CN105543233A - 一种肌肉生长抑制mstn基因及其在云南土鸡选育中的应用 - Google Patents

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CN105543233A CN201511018837.XA CN201511018837A CN105543233A CN 105543233 A CN105543233 A CN 105543233A CN 201511018837 A CN201511018837 A CN 201511018837A CN 105543233 A CN105543233 A CN 105543233A
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Abstract

本发明涉及动物分子育种的基因工程技术，特别是一种与鸡肉生成相关的肌肉生长抑制素（Myostatin,MSTN）基因及其在云南土鸡选育中的应用。本发明提供一种肌肉生长抑制MSTN基因及其在云南土鸡选育中的应用，采用基因芯片技术和生物信息学分析方法，在对武定鸡和微型鸡肌肉组织的基因表达谱研究中发现MSTN基因参与抑制肌肉生成过程，通过对云南本土的微型鸡、武定鸡的MSTN基因进行测序，首次从鸡的肌肉组织中克隆了MSTN基因，使用分子生物学手段研究MSTN基因的表达量与生长性能、屠宰性能的调控规律，探讨微型鸡、武定鸡生长发育的规律，对于云南本土鸡种的保种、开发利用，尤其是来加快其生产性能提供理论参考。

Description

一种肌肉生长抑制MSTN基因及其在云南土鸡选育中的应用
技术领域
本发明涉及动物分子育种的基因工程技术，特别是一种与鸡肉生成相关的肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)基因及其在云南土鸡选育中的应用。
背景技术
近年来，消费者倾向于购买腹脂含量低、肌肉脂肪含量较低，但不饱和脂肪酸含量较高并且口感细嫩、鲜美多汁的鸡肉，为了满足人们的消费需求，商家过于追求高瘦肉率的肉品，导致鸡肉品质的严重下降。为了获取胴体率很高的家禽，发现了肌肉组织中存在的肌肉生长抑制素(myostatin，MSTN)。研究发现MSTN基因作用机理大致如下：当成肌细胞同MSTN基因共同产生时，成肌细胞的增殖随MSTN基因水平的升高而降低。MSTN基因抑制C2C12成肌细胞从细胞周期的Gl到S阶段的过渡。MSTN基因特异性地正向调控P2l(一依赖于细胞周期蛋白的激酶抑制因子)，同时降低成肌细胞中cdk2蛋白的浓度和活性，此时Rb主要以低磷酸化的形式存在，磷酸化的Rb与转译因子如E2F-DPI的结合，从而使细胞分化在G1期停止。这些结果表明，P21表达量升高，cdk2蛋白降低，导致低磷酸化Rb蛋白的集中。这样，将细胞周期阻止在Gl期，另外，过量表达的MSTN基因还减少G0-G1转化的次数，所以抑制MSTN基因的活性能加快细胞循环，促进成肌细胞的分裂。因此可以推测，动物的肌肉增生现象，是缺乏活性MSTN基因，逆向调控成肌细胞增殖的结果。体外研究结果表明，重组MSTN基因抑制C2C12成肌细胞及160日龄牛胚胎成肌细胞的分，且MSTN基因抑制效应是可逆的，当除去MSTN基因时，成肌细胞恢复正常分裂和正常生长的能力。MSTN基因的发现对阐明骨骼肌生长发育的调控机理具有重要的意义，同时将为畜牧业改良动物的肉品质开辟一条新途径。
MSTN基因在猪、人、绵羊和牛中已被定位和标记。在畜禽育种过程中，对畜禽生长速度过度选择导致骨骼肌过快发育，脂肪含量过高，降低了饲料转化率。因此，MSTN基因的研究对控制畜禽肌肉增长，改善肌肉品质具有重要的意义。目前MSTN基因的表达对鸡的肌肉生成的影响及调节机理，国内外尚未报道。
发明内容
鉴于以上研究背景，本发明提供一种肌肉生长抑制MSTN基因及其在云南土鸡选育中的应用，采用基因芯片技术和生物信息学分析方法，在对武定鸡和微型鸡肌肉组织的基因表达谱研究中发现MSTN基因参与抑制肌肉生成过程，通过对云南本土的微型鸡、武定鸡的MSTN基因进行测序，首次从鸡的肌肉组织中克隆了MSTN基因，使用分子生物学手段研究MSTN基因的表达量与生长性能、屠宰性能的调控规律，探讨微型鸡、武定鸡生长发育的的规律，对于云南本土鸡种的保种、开发利用，尤其是来加快其生产性能提供理论参考。
本发明的目的是提供一种肌肉生长抑制MSTN基因，是从武定鸡鸡肌肉组织中分离、克隆的与肌肉生成相关的肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)基因，武定鸡的MSTN基因由3个外显子和2个内含子组成，外显子1、2、3分别为373bp、374bp和1567bp，2个内含子分别为2094bp和2269bp，其序列如SEQ.ID.NO.1，通过对云南本土的武定鸡的MSTN基因进行测序，首次从鸡的肌肉组织中克隆了MSTN基因。
本发明的另一个目的是肌肉生长抑制MSTN基因在云南地方鸡作为肌肉生长抑制特性的分子遗传标记的应用，对肌肉生长抑制素MSTN基因设计引物，进行PCR扩增，通过检测MSTN基因在鸡肌肉组织的组织表达谱，来对云南地方鸡种的肌肉生长抑制特性进行判断，其具体步骤为：
步骤一、肌肉组织中总RNA的提取
前处理：提取RNA之前，先消除器皿及溶液中可能存在的RNA酶。所用的塑料器皿的消毒：一次性塑料器皿，在灭菌锅内高压处理15～20min。非一次性塑料器皿，先用清洁剂洗干净，再用0.1MNaOH、1mMEDTA第一次冲冼，无RNA酶水第二次冲冼；镊子、剪刀及以后要用的玻璃器皿的消毒：将镊子、剪刀及玻璃器皿置于中180℃烘烤5h以上；电泳槽的消毒：先用清洁液洗干净，在0.1％的DEPC水中浸泡过夜后干燥。
提取：取60-100mg冷冻保存的脂肪或肌肉组织于研磨器内，加入1ml的Trizol试剂中低温条件下进行匀浆。匀浆后的混合液转移到1.5ml的离心管中，在2～8℃温度条件下12000rpm离心10min，使核蛋白质复合体充分分离。然后将上清液移入一个干净的离心管中。加入0.2ml的氯仿后，压紧管盖剧烈振荡15sec，常温静置3～5min后，2～8℃11000rpm再离心15min。可见液体分三层。将上层清液移入1.5ml的离心管，加入0.5ml的异丙醇混匀后，常温静置孵育10min，在2～8℃11000×g离心10min，沉淀RNA。倒掉上清液，最后用75％的酒精7500rpm离心5min以洗涤RNA沉淀，并重复该步骤一次。倒掉上清液后，将离心管于室温凉干15～30min，干燥RNA沉淀，加入30-50μl无RNase的DEPC处理水，使RNA溶解完全，并立即保存于-80℃超低温冰箱中待用。
步骤二、cDNA第一链的合成(RT-PCR)
采用北京天根生物工程技术服务有限公司提供的试剂盒进行反转录合成cDNA。其步骤为：在已灭菌无核酸酶的的PCR管中加入1.5μg的总RNA，加入浓度为0.5μg/μlOligo(dT)182μl随机引物和2μldNTP，补无菌水(RNase-freeddH2O)至14μl。轻轻混匀离心3～5sec后，将反应混合物于70℃加热5min后迅速在冰上冷却2min后，简短离心5-8sec收集反应液加入4μl5×First-StrandBuffer、1μl0.1MDTT。最后加入1μl(200U)TIANScriptM-MLV，使混合液的终体积为20μl，混匀；将总反应体系置于PCR仪中，42℃孵育50min，90℃加热5min终止反应，结束后或置冰上进行后续实验或冷冻保存。
步骤三、PCR引物设计及PCR反应条件
参照GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)公开发表的MSTN基因全长序列和禽18s核苷酸序列运用Primer5.0软件进行引物设计，并由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。MSTN基因和18S的产物长度分别为176bp和148bp，引物序列如下：
MSTN基因引物序列：
上游：5’GCTTTTGATGAGACTGGACGAG-3’
下游：5’AGCGGGTAGCGACAACATC-3’
18S基因的引物序列：
上游：5’-CGCGTGCATTTATCAGACCA-3’
下游：5’-ACCCGTGGTCACCATGGTA-3’
MSTN基因克隆的PCR反应条件为：在PCR管内依次加入cDNA模板1.0μl，10×反应缓冲液(buffer)2.0μl，Mg2+0.5μldNTPs(10mM)0.5μl，正、反引物混合(10mΜ)1.0μl，Taq酶0.5μl，补去离子水至25μl的反应总体积，置于PCR仪上，95℃预变性10min，94℃变性45sec，Tm(54℃-64℃,Grad＝10)退火45sec，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃再延伸8min，反应结束后，用琼脂凝胶电泳来分析扩增结果，用DNAmarker来判断扩增片段的大小，用以确定MSTN基因的退火温度即最佳反应条件。
经最佳反应条件扩增的PCR产物，用1％琼脂糖凝胶进行电泳，如产物在凝胶成像系统中目的带明亮清晰，则可用于胶回收及后续实验。
荧光定量PCR的反应条件为：在80℃检测荧光，测定吸光值，得到以循环数为横坐标、吸光值为纵坐标的荧光定量PCR扩增动力学曲线和以标准品拷贝数的对数值为横坐标，Ct值为纵坐标的标准曲线。扩增完毕后，进行熔解曲线的分析，95℃1min，55℃1min，以0.5℃/sec的速度逐渐升温到95℃进行熔解曲线的测定，并在此升温过程中进行荧光强度的连续检测。对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析特异性。18S除退火温度为58℃外,其余条件均相同。
步骤四、云南地方鸡的肌肉生长抑制特性进行判断
通过检测MSTN基因在鸡肌肉组织的组织表达谱，来对云南地方鸡种的肌肉生长抑制特性进行判断。
本发明的有益效果：
1、本发明采用基因芯片技术和生物信息学分析方法，在对武定鸡和微型鸡肌肉组织的基因表达谱研究中发现MSTN基因参与抑制肌肉生成过程，并首次从鸡的肌肉组织中克隆了MSTN基因。因此，研究鸡MSTN基因的序列与表达模式，从分子水平了解抑制肌肉生成的特点，为进一步研究该基因的功能及为改善武定鸡肌肉品质和育种工作提供理论基础。
2、本发明还提供了一种利用MSTN基因在鸡肌肉组织的组织表达谱判断云南地方鸡的肉用性状的方法，作为肌肉生长抑制MSTN基因在云南地方鸡作为肌肉生长抑制特性的分子遗传标记的应用，对肌肉生长抑制素MSTN基因设计引物，进行PCR扩增，通过检测MSTN基因在鸡肌肉组织的组织表达谱，来对云南地方鸡种的肌肉生长抑制特性进行判断，探讨微型鸡、武定鸡生长发育的的规律，对于云南本土鸡种的保种、开发利用，尤其是来加快其生产性能提供理论参考。
附图说明
图1是本发明的PCR扩增MSTN基因图示；
图2是本发明的18SPCR扩增MSTN基因图示；
图3是本发明的MSTN基因在胸肌的表达；
图4是本发明的MSTN基因在腿肌的表达。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例和附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种肌肉生长抑制MSTN基因，是从武定鸡肌肉组织中分离、克隆的与肌肉生成相关的肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)基因，武定鸡的MSTN基因由3个外显子和2个内含子组成，外显子1、2、3分别为373bp、374bp和1567bp，2个内含子分别为2094bp和2269bp。
对上述特征的肌肉生长抑制素MSTN基因设计引物，进行PCR扩增，检测MSTN基因在鸡肌肉组织的组织表达谱，结果显示MSTN基因在肌肉组织中高量表达，初步表明MSTN基因在肌细胞中调控肌肉生成的功能。
1、肌肉组织中总RNA的提取
前处理：提取RNA之前，先消除器皿及溶液中可能存在的RNA酶。所用的塑料器皿的消毒：一次性塑料器皿，在灭菌锅内高压处理15～20min。非一次性塑料器皿，先用清洁剂洗干净，再用0.1MNaOH、1mMEDTA第一次冲冼，无RNA酶水第二次冲冼；镊子、剪刀及以后要用的玻璃器皿的消毒：将镊子、剪刀及玻璃器皿置于中180℃烘烤5h以上；电泳槽的消毒：先用清洁液洗干净，在0.1％的DEPC水中浸泡过夜后干燥。
提取：取60-100mg冷冻保存的脂肪或肌肉组织于研磨器内，加入1ml的Trizol试剂中低温条件下进行匀浆。匀浆后的混合液转移到1.5ml的离心管中，在2～8℃温度条件下12000rpm离心10min，使核蛋白质复合体充分分离。然后将上清液移入一个干净的离心管中。加入0.2ml的氯仿后，压紧管盖剧烈振荡15sec，常温静置3～5min后，2～8℃11000rpm再离心15min。可见液体分三层。将上层清液移入1.5ml的离心管，加入0.5ml的异丙醇混匀后，常温静置孵育10min，在2～8℃11000rpm离心10min，沉淀RNA。倒掉上清液，最后用75％的酒精7500rpm离心5min以洗涤RNA沉淀，并重复该步骤一次。倒掉上清液后，将离心管于室温凉干15～30min，干燥RNA沉淀，加入30-50μl无RNase的DEPC处理水，使RNA溶解完全，并立即保存于-80℃超低温冰箱中待用。
2、cDNA第一链的合成(RT-PCR)
采用北京天根生物工程技术服务有限公司提供的试剂盒进行反转录合成cDNA。其步骤为：在已灭菌无核酸酶的的PCR管中加入1.5μg的总RNA，加入浓度为0.5μg/μlOligo(dT)182μl随机引物和2μldNTP，补无菌水(RNase-freeddH2O)至14μl。轻轻混匀离心3～5sec后，将反应混合物于70℃加热5min后迅速在冰上冷却2min后，简短离心5-8sec收集反应液加入4μl5×First-StrandBuffer、1μl0.1MDTT。最后加入1μl(200U)TIANScriptM-MLV，使混合液的终体积为20μl，混匀；将总反应体系置于PCR仪中，42℃孵育50min，90℃加热5min终止反应，结束后或置冰上进行后续实验或冷冻保存。
3、PCR引物设计及PCR反应条件
参照GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)公开发表的MSTN基因全长序列和禽18s核苷酸序列运用Primer5.0软件进行引物设计，并由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。MSTN基因和18S的产物长度分别为176bp和148bp，引物序列如下：
MSTN基因引物序列：
上游：5’GCTTTTGATGAGACTGGACGAG-3’
下游：5’AGCGGGTAGCGACAACATC-3’
18S基因的引物序列：
上游：5’-CGCGTGCATTTATCAGACCA-3’
下游：5’-ACCCGTGGTCACCATGGTA-3’
MSTN基因克隆的PCR反应条件为：在PCR管内依次加入cDNA模板1.0μl，10×反应缓冲液(buffer)2.0μl，Mg2+0.5μldNTPs(10mM)0.5μl，正、反引物混合(10mΜ)1.0μl，Taq酶0.5μl，补去离子水至25μl的反应总体积，置于PCR仪上，95℃预变性10min，94℃变性45sec，Tm(54℃-64℃,Grad＝10)退火45sec，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃再延伸8min，反应结束后，用琼脂凝胶电泳来分析扩增结果，用DNAmarker来判断扩增片段的大小，用以确定MSTN基因的退火温度即最佳反应条件。
经最佳反应条件扩增的PCR产物，用1％琼脂糖凝胶进行电泳，如产物在凝胶成像系统中目的带明亮清晰，则可用于胶回收及后续实验。
荧光定量PCR的反应条件为：在80℃检测荧光，测定吸光值，得到以循环数为横坐标、吸光值为纵坐标的荧光定量PCR扩增动力学曲线和以标准品拷贝数的对数值为横坐标，Ct值为纵坐标的标准曲线。扩增完毕后，进行熔解曲线的分析，95℃1min，55℃1min，以0.5℃/sec的速度逐渐升温到95℃进行熔解曲线的测定，并在此升温过程中进行荧光强度的连续检测。对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析特异性。18S除退火温度为58℃外,其余条件均相同。
步骤四、云南地方鸡的肌肉生长抑制特性进行判断
通过检测MSTN基因在鸡肌肉组织的组织表达谱，来对云南地方鸡种的肌肉生长抑制特性进行判断。
实施例2
在实施例1的基础上，肌肉生长抑制MSTN基因在云南地方鸡作为武定鸡肌肉生长抑制特性的分子遗传标记的应用，提取待测样本的鸡基因组DNA，经特异性引物扩增得到MSTN基因目的片段，对肌肉生长抑制素MSTN基因设计引物，进行PCR扩增，通过检测MSTN基因在鸡肌肉组织的组织表达谱，根据图谱中条带的数量和大小对待测样本体重增长的快慢进行判断。
实施例3
作为MSTN基因设计的应用，由于MSTN基因是控制肌肉器官的大小的调控因子，为了满足人类的需求，获取更高的胴体率，根据双肌形成机理，利用基因敲除技术控制MSTN基因的表达；利用基因重组技术获得MSTN基因缺失的鸡；使用能与MSTN结合的物质，拮抗该基因的功能；筛选或选择MSTN的抗体或抑制剂，与其结合，灭其功能。都可以达到获取更高生产性能的鸡。
本发明提供一种肌肉生长抑制MSTN基因及其在云南土鸡选育中的应用，采用基因芯片技术和生物信息学分析方法，在对武定鸡和微型鸡肌肉组织的基因表达谱研究中发现MSTN基因参与抑制肌肉生成过程，通过对云南本土的微型鸡、武定鸡的MSTN基因进行测序，首次从鸡的肌肉组织中克隆了MSTN基因，使用分子生物学手段研究MSTN基因的表达量与生长性能、屠宰性能的调控规律，探讨微型鸡、武定鸡生长发育的的规律，对于云南本土鸡种的保种、开发利用，尤其是来加快其生产性能提供理论参考。
最终，以上实施例和附图仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (5)

1.一种肌肉生长抑制MSTN基因，其特征在于：是从武定鸡肌肉组织中分离、克隆的与肌肉生成相关的肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)基因，武定鸡的MSTN基因由3个外显子和2个内含子组成，外显子1、2、3分别为373bp、374bp和1567bp，2个内含子分别为2094bp和2269bp。
2.肌肉生长抑制MSTN基因在云南地方鸡作为武定鸡肌肉生长抑制特性的分子遗传标记的应用。
3.一种利用MSTN基因在鸡肌肉组织的组织表达谱判断云南地方鸡的肉用性状的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
步骤一、肌肉组织中总RNA的提取
1)前处理：提取RNA之前，先消除器皿及溶液中可能存在的RNA酶，对所用的塑料器皿的消毒：一次性塑料器皿，在灭菌锅内高压处理15～20min；非一次性塑料器皿，先用清洁剂洗干净，再用0.1MNaOH、1mMEDTA第一次冲冼，无RNA酶水第二次冲冼；镊子、剪刀及以后要用的玻璃器皿的消毒：将镊子、剪刀及玻璃器皿置于中180℃烘烤5h以上；电泳槽的消毒：先用清洁液洗干净，在0.1％的DEPC水中浸泡过夜后干燥；
2)提取：
a.取60-100mg冷冻保存的脂肪或肌肉组织于研磨器内，加入1ml的Trizol试剂中低温条件下进行匀浆，匀浆后的混合液转移到1.5ml的离心管中，在2～8℃温度条件下12000rpm离心10min，使核蛋白质复合体充分分离；
b.将上清液移入一个干净的离心管中，加入0.2ml的氯仿后，压紧管盖剧烈振荡15sec，常温静置3～5min后，2～8℃11000rpm再离心15min，可见液体分三层；将上层清液移入1.5ml的离心管，加入0.5ml的异丙醇混匀后，常温静置孵育10min，在2～8℃11000rpm离心10min，沉淀RNA，倒掉上清液，最后用75％的酒精7500rpm离心5min以洗涤RNA沉淀，并重复该步骤一次；
c.倒掉上清液后，将离心管于室温凉干15～30min，干燥RNA沉淀，加入30-50μl无RNase的DEPC处理水，使RNA溶解完全，并立即保存于-80℃超低温冰箱中待用；
步骤二、cDNA第一链的合成
a.采用北京天根生物工程技术服务有限公司提供的试剂盒进行反转录合成cDNA，其步骤为：在已灭菌无核酸酶的的PCR管中加入1.5μg的总RNA，加入浓度为0.5μg/μlOligo、182μl随机引物和2μldNTP，补无菌水至14μl；
b.轻轻混匀离心3～5sec后，将反应混合物于70℃加热5min后迅速在冰上冷却2min后，简短离心5-8sec收集反应液加入4μl5×First-StrandBuffer、1μl0.1MDTT；最后加入1μlTIANScriptM-MLV，使混合液的终体积为20μl，混匀；
c.将总反应体系置于PCR仪中，42℃孵育50min，90℃加热5min终止反应，结束后或置冰上或冷冻保存；
步骤三、PCR引物设计及PCR反应条件
进行引物设计，其MSTN基因和18S的产物长度分别为176bp和148bp，引物序列如下：
MSTN基因引物序列：
上游：5’GCTTTTGATGAGACTGGACGAG-3’
下游：5’AGCGGGTAGCGACAACATC-3’
18S基因的引物序列：
上游：5’-CGCGTGCATTTATCAGACCA-3’
下游：5’-ACCCGTGGTCACCATGGTA-3’
MSTN基因克隆的PCR反应条件为：在PCR管内依次加入cDNA模板1.0μl，10×反应缓冲液2.0μl，Mg2+0.5μl，dNTPs0.5μl，正、反引物混合1.0μl，Taq酶0.5μl，补去离子水至25μl的反应总体积，置于PCR仪上，95℃预变性10min，94℃变性45sec，Tm(54℃-64℃,Grad＝10)退火45sec，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃再延伸8min；
荧光定量PCR的反应条件为：在80℃检测荧光，测定吸光值，得到以循环数为横坐标、吸光值为纵坐标的荧光定量PCR扩增动力学曲线和以标准品拷贝数的对数值为横坐标，Ct值为纵坐标的标准曲线，扩增完毕后，进行熔解曲线的分析，95℃1min，55℃1min，以0.5℃/sec的速度逐渐升温到95℃进行熔解曲线的测定，并在此升温过程中进行荧光强度的连续检测，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析特异性；18S除退火温度为58℃外,其余条件均相同；
步骤四、云南地方鸡的肌肉生长抑制特性进行判断
通过检测MSTN基因在鸡肌肉组织的组织表达谱，根据表达图谱来对云南地方鸡种的肌肉生长抑制特性进行判断。
4.根据权利要求3所述的一种利用MSTN基因在鸡肌肉组织的组织表达谱判断云南地方鸡的肉用性状的方法，其特征在于：在步骤三PCR引物设计及PCR反应条件时，MSTN基因克隆的PCR反应结束后，用琼脂凝胶电泳来分析扩增结果，用DNAmarker来判断扩增片段的大小，确定MSTN基因的退火温度即最佳反应条件，并将经最佳反应条件扩增的PCR产物，用1％琼脂糖凝胶进行电泳，胶回收在凝胶成像系统中明亮清晰的目的带。
5.根据权利要求1所述的肌肉生长抑制MSTN基因的应用，其特征在于：利用基因敲除技术控制MSTN基因的表达或利用基因重组技术获得MSTN基因缺失的鸡，获取更高生产性能的鸡的方法。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106367519A (zh) * 2016-09-30 2017-02-01 扬州大学 利用mstn基因提高京海黄鸡屠宰性能的方法
CN107385072A (zh) * 2017-08-25 2017-11-24 扬州大学 一种检测鸡fam134b基因表达量的引物、方法及试剂盒
CN110551831A (zh) * 2019-09-30 2019-12-10 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 猪脂肪酸组成相关的分子标记和基因及应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102321750A (zh) * 2011-08-15 2012-01-18 扬州大学 一种用分子标记快速筛选边鸡体重增长程度的方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102321750A (zh) * 2011-08-15 2012-01-18 扬州大学 一种用分子标记快速筛选边鸡体重增长程度的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANNE COLLIN 等: ""Thyroid status, but not insulin status, affects expression of avian uncoupling protein mRNA in chicken"", 《AM J PHYSIOL ENDOCRINOL METAB》 *
GU Z.等: ""AF346599.2"", 《GENBANK》 *
Z G SONG 等: ""Dexamethasone alters the expression of genes related to the growth of skeletal muscle in chickens ( Gallus gallus domesticus)"", 《JOURNAL OF MOLECULAR ENDOCRINOLOGY》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106367519A (zh) * 2016-09-30 2017-02-01 扬州大学 利用mstn基因提高京海黄鸡屠宰性能的方法
CN107385072A (zh) * 2017-08-25 2017-11-24 扬州大学 一种检测鸡fam134b基因表达量的引物、方法及试剂盒
CN110551831A (zh) * 2019-09-30 2019-12-10 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 猪脂肪酸组成相关的分子标记和基因及应用

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