CN107385072A - 一种检测鸡fam134b基因表达量的引物、方法及试剂盒 - Google Patents
一种检测鸡fam134b基因表达量的引物、方法及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种检测鸡FAM134B基因表达量的引物、方法及试剂盒。引物：SEQ ID NO：1‑6。检测方法：提取鸡组织总RNA进行反转录，得到cDNA。利用设计的扩增目的基因和内参基因的特异引物进行荧光定量PCR。试剂盒由特异性引物SEQ ID NO：1‑6、SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) (2 ×)、ROX Reference Dye II (50 ×)和灭菌水组成。用本发明的试剂盒选择的检测方法简单快捷，可对鸡FAM134B基因表达量进行测定，研究FAM134B基因在鸡各种组织中的表达规律。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种检测鸡FAM134B基因表达量的试剂盒。
背景技术
基因表达是指细胞在生命过程中，把储存在DNA序列中遗传信息经过转录和翻译，转变成有生物活性的蛋白质分子的过程。基因表达规律的研究，可以了解到目的基因在不同组织器官中的表达情况，为进一步分析该基因的功能提供帮助。虽然在基因表达过程中还有翻译和翻译后的加工过程，但是mRNA是转录起始在基因表达的基本控制点，因此基因mRNA表达水平的测定能够较好的反应基因表达水平和生物学功能的强弱。本课题组前期转录组研究发现，在生长速度快慢的两种不同京海黄鸡个体中，FAM134B基因为腿肌组织中的差异表达基因。FAM134(Family with similarity 134，蛋白质序列相似度为134的类细胞因子家族)基因家族包括FAM134A、FAM134B、FAM134C。有研究研究发现FAM134B基因功能缺失、突变能够编码新的高尔基体蛋白，影响高尔基体对蛋白质和脂质的分配及修饰，导致伤害性感受受损以及自主神经性病变。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种检测鸡FAM134B基因表达量的引物、方法及试剂盒，该试剂盒可对鸡FAM134B基因表达量进行测定，研究FAM134B基因在鸡各种组织中的表达规律。
本发明的第一个目是提供一种检测鸡FAM134B基因表达量的引物，包括目的基因FAM134B引物、双内参基因β-actin引物和GAPDH引物；
目的基因FAM134B引物：
F:5’-TTTGTTGCGCTGACCCCTTG-3’(SEQ ID NO:1)
R:5’-TGTCAGTGATGCTCCTCCAA-3’(SEQ ID NO:2)
内参基因GAPDH引物：
F:5’-AGGCGAGATGGTGAAAGTCG-3’(SEQ ID NO:5)
R:5’-GACTTTGCCAGAGAGGACGG-3’(SEQ ID NO:6)。
本发明的第二个目的是提供一种检测鸡FAM134B基因表达量的荧光定量PCR扩增方法：提取鸡组织总RNA进行反转录，得到cDNA；利用权利要求1所述的目的基因FAM134B引物、双内参基因β-actin引物和GAPDH引物进行荧光定量PCR扩增，目的基因FAM134B引物、内参基因β-actin引物和内参基因GAPDH引物扩增产物大小分别为136bp，169bp和85bp，得到鸡组织中FAM134B基因相对表达量。
目的基因FAM134B引物：
F:5’-TTTGTTGCGCTGACCCCTTG-3’ (SEQ ID NO:1)
R:5’-TGTCAGTGATGCTCCTCCAA-3’ (SEQ ID NO:2)
目的基因FAM134B引物的扩增产物长度：136bp CDS序列(XM_003640778.3)从262-397，碱基序列如下：
内参基因β-actin引物的扩增产物长度：169bp CDS序列(NM_205518.1)从855-1023，碱基序列如下：
内参基因GAPDH引物扩增产物长度：85bp CDS序列(NM_204305.1)从51-135，碱基序列如下：
优选的，所述荧光定量PCR扩增程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火34s，40个循环。
优选的，所述方法还包括：PCR扩增结束后采集多个信息点进行溶解曲线分析，程序为：95℃15s，60℃1min；95℃15s。
优选的，所述荧光定量PCR扩增体系为20μL：
SYBR Premix Ex TaqII(Tli RNaseH Plus)(2×) 10μL
PCR Forward primer(10μM) 0.4μL
PCR Reverse Primer(10μM) 0.4μL
ROX Reference Dye II(50×) 0.4μL
模板(cDNA溶液) 2μL
灭菌水6.8μL
反应液的配制在冰上进行，每个样本设三个重复。
优选的，所述京海黄鸡组织选取心、肝、脾、肺、肾、胸肌、腿肌、卵巢的组织样，提取RNA反转录后再进行荧光定量试验，各个组织中FAM134B基因相对表达量见表1：
表1京海黄各个组织中FAM134B基因的相对表达量
本发明的第三个目的是提供一种检测鸡FAM134B基因表达量的试剂盒，包括SEQIDNO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4以及SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6、SYBRPremix Ex TaqII(Tli RNaseH Plus)(2×)、ROX Reference Dye II(50×)和灭菌水，各组分的份量如下：
SEQ ID NO：1：40μL
SEQ ID NO：2：40μL
SEQ ID NO：3：40μL
SEQ ID NO：4：40μL
SEQ ID NO：5：40μL
SEQ ID NO：6：40μL
SYBR Premix Ex TaqII(Tli RNaseH Plus)(2×)：3ml
ROX Reference Dye II(50×)：120μL
灭菌水：3mL。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
第一，提取京海黄鸡组织总RNA进行反转录，得到cDNA。利用设计的扩增目的基因和内参基因的特异引物进行荧光定量PCR。结果表明目的基因和内参基因的溶解曲线上只有单峰的存在，说明引物的特异性良好，三对引物都没有非特异性扩增和引物二聚体的形成，可用于荧光定量PCR。绘制的标准曲线表明，目的基因和内参基因标准曲线的斜率基本一致，即扩增效率基本一致，可运用2-△△CT方法对相对表达量进行分析。
第二，本发明公开了用于上述方法的试剂盒，该试剂盒由特异性引物、SYBRPremix ExTaqII(Tli RNaseH Plus)(2×)、ROX Reference Dye II(50×)和灭菌水组成，其中所述的特异性引物的序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4，SEQ IDNO：5和SEQ ID NO：6所示。提取待测样本的组织总RNA进行反转录后，利用该试剂盒进行荧光定量PCR，运用2-ΔΔCT方法对相对表达量进行分析。用于检测FAM134B基因表达量的试剂盒，该试剂盒简单快捷，且不受外界环境的影响，可以用于检测鸡各组织中FAM134B基因的相对表达量。该试剂盒能够用于研究鸡FAM134B基因各组织中表达情况，分析其表达规律，为FAM134B基因功能的进一步研究奠定理论基础。
附图说明
图1是组织总RNA的提取结果图；图中M指的是Marker DL2000；1、2、3和4分别是心、肝、脾和肺组织RNA；bp表示碱基对数；
图2是FAM134B基因的溶解曲线图；
图3是β-actin基因的溶解曲线图；
图4是GAPDH基因的溶解曲线图；
图5是FAM134B基因的标准曲线图；
图6是β-actin基因的标准曲线图；
图7是GAPDH基因的标准曲线图。
具体实施方式
实施例1
1.待测组织RNA的提取和反转录
实验采用来自京海禽业集团有限公司的饲养管理水平一致的京海黄鸡。选取3只12周龄体重相近的母鸡进行屠宰，采集心、肝、脾、肺、肾、胸肌、腿肌、卵巢组织样，RNA Wait样品保存液浸润后-70℃保存备用。
2.反转录
反转录体系为40ul(冰上配制)，具体操作为，在0.2m1的PCR管中加入5×PrimeScriptRT Master Mix(Perfect Real Time)8u1，加入约2000ng量的RNA模板(根据已经提取的各组织RNA浓度计算)，加入RNase Free dH20补全至40u1.
将加好试剂的PCR管瞬时离心后放在PCR仪上进行反应。反转录条件如下：
37℃15min(反转录反应)
85℃5sec(反转录酶的失活反应)
4℃
所得产物即为cDNA，-20℃保存备用
3.引物设计和PCR扩增
3.1引物的设计
本实验用于荧光定量的目的基因FAM134B引物根据GenBank中的基因序列(登录号：NC_006809.4)和mRNA序列(登录号：XM_015282242.1)跨内含子设计，内参基因β-actin引物根据GenBank中的基因序列(登录号：X00182)和mRNA序列(登录号：L081565)跨内含子设计，内参基因GAPDH引物根据GenBank中的基因序列(登录号：NC_006088.4)和mRNA序列(登录号：NM_204305.1)跨内含子设计。扩增产物大小分别为136bp，169bp和85bp。
引物序列如下：
FAM134B:F:5’-TTTGTTGCGCTGACCCCTTG-3’(SEQ ID NO:1)
R:5’-TGTCAGTGATGCTCCTCCAA-3’(SEQ ID NO:2)
β-actin:F:5’-CAGCCATCTTTCTTGGGTAT-3’(SEQ ID NO:3)
R:5’-CTGTGATCTCCTTCTGCATCC-3’(SEQ ID NO:4)
GAPDH:F:5’-AGGCGAGATGGTGAAAGTCG-3’(SEQ ID NO:5)
R:5’-GACTTTGCCAGAGAGGACGG-3’(SEQ ID NO:6)
目的基因FAM134B引物的扩增产物长度：136bp CDS序列(XM_003640778.3)从262-397，碱基序列如下：
内参基因β-actin引物的扩增产物长度：169bp CDS序列(NM_205518.1)从855-1023，碱基序列如下：
内参基因GAPDH引物扩增产物长度：85bp CDS序列(NM_204305.1)从51-135，碱基序列如下：
3.2试剂盒的组成
序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4以及SEQID NO：5和SEQ ID NO：6的特异性引物、SYBR Premix Ex TaqII(Tli RNaseH Plus)(2×)、ROXReference Dye II(50×)和灭菌水，各组分的份量如下：
SEQ ID NO：1：40μL
SEQ ID NO：2：40μL
SEQ ID NO：3：40μL
SEQ ID NO：4：40μL
SEQ ID NO：5：40μL
SEQ ID NO：6：40μL
SYBR Premix Ex TaqII(Tli RNaseH Plus)(2×)：3ml
ROX Reference Dye II(50×)：120μL
灭菌水：3mL
3.3荧光定量PCR扩增
荧光定量PCR体系为20μL：
SYBR Premix Ex TaqII(Tli RNaseH Plus)(2×) 10μL
PCR Forward primer(10μM) 0.4μL
PCR Reverse Primer(10μM) 0.4μL
ROX Reference Dye II(50×) 0.4μL
模板(cDNA溶液) 2μL
灭菌水6.8μL
反应液的配制在冰上进行，每个样本设三个重复。
荧光定量PCR扩增程序：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火34s，40个循环；为分析扩增产物的特异性，PCR扩增结束后采集多个信息点进行溶解曲线分析，程序为：95℃15s，60℃1min；95℃15s。结果表明目的基因和内参基因的溶解曲线上只有单峰的存在(图2，图3和图4)，说明引物的特异性良好，两对引物都没有非特异性扩增和引物二聚体的形成，可用于荧光定量PCR。
3.4目的基因和内参基因标准曲线的绘制
将目的基因和内参基因的cDNA按照10倍梯度稀释，稀释成4个梯度，以稀释的cDNA为模板进行荧光定量PCR制作标准曲线。目的基因FAM134B基因的标准曲线为：Y＝-3.328X+28.752，拟合度R2＝0.999，扩增效率Eff＝99.739％；内参基因β-actin基因的标准曲线为：Y＝-3.303X+26.636，拟合度R2＝0.998，扩增效率Eff＝100.804％；内参基因GAPDH基因的标准曲线为：Y＝-3.338X+24.328，拟合度R2＝0.999，扩增效率Eff＝99.354％。目的基因和内参基因的标准曲线见图5，图6和图7。由上可知目的基因和内参基因标准曲线的斜率基本一致，扩增效率基本一致，可以运用2-△△CT方法分析FAM134B基因的相对表达量。
3.5FAM134B基因在京海黄鸡母鸡各组织中的表达差异
以12周龄京海黄鸡母鸡为素材，选取心、肝、脾、肺、肾、胸肌、腿肌、卵巢的组织样，提取RNA反转录后再进行荧光定量试验，各个组织中FAM134B基因相对表达量见表1。由表可知，FAM134B基因在心脏中的表达丰度最高，其次为肺、肾、卵巢、肝、腿肌、胸肌、脾脏。该试剂盒可用于检测鸡FAM134B基因在各种组织中的表达量，进而研究基因的功能。
表1京海黄各个组织中FAM134B基因的相对表达量
*表示以脾组织中WNT9A基因相对表达量为内对照。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 一种检测鸡FAM134B基因表达量的引物、方法及试剂盒
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 目的基因FAM134B引物的上游引物
<400> 1
tttgttgcgc tgaccccttg O 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 目的基因FAM134B引物的下游引物
<400> 2
tgtcagtgat gctcctccaa O 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 内参基因β-actin引物的上游引物
<400> 3
cagccatctt tcttgggtat O 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 内参基因β-actin引物的下游引物
<400> 4
ctgtgatctc cttctgcatc cO 22
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 内参基因GAPDH引物的上游引物
<400> 5
aggcgagatg gtgaaagtcg O 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 内参基因GAPDH引物的下游引物
<400> 6
gactttgcca gagaggacgg O 21
<210> 7
<211> 136
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 目的基因FAM134B引物的扩增产物长度
<400> 7
tttgttgcgc tgaccccttg gagagtgtat catttgactt ctctcataat acttggactg 60
ctagttctac agataataaa ggatttggtg ttatctagga taaaaggtgc acagctttgg 120
aggagcatca ctgacaO 137
<210> 8
<211> 169
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 内参基因β-actin引物的扩增产物
<400> 8
cagccatctt tcttgggtat ggagtcctgt ggtatccatg aaactacctt caactccatc 60
atgaagtgtg atgtggatat ccgtaaggat ctgtatgcca acacagtgct gtctggtggt 120
accacaatgt accctggcat tgctgacagg atgcagaagg agatcacagO 170
<210> 9
<211> 85
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 内参基因GAPDH引物扩增产物
<400> 9
aggcgagatg gtgaaagtcg gagtcaacgg atttggccgt attggccgcc tggtcaccag 60
ggctgccgtc ctctctggca aagtc 85
Claims (7)
1.一种检测鸡FAM134B基因表达量的引物，包括内参基因β-actin引物：
F:5’-CAGCCATCTTTCTTGGGTAT-3’SEQ ID NO:3
R:5’-CTGTGATCTCCTTCTGCATCC-3’SEQ ID NO:4
其特征是，所述引物还包括目的基因FAM134B引物和内参基因GAPDH引物；
目的基因FAM134B引物：
F:5’-TTTGTTGCGCTGACCCCTTG-3’SEQ ID NO:1
R:5’-TGTCAGTGATGCTCCTCCAA-3’SEQ ID NO:2
内参基因GAPDH引物：
F:5’-AGGCGAGATGGTGAAAGTCG-3’SEQ ID NO:5
R:5’-GACTTTGCCAGAGAGGACGG-3’SEQ ID NO:6。
2.一种检测鸡FAM134B基因表达量的荧光定量PCR扩增方法，其特征是，所述方法包括：提取鸡组织总RNA进行反转录，得到cDNA；利用权利要求1所述的目的基因FAM134B引物、双内参基因β-actin引物和GAPDH引物进行荧光定量PCR扩增，目的基因FAM134B引物、双内参基因β-actin引物和GAPDH引物扩增产物大小分别为136bp，169bp和85bp，得到鸡组织中FAM134B基因相对表达量。
3.利用权利要求1所述的检测鸡FAM134B基因表达量的荧光定量PCR扩增方法，其特征是，所述荧光定量PCR扩增程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火34s，40个循环。
4.根据权利要求2所述的检测鸡FAM134B基因表达量的荧光定量PCR扩增方法，其特征是，所述方法还包括：PCR扩增结束后采集多个信息点进行溶解曲线分析，程序为：95℃15s，60℃1min；95℃15s。
5.根据权利要求2所述的检测鸡FAM134B基因表达量的荧光定量PCR扩增方法，其特征是，所述荧光定量PCR扩增体系为20μL：
20μL荧光定量PCR扩增体系反应液的配制在冰上进行，每个样本设三个重复。
6.根据权利要求2所述的检测鸡FAM134B基因表达量的荧光定量PCR扩增方法，其特征是，所述鸡组织选取京海黄鸡心、肝、脾、肺、肾、胸肌、腿肌、卵巢的组织样，提取RNA反转录后再进行荧光定量试验，各个组织中FAM134B基因相对表达量见表1：
表1 京海黄鸡各个组织中FAM134B基因的相对表达量
*表示以脾组织中WNT9A基因相对表达量为内对照。
7.一种检测鸡FAM134B基因表达量的试剂盒，包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4以及SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6、2×浓度的SYBR Premix Ex Taq IITli RNaseH Plus、50×浓度的ROX Reference Dye II和灭菌水，各组分的份量如下：
SEQ ID NO：1：40μL
SEQ ID NO：2：40μL
SEQ ID NO：3：40μL
SEQ ID NO：4：40μL
SEQ ID NO：5：40μL
SEQ ID NO：6：40μL
2×浓度的SYBR Premix Ex Taq II Tli RNaseH Plus：3ml
50×浓度的ROX Reference Dye II：120μL
灭菌水：3mL。
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