。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

Claims (7)

1.一种悬钩子属植物中期染色体荧光原位杂交方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)制片：取悬钩子根尖，预处理，固定，然后用1mol·L^-1 HCl在60±0.5℃下解离40s，压片，液氮冻片，干燥；

2)制备探针：提取选自悬钩子植物基因组DNA或通过PCR，得到目的片段45S rDNA或5S rDNA，用荧光素进行标记，制得探针；

3)杂交前预处理：依次用2％纤维素酶和2％果胶酶混合液、100μg·mL^-1的DNase-freeRNaseA、1mg·mL^-1的蛋白酶K和45％醋酸处理，再用4％多聚甲醛固定，然后依次用75％、95％、100％乙醇脱水，晾干；

4)制备杂交液：杂交液总体积为30μL：100％去离子甲酰胺15μL；50％硫酸葡聚糖6μL；20×标准柠檬酸盐3μL；10％十二烷基磺酸钠1μL；荧光素标记的探针3μL；封阻DNA1μL；不足30μL时用灭菌的去离子水补足；将杂交液混匀，于100℃变性5min，转入冰上处理至少10min；

5)制片变性：将制片于70％甲酰胺中70℃变性3min，转入经-20℃冰冻的75％、95％、100％乙醇脱水，晾干；

6)杂交：将杂交液滴于制片上，加盖玻片，封片，于37℃细胞恒温培养箱中杂交过夜；

7)检测：用标准柠檬酸钠盐洗脱，然后加与标记用的荧光素匹配的抗体衬染，观察荧光信号，采集并加工杂交图像。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述的预处理是用0.002mol·L^-18-羟基喹啉在4℃下处理4h或重蒸馏水在4℃下处理24h，固定是采用卡诺氏固定液I：无水乙醇∶乙酸＝3∶1，v/v，在4℃下固定24h，压片是用45％乙酸处理。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述的2％纤维素酶和2％果胶酶混合液处理是在37℃下温育1.5h，DNase-free RNase A处理是在37℃下温育1h，蛋白酶K处理是在37℃下温育30min，45％醋酸室温处理5min，多聚甲醛处理是在室温下固定10min，乙醇脱水时间为每级5min。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中所述的杂交液各个成分的比例：100％去离子甲酰胺15μL；50％硫酸葡聚糖6μL；20×标准柠檬酸盐3μL；10％十二烷基磺酸钠1μL；荧光素标记的探针3μL；封阻DNA 1μL。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)中所述的70％甲酰胺是用2×标准柠檬酸盐稀释，所述的-20℃冰冻乙醇脱水时间为每级5min。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤6)中所述的杂交过夜是密封避光，杂交时间为18h。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤7)中所述的洗脱是用20％甲酰胺0.1×SSC 42℃处理制片10min，再依次用2×SSC缓冲液和0.2％Tween，用2×SSC稀释，洗5min，标记用的荧光素匹配的抗体浓度为5μg·mL^-1，在37℃下处理1h。

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