CN109200289A - Fam134b在制备治疗脓毒症的药物中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了FAM134B的新用途。本发明利用体内和体外实验证明，促进FAM134B表达可以促进DC成熟或提高DC活性，从而实现治疗脓毒症的目的。另外，根据本发明的研究成果，本领域技术人员可知，FAM134B表达高低与脓毒症存在相关性，因此可以将FAM134B作为诊断脓毒症的分子标志物。根据FAM134B与DC细胞的相关性，本发明还提供了一种体外制备高活性DC细胞的方法，从而实现DC细胞的工业化生产。

Description

FAM134B在制备治疗脓毒症的药物中的用途
技术领域
本发明属于分子生物学与生物医学领域，涉及FAM134B在脓毒症治疗中的应用。
背景技术
脓毒症(sepsis)是机体对于感染反应失控所引起的致命性器官功能障碍，系重症监护病房(ICU)患者最主要死亡原因。最新流行病学资料显示，全世界各国每年约有3150万例脓毒症患者，其中死亡人数高达530万，且因高昂的治疗费用及大量的医疗消耗，造成了巨大的经济负担。以美国为例，全美每年有超过75万例脓毒症患者，死亡率为28.6％，而每年用于脓毒症治疗的总费用达167亿美元。我国严重脓毒症的发生率及死亡率亦处于较高水平，据统计，37.3％的ICU患者出现严重脓毒症，其中28.7％的患者死亡，每例患者平均花费约为11390美元。近年来，随着对脓毒症认识的深入及监护水平的提高，脓毒症患者的早期生存率较之前有所提高，但总体死亡率及晚期预后仍未得到明显改善，已成为进一步提高急危重症救治成功率的最大障碍，开展和加强其研究具有极其重要的理论意义和实用价值。目前对于脓毒症患者发生多器官功能障碍及预后不良的确切原因有待澄清，根据2016年提出的脓毒症3.0定义，机体对感染的应答失控(包括免疫反应异常)被认为可能是脓毒症高死亡率及难治性的重要原因，因此，进一步明确机体免疫障碍的确切机制及调控宿主免疫反应平衡对提高脓毒症患者生存率及改善预后具有重要临床价值。
在生理条件下，免疫细胞能通过模式识别受体(PRR)分别以病原相关分子模式(PAMP)及损伤相关分子模式(DAMP)的方式识别入侵病原体及损伤因子，并通过释放促炎细胞因子，诱导淋巴细胞聚集、补体及凝血系统活化等效应来限制及杀灭入侵病原体；与此同时，抗炎反应活化以限制过度的炎症反应，并促进组织修复，使炎症反应处于平衡状态。而脓毒症时机体免疫反应出现失衡，早期炎性细胞过度活化，促炎细胞因子大量产生[包括肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)1β、IL-6等]，内皮细胞损伤及凝血系统活化，血液呈现高凝状态，进而引起脓毒性休克及多器官功能障碍，甚至死亡。传统观点认为炎症介质的过度释放可能是脓毒症患者的主要致死因素，然而，近年研究发现单纯拮抗炎症因子的产生并不能有效提高脓毒症的生存率及改善预后。此外，在早期密切监护及支持治疗条件下，脓毒症发生后4天内患者死亡率约为12％，而超过40％的死亡病例出现于脓毒症发生4天以后，甚至数周之后。Boomer等对40例脓毒症死亡患者进行尸检后发现，与对照组比较，死亡患者免疫细胞分泌细胞因子总量显著降低，而抑制性受体的表达如程序性死亡受体1(PD-1)明显增高，同时抑制性细胞的活性如调节性T细胞(Tregs)及髓源性抑制性细胞(MDSCs)明显增强，机体促炎/抗炎反应显著失衡，表明免疫功能紊乱可能是造成脓毒症患者死亡的重要原因。
脓毒症状态下免疫功能紊乱主要表现为固有免疫及适应性免疫系统的应答障碍，继而无法有效地限制及杀灭病原菌，导致感染的持续性存在，甚至发生二重感染。研究表明，免疫细胞功能障碍及数量减少是脓毒症免疫功能抑制的主要原因。脓毒症时中性粒细胞及巨噬细胞出现明显的趋化障碍，同时促炎细胞因子及活性氧产生显著受抑，树突状细胞(DC)表面分子及共刺激分子表达显著降低，刺激效应性T细胞增殖分化能力明显减弱，并诱导其向辅助性T细胞(Th)2型细胞极化，致使机体免疫状态失衡，加重免疫抑制。此外，脓毒症时免疫细胞凋亡显著增多，导致体内DC、CD4+T细胞、CD8+T细胞及B细胞数量锐减，而Treg、MDSCs等抑制性细胞活性增强，且数量并未减少，相对比例反而升高，呈现持续性免疫抑制状态。由此可见，维持免疫细胞数量稳定及功能平衡是干预脓毒症免疫功能紊乱的重要措施，明确脓毒症时重要免疫细胞功能障碍的确切机制将为寻求调控免疫反应有效靶点提供新的契机。
DC是体内功能最强的抗原提呈细胞，能刺激幼稚T细胞增殖分化，影响机体的免疫平衡状态。在感染发生后，未成熟DC能识别并摄取抗原，对其进行有效加工后细胞趋于成熟，成熟DC高表达CD40、CD80、CD86等共刺激分子及主要组织相容性复合体(MHC-)II类分子，并将抗原提呈给T细胞识别，启动适应性免疫应答。一个成熟的DC能使100-3000个T细胞有效激活。
研究发现，烧伤脓毒症早期DC明显活化，能有效地启动适应性免疫以对抗入侵病原微生物，而晚期其表面分子MHC-II及共刺激分子CD80、CD86表达显著降低，IL-12及TNF-α的产生抑制，表现出明显的应答障碍，而修复受损的DC功能则显著提高脓毒症动物生存率。此外，在盲肠结扎穿孔术(CLP)构建脓毒症动物模型中发现，DC在术后12小时即出现凋亡增多的现象，并持续至术后3天，DC数量显著减少；临床资料中亦观察到脓毒症患者DC数量明显低于正常对照组，而抗凋亡治疗及外源性给予DC均能有效的提高脓毒症动物的生存率，表明维持DC功能及数量稳定是改善脓毒症预后的重要途径。
发明内容
本发明通过构建脓毒症小鼠模型以及构建体外脓毒症细胞模型，研究了FAM134B与脓毒症病理状态下DC细胞功能的关系。结果显示，FAM134B能够调控DC细胞功能以影响对T细胞的激活。因此根据本发明的研究成果，可以获得以下结论：FAM134B可以用于治疗脓毒症。基于以上研究内容，本发明采用了如下保护方案：
根据本发明的一个方面，本发明提供了FAM134B在制备促进DC细胞成熟或增强DC细胞功能活性的试剂中的应用。
进一步，所述试剂包括FAM134B激动剂。
更进一步，所述FAM134B激动剂包括促进FAM134B表达的试剂、促进FAM134B活性的试剂。
优选地，所述促进FAM134B表达的试剂包括FAM134B基因序列、含有FAM134B基因序列的表达载体、促进性miRNA、转录调控因子或靶向小分子化合物等等。
更优选地，所述促进FAM134B表达的试剂是FAM134B的过表达载体。
根据本发明的另一个方面，本发明提供了FAM134B在制备诊断脓毒症的产品中的应用。
进一步，所述产品包括能够检测FAM134B表达水平的试剂。
进一步，所述检测FAM134B表达水平的试剂包括检测FAM134B基因转录水平的试剂、检测FAM134B蛋白水平的试剂。
本发明的检测FAM134B基因转录水平的试剂可基于使用核酸分子的已知方法来发挥其功能：如PCR、如Southern杂交、Northern杂交、点杂交、荧光原位杂交(FISH)、DNA微阵列、ASO法、高通量测序平台等。使用该试剂可以定性地、定量地、或半定量地实施分析。
进一步，所述PCR方法为已知方法，例如，ARMS(Amplification RefractoryMutation System，扩增不应突变系统)法、RT-PCR(逆转录酶-PCR)法、嵌套PCR法等等。扩增的核酸可以通过使用点印迹杂交法、表面等离子共振法(SPR法)、PCR-RFLP法、原位RT-PCR法、PCR-SSO(序列特异性寡核苷酸)法、PCR-SSP法、AMPFLP(可扩增片段长度多态性)法、MVR-PCR法、和PCR-SSCP(单链构象多态性)法来检测。
所述能够检测FAM134B基因转录水平的试剂可以是FAM134B基因或转录本的特异性引物，也可以是FAM134B基因或转录本的特异性识别探针，或同时包括引物和探针。
上面所述的FAM134B基因或转录本的特异性引物包括实时定量PCR中使用的特异扩增FAM134B基因的引物。在本发明的的具体实施例中，所述引物序列如SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示。
引物可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来适当地设计，并通过化学合成来制备。
探针可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来恰当设计，并通过化学合成来制备，或者可以通过从生物材料制备含有期望核酸序列的基因，并使用设计用于扩增期望核酸序列的引物扩增它来制备。
本发明的检测FAM134B蛋白的试剂可基于使用抗体的已知方法来发挥其功能：例如，可以包括ELISA、放射免疫测定法、免疫组织化学法、Western印迹等。
本发明的检测FAM134B蛋白的试剂包括特异性结合FAM134B蛋白的抗体或其片段。可以使用任何结构、尺寸、免疫球蛋白类别、起源等的抗体或其片段，只要它结合靶蛋白质即可。本发明的检测产品中包括的抗体或其片段可以是单克隆的或多克隆的。抗体片段指保留抗体对抗原的结合活性的抗体一部分(部分片段)或含有抗体一部分的肽。抗体片段可以包括F(ab′)2、Fab′、Fab、单链Fv(scFv)、二硫化物键合的Fv(dsFv)或其聚合物、二聚化V区(双抗体)、或含有CDR的肽。本发明的定量FAM134B蛋白的试剂可以包括编码抗体或编码抗体片段的氨基酸序列的分离的核酸，包含该核酸的载体，和携带该载体的细胞。
抗体可以通过本领域技术人员公知的方法来获得。例如，制备保留整个或部分靶蛋白质的多肽或整合编码它们的多核苷酸的哺乳动物细胞表达载体作为抗原。使用抗原免疫动物后，从经过免疫的动物获得免疫细胞并融合骨髓瘤细胞以获得杂交瘤。然后从杂交瘤培养物收集抗体。最后可以通过使用被用作抗原的FAM134B蛋白或其部分对获得的抗体实施抗原特异性纯化来获得针对FAM134B蛋白的单克隆抗体。可以如下制备多克隆抗体：用与上文相同的抗原免疫动物，从经过免疫的动物收集血液样品，从血液中分离出血清，然后使用上述抗原对血清实施抗原特异性纯化。可以通过用酶处理获得的抗体或通过使用获得的抗体的序列信息来获得抗体片段。
标记物与抗体或其片段的结合可以通过本领域普遍知道的方法来实施。例如，可以如下荧光标记蛋白质或肽：用磷酸盐缓冲液清洗蛋白质或肽，添加用DMSO、缓冲剂、等准备的染料，然后混合溶液，再于室温放置10分钟。另外，标记可使用商品化的标记试剂盒，诸如生物素标记试剂盒，如生物素标记试剂盒-NH2、生物素标记试剂盒-SH(DojindoLaboratories)；碱性磷酸酶标记试剂盒诸如碱性磷酸酶标记试剂盒-NH2、碱性磷酸酶标记试剂盒-SH(Dojindo Laboratories)；过氧化物酶标记试剂盒诸如过氧化物酶标记试剂盒-NH2、过氧化物酶标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories)；藻胆蛋白标记试剂盒诸如藻胆蛋白标记试剂盒-NH2、藻胆蛋白标记试剂盒-SH、B-藻红蛋白标记试剂盒-NH2，B-藻红蛋白标记试剂盒-SH、R-藻红蛋白标记试剂盒-NH2、R-藻红蛋白标记试剂盒SH(DojindoLaboratories)；荧光标记试剂盒诸如荧光素标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)555标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)647标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories)；及DyLight 547和DyLight647(Techno Chemical Corp.)、Zenon(TM)、Alexa Fluor(TM)抗体标记试剂盒、Qdot(TM)抗体标记试剂盒(Invitrogen Corporation)和EZ-标记物蛋白质标记试剂盒(Funakoshi Corporation)。为了正确标记，可以使用适宜的仪器来检测经过标记的抗体或其片段。
进一步，所述用于诊断脓毒症的产品包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知FAM134B基因的异常与脓毒症的发生相关也属于使用了本发明的FAM134B的新用途，同样在本发明的保护范围之内。
本发明的试剂盒中还可包括用于提取核酸的试剂，用于PCR的试剂，用于染色或显色的试剂等。例如，这些试剂包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、显色液、洗液等。
此外，所述的试剂盒中还可包括描述检测FAM134B基因表达的方法的说明书等。
本发明所述的试剂盒可包含适于实用(如针对于不同的检测方法)的多种不同的试剂，并不限于目前所列举的试剂，只要是基于FAM134B基因或转录本的检测来诊断脓毒症的试剂均包含在本发明范围内。
根据本发明的另一个方面，本发明提供了FAM134B在制备治疗脓毒症的药物中的应用。
进一步，所述药物包括FAM134B激动剂。
更进一步，所述FAM134B激动剂包括促进FAM134B表达的试剂、促进FAM134B活性的试剂。
优选地，所述促进FAM134B表达的试剂包括FAM134B基因序列、含有FAM134B基因序列的表达载体、促进性miRNA、转录调控因子或靶向小分子化合物等等。
更优选地，所述促进FAM134B表达的试剂是FAM134B的过表达载体。
根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种方法，所述方法包括以下方法中的任一个：
(1)促进DC细胞成熟的方法；
(2)提高DC细胞活性的方法；
(3)制备高活性DC细胞的方法，
所述方法包括施用促进FAM134B表达的试剂和/或促进FAM134B活性的试剂。
进一步，所述试剂包括包括裸基因序列、含有基因序列的表达载体、促进性miRNA、转录调控因子或靶向小分子化合物等等。
根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种构建脓毒症小鼠的方法，所述方法包括施用抑制FAM134B表达的试剂、抑制FAM134B活性的试剂。
进一步，所述抑制FAM134B表达的试剂包括抑制FAM134B本身的试剂、抑制调控FAM134B表达的上下游物质的表达的试剂、抑制调控FAM134B表达的上下游物质的活性的试剂。
进一步，所述试剂包括针对FAM134B基因表达的干扰RNA，或者负调控miRNA、负调控型的转录调控因子、或抑制型靶向小分子化合物。
根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种筛选脓毒症小鼠的方法，所述方法包括检测小鼠DC细胞中FAM134B表达。与野生型小鼠相比，如果待评估小鼠DC细胞中FAM134B表达水平降低，则代表该小鼠是构建成功的脓毒症小鼠。
本发明的药物可以通过本领域任何已知的方式配制药物组合物来使用。这种组合物包含活性成分，加上一种或多种药物可接受的载体、稀释剂、填充剂、结合剂及其它赋形剂，这依赖于给药方式及所设计的剂量形式。本领域枝术人员已知的治疗惰性的无机或有机的载体包括(但不限于)乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、植物油、蜡、脂肪、多羟基化合物例如聚乙二醇、水、蔗糖、乙醇、甘油，诸如此类，各种防腐剂、润滑剂、分散剂、矫味剂。保湿剐、抗氧化剂、甜味剂、着色剂、稳定剂、盐、缓冲液诸如此类也可加入其中，这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味，在这种组合物中可以使用的制剂可是其原始化合物本身的形式，或任选地使用其药物学可接受的盐的形式，本发明的药物可以单独给药，或以各种组合给药，以及与其它治疗药剂一起结合形式给药。如此配制的组合物根据需要可选择本领域技术人员已知的任何适当的方式把药物进行给药。使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明的药物施用于人，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明的药物可根据需要制备成各种剂型。包括但不限于，经皮、粘膜、鼻、口颊、舌下或经口使用的片剂、溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂或栓剂。
本发明的药物的施用途径不受限制，只要它能发挥期望的治疗效果或预防效果即可，包括但不限于静脉内，腹膜内，眼内，动脉内，肺内，口服，小泡内，肌肉内，气管内，皮下的，通过皮肤，通过胸膜，局部的，吸入，通过粘膜，皮肤，肠胃，关节内，心室内，直肠，阴道，颅骨内，尿道内，肝内，瘤内。在某些情况下，可以系统地给药。在某些情况下是局部地给药。
本发明的药物的剂量不受限制，只要获得期望的治疗效果或者预防效果即可。本发明的治疗药物或预防药物的剂量可以使用例如对疾病的治疗效果或者预防效果作为指标来确定。
在本发明的上下文中，“诊断”包括判断受试者是否已经患有疾病、判断受试者是否存在患有疾病的风险。
本文所用的“治疗”涵盖患有相关疾病或病症的哺乳动物例如人类中治疗相关的疾病或疾病状态，并且包括：
(1)预防疾病或疾病状态在哺乳动物中发生，尤其是当该哺乳动物易感于所述疾病状态，但尚未被诊断出患有这种疾病状态时；
(2)抑制疾病或疾病状态，即阻止其发生；或者
(3)缓解疾病或疾病状态，即使疾病或疾病状态消退。
术语“治疗”通常涉及治疗人类或动物(例如，被兽医所应用)，其中可达到某些预期的治疗效果，例如，抑制病症的发展(包括降低发展速度、使发展停止)、改善病症和治愈病症。还包括作为预防措施(例如预防)的治疗。对还没有发展为病症但有发展为该病症危险的患者的用途，也包括在术语“治疗”中。
附图说明
图1显示利用Western blot检测FAM134B蛋白表达情况的显影图；
图2显示利用流式细胞术检测DC表面分子表达情况的流式图；
图3显示利用CCK8实验检测T细胞增殖活性的统计图；
图4显示利用流式细胞术检测LPS刺激条件下DC表面分子表达情况的流式图；
图5显示利用CCK8实验检测LPS刺激条件下T细胞增殖活性的统计图；
图6显示FAM134B缺陷小鼠和野生型小鼠脾脏标本的实物图；
图7显示FAM134B缺陷小鼠中DC表面分子表达情况的流式图；
图8显示FAM134B缺陷小鼠中T细胞增殖活性的统计图；
图9显示利用免疫荧光检测慢病毒转染情况的荧光图；
图10显示利用流式细胞术检测慢病毒转染效率的流式图；
图11显示利用qPCR检测慢病毒转染后FAM134B mRNA水平的统计图；
图12显示利用Western blot检测慢病毒转染后FAM134B蛋白表达的统计图；
图13显示利用流式细胞术检测FAM134B干扰后DC表面分子表达情况的流式图。
图14显示利用流式细胞术检测过表达FAM134B后DC表面分子表达情况的流式图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 FAM134B与脓毒症的相关性研究
1、体内实验
取6-8周龄野生型雄性C57BL/6小鼠(体重：20～22g)，进行编号、称重，随机分成三组(随机数字法)：正常组、假伤组及脓毒症组，脓毒症组小鼠行CLP构建脓毒症模型，假伤组小鼠开腹暴露盲肠、还纳后关腹。于术后6h、24h、72h处死动物，分别取出小鼠脾脏，采用免疫磁珠法(CD11c Microbeads)分离、纯化DC，评估DC功能，检测并比较各组不同时间点FAM134B表达情况。
(1)脓毒症动物模型的建立
取6-8周龄雄性C57BL/6小鼠(20～22g)，术前禁食12h，自由饮水。5％水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠(30mg/kg)，麻醉成功后仰卧位固定小鼠于手术板上，暴露并消毒腹部皮肤。沿腹正中线作长约1cm的纵形切口，逐层切开皮肤及腹膜，暴露盲肠，于盲肠根部至末端的1/2处用3号丝线结扎盲肠；用22G针头于结扎端中线处贯穿盲肠一次，注意避开血管，并挤出少许肠内容物，还纳盲肠，逐层缝合腹膜及皮肤，轻柔腹部后再次消毒腹部皮肤。造模成功后于颈后皮下注射1ml 0.9％生理盐水进行补液，术后自由进食饮水，保持室温恒定。假伤组小鼠仅开腹暴露盲肠后还纳、关腹。
(2)脾脏DC细胞的分离与鉴定
脾脏单个核细胞的提取：无菌取出小鼠脾脏，置于加有胶原酶D的培养皿中，剪碎后37℃孵育25分钟，加入EDTA再孵育5min。将处理好的脾脏组织用研磨棒在400目的钢滤网上研磨，收集滤液后离心，1200rpm离心5min，弃上清。用4ml磷酸盐缓冲液(PBS)重悬细胞，并缓慢加至装有等体积小鼠脏器淋巴细胞分离液(Ficoll-Papue)的离心管中，室温中3000rpm离心15min，吸取中间云雾状细胞层，PBS洗涤两遍后获得单个核细胞。
脾脏DC的分离与鉴定：采用MiniMACS免疫磁性分离系统分离、纯化DC，按照每107个单个核细胞加入40μl PBS的比例重悬单个核细胞，以每107个单个核细胞加入10μl抗小鼠DC微磁珠(CD11c Microbeads)的比例加入适量微磁珠；混匀后4℃避光孵育10min，加入10ml PBS离心洗涤一次，弃上清后用500μlPBS重悬。将MS分选柱置入MiniMACS磁性分选磁场中，1ml PBS润洗一次，将500μl细胞悬液加入MS分选柱中，让阴性细胞随液体缓慢流出，而CD11c+阳性DC则存留在MS柱中；500μl PBS润洗MS柱3次后，加入1ml PBS并用活塞将存留在柱子里的细胞推入离心管中，PBS洗涤两次后计数，收集DC进行纯度及活性测定。
(3)DC表面分子CD80、CD86、MHC-II表达检测
通过流式细胞术检测DC表面分子CD80、CD86、MHC-II表达。
步骤如下：将分离纯化的脾脏DC按照2×106个细胞/ml的比例用PBS重悬细胞，取100μl细胞悬液分别加入1μl Percp-Cy5.5偶联的抗小鼠CD80抗体、1μlAPC偶联的抗小鼠CD86抗体及1μl FITC偶联的抗小鼠MHC-II抗体，4℃孵育40-60min，加入10倍体积的PBS离心洗涤一次，1200rpm离心5min，弃上清后用300μl PBS重悬细胞，采用流式细胞分析仪检测荧光表达变化。
结果显示，脓毒症早期DC表面分子CD80、CD86及MHC-II表达上调，其中以24h增加最为显著，而脓毒症72h后表面分子表达明显下降(图2)，此时脓毒症小鼠出现死亡高峰。
(4)检测DC对T细胞增殖的影响
采用混合淋巴细胞试验：将经CD3/CD28处理的CD4+T细胞预培养24h，按照DC:T＝1:100的比例加入DC后再培养72h。
采用CCK8法检测T细胞增殖情况。
步骤如下：将96孔板中的培养基吸取100μl后，每孔加入10μl CCK8溶液后，充分混匀，于37℃含5％CO2的细胞培养箱中培养1-4h，观察颜色变化，用酶标仪在450nm处检测OD值。
结果显示，T细胞增殖活性在脓毒症早期升高，在脓毒症24h达峰值，而在脓毒症72h则明显受抑(图3)，*P<0.05代表差异具有统计学意义。
(5)Western blot检测FAM134B蛋白表达
收集DC细胞样本，PBS洗涤两次后弃上清，按照106个细胞加入10μl裂解液的比例加入适量裂解液并充分混匀；4℃反应30min，液氮反复冻融三次后，在4℃状态下12000rpm离心30min，收集上清，采用BCA法对总蛋白进行定量。运用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离目的蛋白，并用半干转方法将蛋白转移至PVDF膜上，将膜置于10％的脱脂牛奶中室温封闭2h后，一抗(1:1000)于4℃孵育过夜；TBS-T缓冲液洗膜3次，5min/次，将膜置于辣根过氧化物酶偶联的二抗(1:5000)溶液中，室温孵育1h后，TBS-T缓冲液洗膜3次。采用ECL显影试剂盒将膜在凝胶成像仪中进行显影、成像，Image Lab软件对各条带的灰度值进行比较。结果显示，脓毒症24h时FAM134B蛋白表达较假伤组及术后6h明显上调，而在脓毒症72h时FAM134B蛋白下调趋势明显(图1)。
2、体外实验
采用CD11c Microbeads分离野生型雄性C57BL/6小鼠脾脏DC，在含10％胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养基(含青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml及L-glutamine)中混匀后置于37℃、5％CO2孵箱中进行体外培养；实验分成对照组及LPS刺激组，LPS刺激组予以1μg/mlLPS，对照组加入等体积的生理盐水，培养6h、24h、72h后分别检测FAM134B表达情况。
结果：DC表面分子CD80、CD86及MHC-II表达在LPS刺激下均呈现明显增加，于24h达到高峰，而刺激72h后DC表面分子表达有所抑制(图4)。DC与T细胞共培养后，T细胞增殖活性在LPS刺激24h增加，在72h则出现明显抑制(图5)，*P<0.05代表差异具有统计学意义。
上述体内实验和体外实验结果显示，FAM134B蛋白变化趋势与DC细胞成熟变化趋势一致，表明FAM134B蛋白可能调控DC细胞成熟、功能活化过程。
实施例2 干扰FAM134B基因表达对DC功能活化的影响
1、体内实验
1.1 FAM134B基因敲除小鼠(FAM134B-/-)获得
南京大学-南京生物医药研究院是国内最早通过AAALAC认证，且保持认证资质时间最长的研究机构，是国家科技部唯一认证的国家级遗传工程小鼠种子中心。本申请需要的重要模式动物(FAM134B基因敲除小鼠，FAM134B-/-)已由南京大学-南京生物医药研究院制作并提供：
a.设计及构建sgRNA：分别在Fam134b基因的内含子3-4之间和3’-UTR的位置各设计2条sgRNA，并在体外进行合成构建；
b.显微注射：将构建好的sgRNA和Cas9 mRNA一起注射至0.5天的受精卵中，并将20-25枚注射后的受精卵移植到假孕0.5天的ICR受体鼠的输卵管中；
c.F0代小鼠的出生与鉴定：经过19～21天的妊娠期后ICR受体鼠生下F0代小鼠，再通过PCR和测序的方法鉴定所有的F0小鼠；
d.F0阳性小鼠经过配繁得到大量的纯合小鼠。
1.2脾脏DC表面分子CD80表达检测
利用流式细胞术检测DC表面分子CD80表达。
1.3脾脏DC与T细胞共培养
混合淋巴细胞试验检测DC对T细胞增殖的影响：将经CD3/CD28处理的CD4+T细胞预培养24h，按照DC:T＝1:100的比例加入DC后再培养72h。采用CCK8法检测T细胞增殖情况。
1.4结果
通过比较野生型小鼠与FAM134B基因敲除小鼠(FAM134B-/-)证实，与野生型(WT)小鼠比较，FAM134B基因敲除小鼠脾脏明显小于同龄野生型小鼠(图6)；其脾脏DC表面分子CD80表达在脓毒症时明显处于较低水平(图7)，将DC与T细胞共培养后发现，脓毒症时FAM134B-/-小鼠DC刺激T细胞增殖活性明显低于WT小鼠(图8)，*P<0.05代表差异具有统计学意义。上述结果表明，FAM134B参与DC功能活化过程。
2、体外实验
2.1 DC2.4细胞系培养
细胞在含10％胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养基(含青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml及L-glutamine)中，置于37℃、5％CO2孵箱中进行体外培养。
2.2 FAM134B干扰序列转染
(1)携带有FAM134B干扰序列(shRNA)的慢病毒载体构建
携带有FAM134B干扰序列(shRNA)的慢病毒载体构建是由和元生物技术(上海)股份有限公司完成。大致过程如下所示：根据小鼠FAM134B基因的转录本设计3到4个siRNA靶点，安排引物合成；将合成好的oligo用oligo annealing buffer溶解成20μM，互补单链各取30μl混合。然后将oligo混合物在水浴锅中95℃加热5min，然后水浴锅开盖置室温中自然冷却至室温，形成双链oligo片段。用限制性内切酶对表达载体进行酶切，酶切反应体系为：质粒2μg，10x反应Buffer 5μl，限制性内切酶各1μl，去离子水补足50μl，于37℃水浴锅中孵育2h以上。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，并把目的载体条带从琼脂糖凝胶电泳后的胶中割下来，制备线性化表达载体，进一步替换掉原来的ccdB毒性基因。挑取平板上长出的转化子重悬于10μl LB培养液中，取1μl做模板进行菌落PCR鉴定，筛选转化子并通过测序的方法鉴定得到的阳性克隆。测序验证正确的克隆，进行高纯度质粒抽提。
其中，shRNA序列信息如表1所示。
表1 shRNA序列
Marker Gene Gene ID TargetSeq GC％
Y4608 Fam134b NM_025459 GCTCTTTGTCCTAAGATTA 36.85
Y4609 Fam134b NM_025459 CCCACAGAGCTCAAGAGAA 52.64
Y4610 Fam134b NM_025459 CCAGGCAGAGCTAGATCAA 52.64
Y007 NC TTCTCCGAACGTGTCACGT 52.6
其中，病毒载体构建框架如表2所示。
表2病毒载体构建框架
NO. 5’ STEM Loop STEM 3’
Y4608-F Ccgg GCTCTTTGTCCTAAGATTA TTCAAGAGA TAATCTTAGGACAAAGAGC TTTTTTg
Y4608-R aattcaaaaaa GCTCTTTGTCCTAAGATTA TCTCTTGAA TAATCTTAGGACAAAGAGC
Y4609-F Ccgg CCCACAGAGCTCAAGAGAA TTCAAGAGA TTCTCTTGAGCTCTGTGGG TTTTTTg
Y4609-R aattcaaaaaa CCCACAGAGCTCAAGAGAA TCTCTTGAA TTCTCTTGAGCTCTGTGGG
Y4610-F Ccgg CCAGGCAGAGCTAGATCAA TTCAAGAGA TTGATCTAGCTCTGCCTGG TTTTTTg
Y4610-R aattcaaaaaa CCAGGCAGAGCTAGATCAA TCTCTTGAA TTGATCTAGCTCTGCCTGG
Y007-F CCGG TTCTCCGAACGTGTCACGT TTCAAGAGA ACGTGACACGTTCGGAGAA TTTTTTG
Y007-R AATTCAAAAAA TTCTCCGAACGTGTCACGT TCTCTTGAA ACGTGACACGTTCGGAGAA
其中，使用到的引物片段如表3所示。
表3 DNA引物片段
(2)转染
将携带有FAM134B干扰序列(shRNA)的慢病毒载体在5μg/ml polybrene作用下，接种至培养DC2.4细胞中，转染9h后观察细胞形态并更换新鲜培养基，24h后再次更换培养基，继续培养48h。
2.3干扰效果检测
观察转染细胞荧光表达情况，并加入Puromycin dihydrochloride对细胞进行筛选，采用流式细胞术检测转染效率，通过qPCR及Western blot技术验证FAM134B干扰效果。
(1)流式细胞术检测转染效率
分别收集正常和转染后的DC2.4细胞，按照2×106个细胞/ml的比例用PBS重悬细胞，取100μl细胞悬液采用流式细胞仪检测比较转染后DC2.4细胞荧光表达情况。
(2)Western blot检测FAM134B蛋白表达
收集细胞样本，PBS洗涤两次后弃上清，按照106个细胞加入10μl裂解液的比例加入适量裂解液并充分混匀；4℃反应30min，液氮反复冻融三次后，在4℃状态下12000rpm离心30min，收集上清，采用BCA法对总蛋白进行定量。运用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离目的蛋白，并用半干转方法将蛋白转移至PVDF膜上，将膜置于10％的脱脂牛奶中室温封闭2h后，一抗(1:1000)于4℃孵育过夜；TBS-T缓冲液洗膜3次，5min/次，将膜置于辣根过氧化物酶偶联的二抗(1:5000)溶液中，室温孵育1h后，TBS-T缓冲液洗膜3次。采用ECL显影试剂盒将膜在凝胶成像仪中进行显影、成像，Image Lab软件对各条带的灰度值进行比较。
(3)实时荧光定量PCR检测FAM134B基因mRNA表达
采用Trizol法提取DC2.4细胞总RNA，取5～10×106个细胞，加入1ml Trizol试剂混匀，室温静置5min；加入0.2ml氯仿，振荡15s后室温静置2min，4℃离心，12000g×15min，取上清；加入0.5ml异丙醇混匀，4℃过夜。4℃离心，12000g×10min，观察RNA沉淀产生，弃上清，75％乙醇洗涤沉淀，7500g×5min，完全弃上清，晾干。RNA样本用10～20μl无酶水溶解后采用紫外分光光度计进行定量。配制逆转录体系，对RNA样本进行逆转录，加入2μg含量的RNA模板后，一次加入rRNAasin(40μ/μl,0.5μl)，Oligo(dt)15(0.5μg/μl,1μl)，MgCl2(25mM,4μl)，10×逆转录buffer(2μl)，dNTP(10mM，2μl)，AMV逆转录酶(10U/μl,1.5μl)，于PCR仪中42℃水浴1h，95℃5min灭活逆转录酶，得到cDNA。配制qPCR反应体系(SYBR GreenPCR Master Mix:10μl，3’引物(5μM)：2μl，5’引物(5μM)：2μl，稀释的cDNA:6μl)，将反应溶液置于Real-time PCR反应仪上进行PCR扩增，采用△△CT方法比较基因的相对表达差异。
引物序列如下所示：
FAM134B：正向引物：5’-GGCCTCTCACTTCCTCTCAA-3’(SEQ ID NO.1)；
反向引物：5’-GGGCTCCTTCTAGCTGGTCT-3’(SEQ ID NO.2)。β-actin：正向引物：5’-GTGGGCCGCTCTAGGCACCA-3’(SEQ ID NO.3)；
反向引物：5’-TGGCCTTAGGGTTCAGGGGG-3’(SEQ ID NO.4)。
反应过程：95℃：3min，95℃：30s，60℃：20s循环40次。
结果：免疫荧光观察转染成功(图9)，流式细胞术检测转染效率为94.26％(图10)，Western blot检测慢病毒转染后FAM134B蛋白水平显著下降(图12)，qPCR检测慢病毒转染后FAM134B基因mRNA水平显著下降(图11)，及差异具有统计学意义(*P<0.05)。
(4)DC2.4细胞表面分子CD80、CD86、MHC-II表达检测
培养干扰FAM134B表达的DC2.4细胞24h后，予以1μg/ml LPS刺激24h后观察到：FAM134B干扰病毒组DC2.4细胞表面分子CD80、CD86、MHC-II表达明显低于空载体病毒组(图13)，说明FAM134B与介导DC功能活化密切相关。
实施例3 过表达FAM134B对DC功能活化的影响
1、步骤
从Genbank中查询FAM134B基因的上下游序列，采用VectorNTI软件设计特异性扩增引物。引入酶切位点，用限制性内切酶对表达载体进行酶切，得到目的基因，制备线性化表达载体。使用T4DNA连接酶将目的基因构建入线性化表达载体中。测序验证正确的克隆，进行高纯度质粒抽提。将含过表达FAM134B的慢病毒载体转染DC2.4细胞9h后，给细胞换液，继续培养72h后获得稳定遗传的过表达FAM134B的DC2.4细胞系。按照2×106个细胞/ml的比例接种DC2.4细胞培养24h后，予以1μg/ml LPS刺激72h检测DC2.4表面分子表达情况。
2、结果
LPS刺激DC2.4细胞72h后观察到：与对照组比较CD80、CD86及MHC-II的表达水平明显降低，DC功能呈现显著抑制。而诱导FAM134B过表达后，DC表面分子CD80、CD86及MHC-II的表达较LPS刺激空载体病毒组均出现明显增高(图14)，说明提高FAM134B的表达能显著改善脓毒症持续暴露时DC功能抑制。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 中国人民解放军总医院第一附属医院
<120> FAM134B在制备治疗脓毒症的药物中的用途
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggcctctcac ttcctctcaa 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gggctccttc tagctggtct 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtgggccgct ctaggcacca 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tggccttagg gttcaggggg 20

Claims (10)

1.FAM134B在制备促进DC成熟或提高DC细胞功能活性的试剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括FAM134B激动剂；所述FAM134B激动剂包括促进FAM134B表达的试剂、促进FAM134B活性的试剂；优选地，所述促进FAM134B表达的试剂包括FAM134B过表达载体。
3.FAM134B在制备诊断脓毒症的产品中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述产品包括能够检测FAM134B表达水平的试剂；优选地，所述检测FAM134B表达水平的试剂包括检测FAM134B基因转录水平的试剂、检测FAM134B蛋白水平的试剂。
5.FAM134B在制备治疗脓毒症的药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物包括FAM134B激动剂；所述FAM134B激动剂包括促进FAM134B表达的试剂、促进FAM134B活性的试剂；优选地，所述促进FAM134B表达的试剂包括FAM134B过表达载体。
7.一种方法，所述方法包括以下方法中的任一个：
(1)促进DC细胞成熟的方法；
(1)提高DC细胞功能活性的方法；
(2)制备高活性DC细胞的方法，
其特征在于，所述方法包括施用促进FAM134B表达的试剂和/或促进FAM134B活性的试剂。
8.一种构建脓毒症小鼠的方法，其特征在于，所述方法包括施用抑制FAM134B表达的试剂、抑制FAM134B活性的试剂。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述抑制FAM134B表达的试剂包括抑制FAM134B本身的试剂、抑制调控FAM134B表达的上下游物质的表达的试剂、抑制调控FAM134B表达的上下游物质的活性的试剂。
10.一种筛选脓毒症小鼠的方法，其特征在于，所述方法包括检测小鼠DC细胞中FAM134B表达水平；与野生型小鼠相比，如果待评估小鼠DC细胞中FAM134B表达水平降低，则代表该小鼠是构建成功的脓毒症小鼠。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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US20170042883A1 (en) * 2011-12-21 2017-02-16 The Procter & Gamble Company Methods for Detecting and Treating Rhinovirus Infection
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