CN107683142A - 基于多孔硅微粒的癌症疫苗和增强抗肿瘤免疫性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了多孔硅(pSi)微粒(PSM)，其在癌症免疫治疗和分子纳米医学领域提供了重要的进展。具体地，公开了用于基于树突状细胞的疫苗组合物的基于PSM的强有力佐剂以及将其用于各种癌症免疫疗法的方法。本发明的PSM还适用于开发其它类型的疫苗，包括不一定与治疗癌症有关的疫苗，如用于治疗如下疾病的疫苗：痤疮、阿茲海默氏病、哮喘、动脉粥样硬化、自身免疫病症、自身炎性疾病、乳糜泻、结肠炎、克罗恩病、糖尿病、肾小球肾炎、感染性疾病、炎性肠病、肠易激综合征、局部缺血、狼疮、盆腔炎性疾病、再灌注损伤、类风湿性关节炎、结节病、移植排斥和相关疾病。

Description

基于多孔硅微粒的癌症疫苗和增强抗肿瘤免疫性的方法
发明背景
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年4月2日提交的美国临时专利申请第62/142,278号(待决；代理案号37182.190PV01)的优先权；其内容通过明确引用以其全文特别并入本文中。
关于联邦政府赞助的研究或开发的声明
本发明是在美国国防部(United States Department of Defense)授予的基金号W81XWH-09-1-0212和W81XWH-12-1-0414；和美国国立卫生研究院(National Institutesof Health)授予的基金号U54-CA143837和U54-CA151668的政府支持下完成的。政府在这项发明中有一定的权利。
联合研究协议参与方的名字
不适用。
技术领域
本公开涉及分子生物学、肿瘤学和纳米医学的领域。多孔硅微粒已被开发用于各种治疗适应症。在特定的实施方式中，这些组合物用作强有力的佐剂来促进癌症疫苗的开发。此外，还提供了用于在受影响的哺乳动物中提高抗原交叉呈递、诱导哺乳动物I型干扰素特异性细胞应答和治疗多种癌症和肿瘤的方法和药剂。
相关技术的描述
癌症免疫疗法试图增强或恢复免疫功能来有效地识别与异常细胞相关的抗原。这些基于免疫疗法的方法的范围是广泛的，并且包括刺激被动免疫应答的细胞因子递送(Wayteck等人,2013；Jaime-Ramirez等人,2011)；离体刺激自体免疫细胞，随后将其施用给患者(Phan等人,2013)；使用毒性化疗佐剂来刺激免疫应答(Wan等人,2012)；抗体介导的疗法(Lan等人,2013)以及由抗原与明矾、乳液、脂质体、免疫刺激复合物(Audibert,2003)或聚合物纳米粒子(Craparo和Bondi,2012)的组合组成的制剂。
认为用作持续抗原释放的储库的疫苗佐剂明矾诱导细胞毒性作用，从而引起尿酸释放和向注射位点募集免疫细胞(Kool等人,2008)。明矾有利于T辅助细胞2(Th2)免疫应答，其诱导B细胞产生中和抗体(Rimaniol等人,2007；Mori等人,2012；Brewer,2006)。然而，有效的癌症免疫疗法需要Th1细胞因子来阻止肿瘤生长，特别是IFN-γ和TNF-α(Braumuller等人,2013)。
类似于明矾，阳离子脂质体具有固有的细胞毒性，从而诱导细胞死亡并刺激免疫细胞浸润至注射位点或积聚。与依靠表面吸收来结合MPL的明矾相比，脂质体将MPL并入到脂质双层中。以前，据报道，不同于等效剂量的游离MPL，MPL-脂质体抑制乳癌的4T1免疫活性鼠模型中的肿瘤生长(Meraz等人,2014)。除募集和活化免疫细胞外，还提出阳离子脂质体引起肿瘤细胞损伤而释放内源肿瘤抗原，从而引导针对癌细胞的免疫应答。
大量内源肿瘤抗原产生用于免疫识别的一系列表位。Yan等人(2007)展示了阳离子脂质体的辅助作用，其通过微阵列mRNA分析显示DOTAP脂质体上调了树突状细胞(DC)中的趋化因子(包括CCL2、CCL3和CCL4)。将胆固醇并入阳离子脂质体的双层中也提高了其辅助作用(Barnier-Quer等人,2013)。先前显示，使用多孔硅微粒，吸附的MPL的粒子呈递增加了DC的粒子摄取；共刺激和主要组织相容性复合体(MHC)I类和II类分子的DC表达增加；DC向引流淋巴结的迁移增加；和呈递卵白蛋白肽序列的DC与来自OT-1小鼠的T细胞之间的关联增加(Meraz等人,2012)。
设计成用于提高对抗原的免疫应答的基于铝的佐剂在20世纪20年代引入，并且91年后，其仍然是疫苗中使用的标准佐剂。关于基于纳米粒子的新型疫苗的研究正在不断增加，其优势在于将佐剂与抗原组合在单一实体中。这些粒子被抗原呈递细胞(APC)快速内化，运输至淋巴组织以呈递给淋巴细胞。
发明内容
本发明通过在一般意义上提供用于各种诊断和治疗适应症的中孔硅粒子克服了本领域中的这些和其它固有限制。在说明性实施方式中，已经描述了用作佐剂和用作抗癌免疫的疫苗的pSi微粒。
在特定的实施方式中，本公开提供了作为用于基于细胞(并且特别是基于哺乳动物树突状细胞)的疫苗的强有力佐剂的多孔硅(pSi)微粒(PSM)。这些佐剂特别适用于制备用于治疗哺乳动物的一种或多种疾病、病症、缺乏症、功能障碍或缺陷，并且特别适用于治疗和/或改善哺乳动物癌症(如人类肿瘤)的一种或多种症状的药剂，如疫苗。本文公开的PSM特别适用于各种体外、离体和体内治疗方案，并且其可以单独配制或者与一种或多种其它试剂组合配制来用于各种治疗适应症，包括(但不限于)用于治疗或改善一种或多种人类癌症或其它过度增生性病症的症状，所述一种或多种其它试剂包括(但不限于)一种或多种肿瘤抗原、一种或多种抗原肽、一种或多种诊断剂、一种或多种治疗剂、一种或多种细胞毒性剂、一种或多种化疗剂或其任意组合。
本文公开的PSM可以根据以下实施例中所述的一种或多种方法制备，并且在说明性实施方式中，可以在临床实验室中与来自患者的树突状细胞一起温育，使得这些细胞接着被注射回患者体内，在患者体内，其刺激或以其它方式引起患者体内细胞毒性T细胞的产生，从而促进原位杀死肿瘤细胞的过程。
以类似的方式，PSM也可以用一种或多种特异性针对特定靶标疾病的抗原进行非原位包装，接着与来自患者的树突状细胞一起温育，接着将其注射回患者中来刺激或以其它方式在患者体内引起免疫应答，从而帮助身体防御特定的靶标疾病。
或者，可以将PSM组合物直接注射在患者中，而不与树突状细胞在体外一起进行温育，来增强免疫应答。
如本文所述，PSM还可以任选地包括一种或多种活性剂，如一种或多种预防剂、一种或多种治疗剂、一种或多种诊断剂、一种或多种疫苗、一种或多种成像剂、一种或多种放射性标记、一种或多种辅助剂、一种或多种化疗剂、一种或多种细胞毒性剂或其任意组合，其被并入PSM中或并在PSM周围或与PSM一起配制在药物制剂中以共同施用至患者。
在相关实施方式中，本发明还提供治疗和/或诊断试剂盒，其包括一种或多种通常与如下物质组合的本文所公开的基于PSM的佐剂或疫苗组合物：一种或多种药学上可接受的运载体、一个或多个用于向目标受试者施用所述组合物的装置以及用于使用组合物预防、诊断或治疗哺乳动物病状、疾病、病症、创伤和/或功能障碍(包括(但不限于)一种或多种癌症等)的一套或多套说明书。
本发明还在整体和一般意义上提供了用于向哺乳动物树突状细胞提供活性剂的方法，其包含向受试者施用有效量的一种或多种本文所公开的PSM组合物。在某些实施方式中，受试者具有患一种或多种异常病状的风险，被诊断为患有或怀疑患有一种或多种异常病状，所述异常病状包括例如一种或多种癌症或其它过度增生性病症。
如本文所述，本发明的载有PSM-抗原的疫苗组合物还可以任选地包括一种或多种其它治疗剂、诊断剂、成像剂或其组合。
在另一个实施方式中，本公开还提供一种用于向有需要的哺乳动物受试者的一个或多个细胞、组织、器官或系统施用活性剂的方法。所述方法通常涉及以一定量和时间向有需要的哺乳动物受试者提供一种或多种本文所公开的组合物，来有效地向受试者体内或体周的一个或多个所选组织、器官、系统或细胞施用具有PSM群的活性剂。在特别优选的实施方式中，受试者是人类，并且组合物包含第一阶段粒子，所述第一阶段粒子被改适并配置成定位于活性剂所施用至的人类患者的体内或体周的第一目标位点。
如本文所述，可以通过任何一种或多种常规给药方法将本公开组合物施用至受试者，所述常规方法包括(但不限于)口服、鼻内、静脉内、皮下或直接注射至受试者体内或体周的一个或多个细胞或一个或多个组织。
如本文进一步描述，在某些应用中，可能需要使从受试者获得的细胞群与PSM组合物离体接触，接着将所得接触过的细胞再引入受试者体内。预期这种离体疗法特别适用于将所公开的PSM引入人类树突状细胞群，这使得活性成分与细胞接触，接着将所得细胞再引入动物体内。优选地，被提取用于这种离体操作的细胞是正在治疗的实际患者的细胞。
在特定的实施方式中，本发明的PSM组合物可以被配制用于药物施用，并且优选施用至人类。这些组合物还可以包括一种或多种其它治疗剂、化学治疗、佐剂或不同的第二PSM群。
附图说明
为了促进对本发明的原理的理解，现在将参考附图中所说明的实施方式或实施例，并且将使用特定的语言来描述所述实施方式或实施例。然而，应理解，并不意欲因此限制本发明的范畴。所描述的实施方式中的任何改变和其它修改以及如本文所述的本发明的原理的任何其它应用都被认为是本发明所属领域的普通技术人员通常会想到的。
以下附图形成本说明书的一部分，并被包括在内以展现本发明的某些方面。如果申请中含有一个或多个以彩色绘制的附图，则通过要求和支付必要的费用后，将由美国专利和商标局(the United States Patent and Trademark Office)提供具有彩色附图的本专利或专利申请公开的复印件。通过参考以下描述并结合附图可以更充分地理解本发明，其中相同的参考数字表示相同的要素，并且其中：
图1A、图1B、图1C、图1D、图1E、图1F和图1G显示PSM负载的抗原通过吞噬作用和巨胞饮作用被树突细胞(DC)有效内化。图1A显示内化载有卵白蛋白-异硫氰酸荧光素(OVA-FITC)纳米脂质体的PSM粒子的DC的代表性显微镜视图。上图，DC2.4细胞；下图，骨髓衍生的树突状细胞(BMDC)。比例尺，25μm。图1B是代表性的透射电子显微术(TEM)图像，其显示DC内的PSM/OVA粒子周围的多孔结构。上图放大倍数＝5,000×；下图放大倍数＝50,000×。上图的比例尺＝4μm；下图比例尺＝0.5μm。图1C显示在存在吞噬抑制剂细胞松弛素D的情况下PSM/FITC-OVA的DC摄取。图1D显示在存在巨胞饮抑制剂阿米洛利的情况下PSM/FITC-OVA的DC摄取。图1E显示与用不同浓度的可溶性OVA或PSM/OVA预处理3小时的DC共温育后，B3Z细胞的IL-2产生。图1F显示与用50μg/mL可溶性OVA或PSM/OVA激发的DC共温育接着在不同时间点固定后，B3Z细胞的IL-2产生。图1G显示与DC共温育后B3Z细胞的IL-2产生。在用5μg/mL可溶性肽或PSM/肽激发后，将DC充分洗涤，并且立即与B3Z细胞共温育(0小时)，或培养18至30小时，接着进行T细胞共温育；数据以平均值±S.D.的形式呈现；*，P<0.05，**，P<0.01；(还参见图7A-图7E)；
图2A、图2B和图2C显示PSM负载的OVA的抗原呈递。图2A说明了抗原的亚细胞转运。将DC与PSM/FITC-OVA一起温育0.5小时，接着充分洗涤以去除未结合的粒子。将细胞再培养0.5小时、1小时、3小时或6小时，接着固定，然后用识别特定细胞器的抗体(对于早期核内体为EEA1；对于晚期核内体为Rab7；对于再循环核内体为TR；并且对于ER为KDEL)免疫染色。比例尺＝25μm。图2B显示在蛋白酶体抑制剂MG-132和环氧霉素、或溶酶体抑制剂亮肽素存在下与用100μg/mL OVA或PSM/OVA处理的DC共温育后，B3Z细胞的IL-2产生。肽I(100ng/mL)用作阳性对照。图2C显示BMDC的OVA交叉呈递。将BMDC与OVA或PSM/OVA一起温育16小时，接着收获并用识别DC的抗CD11c抗体和识别DC表面上的OVA257-264/H-2Kb复合物的25D1.16抗体标记。以红色数字显示DC中25D1.16染色阳性群体的百分比。数据以平均值±S.D.的形式呈现；*，P<0.05，**，P<0.01(还参见图8A、图8B和图8C)；
图3A、图3B、图3C和图3D显示DC中PSM诱导的IFN-I信号传导。图3A显示与PSM、游离抗原或PSM/抗原一起温育后24小时，BMDC的培养基中促炎性细胞因子的蛋白水平。细胞培养基作为阴性对照。图3B显示与PSM一起温育后24小时BMDC表面上的共刺激分子的表达模式。图3C是与PSM、游离抗原或PSM/OVA抗原共温育后5小时BMDC中Ifn-α4和Ifn-β基因的mRNA水平的QPCR分析。图3D显示与PSM一起温育后24小时BMDC的细胞培养基中蛋白质IFN-β和RANTES的ELISA测定法。数据以平均值±S.D.的形式呈现；*，P<0.05，**，P<0.01(还参见图9A和图9B)；
图4A、图4B、图4C、图4D、图4E、图4F、图4G、图4H、图4I和图4J显示TRIF和MAVS介导的PSM诱导的干扰素I型(IFN-I)活化。图4A、图4B、图4C和图4D说明在感染携带靶向所示基因的shRNA的慢病毒的BMDC中，PSM诱导的Ifn-α4和Ifn-β基因表达的变化。图4E、图4F、图4G和图4H说明在从野生型或基因敲除小鼠分离的BMDC中，PSM诱导的Ifn-α4和Ifn-β基因表达的变化。图4I显示从野生型或基因敲除小鼠分离的BMDC中PSM诱导的RANTES产生。图4J是介导IFN-I活化的PSM诱导的信号传导通路的示意图。数据以平均值±S.D.的形式呈现；*，P<0.05，**，P<0.01；(还参见图10A、图10B、图10C、图10D、图10E和图10F)；
图5A、图5B、图5C、图5D、图5E、图5F和图5G显示PSM/HER2DC疫苗抑制小鼠乳腺肿瘤生长。图5A显示原发性TUBO肿瘤生长的抑制。将TUBO细胞接种到乳腺脂肪垫中。4天后，用PBS、PSM、PSM/p66、DC+p66或DC+PSM/p66静脉内处理小鼠(n＝8只/组)，并且在接下来的4周中监视肿瘤生长。肿瘤体积以平均值±SEM的形式呈现。图5B显示进行不同处理的BALB-neuT小鼠中的肿瘤多样性。将BALB-neuT转基因小鼠分成三组(n＝5)，并且用所指示药剂静脉内处理两次(第6周和第8周)；每周对每只小鼠的肿瘤结节数进行计数。图5C、图5D和图5E显示来自不同处理组的肿瘤组织中IFN-I、促炎性细胞因子和细胞毒性T细胞标志物的mRNA水平的定量RT-PCR测量。图5F和图5G显示经历不同处理的小鼠的肿瘤内细胞因子水平的ELISA测量。除肿瘤体积外，数据以平均值±S.D.形式呈现；*，P<0.05，**，P<0.01(还参见图11A-图11F)；
图6A、图6B、图6C、图6D、图6E和图6F显示用PSM/HER2激发的DC引发CD8T细胞介导的抗肿瘤免疫。图6A是来自处理后BALB/c小鼠的TUBO肿瘤组织中MHCII蛋白水平的蛋白质印迹分析。处理后10天收获肿瘤组织。图6B显示来自处理后BALB/c小鼠的TUBO肿瘤组织中MHCII的免疫组织化学染色；比例尺＝100μm。图6C显示来自处理后BALB/c小鼠的TUBO肿瘤组织中CD11c和CD34(血管标志物)的免疫荧光染色；比例尺＝50μm。图6D显示从处理后TUBO肿瘤组织分离的CD11c和MHCII双阳性细胞的流式细胞术分析。各样品中CD11c和MHCII双阳性细胞的百分比用红色标记。图6E说明处理后TUBO肿瘤中增加的HER2特异性CD8T细胞。在左图中，显示了处理后肿瘤组织中CD8和p66-五聚体阳性肿瘤浸润淋巴细胞的流式细胞术分析。在右图中，提供了肿瘤浸润淋巴细胞中p66-五聚体阳性CD8T细胞的百分比的定量。图6F说明免疫细胞耗减(depletion)对DC+PSM/p66处理抑制TUBO肿瘤生长的作用。用同种型对照抗体、抗CD4抗体、抗CD8抗体或氯膦酸二钠脂质体(clodrosome)处理接种了TUBO肿瘤的BALB/c小鼠(n＝8只/组)以耗减特定的细胞类型。接着用DC+PSM/p66处理小鼠，并且在接下来的4周中监视肿瘤生长。肿瘤体积以平均值±SEM的形式呈现；除肿瘤体积以外，数据以平均值±S.D.的形式呈现；*，P<0.05，**，P<0.01；
图7A、图7B、图7C、图7D和图7E展示PSM增强了DC中的抗原呈递。图7A是说明DC疫苗中的组分的漫画。将抗原封装到脂质体中并负载到PSM粒子中，接着通过DC将其内化。图7B显示与用不同浓度的可溶性OVA或PSM/OVA预处理的DC共温育后，B3Z细胞的IL-2产生。将DC与OVA或PSM/OVA一起温育3小时，充分洗涤(不固定)，接着与B3Z细胞共温育18小时。通过ELISA测量细胞培养基中的IL-2水平。数据以平均值±S.D.的形式呈现。图7C显示与用可溶性OVA、脂质体OVA或负载到不同尺寸的PSM粒子中的OVA预处理的DC共温育后，B3Z细胞的IL-2产生。用100μg/mL OVA、脂质体OVA或PSM/OVA预处理DC三小时，接着固定并且充分洗涤，然后与B3Z细胞共温育。通过ELISA测量培养基中的IL-2水平。数据以平均值±S.D.的形式呈现。图7D显示PSM/抗原的细胞间转移。将DC2.4细胞与载有FITC-OVA的PSM一起温育1小时。将未结合的粒子洗掉，并且将内化有荧光PSM/FITC-OVA的DC添加到预先接种的DC2.4细胞培养物中。在荧光显微镜下通过每隔8min视频记录来追踪粒子运动。显示从一个细胞转移到相邻细胞的粒子的快照。图7E显示PSM/抗原在体内从注射的DC释放。将BMDC与PSM/FITC-OVA一起温育1小时。充分清洗以去除游离粒子后，用CellTrackerTM红染料标记DC，并静脉内注射到小鼠中。注射后24小时收获动物组织，加工冷冻切片并通过荧光显微术检验。在这个肺组织切片中，一些绿色荧光PSM/FITC-OVA粒子从红色DC中分离；比例尺＝20μm；
图8A、图8B和图8C显示DC中PSM/抗原的交叉呈递。图8A说明与用OVA、PSM/OVA或肽I(OVA 257-264，100ng/mL)预处理的WT或TAP-/-DC共温育后，B3Z细胞的IL-2产生。**，P<0.01。图8B显示与用OVA、PSM/OVA或肽II(OVA 323-339，100ng/mL)预处理的WT或TAP-/-DC共温育后，DOBW细胞的IL-2产生。数据以平均值±S.D.的形式呈现。图8C是显示PSM/抗原内化、抗原加工和从DC向CD8T细胞的呈递的示意图；
图9A和图9B显示PSM不诱导DC中的促炎性应答。图9A是与PSM或明矾共温育后4小时，来自BMDC的IL-1β释放的定量。用50ng/mL LPS激发BMDC过夜，接着与粒子共温育。数据以平均值±S.D.的形式呈现；*，P<0.05。图9B说明与所指示药剂一起温育后3小时，BMDC中促炎性细胞因子的mRNA水平的定量。数据以平均值±S.D.的形式呈现；
图10A、图10B、图10C、图10D、图10E和图10F显示DC中PSM诱导的IFN-I信号传导的活化。图10A显示来自用LPS(TLR4配体，200ng/mL)、CpG(TLR9配体，1μg/mL)或poly I:C(TLR3配体，20μg/mL)处理后18小时的WT、Tlr4-/-、Tlr9-/-和Tlr3-/-小鼠的BMDC的TNF-α和IL-6产生的定量。数据以平均值±S.D.的形式呈现；**，P<0.01。图10B显示BMDC中PSM诱导的的Ifn-α4和Ifn-β基因表达不受TLR缺乏影响。将从野生型或敲除小鼠分离的BMDC与PSM共温育，并且收获细胞来进行IFN-I基因表达分析。图10C、图10D和图10E显示用化学抑制剂预处理的BMDC中PSM诱导的Ifn-α4和Ifn-β基因表达。Cyto-D(细胞松弛素D)是吞噬抑制剂；LY-294002是PI3K抑制剂；并且BX-795是IKKi/TBK1的抑制剂。图10F显示在用仅培养基、抗原(Ag)、PSM或PSM/抗原处理后的DC中先天免疫信号传导通路的活化状态的蛋白质印迹分析；
图11A、图11B、图11C、图11D、图11E和图11F显示PSM/抗原激发的DC疫苗刺激肿瘤内免疫并且抑制肿瘤生长。图11A是用所指示药剂处理后具有TUBO肿瘤的小鼠(n＝8只/组)的开普兰-迈耶存活曲线。这个研究对应于图5A中的结果。图11B显示用PBS、仅DC或DC+PSM/TRP2处理的小鼠(n＝8只/组)中的TUBO肿瘤生长。将TUBO细胞接种在BALB/c小鼠的乳腺脂肪垫中(每只小鼠0.5×106个细胞)。四天后，用PBS、仅DC或用PSM/TRP-2激发的DC静脉内处理小鼠。在接下来的4周中记录肿瘤尺寸。肿瘤体积以平均值±SEM的形式呈现。图11C说明不同处理组中肿瘤内抗原特异性CD8T细胞的百分比。用所指示药剂处理具有TUBO肿瘤的BALB/c小鼠。处理后10天收获肿瘤，并且加工获得单细胞。接着用HER2p66五聚体和抗CD8抗体将其染色并且通过流式细胞术分析。p66特异性CD8T细胞在总肿瘤内CD8T细胞中的百分比以红色显示。图11D显示处理后动物(n＝5只/组)中无肿瘤小鼠的百分比；这个研究对应于图5B中的结果。图11E是用所指示药剂处理后10天分离的肿瘤组织中Foxp3mRNA水平的定量RT-PCR分析。数据以平均值±S.D.的形式呈现；*，P<0.05。图11F是原发性肿瘤细胞培养物上清液中IL-4水平的ELISA结果。处理后10天，从不同组的肿瘤获得细胞。数据以平均值±S.D.的形式呈现；n.s.＝统计上不显著；
图12A和图12B是多孔硅微粒(PSM)的扫描电子显微术(SEM)影像。PSM是生物相容的无毒“小片样”微粒，其被工程化成平均直径在约1.0μm至约3.5μm之间并且平均厚度在约0.2μm至约0.7μm之间。PSM可以用3-氨基丙基-三乙氧基硅烷(APTES)进行表面修饰以进一步增强其稳定性。未修饰的PSM在几小时内溶解于水中，而APTES偶联的PSM保持完整长达3周；
图13显示由PSM促进的有效抗原呈递和抗原特异性T细胞的活化。使用体外抗原呈递测定法在DC中评估T细胞对与脂质体卵白蛋白混合的PSM(与lipo-OVA混合的PSM)或载有脂质体OVA的PSM(载有lipo-OVA的PSM)的抗原交叉呈递的应答。用药剂脉冲DC，接着与OVA特异性B3Z CDS T细胞共温育。用鼠科IL-2特异性ELISA试剂盒测量卵白蛋白特异性CDS T细胞的IL-2分泌。结果指示简单混合PSM与脂质体OVA与载有OVA的PSM在刺激IL-2分泌方面一样有效；
图14A、图14B、图14C和图14D显示在多种抗原中与单独的PSM、单独的抗原或培养基对照相比，PSM+抗原的相对表达；
图15A、图15B、图15C、图15D、图15E、图15F、图15G和图15H显示在多种抗原中与培养基对照相比，单独的PSM的相对表达；
图16显示与DC+666、PSM+p66或单独PSM或培养基对照相比，DC+PSM/p66的肿瘤体积(mm3)随时间的变化；
图17显示PSM增强Toll样受体9激动剂CpG和STING配体cGAMP的佐剂活性。PSM与CpG和cGAMP协同活化树突状细胞。将骨髓衍生的树突状细胞与仅培养基、游离卵白蛋白抗原(OVA)、含Toll样受体9激动剂CpG和STING配体cGAMP的游离OVA(CpG+cGAMP+OVA)、封装在DOPC脂质体中的试剂(Lipo/OVA、Lipo/CpG+OVA、Lipo/cGAMP+OVA、LIPO/CpG+cGAMP+OVA)或封装在DOPC脂质体中并且与PSM混合的试剂(PSM/OVA、PSM/CpG+OVA、PSM/cGAMP+OVA、PSM/CpG+cGAMP+OVA)一起温育。接着将树突状细胞与OVA特异性CD8+T细胞一起温育，并且测量来自被刺激的T细胞的IL-2分泌。卵白蛋白I类抗原肽(OT-I)作为研究的阳性对照。相较于Lipo/CpG+cGAMP+OVA处理组，在PSM/CpG+cGAMP+OVA处理组中检测到显著增加的IL-2表达水平；
图18A和图18B显示PSM提高抗体产生。通过腹膜内注射如下物质来处理野生型小鼠：磷酸盐缓冲盐水对照(PBS)；与以下物质混合的PSM：1)脂质体OVA(PSM/OVA)、2)脂质体CpG和OVA(PSM+CpG+OVA)、3)脂质体cGAMP和OVA(PSM+cGAMP+OVA)、4)脂质体CpG和cGAMP和OVA(PSM/CpG+cGAMP+OVA)；或与OVA混合的氧化铝微粒(明矾+OVA)。在1周、2周和3周后测量血浆OVA特异性抗体水平。显示第3周样品的IgG2a(图18A)和IgG2b(图18B)滴度数据。第1周和第2周两者的样品趋势是相同的。明矾作为研究的阳性对照，因为其通常用作基于抗体的疫苗的佐剂。结果指示，PSM与CpG和cGAMP协同作用于抗体产生；
图19A、图19B、图19C、图19D和图19E显示PSM与CpG和cGAMP协同作用于记忆T细胞产生。用树突状细胞处理具有HER2阳性TUBO肿瘤的BALB/c小鼠，所述树突状细胞用以下物质脉冲：PBS对照(图19A)；与脂质体p66抗原混合的PSM(PSM/p66)(图19B)；与脂质体CpG+p66混合的PSM(PSM/CpG+p66)(图19C)；与cGAMP+p66混合的PSM(PSM/cGAMP+p66)(图19D)；或与CpG+cGAMP+p66混合的PSM(PSM/CpG+cGAMP+p66)(图19E)。免疫接种后6周使小鼠安乐死，从肿瘤组织分离单细胞并针对CD44A阳性记忆T细胞进行分析。结果显示相较于其它组，用PSM/CpG+cGAMP+p66处理的小鼠的记忆T细胞水平显著增加；
图20显示在用PSM/(CpG+cGAMP+WNV)处理的野生型小鼠中针对西尼罗病毒蛋白刺激抗体产生；并且
图21显示纳米疫苗处理抑制HER2阳性乳腺癌。向BALB/c小鼠接种表达HER2的TUBO肿瘤。当肿瘤尺寸达到100mm3时，向小鼠接种所指示的疫苗一次，并且7天后接种另一次。
序列的简要说明：
SEQ ID NO:1是根据本公开的一个方面使用的示例性肽。
SEQ ID NO:2是根据本公开的一个方面使用的示例性肽。
具体实施方式
本发明的说明性实施方式描述如下。为了清楚起见，在本说明书中未描述实际实施方案的所有特征。当然应了解，在任何这种实际实施方式的开发中，必须做出许多特定针对具体实施方案的决定来实现开发者的特定目标，如符合系统相关和商业相关的约束，所述决定将在一个实施方案与另一个实施方案之间变化。此外，应了解，这种开发工作可能是复杂且耗时的，但是对于受益于本公开的本领域的普通技术人员而言，这将是常规工作。
癌症免疫疗法近来获得了高度的关注，这部分得益于美国食品和药物管理局(theUnited States Food and Drug Administration；FDA)最近批准了用于转移性前列腺癌的基于树突状细胞的疗法(思普路塞-T(sipuleucel-T)；DendreonCorp.Seattle,WA,USA)和用于晚期癌症治疗的基于检查点阻断抗体的临床疗法[例如抗CTLA4(伊匹单抗(ipilimumab)、和纳武单抗(nivolumab)、Bristol-Myers Squibb,Princeton,NJ,USA)和抗PD1抗体(MK-3475、派姆单抗(pembrolizumab)、Merck Oncology,Whitehouse Junction,NJ,USA)](参见例如Hodi等人,2010；Postow等人,2015；Sharma等人,2011)。尽管取得了这些进展，但由于多种因素，如低效疫苗递送、肿瘤组织中抗原交叉呈递缺陷、抑制性免疫细胞(包括调节性T细胞(Treg)和骨髓衍生的抑制性细胞(MDSC))的浸润和免疫抑制性细胞因子环境，对于癌症免疫疗法的完全反应在临床上仍然很少(Dougan和Dranoff,2009)。预期逆转免疫抑制性肿瘤微环境的方法对癌症免疫疗法具有显着影响(Gajewski等人,2013b)。
先天免疫是肿瘤免疫的主要组成部分，并且通过识别肿瘤抗原和来自肿瘤细胞的危险信号适当地活化先天免疫细胞确保了对癌症的有效适应性免疫(Dougan和Dranoff,2009)。因此，可以靶向桥接先天免疫与适应性免疫的因素以进行癌症免疫疗法。树突状细胞(DC)是通过对抗原进行检验和加工来呈递给T细胞的专业抗原呈递细胞，并且抗原呈递过程通常需要亚细胞抗原递送和先天免疫信号传导。先前已报道，I类抗原在早期核内体中被加工，并且与抗原加工相关的转运蛋白的适当再定位需要Toll样受体4(TLR4)-MyD88活性(Burgdorf等人,2008)。然而，该研究针对可溶性抗原交叉呈递进行；是否可以将相同的机制应用于其它形式的抗原(如粒子抗原)仍然是未知的。
先天免疫刺激(如TLR配体)通常用作提高基于DC的免疫应答的免疫佐剂(Coffman等人,2010)。TLR活化刺激下游通路，如NF-κB信号传导和用于促炎性细胞因子诱导的MAPK信号传导(Kawai和Akira,2011)。这些细胞因子将进一步诱导抗原呈递分子的表达和易位并促进抗原加工。讽刺的是，过强的TLR刺激可能诱导有害的炎性应答(Spaner等人,2008)，这一事实阻止了其在临床中的使用。除炎性细胞因子以外，I型干扰素(IFN-I)还促进DC成熟、抗原交叉呈递和CD8T细胞克隆扩增(Coffman等人,2010；Le Bon和Tough,2008)。此外，最近的研究报道了IFN-I在抗肿瘤免疫中的关键作用，其通过再活化肿瘤内DC中的交叉呈递功能实现(Yang等人,2014)。
抗原和佐剂的物理性质可能有助于其免疫-刺激功能。抗原或佐剂的尺寸、形状和表面特征对其免疫原性具有显着影响(Bachmann和Jennings,2010)。粒子抗原疫苗可以通过充当抗原储库并保护抗原免于酶降解来提供优于可溶性抗原疫苗的优点，使得能够向特定免疫器官和细胞类型进行靶向递送并通过所要通路以受控的释放速率来刺激抗原呈递(Paulis等人,2013)。例如，明矾佐剂和许多纳米尺寸晶体结构可活化炎性小体并促进DC中IL-1β的释放，这可能促进DC的抗原呈递功能并增强免疫应答(Sharp等人，2009)。尽管如此，这些粒子的作用机制仍未被充分了解。
微米和纳米尺寸的粒子近年来已成为受欢迎的癌症疫苗佐剂的候选者。然而，这些粒子提高免疫应答的机制仍不清楚。
多孔硅微粒(PSM)是微米尺寸的盘形硅粒子，其含有可以运载纳米尺寸药物的纳米孔，并且已经用于递送小分子药物和其它癌症治疗剂(Chen等人,2014；Dave等人,2014；Shen等人,2013a；Xu等人,2013)。这种药物运载体是可降解的和生物相容的，并且可以通过表面化学修饰来调整负载物的释放速率(Shen等人,2013b；Tanaka等人,2010；Xu等人,2013)。在本文中，检查了PSM作为癌症疫苗佐剂的潜力。纳米孔内负载有脂质体抗原的PSM被DC有效内化，并被运输至早期核内体以进行有效交叉呈递。值得注意地，吞噬PSM在DC中诱导I型干扰素应答。此外，用PSM负载的HER2抗原肽激发的DC通过刺激基质细胞MHCII表达、Th1细胞因子产生和肿瘤内CD8T细胞细胞毒性而抑制老鼠中过表达HER2的乳腺肿瘤的生长。因此，PSM通过改善交叉呈递和调节局部免疫微环境代表了基于DC的免疫疗法的新佐剂。
示例性定义
根据本发明，多核苷酸、核酸区段、核酸序列等包括但不限于DNA(包括(但不限于)基因组或基因组外DNA)、基因、肽核酸(PNA)RNA(包括(但不限于)rRNA、mRNA和tRNA)、核苷和适合的核酸区段，其从天然来源获得、经化学合成、被修饰或以其它方式完全或部分通过人工制备或合成。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。以下参考文献向本领域的技术人员提供了本发明中使用的许多术语的通用定义：生物化学和分子生物学词典(Dictionary of Biochemistry andMolecular Biology),(第2版)J.Stenesh(编),Wiley-Interscience(1989)；微生物学和分子生物学词典(Dictionary of Microbiology and Molecular Biology)(第3版),P.Singleton和D.Sainsbury(编),Wiley-Interscience(2007)；钱伯斯科学技术词典(Chambers Dictionary of Science and Technology)(第2版),P.Walker(编),Chambers(2007)；遗传学专业词典(Glossary of Genetics)(第5版),R.Rieger等人(编),Springer-Verlag(1991)；和哈珀柯林斯生物学词典(The HarperCollins Dictionary of Biology),W.G.Hale和J.P.Margham(编),HarperCollins(1991)。
尽管类似或等效于本文所述的任何方法和组合物可以用于实践或测试本发明，但本文描述优选的方法和组合物。出于本发明的目的，下文为了清晰明了和便于参考而定义以下术语：
根据专利法的长期惯例，在本申请中、包括权利要求书中使用时，不带具体数量的指称表示“一或多”。
如本文所用，术语“约”和“近似”可互换，并且通常应该被理解为是指给定数字周围的数字的范围，以及所述数字范围内的所有数字(例如，除非另外说明，否则“约5至15”是指“约5至约15”)。此外，本文中的所有数值范围应被理解为包括该范围内的每个整数。
如本文所用，“抗原性多肽”或“免疫原性多肽”是当引入脊椎动物时与脊椎动物的免疫系统分子反应(即是抗原性的)和/或在脊椎动物中诱导免疫应答(即是免疫原性的)的多肽。
“生物相容性”是指如下材料，其在暴露于活细胞时将支持细胞的适当细胞活性，而不会在细胞中引起不良作用，如细胞的生命周期改变、细胞的增殖速率改变或细胞毒性作用。
如本文所用，术语“缓冲剂”包括一种或多种组合物或其水溶液，在将酸或碱添加到包括所述缓冲剂的溶液或组合物中时，所述缓冲剂抵抗pH的波动。这种对pH变化的抵抗力是由于这些溶液的缓冲性质，并且可以是组合物中包括的一种或多种具体化合物的功能。因此，展现缓冲活性的溶液或其它组合物被称为缓冲剂或缓冲溶液。缓冲剂通常不具有维持溶液或组合物的pH的无限能力；相反，其通常能够将pH维持在一定范围内，例如约5至7的pH。
如本文所用，术语“运载体”旨在包括任何溶剂、分散介质、包衣、稀释剂、缓冲剂、等渗剂、溶液、悬液、胶体、惰性物质等或其组合，其对于施用至相关动物是在药学上可接受的或对于治疗或诊断目的是可接受的，如果适用的话。
如本文所用，术语“DNA区段”是指已经分离的不含特定物种的总基因组DNA的DNA分子。因此，使用本文所公开的一种组合物从生物样品获得的DNA区段是指从获得其的特定物种的总基因组DNA中分离或纯化的一个或多个DNA区段。DNA区段和这些区段的较小片段以及重组载体，包括例如质粒、粘粒、噬菌体、病毒等包括在术语“DNA区段”内。
如本文所用，术语“有效量”是指能够治疗或改善疾病或病状或以其它方式能够产生预期治疗效果的量。
如本文所用，术语“表位”是指给定的免疫原性物质的部分，所述部分是宿主免疫系统的抗体或细胞表面受体的靶标，即被所述抗体或细胞表面受体结合，如通过本领域中已知的的任何方法所测定，所述宿主免疫系统对所述给定的免疫原性物质发起了免疫应答。此外，表位可以定义为在动物中引起抗体应答或诱导T细胞应答的免疫原性物质的部分，如通过本领域可用的任何方法测定(参见例如Geysen等人,1984)。表位可以是任何免疫原性物质如蛋白质、多核苷酸、多糖、有机或无机化学物质或其任何意合的部分。术语“表位”还可以与“抗原决定簇”或“抗原决定簇位点”互换使用。
如本文所用，术语“例如”仅以实例方式使用而不欲是限制性的，并且不应该被理解为仅指说明书中明确列举的那些项目。
如本文所用，术语“同源性”是指两个多核苷酸或多肽序列之间的互补程度。当第一核酸或氨基酸序列具有与第二核酸或氨基酸序列完全相同的一级序列时，词语“同一性”可以代替词语“同源性”。序列同源性和序列同一性可以通过使用本领域已知的算法和计算机程序分析两个或超过两个序列来确定。可以使用这些方法评估给定的序列是否与另一所选序列具有同一性或同源性。
如本文所用，当提及多肽或多核苷酸时，“同源的”是指具有相同的基本结构的序列，尽管来自不同起源。通常，同源蛋白质来源于密切相关的遗传序列或基因。相比之下，“同功(analogous)”多肽是与来自不同物种或生物体的多肽具有相同功能但具有显着不同的形式来完成该功能的多肽。同功蛋白质通常来源于不密切相关的基因。
如本文所用，短语“需要治疗”是指护理者(如医师或兽医)做出判断患者需要(或将以一种或多种方式受益于)治疗。这种判断可以基于护理者专业知识范围内的各种因素进行，并且可以包括患者生病是因为如下疾病状态的知识，所述疾病状态可以通过一种或多种化合物或药物组合物、如本文阐述的化合物或药物组合物治疗。
在两个或超过两个肽序列的情况下，术语“相同”或“同一性”百分比是指两个或超过两个序列或子序列在比较和比对以在比较窗内获得最大一致性时相同或具有指定百分比的相同氨基酸残基，如使用序列比较算法或通过手动比对和目测检查来测量。
短语“分离的”或“生物学上纯的”是指材料实质上或基本上不含在所述材料以其天然状态发现时通常伴随着其的组分。
如本文所用，术语“试剂盒”可以用于描述包括试剂、组分或药学上配制的组合物的至少一个集合以进行本发明的一种或多种测定方法的便携式独立封闭体的变型。任选地，这种试剂盒可以包括一套或多套用于例如在实验室或临床应用中使用所封装的组合物的说明书。
“连接”或“接合”是指本领域已知用于功能性连接肽的任何方法，包括(但不限于)重组融合、共价键合、二硫键合、离子键合、氢键合、静电键合等。
“微粒”是指具有1微米至1000微米或1微米至100微米的最大特征尺寸的粒子。优选地，本公开的多孔粒子应该具有相对高的孔隙率以使聚合物-活性剂偶联物能够负载在多孔粒子的孔中。任选地，本公开的多孔粒子可以用靶向性部分涂布。这些实施方式可以用于将活性化合物靶向递送至期望的疾病位点。
“纳米粒子”是指最大特征尺寸小于1微米的粒子。优选地，本公开的聚合物-活性剂偶联物在多孔硅粒子生理性降解后从多孔粒子释放后并且在与水性环境接触后形成纳米粒子。
如本文所用，术语“天然存在”在应用于物体时是指物体可以在自然界中找到。例如，存在于可以从自然界中的来源分离的生物体(包括病毒)中的、并且在实验室中未有意进行过人工修饰的多肽或多核苷酸序列是天然存在的，。如本文所用，可根据经典遗传学选择性饲养的实验室啮齿类动物品系被认为是天然存在的动物。
如本文所用，术语“核酸”包括以下物质中的一种或多种类型：多脱氧核糖核苷酸(含有2-脱氧-D-核糖)、多核糖核苷酸(含D-核糖)和任何其它类型的多核苷酸，所述多核苷酸为嘌呤或嘧啶碱基或修饰的嘌呤或嘧啶碱基(包括无碱基位点)的N-糖苷。如本文所用，术语“核酸”还包括通常通过亚单元之间的磷酸二酯键，但在一些情况下通过硫代磷酸酯、甲基膦酸酯等共价键合的核糖核苷或脱氧核糖核苷的聚合物。“核酸”包括单链和双链DNA，以及单链和双链RNA。示例性的核酸包括(但不限于)gDNA；hnRNA；mRNA；rRNA；tRNA；微小RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、小核仁RNA(snORNA)、小核RNA(snRNA)和小时序RNA(stRNA)等和其任意组合。
如本文所用，术语“可操作地连接”是指被连接的核酸序列通常是连续的或实质上连续的，并且在必需要连接两个蛋白质编码区时，是连续的并且在阅读框中。然而，由于增强子通常在与启动子分隔数千个碱基时起作用，并且内含子序列可以具有不同长度；所以一些多核苷酸元件可以可操作地连接，但不是连续的。
如本文所用，术语“患者”(也可互换地称为“宿主”或“受试者”)是指可用作本文所讨论的一种或多种治疗或诊断制剂的接受者的任何宿主。在某些方面，患者是脊椎动物，其旨在表示任何动物物种(并且优选哺乳动物物种，如人类)。在某些实施方式中，患者可以是任何动物宿主，包括(但不限于)人类和非人类的灵长类动物、禽类、爬行动物、两栖动物、牛、犬、山羊(caprine)、cavine、乌鸦、石斑鱼(epine)、马、猫科动物、山羊(hircine)、兔、野兔、狼、鼠科、绵羊、猪、racine、狐狸等，包括(但不限于)驯养家畜、成群(herding)或迁徙动物或鸟、外来动物或动物学标本以及伴侣动物、宠物或兽医或动物医疗保健从业者照料的任何动物。
短语“药学上可接受的”是指分子实体和组合物，当施用至哺乳动物时，并且特别是当施用至人类时，其优选不产生过敏或类似的不良反应。如本文所用，“药学上可接受的盐”是指优选保留母化合物的所要生物活性并且不会赋予任何不期望的毒理学效应的盐。这些盐的实例包括(但不限于)与无机酸(例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等)形成的酸加成盐；和与有机酸形成的盐，所述有机酸包括(但不限于)乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、葡糖酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、苯甲酸、鞣酸、双羟萘酸(帕莫酸)、藻酸、萘甲酸、聚谷氨酸、萘磺酸、萘二磺酸、聚半乳糖醛酸；与多价金属阳离子(如锌、钙、铋、钡、镁、铝、铜、钴、镍、镉等)形成的盐；与由N,N'-二苯甲基乙二胺或乙二胺形成的有机阳离子形成的盐；和其组合。
如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指衍生自药学上可接受的碱、无机酸或有机酸的本公开化合物。适合的酸的实例包括(但不限于)盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、富马酸、马来酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水杨酸、琥珀酸、甲苯对磺酸、酒石酸、乙酸、柠檬酸、甲磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸、三氟乙酸和苯磺酸。衍生自适当碱的盐包括(但不限于)如钠和氨的可溶性无机盐。
如本文所用，术语“质粒”或“载体”是指由遗传材料(即，核酸)组成的遗传构建体。通常，质粒或载体含有在细菌宿主细胞(例如大肠杆菌(Escherichia coli))中有功能的复制起点和用于检测包括质粒的细菌宿主细胞的可选择标志物。本发明的质粒和载体可以包括本文所述的一种或多种遗传元件，使得插入的编码序列可以在适合的表达细胞中转录和翻译。另外，质粒或载体可以包括一个或多个核酸区段、基因、启动子、增强子、激活子、多克隆区或其任意组合，包括获自或衍生自一个或多个天然和/或人造来源的区段。
如本文所用，术语“多肽”旨在涵盖一个“多肽”以及多个“多肽”，并且包括具有两个或超过两个氨基酸的任何链。因此，如本文所用，包括(但不限于)“肽”、“二肽”、“三肽”、“蛋白质”、“酶”、“氨基酸链”和“连续氨基酸序列”的术语都可以涵盖在“多肽”的定义内，并且可以使用术语“多肽”来代替这些术语中的任一个，或与这些术语中的任一个可互换地使用。该术语还包括经历了一个或多个翻译后修饰的多肽，所述修饰包括例如(但不限于)糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、衍生化、蛋白水解裂解、翻译后加工或通过包括一种或多种非天然存在的氨基酸来修饰。本领域存在多核苷酸和多肽结构的常规命名法。例如，广泛使用一个字母和三个字母缩写来描述氨基酸：丙氨酸(A；Ala)、精氨酸(R；Arg)、天冬酰胺(N；Asn)、天冬氨酸(D；Asp)、半胱氨酸(C；Cys)、谷氨酰胺(Q；Gln)、谷氨酸(E；Glu)、甘氨酸(G；Gly)、组氨酸(H；His)、异亮氨酸(I；Ile)、亮氨酸(L；Leu)、甲硫氨酸(M；Met)、苯基丙氨酸(F；Phe)、脯氨酸(P；Pro)、丝氨酸(S；Ser)、苏氨酸(T；Thr)、色氨酸(W；Trp)、酪氨酸(Y；Tyr)、缬氨酸(V；Val)和赖氨酸(K；Lys)。本文所述的氨基酸残基优选为“L”异构形式。然而，“D”异构形式的残基可以取代任何L-氨基酸残基，其前提条件是多肽所要特性得以保留。
如本文所用，本文所用的术语“预防”和“抑制”是指在疾病状态的临床症状开始前施用单独的或包含在药物组合物中的化合物以预防该疾病状态的任何症状、方面或特征。这种预防和抑制不一定是绝对的被认为是医学上有用的。
在本文中，“蛋白质”可与“肽”和“多肽”互换使用，并且包括合成、重组或体外产生的肽和多肽两者以及将核酸序列施用至宿主动物或人类受试者后体内表达的肽和多肽。术语“多肽”优选意指任何氨基酸链长，包括长度约2至约20个氨基酸残基的短肽，长度约10至约100个氨基酸残基的寡肽和长度上包括约100个或多于100个氨基酸残基的更长多肽。此外，该术语还意图包括酶，即包括至少一种氨基酸聚合物的功能性生物分子。本发明的多肽和蛋白质还包括翻译后修饰的或者已经被翻译后修饰的、并且包括添加到氨基酸链骨架上的任何糖或其它衍生物或偶联物的多肽和蛋白质。
如本文所用，“纯化”是指与许多其它化合物或实体分离。化合物或实体可以被部分纯化、实质上纯化或为纯的。当从实质上所有其它化合物或实体中移出化合物或实体时，认为所述化合物或实体是纯的，即纯度优选至少约90％，更优选至少约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％。部分或实质上纯化的化合物或实体可以被移出离开至少50％、至少60％、至少70％或至少80％的与所述化合物或实体天然地一起存在的物质，例如细胞物质，如细胞蛋白质和/或核酸。
如本文所用，术语“调节元件”是指调节转录的核酸序列的一个或多个区域。示例性调节元件包括(但不限于)增强子、转录后元件、转录控制序列等。
如本文所用，术语“RNA区段”是指已经分离出的不含特定物种的总细胞RNA的RNA分子。因此，RNA区段可以指已经与其它RNA分离或纯化不含其它RNA的一个或多个RNA区段(天然或合成来源)。RNA区段和这些片段的较小片段包括在术语“RNA区段”中。
在提及氨基酸时，术语“序列”涉及给定氨基酸链(例如多肽或蛋白质)内氨基酸的线性N末端至C末端顺序的全部或一部分；“子序列”是指序列内的任何一段连续的氨基酸，例如给定蛋白质或多肽序列内的至少3个连续氨基酸。关于核苷酸链，“序列”和“子序列”与核苷酸5'至3'顺序有关具有类似含义。
如本文所用，术语“结构基因”旨在笼统地描述多核苷酸，如基因，其被表达来产生编码的肽、多肽、蛋白质、核酶、催化性RNA分子或反义分子。
术语“基本上如SEQ ID NO:X中所示的序列”是指该序列实质上对应于SEQ ID NO:X的一部分，并且具有相对少的、与SEQ ID NO:X的核苷酸(或在多肽序列的情况下是氨基酸)不同一或不为生物学功能等效物的核苷酸(或氨基酸)。术语“生物学功能等效物”在本领域中被充分理解，并且在本文中进一步详细定义。因此，特别预期核苷酸的约85％至约90％；或更优选约91％至约95％；或甚至更优选约96％至约99％与本文提供的核苷酸序列一个或多个同一或功能等效的的序列适用于实践本发明。
用于本发明的适合的标准杂交条件包括例如在42℃下在50％甲酰胺、5×邓哈特氏溶液(Denhardt's solution)、5×SSC、25mM磷酸钠、0.1％SDS和100μg/mL变性鲑鱼精子DNA中杂交16小时，接着在60℃下用0.1×SSC、0.1％SDS溶液依序洗涤1小时以去除所要量的背景信号。用于本发明的较低严格性杂交条件包括例如在42℃下在35％甲酰胺、5×邓哈特氏溶液、5×SSC、25mM磷酸钠、0.1％SDS和100μg/mL变性鲑鱼精子DNA或大肠杆菌DNA中杂交16小时，接着在55℃下用0.8×SSC、0.1％SDS依序洗涤。本领域技术人员应认识到，可以容易地调节条件以获得期望水平的严格性。
当然，本发明还涵盖与本文特别阐述的具体核苷酸序列的至少一个或多个互补、基本互补和/或实质上互补的核酸区段。“互补”的核酸序列是根据标准沃森-克里克互补规则(Watson-Crick complementarityrules)能够碱基配对的核酸序列。如本文所用，术语“互补序列”是指实质上互补的核酸序列，其可以通过上文所述的相同核苷酸比较来评估，或定义为能够与本文所公开的一个或多个具体核酸区段在相对严格的条件(如上文刚描述的条件)下杂交。
如上所述，本发明的探针和引物可以具有任何长度。通过给序列分配数值，例如，第一个残基是1，第二个残基是2等，可以提出定义给定序列内含有的所有探针或引物的算法：
n到n+y，
其中n是从1到序列的最后一个数字的整数，y是探针或引物的长度减去1，其中n+y不超过序列的最后一个数字。因此，对于25碱基对探针或引物(即“25mer”)，探针或引物的集合对应于序列的整个长度上的碱基1至25、碱基2至26、碱基3至27、碱基4至28等。类似地，对于35碱基对探针或引物(即“35-mer”)，示例性引物或探针序列包括(但不限于)对应于序列的整个长度上的碱基1至35、碱基2至36、碱基3至37、碱基4至38等的序列。同样地，对于40-mer，这些探针或引物可能对应于第一个碱基对至bp 40、序列的第二个bp至bp41、第三个bp至bp 42等的核苷酸，而对于50-mer，这些探针或引物可能对应于从bp 1延伸至bp 50、bp 2至bp 51、bp 3至bp 52、bp 4至bp 53等的核苷酸序列。
如本文所用，术语“受试者”描述可以用根据本发明的组合物向其提供治疗的生物体，包括哺乳动物，如灵长类动物。可以受益于所公开的治疗方法的哺乳动物物种包括(但不限于)猿；黑猩猩；猩猩；人类；猴；驯养动物，如狗和猫；家畜，如马、牛、猪、绵羊、山羊和鸡；和其它动物，如小鼠、大鼠、豚鼠和仓鼠。
如本文所用，与组分的量相关的术语“实质上不含”或“基本上不含”优选指含有小于约10重量％、优选小于约5重量％并且更优选小于约1重量％的化合物的组合物。在优选实施方式中，这些术语是指小于约0.5重量％、小于约0.1重量％或小于约0.01重量％。
当用于定义氨基酸或核酸序列时，术语“实质上互补”是指特定的标的序列(例如寡核苷酸序列)与所选序列的全部或一部分实质上互补，因此将特异性地结合于编码所选序列的mRNA的一部分。因此，通常序列将与mRNA“靶标”序列高度互补，并且将在序列的整个互补部分具有不超过约1个、约2个、约3个、约4个、约5个、约6个、约7个、约8个、约9个或约10个等的碱基错配。在许多情况下，可能期望序列是精确匹配的，即与寡核苷酸特异性结合的序列完全互补，因此沿着互补链段具有零错配。因此，高度互补的序列通常将非常特异性地结合于mRNA的靶序列区，因此将高效地减少和/或甚至抑制靶mRNA序列翻译成多肽产物。
实质上互补的核酸序列与该核酸所特异性结合的相应的核酸靶序列具有大于约80％的互补性(或“精确匹配％”)，并且更优选与该核酸所特异性结合的相应的靶序列大于约85％的互补性。在某些方面，如上所述，需要具有甚至更加在实质上互补的核酸序列来用于实践本发明，并且在这些情况下，核酸序列与该核酸所特异性结合的相应靶序列具有大于约90％的互补性，并且在某些实施方式中与该核酸所特异性结合的相应靶序列具有大于约95％的互补性，并且甚至与设计的核酸所特异性结合的靶序列的全部或一部分具有高达并且包括约96％、约97％、约98％、约99％并且甚至约100％的精确匹配互补性。
任何公开的核酸序列的相似度％或互补性％可以例如通过使用可从威斯康星大学遗传学计算机组(University of Wisconsin Genetics Computer Group；UWGCG)获得的GAP计算机程序6.0版比较序列信息来确定。GAP程序利用Needleman和Wunsch(1970)的比对方法。简言之，GAP程序将相似度定义为相似的比对符号(即，核苷酸或氨基酸)的数目除以两个序列中较短序列中的符号的总数。GAP程序的优选缺省参数包括：(1)核苷酸的一元比较矩阵(含有对于同一性的值1，和对于非同一性的值0)，以及Gribskov和Burgess(1986)的加权比较矩阵，(2)每个间隙罚分3.0，并且每个间隙中的每个符号再罚分0.10；和(3)末端间隙不罚分。
如本文所用，“合成”应指该材料并非来源于人类或动物。
术语“治疗上实用的时间段”是指活性剂在治疗上有效所要的时间段。术语“治疗上有效”是指减轻症状的严重性和/或频率、消除症状和/或潜在原因、预防症状和/或其潜在原因的发生以及改善或补救损伤。
“治疗剂”可以是可以在受试者的靶向位点产生所要的生物效应的任何生理学或药理学活性物质。治疗剂可以是天然存在的或通过合成或重组方法产生的化疗剂、免疫抑制剂、细胞因子、细胞毒性剂、溶核化合物、放射性同位素、受体和前药活化酶，或其任意组合。受经典多药耐药性影响的药物，如长春花生物碱(如长春花碱和长春新碱)、蒽环类(如阿霉素和柔红霉素)、RNA转录抑制剂(如放线菌素-D)和微管稳定药物(如紫杉醇)可特别地用作治疗剂。细胞因子也可以用作治疗剂。这些细胞因子的实例是淋巴因子、单核因子和传统的多肽激素。癌症化疗剂可以是优选的治疗剂。对于抗癌剂和其它治疗剂的更详细的描述，请本领域技术人员参考任何数量的指导性手册，包括(但不限于)医师案头参考(Physician's Desk Reference)和Goodman和Gilman的“治疗剂药理学基础(Pharmacological Basis of Therapeutics)”第十版,Hardman等人(编)(2001)。
“转录调节元件”是指单独或与一个或多个其它核酸序列组合活化转录的多核苷酸序列。转录调节元件可以例如包含一个或多个启动子、一个或多个响应元件、一个或多个负调节元件和/或一个或多个增强子。
如本文所用，“转录因子识别位点”和“转录因子结合位点”是指多核苷酸序列或序列基元，其被鉴定为一个或多个转录因子的序列特异性相互作用的位点，所述序列特异性相互作用通常采取直接的蛋白质-DNA结合的形式。通常，转录因子结合位点可以通过DNA足迹、凝胶迁移率变动分析等来鉴定，和/或可以基于已知的共有序列基元或通过本领域技术人员已知的其它方法预测。
“转录单元”是指如下多核苷酸序列，其包含至少第一结构基因，所述第一结构基因可操作地连接于至少第一顺式作用启动子序列并任选地可操作地连接于为所述结构基因序列的有效转录所需的一个或多个其它顺式作用核酸序列；和至少第一远端调节元件，其可能是在启动子和/或增强子元件控制下可操作地安置的结构基因序列的适当组织特异性和发育转录(developmental transcription)所需要的；以及任何其它为有效转录和翻译所必需的顺式序列(例如聚腺苷酸化位点、mRNA稳定性控制序列等)。
如本文所用，术语“转化的细胞”旨在指如下宿主细胞，其核酸互补物已通过将一种或多种外源多核苷酸引入该细胞而改变。
如本文所用，术语“转化”通常旨在描述将外源多核苷酸序列(例如，病毒载体、质粒或重组DNA或RNA分子)引入宿主细胞或原生质体中的过程，其中外源多核苷酸被并入至少第一染色体中或能够在转化的宿主细胞内自主复制。转染、电穿孔和“裸”核酸摄取均代表用于用一种或多种多核苷酸转化宿主细胞的技术的实例。
如本文所用，“治疗”是指向受试者提供任何类型的医学或手术管理。治疗可以包括(但不限于)向受试者施用包含治疗剂的组合物。“治疗”包括出于如下目的向受试者进行本发明的化合物或组合物的任何施用或应用，例如治愈、逆转、减轻疾病、病症或病状或疾病、病症或病状的一种或多种症状或表现、降低其严重程度、抑制其进展或降低其可能性。在某些方面，本发明的组合物还可以预防性地施用，即在产生病状的任何症状或表现之前施用，其中这种预防是被批准的。通常，在这些情况下，受试者是通过家族史、医疗记录或完成一个或多个指示以后出现这种疾病或病症的倾向性的诊断或预后测试而被诊断为具有出现这种疾病或病症的“风险”的受试者。
应用于本文公开的活性剂递送组合物的释放动力学的表述“零级或接近零级”旨在包括在施用组合物后在治疗上实用的时间段中以受控方式释放活性剂的速率，使得达到活性剂的治疗上有效的血浆浓度。
在某些实施方式中，宜将本发明的一个或多个核酸区段与适当的可检测标志物(即“标记”)组合使用，如在杂交测定法中使用标记的多核苷酸探针来测定给定靶序列的存在的情况下。本领域已知用于标记寡核苷酸探针的多种适当的指示剂化合物和组合物，其包括(但不限于)荧光、放射性、酶学或其它配体，如抗生物素蛋白/生物素等，在适当的测定法中，所述指示剂化合物和组合物能够被检测到。在特定的实施方式中，也可以使用一种或多种荧光标记或酶标签，如尿素酶、碱性磷酸酶或过氧化物酶，来代替放射性或其它对环境不太理想的试剂。在酶标签的情况下，已知比色、显色或荧光指示剂底物，其可以用于提供人眼可见的样品检测方法，或者通过分析方法(如闪烁扫描术、荧光测定法、分光光度法等)进行的样品检测方法，以鉴定与含有一个或多个互补或实质上互补的核酸序列的样品的特异性杂交。在所谓的“多路复用”测定法中，其中同时或依序检测两个或超过两个标记的探针，可能需要用具有第一检测性质或参数(例如发射谱和/或激发谱最大值)的第一标记来标记第一寡核苷酸探针，所述测定法还用具有与第一标记不同(即，分立或可辨别)的第二检测性质或参数的第二标记来标记第二寡核苷酸探针。多路复用测定法的使用，特别是在遗传扩增/检测方案的情况下，是分子遗传学领域的普通技术人员周知的。
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实施例
包括以下实施例来展示本发明的说明性实施方式。本领域的普通技术人员应了解，这些实施例中公开的技术代表了在本发明的实践中被发现功能良好的技术，因此可以认为构成其实践的优选模式。然而，本领域普通技术人员根据本公开应了解，在不背离本发明的精神和范畴下，可以在所公开的特定实施方式中进行许多改变并且仍然获得相同或类似的结果。
实施例1-PSM通过提高交叉呈递和诱导I型干扰素来增强抗肿瘤免疫性
在这个实施例中，描述了基于PSM的癌症疫苗，其大大提高树突状细胞中的交叉呈递和活化的I型干扰素应答。PSM负载的抗原展现延长的早期核内体定位和通过蛋白酶体依赖性通路和溶酶体依赖性通路两者提高的交叉呈递。树突状细胞对PSM的吞噬通过TRIF依赖性通路和MAVS依赖性通路诱导I型干扰素应答。用PSM负载的HER2抗原激发的树突状细胞在具有HER2阳性乳腺肿瘤的小鼠中产生强大的CD8T细胞依赖性抗肿瘤免疫。重要的是，这种免疫接种活化了肿瘤免疫微环境，使其具有高水平的肿瘤内I型干扰素和MHC-II表达、大量CD11c+树突状细胞浸润和肿瘤特异性细胞毒性T细胞应答。这些发现突出了基于PSM的佐剂增强基于树突状细胞的癌症免疫疗法的用途。
材料和方法
细胞和小鼠。不成熟的C57BL/6DC系DC2.4获自马萨诸塞大学医学院(Worcester,MA,USA)。DOBW细胞(一种针对OVA(323-339)/I-Ad复合物的T-T杂交瘤)获自凯斯西储大学(Cleveland,OH,USA)。B3Z细胞(针对OVA(257-264)/H-2Kb复合物的T-T杂交瘤)获自加州大学伯克利分校(Berkeley,CA,USA)。将所有DC和T细胞系维持在含有10％FBS、1mM丙酮酸盐、2mM L-谷氨酰胺、50μM 2-巯基乙醇和青霉素/链霉素(各100μg/mL)的RPMI 1640培养基中。TUBO细胞和BALB-neuT转基因小鼠获自都灵大学(Turin,ITALY)和梅奥诊所(The MayoClinic)(Rochester,MN,USA)。C57BL/6和BALB/c小鼠获自Charles River(Wilmington,MA,USA)或杰克逊实验室(Bar Harbor,ME,USA)。B6.129S2-Tap1tm1Arp/J(Tap-/-)、B6N.129S1-Tlr3tm1flv/J(Tlr3-/-)、C57BL/6J-Ticam1LPS2/J(Trif-/-)、C57BL/6J-Tmem173gt/J(StingGt/Gt)小鼠品系获自杰克逊实验室。Tlr4-/-,Tlr9-/-和Myd88-/-小鼠品系如前述(Duggan等人,2011；Millien等人,2013)饲养。所有动物研究均采用机构批准的指南进行。
制备封装抗原的脂质体和PSM负载。如前述(Tanaka等人,2010；Xu等人,2013)制备脂质体。简言之，将蛋白质或肽抗原溶解于H2O中；在叔丁醇中制备20mg/mL 1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酰胆碱(DOPC)，并且在水中制备0.1％Tween-接着通过涡旋1min一起混合到叔丁醇中。然后将样品在冻干机中冷冻干燥。为了将脂质体负载到PSM粒子中，将120μL H2O添加到脂质体粉末中，接着进行短暂的超声处理。然后将含脂质体的H2O添加到干PSM粒子中，接着进行短暂的超声处理。
体外抗原呈递测定法。如前述(Mukai等人,2011)进行体外抗原呈递测定法。简言之，将从C57BL/6小鼠或TAP-/-小鼠分离的DC2.4细胞或BMDC以2×105个细胞/孔的密度接种在96孔平底培养板中，并且在37℃下培养12小时。用PBS洗涤各孔一次，接着用可溶性OVA、PSM/OVA、OVA衍生的MHC I类表位肽[OVA257-264；SIINFEKL(SEQ ID NO:1)]或MHC II类表位肽[OVA323-339；ISQAVHAAHAEINEAGR(SEQ ID NO:2)；肽2.0]脉冲细胞指定的时间点，并立即用1％多聚甲醛固定。接着将细胞与2×105个B3Z细胞或2×105个DOBW细胞在37℃下共培养18小时。通过使用鼠科IL-2ELISA试剂盒(Ebioscience,San Diego,CA,USA)测定释放到培养基中的IL-2的量来评估被刺激的B3Z或DOBW细胞的应答。对于抑制分析，在抗原脉冲前，在37℃下用10mM MG-132(EMD Chemicals,San Diego,CA,USA)、1mM环氧霉素(EMDChemicals)或40mM亮肽素(EMD Chemicals)预处理BMDC 1小时。抗原脉冲培养基还含有各抑制剂。
共焦激光扫描显微术。将DC2.4细胞或BMDC以1×105个细胞/孔的密度接种在8孔带小室的载玻片上，并在37℃下培养24小时。PBS洗涤各孔两次，并且将细胞用FITC-OVA或PSM/FITC-OVA脉冲20min。用PBS洗涤细胞两次并在37℃下在培养基中再温育30min、1、3或6小时。用PBS洗涤细胞，用4％多聚甲醛固定，接着用针对单个细胞器的特定标志物的抗体染色。用于检测早期核内体、晚期核内体、早期和再循环核内体以及内质网(ER)的抗体分别为兔抗EE Ag 1(EEA1)Ab(ab74906；Abcam,Cambridge,MA,USA)、兔抗Rab7Ab(ab50313；Abcam)、鼠抗转铁蛋白受体(TfR)Ab(ab22391；Abcam)和兔抗KDEL Ab(ab50601；Abcam)。接着用PBS洗涤细胞，并在室温下与Alexa 594结合的抗兔IgG Ab(A11037；Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)或Alexa 594结合的抗兔IgG Ab(A21209；Invitrogen)一起温育1小时。将样品用 Gold抗褪色试剂和DAPI(Invitrogen)包埋，并通过共焦激光扫描显微术(Olympus IX81)分析。
透射电子显微术。透射电子显微术(TEM)分析由MD安德森癌症中心(Houston,TX,USA)的TEM核心设备进行。将从C57BL/6小鼠分离的BMDC以1×106个细胞的密度接种在24孔板上，并在37℃下培养24小时。用PBS洗涤培养皿两次，接着在37℃下用PSM/OVA脉冲细胞20min。用PBS洗涤细胞两次并在37℃下在培养基中再温育2小时。将细胞在4％多聚甲醛中固定。固定后，洗涤样品并用0.1％二甲胂酸盐缓冲的鞣酸处理，用1％缓冲的四氧化锇后固定30min，并用1％乙酸双氧铀染色。接着将样品在增加浓度的乙醇中脱水并包埋在812树脂(Ted Pella,Inc.,Redding,CA,USA)中。使样品在60℃烘箱中聚合2天。使用超薄切片机(Leica Biosystems,Deerfield,IL,USA)切割超薄切片，在EM染色机(Leica Biosystems)中用乙酸双氧铀和柠檬酸铅染色，并在透射电子显微镜(JEOLUSA,Inc.,Peabody,MA,USA)中检验。
实时PCR。用Trizol试剂(Life Technologies,Inc.Grand Island,NY,USA)分离总RNA，并用于使用逆转录试剂盒(Roche,Nutley,NJ,USA)进行cDNA合成。使用Green Select Master Mix在StepOnePlusTM实时PCR系统(Life Technologies)上进行实时PCR。通过ΔΔCT法计算单个基因的表达，并根据β-肌动蛋白的表达归一化。
肿瘤研究。将悬浮于冷MatrigelTM/PBS(1:1)中的TUBO细胞(1×106个细胞/小鼠)植入雌性BALB/c小鼠(6-10周龄)的乳腺脂肪垫中。在肿瘤接种后的第4天(肿瘤达到可触知的尺寸)，将动物随机分组(每组8只小鼠)并接受静脉内注射治疗。监视小鼠的肿瘤尺寸和存活。肿瘤体积记录为宽度×长度2/2。为进行肿瘤内细胞因子和蛋白质分析，在肿瘤接种后第14天处死小鼠，并且收获肿瘤来分别通过流式细胞术、qPCR和蛋白质印迹分析进行免疫细胞分型、RNA和蛋白质分析。在使用BALB-neuT小鼠进行的肿瘤预防研究中，通过在6至8周龄静脉内注射疫苗处理小鼠组(每组5只小鼠)，接着监视肿瘤发病率、肿瘤多样性和小鼠存活30周。在耗减研究中，使用抗CD4(GK1.5)和抗CD8(2.43)mAb进行T细胞亚群的体内耗减。使用氯膦酸二钠脂质体(EncapsulaNanoSciences,LLC,Brentwood,TN,USA)来耗减巨噬细胞。从接种肿瘤细胞前1周开始(每只小鼠0.5×106个细胞)，每周两次向动物腹膜内注射200μg抗CD4和抗CD8mAb或200μL氯膦酸二钠脂质体，持续3周。
统计分析。通过Student检验评估P值来确定统计显著性。使用回归分析测试两个变量之间的关系，并且认为P<0.05是显著的。通过对数秩检验比较开普兰-迈耶存活曲线(Kaplan-Meier survival curve)来分析存活分析。
BMDC。使用6-10周龄雌性小鼠分离骨髓产生的DC。简言之，收集来自小鼠后腿的股骨和胫骨，并使用注射器用含1％FBS的PBS冲洗出骨髓细胞。用ACK溶解缓冲剂(Lonza,Inc.,Basel,SWITZERLAND)短暂处理细胞来去除红血球，接着再悬浮于具有10％FBS、抗生素、55μM 2-巯基乙醇的RPMI1640培养基中。补充重组鼠科GM-CSF和IL-4(20ng/mL)使细胞生长。每隔一天更换新鲜细胞培养基。收获非粘附细胞作为不成熟BMDC。为进行体内研究，用100ng/mL LPS刺激BMDC过夜以进行成熟，接着用可溶性抗原或PSM/抗原激发3小时，随后静脉内注入小鼠中。
细胞因子测量。通过ELISA使用Bio-Plex ProTM小鼠细胞因子23-plex分析(Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)或单个细胞因子ELISA试剂盒(来自Ebioscience或PBL Assay Science(Piscataway,NJ,USA))测量从细胞培养物释放的细胞因子。
shRNA介导的基因敲低。编码shRNA的pLKO.1慢病毒载体如前述(Zhang等人,2011)，或购自Sigma-Aldrich Chemical Co.(St.Louis,MO,USA)。为了产生慢病毒粒子，将慢病毒载体与封装质粒psPAX2和pMD2一起转染到HEK293T细胞中。如前述(Zhang等人,2011)用慢病毒感染树突状细胞，并且通过实时PCR确认敲低效率。
结果和讨论
树突状细胞摄取PSM负载的抗原。分析通过静脉内注射PSM处理的小鼠中免疫细胞的粒子摄取，并且显示相较于F4/80+巨噬细胞，粒子在外周血中优先被CD11c+DC吞噬(参见表1)。
表1
小鼠外周血中免疫细胞对PSM的体内摄取
在PSM静脉内施用后的不同时间点计算特定细胞类型(CD115+Ly6C高不成熟单核细胞、CD115+Ly6C低成熟单核细胞、Gr1+CD11b+嗜中性粒细胞、F4/80+CD11b+巨噬细胞、CD11c+CD11b+树突状细胞)的总数中PSM阳性细胞的数量作为摄取百分比。显示两个代表性研究中的一个。
因为DC是最有效的抗原呈递细胞，所以研究了利用PSM增强抗原呈递的可能性。首先将卵白蛋白(OVA)(一种充分表征的模型抗原)用于体外和体内免疫应答研究(图7A)。将FITC偶联的OVA(FITC-OVA)封装到脂质体中，并遵循先前描述的程序(Shen等人,2013a；Tanaka等人,2010；Xu等人,2013)负载到PSM中。在细胞培养物中，早在共温育后0.5小时PSM负载的FITC-OVA(PSM/FITC-OVA)就被DC有效内化(图1A)，表明细胞有效摄取粒子。透射电子显微术揭示，温育后3小时PSM粒子被吞噬体样多孔结构包围(图1B)。用吞噬抑制剂细胞松弛素D或巨胞饮抑制剂阿米洛利预处理DC显著降低了粒子内化(图1C和图1D)，表明吞噬作用和巨胞饮作用都参与了该过程。有趣的是，实时粒子追踪揭示DC-内化的粒子可以在体外转移到邻近的细胞(图7D)。当将含PSM的DC静脉内注射到小鼠中时，某些PSM粒子从注射的细胞分离，并且很可能被内源细胞吞噬(图7E)。
接着使用体外抗原呈递测定法评估DC中T细胞对PSM负载的OVA(PSM/OVA)的抗原交叉呈递的应答。在OVA特异性B3Z CD8T细胞中，用PSM/OVA脉冲的DC诱导的IL-2产生水平显著高于用可溶性OVA脉冲的DC(图1E、图1F和图7B)，表明在DC中PSM/OVA的交叉呈递比可溶性OVA有效得多。PSM/OVA的有效交叉呈递无PSM尺寸依赖性，因为相较于用可溶性OVA或脂质体OVA脉冲的DC，用不同尺寸的PSM微粒(直径0.6-2.5μm)中的OVA脉冲的DC在B3Z细胞中始终诱导更高水平的IL-2产生(图7C)。因此，在所有其它研究中使用1-μm PSM粒子。接着判定PSM封装是否可以诱导持续的抗原呈递。在37℃下用可溶性或PSM封装的OVA肽脉冲DC2小时，接着充分洗涤，然后立即与B3Z细胞共培养或在培养基中温育18或30小时，然后进行B3Z细胞共培养。当在去除可溶性或PSM制剂中的OVA肽后立即将DC用于共培养时，T细胞培养物中的IL-2水平是相当的(图1G)。然而，在肽去除后18小时和30小时，与PSM/肽脉冲的DC共培养的T细胞活性显著高于可溶性肽脉冲的DC，表明PSM递送的抗原诱导延长的向T细胞的MHC肽呈递。
PSM/OVA抗原的抗原呈递通路。接着使用共焦显微术检查胞内抗原运输。早在与DC共温育后0.5小时，PSM/FITC-OVA粒子就与早期核内体(EEA1+)共定位，并且在温育后3小时和6小时位于内质网(KDEL+)中。在晚期核内体(Rab7+)或再循环核内体(转移受体+)中很少发现粒子(图2A)。有趣的是，到第6小时仍能在早期核内体中观察到PSM/FITC-OVA，表明PSM/OVA可以较长时间保留在这种亚细胞器中。相比之下，游离的FITC-OVA到第6小时显示非常微弱的信号，这可能是由于细胞内快速降解所致。
为了识别PSM封装的疫苗的抗原加工途径，用蛋白酶体和溶酶体抑制剂处理DC，接着与可溶性OVA或PSM/OVA共温育，并测量IL-2表达的诱导。蛋白酶体抑制剂(MG-132和环氧霉素)，但不是溶酶体抑制剂亮肽素，完全阻断可溶性OVA的I类抗原呈递(图2B)。相反，PSM/OVA诱导的IL-2产生被所有抑制剂抑制，表明蛋白酶体和溶酶体通路两者都参与了PSM/OVA的抗原呈递。由于抗原加工相关转运体(TAP)蛋白是I类抗原呈递通路的基本组分(Trombetta和Mellman,2005)，所以在从TAP1敲除小鼠分离的DC(TAP-/-DC)中测试抗原加工。正如预期，在TAP-/-DC中，PSM/OVA的I类抗原呈递被消除(图8A)。相反，在WT和TAP-/-细胞中，PSM/OVA的II类抗原呈递类似(图8B)。因此，通过DC进行的PSM/OVA交叉呈递需要TAP依赖性抗原加工。
由于OVA抗原加工导致OVA肽结合的I类MHC分子的表面表达，所以用特异性识别MHCI-肽(SIINFEKL-H-2Kb)复合物的抗体25D1.16探测加工的抗原。实际上，在用PSM/OVA激发的DC中可以识别到比在用可溶性OVA激发的DC中更多的25D1.16阳性细胞(图2C)，因此证实抗原加工和由DC进行的PSM负载的OVA的呈递提高。
这些观察结果指示，在通过吞噬作用/巨胞饮作用由DC内化后，PSM/OVA离开吞噬体，并且释放的抗原通过蛋白酶体通路被加工。加工的抗原与ER中的MHC分子结合，接着被转运到细胞表面。或者，抗原可以在早期核内体中通过核内体蛋白酶直接加工，并以抗原肽-MHC复合物的形式呈递至细胞表面。在任一情况下，需要TAP蛋白来将抗原肽负载到MHC分子上(图8C)。
PSM诱导的先天免疫应答。有理由认为，通过PSM负载的抗原产生的提高的交叉呈递除了与早期核内体递送之外，可能还与先天免疫的活化有关。虽然明矾佐剂可以活化炎性小体并诱导DC中的IL-1β成熟和释放，但PSM在用LPS激发的DC中不诱导IL-1β释放(图9A)。PSM和载有抗原的PSM都不改变促炎性细胞因子的mRNA或蛋白水平(参见图3A和图9B)。此外，在PSM处理后，表面共刺激分子(CD80、CD86和CD40)的表达几乎没有变化(参见图3B)。
作为对病毒感染的先天免疫应答的一个重要分支，需要IFN-I应答通过促进交叉呈递和刺激CD8T细胞克隆扩增来进行最佳的T细胞活化(Le Bon和Tough,2008；Ng和Gommerman,2013)。分析了IFN-I相关基因的表达谱，并且发现空的PSM和载有抗原的PSM(但不是游离抗原)都诱导了IFN-α4和IFN-β表达的显著增加(图3C)。ELISA结果证实PSM处理的DC表现出IFN-β产生的适度但显著增加，并且还分泌高水平的RANTES，即一种IFN-I调节的趋化因子(图3D)。
PSM诱导的IFN-I应答依赖于TRIF和MAVS信号传导。为了判定由PSM引发的IFN-I应答是否依赖于任何已知的TLR或RLR诱导的IFN-I通路，敲低这些通路中关键衔接分子的表达，接着分析DC中PSM诱导的IFN-I应答(图4A、图4B、图4C和图4D)。PSM保留了诱导IFN-I应答的能力，抑制了MyD88和STING的表达。相反，当TRIF或MAVS被敲低时，IFN-I诱导被消除，表明PSM通过TRIF和MAVS依赖性通路诱导IFN-I应答。接着使用来自基因敲除小鼠的衍生自骨髓的树突状细胞(BMDC)来验证基于shRNA的研究的结果。PSM的IFN-I诱导在Trif-/-BMDC中被完全抑制，但在StingGt/Gt(Sauer等人,2011)或Myd88-/-BMDC中没有(图4E、图4F、图4G和图4H)。始终地，PSM处理提高来自WT、Myd88-/-、StingGt/Gt和Tlr3-/-小鼠的BMDC中的RANTES产生；然而，在Trif-/-BMDC中RANTES的产生被抑制(图4I)。尽管TLR4、TLR9和TLR3缺乏分别消除了DC对LPS、CpG和polyI:C的应答(图10A)，但是PSM诱导的IFN-I应答不受影响(图10B)，表明PSM诱导的IFN-I应答具有不依赖于TLR的机制。
由于PSM摄取和交叉呈递需要吞噬PSM/抗原，所以后续研究检验了PSM诱导的IFN-I是否需要吞噬作用。用吞噬抑制剂细胞松弛素D预处理抑制PSM的IFN-I诱导(图10C)。还分析了吞噬作用的下游激酶信号传导。PI3K抑制对IFN-I诱导无影响(图10D)。相比之下，BX795对IFN-I信号传导的关键激酶(TBK1/IKKi)的抑制显著抑制了IFN-I诱导(图10E)。还分析了PSM/抗原激发后BMDC中MAPK和NF-κB信号传导的活化状态。除了ERK磷酸化水平轻微增加之外，PSM激发未强烈地活化JNK、p38、AKT或NF-κB的信号传导(图10F)。总之，这些数据指示DC吞噬PSM负载的抗原活化了TRIF-和MAVS-依赖性信号传导和下游的TBK1/IKKi来引起IFN-I应答(图4J)。
用PSM/HER2抗原肽激发的DC的抗肿瘤功效。鉴于有效的交叉呈递和CD8T细胞的细胞毒性在抗肿瘤免疫中的关键作用，进一步的研究检验了通过PSM/抗原提高DC中的交叉呈递和活化的IFN-I是否可以被转化成动物肿瘤模型中提高的抗肿瘤活性。用TUBO肿瘤细胞接种BALB/c小鼠，所述肿瘤细胞最初来源于BALB-neuT转基因小鼠(在MMTV启动子下过表达大鼠neu)的乳腺肿瘤(Lucchini等人,1992)。当肿瘤达到可触知的尺寸时，用PSM、PSM/p66(p66是I类HER2抗原肽)(Nagata等人,1997)、p66激发的DC(DC+p66)或PSM/p66激发的DC(DC+PSM/p66)静脉内处理小鼠。尽管PSM对肿瘤生长没有影响，但直接的PSM/p66施用显著抑制肿瘤生长(图5A)。接受DC+p66的小鼠显示与PSM/p66处理组中那些相当的肿瘤生长抑制。在用DC+PSM/p66处理的小鼠中观察到最显著的效果，其由几乎完全的肿瘤生长抑制和延长的动物存活所证实(图5A和图11A)。由于用仅DC或用PSM-TRP-2(一种不相关抗原)激发的DC处理不能抑制肿瘤生长(图11B)，因此对肿瘤生长的作用是HER2肽p66所特有的。此外，抗肿瘤功效与肿瘤内HER2特异性CD8T细胞频率相关联(图11C)。
在一个独立的研究中，评估了来自PSM/p66的肿瘤预防作用。BALB-neuT小鼠在15周时开始产生自发性肿瘤，并且所有小鼠到17周时都产生了肿瘤(图11D)。到第20周时平均每只小鼠有超过五个肿瘤(图5B)。与未免疫接种的小鼠相比，用PSM/p66或DC+PSM/p66处理的小鼠产生显著较少的肿瘤并展现较长的肿瘤潜伏期(图5B和图11D)。结果指示PSM负载的HER2肽充当抗HER2疫苗并且预防转基因小鼠中的乳腺肿瘤产生。
PSM/抗原激发的DC引发的免疫刺激性肿瘤微环境。在处理后的TUBO肿瘤中定量肿瘤内细胞因子水平，因为抗肿瘤免疫通常依赖于免疫刺激性肿瘤微环境(Coussens等人,2013)。与基于细胞的研究一致(图3C)，定量RT-PCR(qPCR)分析揭示了免疫接种的小鼠中肿瘤内IFN-I水平显著增加(图5C)。将一定水平的促炎性细胞因子混合。虽然免疫接种的小鼠中TNF-α和IL-17a的表达增加，但是IL-17F、IL-6和抗凋亡分子Bcl-2保持不变(图5D)。另一方面，免疫接种组中抗原呈递分子MHC-II的表达显著增加(图5E)。此外，细胞毒性T细胞标志物(颗粒酶和穿孔素)和IFN-γ的水平在免疫接种后也增加，其中在DC+PSM/p66处理组中颗粒酶和IFN-γ水平高达DC或DC+p66处理组中的2-3倍(图5E)。有趣的是，所有DC疫苗均诱导Treg标志基因Foxp3的肿瘤内表达(图11E)，表明免疫接种诱导Treg扩增和耐受性(Ambrosino等人,2006)。为了证实qPCR结果，从肿瘤样品分离单细胞，在培养物中生长，并通过ELISA测量细胞生长培养基中的细胞因子水平。与其它组相比，来自DC+PSM/p66处理组的肿瘤细胞中检测到显著增加水平的关键促炎性细胞因子(如IL-1β、IL-17和TNF-α)(图5F)。此外，在DC+PSM/p66处理组中，Th1细胞因子(如IFN-γ、IL-12p40和IL-12p70)最高(图5G)。由于BALB/c小鼠倾向于Th2应答(Mills等人,2000)，在DC和DC+p66处理后观察到Th2细胞因子IL-4水平的急剧增加(图11F)。但是，DC+PSM/p66处理不诱导IL-4产生。因此，PSM/p66激发可以避免BALB/c小鼠中与DC处理有关的强Th2应答。这些结果表明DC+PSM/p66在肿瘤组织中诱导促炎性环境，并且将BALB/c小鼠中Th2应答转变为可能有助于抗肿瘤免疫的Th1应答，否则Th2应答占主导地位。
PSM/HER2激发的DC疫苗活化的针对肿瘤的细胞毒性T细胞免疫。还分析了可能有助于肿瘤内细胞因子环境的肿瘤内细胞群。肿瘤组织裂解物的蛋白质印迹分析揭示了处理组间相当的MHC-I蛋白水平；然而，来自DC+PSM/p66组的肿瘤中MHC-II表达显著增加(图6A)。免疫组织化学(IHC)染色证实在DC+PSM/p66组中肿瘤结节边缘上存在高水平的MHCII阳性细胞(图6B)。免疫荧光染色和流式细胞术分析揭示相较于其它组，来自DC+PSM/p66组的肿瘤中CD11c+MHCII+细胞的百分比显著增加(图6C和图6D)。
作为T细胞介导的抗肿瘤免疫的执行者，在DC+PSM/p66处理的肿瘤中，HER2特异性CD8T细胞具有最高水平(图6E)。为了确定抗肿瘤免疫所需的免疫细胞类型，在具有TUBO肿瘤的小鼠中耗减CD4T细胞、CD8T细胞或巨噬细胞，接着用DC+PSM/p66处理小鼠(图6F)。CD8T细胞的耗减完全消除了抗肿瘤免疫性。相反，耗减CD4T细胞或巨噬细胞不会损害抗肿瘤免疫性；用同种型对照抗体处理也不会。这些结果指示CD8T细胞对于DC+PSM/p66诱导的抗肿瘤活性是必需的。
图12A和图12B显示了根据本发明的一个方面的示例性1μm×0.4μm盘状微粒的扫描电子显微术(SEM)图像。PSM可以制成各种不同的尺寸和形状。已经开发了盘状(即，小片状)、半球形、圆柱形和其它类型的pSi粒子。已经制造了各种盘状pSi粒子，直径尺寸在约1.0μm至约3.5μm范围内，厚度尺寸在约0.2μm至约0.7μm范围内。
图13中呈现的数据显示为了判定PSM是否可以作为佐剂来增强免疫接种，将卵白蛋白(OVA)(测试抗原)与PSM混合，或将OVA负载到PSM的纳米孔中，接着与树突状细胞(DC)一起温育三小时。之后，将DC与识别OVA抗原肽的B3Z CD8T细胞共温育14-18小时。CD8T细胞将白介素2(IL-2)分泌到培养基中，指示细胞已被活化。相较于仅与卵白蛋白一起温育的细胞(阴性对照，不含PSM)，与PSM+卵白蛋白的简单混合物或载有卵白蛋白的PSM一起温育的DC显著刺激IL-2表达。与进行任意预处理的树突状细胞共温育的CD8T细胞的IL-2分泌没有差异。这一结果展示，PSM促进了树突状细胞对卵白蛋白的加工和抗原肽呈递，并且仅含有PSM+抗原的混合物足以提高树突状细胞的性能。
本文提供的数据展示所公开的PSM可以用作癌症疫苗的强有力佐剂，并且该活性通过以前未描述的作用机制(即通过诱导I型干扰素应答)产生。与现有佐剂(如活化炎性小体并促进树突状细胞中的IL-1β释放的纳米尺寸的明矾晶体)相反，本文所公开的PSM组合物通过触发I型干扰素介导的细胞应答而起到疫苗佐剂的作用。与现有技术的常规粒子佐剂相比，本发明的佐剂组合物特异性地提高了抗原呈递，并且避免了全身炎症的许多广泛的不良后果。
已经提出，对粒子抗原或佐剂的吞噬不仅促进其被APC摄取，而且通过与先天免疫受体相互作用触发先天免疫活化(Fric等人,2014)。在这个实施例中，已经展示PSM/抗原激发的DC中的交叉呈递和IFN-I诱导都需要吞噬作用，加强了吞噬作用在抗原摄取和先天免疫活化中的双重作用。
暴露于微生物或肿瘤衍生的DNA和RNA后，在DC中引发IFN-I应答。对核苷酸的结合活化了先天免疫受体(如TLR和RLR)，接着募集单个的衔接蛋白和关键激酶TBK1和IKKi，从而导致IRF3或IRF7磷酸化、核易位和IFN-I基因转录的活化(Prinz和Knobeloch,2012)。普遍认为MyD88是TLR7/8/9诱导的IFN-I信号传导所必需的，而TRIF是TLR3/4-诱导的IFN-I信号传导所需要的。细胞内RNA和DNA传感器依赖于衔接分子MAVS和STING来进行信号转导(Prinz和Knobeloch,2012)。有趣的是，膜融合可以通过STING依赖性信号传导在不活化DNA或RNA传感器的情况下直接活化IFN-I应答，这表明物理融合有时作为引发先天免疫应答的“危险信号”(Holm等人,2012)。然而，膜融合不太可能是PSM诱导的IFN-I应答的主要因素，因为在DC中STING的敲低或敲除没有消除PSM诱导的IFN-I应答。有趣的是，TRIF和MAVS对于PSM诱导的IFN-I应答都是必需的，因为它们似乎介导来自TLR和RLR的不同上游信号。然而，MAVS最初被鉴定为细胞内poly(I:C)诱导的IFN-I信号传导中的TRIF的下游衔接子(Xu等人,2005)，并且DDIF1/DDX21/DHX36复合物诱导的IFN活化需要TRIF和MAVS两者(Zhang等人,2011)。因此，对于响应于细胞内DNA/RNA分子或吞噬的PSM粒子的IFN-I诱导，可能存在TRIF-MAVS轴心。值得注意的是，PSM诱导了中等程度的IFN-I表达。如在淋巴毒素受体介导的IFN-I诱导中所展示，这样的IFN-I水平足够有效地刺激交叉呈递和CD8T细胞扩增(Summers deLuca等人,2011)。
在肿瘤微环境的情况下，尽管针对癌症的内源免疫仍然存在，但抗肿瘤免疫的许多方面在肿瘤产生期间已经被削弱，因此需要外源增强处理(Gajewski等人,2013a)。已报道IFN-I水平升高与针对癌症的临床免疫应答有利地关联(Fuertes等人,2011)，并且肿瘤内IFN-I水平预测乳癌患者对基于蒽环的化学疗法的临床应答(Sistigu等人,2014)。与IFN-β偶联的外源治疗抗体也通过活化内源树突状细胞的交叉呈递能力来提高抗肿瘤活性(Yang等人,2014)。因此，靶向DC和再活化其交叉呈递能力代表了癌症免疫疗法的重要策略。
可以通过施用外源制备的DC或通过注射靶向内源DC的抗原和佐剂来进行基于树突状细胞的免疫疗法。在机理上，注射的DC可以直接向T细胞呈递抗原，或者可以作为细胞递送载体并将抗原转移到内源DC(Kleindienst和Brocker,2003；Yewdall等人,2010)。
尽管不受任何特定理论的限制，但载有PSM/抗原的DC可将PSM/抗原转移至内源DC并促进其抗肿瘤免疫性是具有吸引力的设想。本实施例中提供的数据支持这种设想，因为在体外DC之间观察到PSM的细胞间交换，并且PSM在体内从注射的DC释放。
之前的报道还鉴定了激动剂抗CD40抗体处理后伴随肿瘤内MHC-II表达增加的抗肿瘤免疫，这归因于活化的先天免疫细胞，主要是巨噬细胞(Beatty等人,2011；O'Sullivan等人,2012)。在这个实施例中，PSM/抗原激发的DC处理也急剧增加肿瘤组织中的MHC-II表达。然而，在TUBO肿瘤模型中对巨噬细胞的耗减对基于DC的治疗效果没有显著影响。相反，在用PSM/HER2激发的DC处理的小鼠中观察到伴随MHC-II上调的CD11c+细胞的肿瘤浸润增加，展示了活化的DC在抗肿瘤活性中的关键作用。这些发现与描述IFN-I活化肿瘤内树突状细胞和抗体介导的肿瘤免疫性提高的最近报道一致(Yang等人,2014)。
CD8T细胞被认为是抗肿瘤活性的关键参与者(Dougan和Dranoff,2009)。已经显示，CD8T细胞的耗减消除了PSM/抗原激发的DC疫苗的抗肿瘤活性。这个结果与如下使用相同CD8表位HER2肽的前述报道一致，即抗肿瘤免疫主要依赖于CD8T细胞的细胞毒性杀灭活性(Assudani等人,2008；Nava-Parada等人,2007)。另一个重要的观察结果是免疫接种还诱导肿瘤组织中的FOXP3表达。在人类临床试验(Gajewski等人,2013b)和鼠科肿瘤模型(如BALB-neuT转基因小鼠)(Ambrosino等人,2006)两者中，Treg浸润是诱导有效抗肿瘤免疫应答的主要障碍。通过抗体或遗传操作进行的瞬时Treg消融已经显示自身具有抗肿瘤作用(Bos等人,2013；Marabelle等人,2013)。这可以解释为什么CD4抗体耗减不影响用PSM/抗原激发的DC的抗肿瘤免疫，因为除T辅助(TH)细胞外，CD4抗体也可能耗减Treg。基于这些结果，用PSM/抗原激发的DC疫苗和瞬时Treg消融的组合处理还可以改善抗肿瘤疫苗的结果。
显示PSM/抗原激发的DC免疫接种通过诱导有效的抗原交叉呈递和引发IFN-I应答而产生强抗肿瘤免疫。吞噬PSM/抗原产生延长的早期核内体抗原定位并同时活化IFN-I信号传导，从而提供吞噬作用和先天免疫信号传导如何合作来提高交叉呈递的另一个实例。已经鉴定到介导PSM诱导的IFN-I信号传导的特定细胞内通路，说明TRIF和MAVS在对粒子抗原的应答中的基本功能。此外，在PSM增强的DC疫苗中已经展示了免疫活性肿瘤微环境的作用。这些发现还突出了粒子疫苗和IFN-I信号传导在刺激肿瘤免疫微环境以进行成功的免疫疗法中的优势。
实施例2-PSM佐剂提高抗原交叉呈递并诱导IFN-I应答
本实施例展示，PSM可以与其它佐剂协同刺激树突状细胞，从而活化CD8阳性细胞毒性T细胞(治疗性癌症疫苗所必需)和CD4阳性T辅助细胞(T细胞和B细胞活化所必需)。结果表明，PSM不仅可用作治疗性癌症疫苗(CD8T细胞活性)的强有力佐剂，而且还可用作靶向感染性疾病(CD4T细胞活性)的疫苗。
这些研究展示：1)PSM与其它佐剂协同增强免疫接种效率，2)PSM强有力刺激抗体产生(CD4+T细胞活性)，和3)PSM增强了记忆T细胞群。
实施例3-PSM佐剂促进针对感染性疾病的抗体产生
本实施例展示基于PSM的佐剂有效治疗感染性疾病。
为了说明公开的基于PSM的佐剂治疗感染性疾病的功效，将西尼罗病毒(WNV)蛋白与PSM+CpG+cGAMP混合，接着向野生型小鼠注射磷酸盐缓冲盐水对照或PSM(CpG+cGAMP+WNV)。接着在注射后2、3和4周收集血液样品，并定量WNV特异性抗体的水平。图17说明第一样品集(免疫接种后2周)的结果。
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应理解，本文所述的实施例和实施方式仅用于说明的目的，并且可向本领域技术人员提议对其进行各种修改或改变，且所述修改或改变包括在本申请的精神和范围以及权利要求书的范畴内。
本文引用的所有参考文献(包括出版物、专利申请和专利)均以引用的方式并入本文中，其引用程度如同各参考文献被单独且特别地指示为以引用的方式并入并且在本文中阐述其全文一样。
除非本文另外指明，否则本文中的值的范围的叙述仅仅意欲作为单独提及属于该范围内的各单独值的速记方法，并且各单独的值被并入本说明书中，就如同其在本文中单独叙述一样。
除非另外说明或上下文明显矛盾，否则本文中关于一个或多个要素使用如“包含”、“具有”、“包括”或“含有”的术语描述本发明的任何方面或实施方式旨在支持“由该特定的一个或多个要素组成”、“基本上由其组成”或“实质上包含该特定的一个或多个要素”的本发明的类似方面或实施方式(例如除非另外详细说明或上下文明显矛盾，否则在本文中描述为包含特定要素的组合物应被理解为还描述含有和/或包括该特定要素的组合物)。
本文所公开和要求保护的所有组合物和方法可根据本公开不经过度实验即可进行制备和执行。尽管本发明的组合物和方法已经根据优选实施方式进行了描述，但是对于本领域技术人员显而易见的是，可以在不背离本发明的构思、精神和范畴的情况下对本文所述的组合物和方法以及在方法的步骤中或步骤的工序中进行变化。更具体地，显而易见，某些化学和/或生理学上相关的试剂可以替代本文所述的试剂，而获得相同或相似的结果。所有这些对本领域技术人员显而易见的类似的替代物和修改被认为属于权利要求书所限定的本发明的精神、范畴和构思内。
序列表
<110> 卫理公会医院
沈海法
夏小俊
毛里奥.费拉里
<120> 基于多孔硅微粒的癌症疫苗和增强抗肿瘤免疫性的方法
<130> 37182-190WO01
<150> US 62/142278
<151> 2015-04-02
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> OVA-derived MHC class I epitope Synthetic Peptide
<400> 1
Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu
1 5
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MHC class II epitope Synthetic Peptide
<400> 2
Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly
1 5 10 15
Arg

Claims (31)

1.一种组合物，其包含：
(a)多孔硅(pSi)微粒群；和
(b)至少一种肿瘤特异性肽抗原或至少一种癌症特异性肽抗原。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述抗原特异于人类肿瘤特异性多肽或肽，如卵白蛋白、HER2或p66。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的组合物，其还包含佐剂，如明矾。
4.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其在被引入适合的哺乳动物细胞中时被改适并配置来增加IFN-I表达，优选增加IFN-α4或IFN-β表达。
5.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其还包含哺乳动物树突状细胞群。
6.根据权利要求1所述的组合物，其还包含其它化疗剂，如选自以下的药剂：免疫调节剂、神经活性剂、抗炎剂、抗脂血症药剂、激素、受体激动剂、受体拮抗剂、抗感染剂、蛋白质、肽、抗体、抗原结合片段、酶、RNA、DNA、siRNA、mRNA、核酶、激素、辅因子、类固醇、反义分子和其任意组合。
7.根据权利要求4所述的组合物，其中所述化疗剂包含一种或多种抗肿瘤化合物、一种或多种细胞毒性化合物、一种或多种细胞抑制性化合物或其任意组合。
8.根据权利要求6所述的组合物，其中所述化疗剂选自：环磷酰胺、阿霉素、5-氟尿嘧啶、多西他赛、紫杉醇、曲妥珠单抗、甲氨蝶呤、表柔比星、顺铂、卡铂、长春瑞滨、卡培他滨、吉西他滨、米托蒽醌、伊沙匹隆、艾日布林、拉帕替尼、卡莫司汀、氮芥、硫芥、四硝酸铂、长春花碱、依托泊苷、喜树碱和其任意组合。
9.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其还包含佐剂。
10.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其还包含抗原、抗原性多肽或其抗原性肽片段。
11.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，所述组合物1)用脂质体群、纳米粒子群或微粒群配制；或2)与一种或多种表面活性剂、类脂质体、醇质体、传递体、磷脂或鞘脂质体混合。
12.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其与一种或多种药学上可接受的运载体、缓冲剂、稀释剂、媒介物或赋形剂混合。
13.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其被配制用于全身施用至哺乳动物，并且优选静脉内施用至人类。
14.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其被改适并配置来作为治疗性试剂盒的一部分，所述试剂盒包含所述组合物和用于将所述组合物施用至有需要的人类的至少第一套说明书。
15.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其用于治疗、预防或改善哺乳动物疾病、病症、功能障碍、缺乏症、缺陷、创伤、损伤或异常病状的一种或多种症状。
16.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其用于治疗、预防或改善人类癌症的一种或多种症状。
17.一种分离的哺乳动物细胞群，其包含根据前述权利要求中任一项所述的组合物。
18.根据权利要求17所述的分离的哺乳动物细胞群，其特征在于，其是人类树突状细胞。
19.根据权利要求1至16中任一项所述的组合物在制造药物中的用途，所述药物用于治疗或改善哺乳动物受试者的癌症的至少一种症状。
20.根据权利要求19所述的用途，其中所述哺乳动物受试者是人类、非人类灵长类动物、伴侣动物、外来动物或家畜。
21.一种试剂盒，其包含：1)pSi微粒群或根据权利要求1至16中任一项所述的组合物；和2)用于向有需要的哺乳动物施用所述组合物的说明书，所述组合物的施用作为用于预防、诊断、治疗或改善所述哺乳动物的疾病、功能障碍、异常病状或创伤的一种或多种症状的方案的一部分。
22.一种治疗或改善有需要的动物的癌症的一种或多种症状的方法，所述方法包括向所述动物施用有效量的1)pSi微粒群或2)根据权利要求1至16中任一项所述的组合物，其施用时间足以治疗或改善所述动物的癌症的所述一种或多种症状。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述癌症被诊断为或被鉴定为难治性、转移性、复发性或治疗耐受性癌症。
24.根据权利要求22或权利要求23所述的方法，其中所述动物是哺乳动物。
25.根据权利要求22至24中任一项所述的方法，其中所述动物是人类。
26.根据权利要求22至25中任一项所述的方法，其中所述方法还包括向所述动物施用治疗有效量的辐射或其它化学治疗剂。
27.根据权利要求22至26中任一项所述的方法，其中将所述组合物以单次施用形式或以一系列多次施用的形式，在一天或多天期间、一周或多周期间或一个月或多个月期间或更久的时间内，全身施用至所述动物。
28.根据权利要求22至27中任一项所述的方法，其中所述组合物还包含：第二不同化疗剂或包含第二不同肿瘤特异性抗原的第二不同pSi微粒群。
29.一种向有需要的哺乳动物受试者的一个或多个细胞、组织、器官或系统施用诊断剂、治疗剂或预防剂的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1至16中任一项所述的组合物。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述细胞被鉴定为人类树突状细胞。
31.一种针对人类的癌症复发提供长期防护的方法，所述方法包括向有需要的人类受试者施用一定量的pSi微粒群或一定量的根据权利要求1至16中任一项所述的组合物，并且施用时间针对癌症复发有效地提供长期防护。
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