CN105828834A - 检查点抑制剂和治疗剂的组合以治疗癌症 - Google Patents

Abstract

本公开内容至少部分源于下述开创性认知：连续地、以任一次序地或基本上同时地包括检查点抑制剂和治疗剂的一个或多个周期和/或剂量的组合治疗方案在治疗一些受试者中的癌症中可以是更有效的，和/或可以起始、使实现、增加、增强或延长免疫细胞的活性和/或数目，或通过肿瘤的医学有益应答。

Description

检查点抑制剂和治疗剂的组合以治疗癌症

与相关申请的交叉参考

本申请根据35USC§119(e)要求于2013年11月5日提交的美国申请系列61/900,309，以及于2013年11月5日提交的美国申请系列61/900,355的优先权利益。先前申请的公开内容视为本申请的部分，并且通过引用的方式全文并入本申请的公开内容。

发明背景

发明领域

本发明一般涉及治疗癌症，并且更具体而言，涉及使用检查点抑制剂和治疗剂的组合治疗癌症的方法。

背景信息

越来越多的证据表明智胜机体的免疫应答的能力代表肿瘤发展的标志。像这样，研究者已开始着眼于用靶向试剂恢复免疫应答的方法，从而基本上通过治疗免疫系统来间接治疗癌症。用于实现这点的一种特别有希望的策略是靶向所谓的免疫检查点，其充当对免疫系统的T细胞的关闭开关。

使现有免疫应答“解锁”或使免疫应答的起始解锁的检查点抑制剂疗法在治疗受试者亚组中的癌症方面是非常有效的。然而，受试者亚组是相对小的群体，仅构成大约25％的癌症受试者群体(即，“响应受试者群体”)。相应地，虽然检查点抑制剂在治疗响应受试者群体中的癌症方面是非常有效的，但大约75％的癌症受试者不响应该疗法。此外，即使在响应群体中，应答也不一定是完全的或最佳的。

因为免疫检查点中的许多通过特异性受体和配体对之间的相互作用调节，所以单克隆抗体或其它试剂可以用于阻断该相互作用且阻止免疫抑制。近年来最受瞩目的两种检查点受体是CTLA-4和PD-1。

CTLA-4、PD-1及其配体是共信号传导分子的CD28-B7家族的成员，其在T细胞功能及其它细胞功能的所有阶段自始至终起重要作用。PD-1受体在活化T细胞(和B细胞)的表面上表达，并且在正常情况下，与其配体(PD-L1和PD-L2)结合，所述配体在抗原呈递细胞例如树突状细胞或巨噬细胞的表面上表达。该相互作用将信号发送到T细胞内，并且基本上将其关闭或抑制其。癌细胞通过在其表面上驱动高水平的PD-L1表达来利用这种系统。这允许其获得PD-1途径的控制，并且关闭可能进入肿瘤微环境的表达PD-1的T细胞，因此压制抗癌免疫应答。

第一类免疫疗法伊匹木单抗(Yervoy)(靶向T细胞表面上的细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)的单克隆抗体)被批准用于黑素瘤的治疗。现在，针对程序性死亡-1(PD-1)T细胞受体或其配体(PD-L1或PD-L2)的新靶向免疫疗法可以证明比伊匹木单抗更有效且甚至更安全。另外的检查点靶还可以证明是有效的，例如TIM-3、LAG-3、各种B-7配体、CHK1和CHK2激酶、BTLA、A2aR及其它。

目前，至少七种检查点抑制剂试剂在临床试验中。其中有全人和人源化的单克隆抗PD-1抗体，以及全人抗PD-L1抗体，以及组合PD-L2的细胞外结构域和IgG1的融合蛋白。这些试剂各自设计为阻断PD-1及其配体之间的相互作用，并且因此使T细胞(或其它细胞)的开/关保持在“开”的位置上，尽管它们各自具有略微不同的作用机制。

用于癌症治疗的另一种策略是组合检查点抑制剂与治疗剂。生物治疗剂包括抗体和疫苗已证明在癌症治疗中是有效的。检查点抑制剂和治疗剂(例如生物制品)的组合可以增强或延长受试者中的抗肿瘤应答。进一步地，生物治疗剂与检查点抑制剂一起施用可以增强或延长检查点抑制剂的效应，使得受试者能够响应检查点抑制剂，或使得能够减少检查点抑制剂的毒性或剂量。

因此，存在开发在非响应性受试者群体和响应受试者群体两者中起始或增强检查点抑制剂的有效性的方法和组合疗法的需要。本发明公开了起始、使实现、增强或改善抗肿瘤免疫应答的方法和组合疗法，以随后使实现、增强或改善针对检查点抑制剂的受试者或肿瘤应答。

发明概述

本公开内容至少部分源于下述开创性认知：连续地、以任一次序地或基本上同时地包括检查点抑制剂和治疗剂的一个或多个周期和/或剂量的组合治疗方案在治疗一些受试者中的癌症中可以是更有效的，和/或可以起始、使实现、增加、增强或延长免疫细胞的活性和/或数目，或通过肿瘤的医学有益应答。

相应地，在一个实施方案中，本发明提供了在有此需要的受试者中治疗癌症或者起始、增强或延长抗肿瘤应答的方法，其包括给受试者施用与其为检查点抑制剂的试剂组合的治疗剂。在一个方面，检查点抑制剂是生物学治疗剂或小分子。在另一个方面，检查点抑制剂是单克隆抗体、人源化抗体、全人抗体、融合蛋白或其组合。在一个进一步方面，检查点抑制剂抑制检查点蛋白质，所述检查点蛋白质可以是CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK1、CHK2、A2aR、B-7家族配体或其组合。在一个另外方面，检查点抑制剂与可以是下述的检查点蛋白质的配体相互作用：CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK1、CHK2、A2aR、B-7家族配体或其组合。在一个方面，治疗剂是免疫刺激试剂、T细胞生长因子、白介素、抗体、疫苗或其组合。在一个进一步方面，白介素是IL-7或IL-15。在一个特定方面，白介素是糖基化的IL-7。在一个另外方面，疫苗是树突状细胞(DC)疫苗。

在一个进一步方面，检查点抑制剂和治疗剂同时或以任一次序连续施用。在一个另外方面，治疗剂在检查点抑制剂之前施用。在一个特定方面，治疗剂是疫苗，并且检查点抑制剂是PD-1抑制剂。在一个进一步方面，疫苗是树突状细胞疫苗。

在一个方面，治疗由临床结果；通过T细胞的抗肿瘤活性增加、增强或延长；与治疗前的数目相比较，抗肿瘤T细胞或活化T细胞数目的增加，或其组合决定。在另一个方面，临床结果是肿瘤消退；肿瘤缩小；肿瘤坏死；通过免疫系统的抗肿瘤应答；肿瘤扩大、复发或扩散，或其组合。在一个另外方面，治疗效应通过T细胞的存在、指示T细胞炎症的基因标记的存在或其组合预测。

在另一个方面，受试者患有癌症。在一个另外方面，癌症是任何实体瘤或液体癌症，包括泌尿生殖癌(例如前列腺癌、肾细胞癌、膀胱癌)、妇科癌症(例如卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌)、肺癌、胃肠癌(例如非转移性或转移性结肠直肠癌、胰腺癌、胃癌、食道癌、肝细胞癌、胆管细胞癌)、头颈癌(例如头颈鳞状细胞癌)、恶性胶质母细胞瘤、恶性间皮瘤、非转移性或转移性乳腺癌(例如激素难治性转移性乳腺癌)、恶性黑素瘤、梅克尔细胞癌或骨与软组织肉瘤、和血液学瘤形成例如多发性骨髓瘤、急性髓性白血病、慢性髓性白血病、骨髓增生异常综合征和急性成淋巴细胞性白血病。在一个优选的实施方案中，疾病是非小细胞肺癌(NSCLC)、乳腺癌(例如激素难治性转移性乳腺癌)、头颈癌(例如头颈鳞状细胞癌)、转移性结肠直肠癌、激素敏感性或激素难治性前列腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、肝细胞癌、肾细胞癌、软组织肉瘤或小细胞肺癌。

在一个进一步方面，方法进一步包括在用组合疗法治疗之前、与用组合疗法治疗同时、或在用组合疗法治疗之后，给受试者施用化学治疗剂、靶向疗法或辐射。在一个另外方面，肿瘤可以在治疗剂和检查点抑制剂施用之前被切除。

在另一个实施方案中，本发明提供了增强或延长检查点抑制剂的效应，或使得受试者能够响应检查点抑制剂，或使得能够减少检查点抑制剂的毒性或剂量的方法，其包括给有此需要的受试者施用与检查点抑制剂组合的治疗剂，其中所述受试者患有癌症。在一个方面，检查点抑制剂是生物学治疗剂或小分子。在另一个方面，检查点抑制剂是单克隆抗体、人源化抗体、全人抗体、融合蛋白或其组合。在一个进一步方面，检查点抑制剂抑制检查点蛋白质，所述检查点蛋白质可以是CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK1、CHK2、A2aR、B-7家族配体或其组合。在一个方面，检查点抑制剂与可以是下述的检查点蛋白质的配体相互作用：CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK1、CHK2、A2aR、B-7家族配体或其组合。在一个另外方面，治疗剂是免疫刺激试剂、T细胞生长因子、白介素、抗体和疫苗或其组合。在一个进一步方面，白介素是IL-7或IL-15。在一个特定方面，白介素是糖基化的IL-7。在一个方面，疫苗是树突状细胞(DC)疫苗。

在一个进一步方面，检查点抑制剂和治疗剂同时或以任一次序连续施用。在一个另外方面，治疗剂在检查点抑制剂之前施用。在一个特定方面，治疗剂是疫苗，并且检查点抑制剂是PD-1抑制剂。在一个进一步方面，疫苗是树突状细胞疫苗。

在另一个方面，癌症是任何实体瘤或液体癌症，包括泌尿生殖癌(例如前列腺癌、肾细胞癌、膀胱癌)、妇科癌症(例如卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌)、肺癌、胃肠癌(例如非转移性或转移性结肠直肠癌、胰腺癌、胃癌、食道癌、肝细胞癌、胆管细胞癌)、头颈癌(例如头颈鳞状细胞癌)、恶性胶质母细胞瘤、恶性间皮瘤、非转移性或转移性乳腺癌(例如激素难治性转移性乳腺癌)、恶性黑素瘤、梅克尔细胞癌或骨与软组织肉瘤、和血液学瘤形成例如多发性骨髓瘤、急性髓性白血病、慢性髓性白血病、骨髓增生异常综合征和急性成淋巴细胞性白血病。在一个优选的实施方案中，疾病是非小细胞肺癌(NSCLC)、乳腺癌(例如激素难治性转移性乳腺癌)、头颈癌(例如头颈鳞状细胞癌)、转移性结肠直肠癌、激素敏感性或激素难治性前列腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、肝细胞癌、肾细胞癌、软组织肉瘤或小细胞肺癌。

在一个进一步方面，方法进一步包括在用组合疗法治疗之前、与用组合疗法治疗同时、或在用组合疗法治疗之后，给受试者施用化学治疗剂、靶向疗法或辐射。在一个另外方面，肿瘤可以在治疗剂和检查点抑制剂施用之前被切除。

在一个进一步的实施方案中，本发明提供了包含与治疗剂组合的检查点抑制剂的药物组合物。在一个方面，治疗剂是生物制品，并且生物学治疗剂是疫苗。

在一个实施方案中，本申请提供了用于癌症治疗的组合疗法，其中组合疗法包括过继性T细胞疗法和检查点抑制剂。在一个方面，过继性T细胞疗法包含自体和/或同种异体T细胞。在另一个方面，自体和/或同种异体T细胞靶向针对肿瘤抗原。在一个进一步方面，检查点抑制剂是PD-1或PDL-1检查点抑制剂。

在一个另外的实施方案中，本发明提供了增强抗肿瘤或抗癌免疫应答的方法，该方法包括给受试者施用过继性T细胞疗法和检查点抑制剂。在一个方面，过继性T细胞疗法在检查点抑制剂之前施用。在一个另外方面，过继性T细胞疗法在检查点抑制剂之前1-30天施用。在一个进一步方面，抗肿瘤应答是抑制肿瘤生长，诱导肿瘤细胞死亡、肿瘤消退，阻止或延迟肿瘤复发、肿瘤生长、肿瘤扩散或肿瘤消除。

在一个实施方案中，本发明提供了用于癌症治疗的组合疗法的方法，其中组合疗法包括(a)治疗性癌症疫苗或过继性T细胞疗法，和(b)检查点抑制剂。在一个方面，治疗性癌症疫苗是树突状细胞疫苗。在一个特定方面，治疗性癌症疫苗是树突状细胞疫苗。在一个特定方面，树突状细胞疫苗包括自体树突状细胞和/或同种异体树突状细胞。在特定方面，自体或同种异体树突状细胞在施用于受试者之前装载有癌抗原。在特定方面，自体或同种异体树突状细胞通过直接施用于肿瘤而装载有癌抗原。在特定方面，过继性T细胞疗法包含自体和/或同种异体T细胞。在特定方面，自体和/或同种异体T细胞靶向针对肿瘤抗原。在特定实施方案中，检查点抑制剂是PD-1、PDL-1或CTLA-4检查点抑制剂。

在另一个实施方案中，本发明提供了用于起始、维持或增强抗肿瘤免疫应答的方法，该方法包括给受试者施用(a)治疗性癌症疫苗或过继性T细胞疗法，和(b)检查点抑制剂。在特定方面，治疗性癌症疫苗或过继性T细胞疗法在检查点抑制剂之前施用。在特定实施方案中，治疗性癌症疫苗或过继性T细胞疗法在检查点抑制剂之前1-30天施用。在特定方面，抗肿瘤应答是肿瘤特异性应答、临床应答、肿瘤尺寸的减小、肿瘤特异性生物标记物的减少、增加的四聚体染色、抗肿瘤细胞因子的增加或其组合。在一个特定方面，临床应答是减少的肿瘤生长和/或肿瘤尺寸的减小。在一个特定方面，治疗性癌症疫苗或过继性T细胞疗法是癌细胞疫苗。在特定方面，过继性T细胞疗法包含自体和/或同种异体T细胞。在特定方面，自体和/或同种异体T细胞靶向针对肿瘤抗原。在一个特定方面，治疗性癌症疫苗是树突状细胞疫苗。在特定方面，树突状细胞疫苗包含自体树突状细胞和/或同种异体树突状细胞。在一个特定方面，检查点抑制剂是PD-1、PDL-1和/或CTLA-4检查点抑制剂。在一个特定方面，起始、维持或增强抗肿瘤免疫应答是用于癌症的治疗。

在一个进一步的实施方案中，本发明提供了用于增强检查点抑制剂的功效，或使得受试者能够响应检查点抑制剂的方法，该方法包括给受试者施用(a)治疗性癌症疫苗或过继性T细胞疗法，和(b)检查点抑制剂。在特定方面，30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的受试者响应治疗性癌症疫苗或过继性T细胞疗法和检查点抑制剂的施用。在特定方面，治疗性癌症疫苗或过继性T细胞疗法活化TH1T细胞。在特定方面，过继性T细胞疗法包含自体和/或同种异体T细胞。在特定方面，自体和/或同种异体T细胞靶向针对肿瘤抗原。在特定方面，治疗性癌症疫苗是癌细胞疫苗或树突状细胞疫苗。在特定方面，树突状细胞疫苗包含自体树突状细胞和/或同种异体树突状细胞。在一个特定方面，检查点抑制剂是PD-1、PDL-1和/或CTLA-4检查点抑制剂。在一个特定方面，增强功效是用于癌症的治疗。在特定方面，受试者患有癌症。

在一个实施方案中，本发明提供了用于治疗癌症的方法，该方法包括施用(a)治疗性癌症疫苗或过继性T细胞疗法，和(b)检查点抑制剂。在特定实施方案中，治疗性癌症疫苗或过继性T细胞疗法在检查点抑制剂之前施用。在特定方面，治疗性癌症疫苗或过继性T细胞疗法在检查点抑制剂之前1-30天施用。在特定方面，30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的受试者响应治疗性癌症疫苗或过继性T细胞疗法和检查点抑制剂的施用。在特定方面，治疗性癌症疫苗或过继性T细胞疗法活化TH1T细胞。在特定方面，治疗性癌症疫苗或过继性T细胞疗法是癌细胞疫苗或树突状细胞疫苗。在特定方面，癌细胞疫苗包含自体和/或同种异体T细胞。在特定方面，自体和/或同种异体T细胞靶向针对肿瘤抗原。在特定方面，树突状细胞疫苗包含自体和/或同种异体树突状细胞。在一个特定方面，检查点抑制剂是PD-1、PDL-1和/或CTLA-4检查点抑制剂。

在一个实施方案中，本发明提供了用于抑制肿瘤生长，或诱导肿瘤细胞死亡、肿瘤消退或肿瘤消除的方法，该方法包括施用(a)治疗性癌症疫苗或过继性T细胞疗法，和(b)检查点抑制剂。在特定方面，治疗性癌症疫苗或过继性T细胞疗法在检查点抑制剂之前施用。在特定方面，治疗性癌症疫苗或过继性T细胞疗法在检查点抑制剂之前1-30天施用。在特定方面，30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的受试者响应治疗性癌症疫苗或过继性T细胞疗法和检查点抑制剂的施用。在特定方面，治疗性癌症疫苗或过继性T细胞疗法活化TH1T细胞。在特定实施方案中，治疗性癌症疫苗或过继性T细胞疗法是癌细胞疫苗或树突状细胞疫苗。在特定方面，癌细胞疫苗包含自体和/或同种异体T细胞。在特定方面，自体和/或同种异体T细胞靶向针对肿瘤抗原。在特定方面，树突状细胞疫苗包含自体和/或同种异体树突状细胞。在一个特定方面，检查点抑制剂是PD-1、PDL-1和/或CTLA-4检查点抑制剂。

在一个进一步的实施方案中，本发明提供了用于预防或延迟肿瘤复发、肿瘤生长或肿瘤扩散的方法，该方法包括给受试者施用本文描述的治疗性癌症疫苗或过继性T细胞疗法和检查点抑制剂。

在另一个实施方案中，本发明提供了用于减少检查点抑制剂的毒性或使得能够用更低剂量的检查点抑制剂获得疗效的方法，该方法包括给受试者施用本文描述的治疗性癌症疫苗或过继性T细胞疗法和检查点抑制剂。

在一个另外的实施方案中，本发明提供了用于在检查点抑制剂施用之前诱导免疫应答的方法，该方法包括使用装载有自体或同种异体(例如来自细胞系)肿瘤抗原的自体或同种异体树突状细胞或者自体或同种异体T细胞，来起始或使实现抗肿瘤免疫应答，随后施用本文描述的一种或多种检查点抑制剂。

在一个实施方案中，本发明提供了用于在检查点抑制剂施用之前诱导免疫应答的方法，该方法包括使用装载有自体或同种异体(例如来自细胞系)肿瘤抗原的自体或同种异体树突状细胞或者自体或同种异体T细胞，来增强预先存在的抗肿瘤免疫应答，随后施用本文描述的一种或多种检查点抑制剂。

在另一个实施方案中，本发明提供了用于在检查点抑制剂施用之前诱导免疫应答的方法，该方法包括使用直接施用到肿瘤内或施用至肿瘤外周用于体内抗原装载的自体或同种异体树突状细胞，来起始或使实现抗肿瘤免疫应答，随后施用本文描述的一种或多种检查点抑制剂。

在一个进一步的实施方案中，本发明提供了用于在检查点抑制剂施用之前诱导免疫应答的方法，该方法包括使用直接施用到肿瘤内或施用至肿瘤外周用于体内抗原装载的自体或同种异体树突状细胞，来增强预先存在的抗肿瘤免疫应答，随后施用本文描述的一种或多种检查点抑制剂。

在一个实施方案中，本发明提供了用于在检查点抑制剂施用之前诱导免疫应答的方法，该方法包括使用装载有自体肿瘤抗原的同种异体树突状细胞，来起始抗肿瘤免疫应答，随后施用本文描述的一种或多种检查点抑制剂。

在一个另外的实施方案中，本发明提供了用于在检查点抑制剂施用之前诱导免疫应答的方法，该方法包括使用装载有自体肿瘤抗原的同种异体树突状细胞，来增强预先存在的抗肿瘤免疫应答，随后施用本文描述的一种或多种检查点抑制剂。

在另一个实施方案中，本发明提供了用于在检查点抑制剂施用之前诱导免疫应答的方法，该方法包括使用直接施用到肿瘤内或施用至肿瘤外周用于体内抗原装载的同种异体树突状细胞，来起始抗肿瘤免疫应答，随后施用本文描述的一种或多种检查点抑制剂。

在一个进一步的实施方案中，本发明提供了用于在检查点抑制剂施用之前诱导免疫应答的方法，该方法包括使用直接施用到肿瘤内或施用至肿瘤外周用于体内抗原装载的同种异体树突状细胞，来增强预先存在的抗肿瘤免疫应答，随后施用本文描述的一种或多种检查点抑制剂。

在一个实施方案中，本发明提供了用于在检查点抑制剂施用之前诱导免疫应答的方法，该方法包括使用离体扩增和/或活化的自体抗肿瘤T细胞，来起始抗肿瘤免疫应答，随后施用本文描述的一种或多种检查点抑制剂。

在另一个实施方案中，本发明提供了用于在检查点抑制剂施用之前诱导免疫应答的方法，该方法包括使用离体扩增和/或活化的抗肿瘤T细胞，来增强预先存在的抗肿瘤免疫应答，随后施用本文描述的一种或多种检查点抑制剂。

在一个另外的实施方案中，本发明提供了用于使用(a)治疗性癌症疫苗或过继性T细胞疗法和(b)检查点抑制剂诱导或增强肿瘤应答的方法。在特定实施方案中，肿瘤应答是触发程序性细胞死亡。在特定实施方案中，肿瘤应答是肿瘤细胞数目的减少。在特定实施方案中，肿瘤应答是肿瘤生长的速率减少。在特定实施方案中，肿瘤应答是激酶途径的阻断。在特定实施方案中，肿瘤应答是TH1细胞的活化。在特定实施方案中，肿瘤应答是活化的T细胞应答。在特定实施方案中，肿瘤应答的质量可以通过TH1与TH2应答的比率进行测量，其中高TH1应答指示高质量应答。

在一个进一步的实施方案中，本文描述的检查点抑制剂可以包含一种或多种分开的检查点抑制剂。此外，本文描述的(a)治疗性癌症疫苗或过继性T细胞疗法和(b)检查点抑制剂的施用可以减少待施用于受试者或患者的检查点抑制剂的有效量。进一步地，检查点抑制剂的减少的量可以减少检查点抑制剂的毒性，并且增加受试者对检查点抑制剂的耐受。

附图简述

图1A-C显示了DC疫苗在良好建立的神经胶质瘤中促进活化淋巴细胞浸润，而无治疗益处。(A)DC疫苗相较于对照促进淋巴细胞(CD3+)的显著肿瘤浸润。(B)显著比例的这些细胞是活化的淋巴细胞(CD3+CD8+CD25+)。(C)在DC疫苗和对照组之间未记录到存活益处。

图2A-B显示在DC疫苗后，在肿瘤微环境中存在抑制性髓样细胞的增加的累积。(A)荷瘤对照显示肿瘤浸润性髓样细胞(Thy1.2-Ly6C+)的增加。该群体在用DC疫苗处理的小鼠中显著更多。(B)显著百分比的这些髓样细胞表达PD-L1(Thy1.2-Ly6C+PD-L1+)。

图3A-G显示PD-1的阻断阻止抑制性髓样细胞的累积，并且促进活化淋巴细胞浸润，且具有治疗益处。(A)在DC疫苗接种的小鼠和用佐剂抗PD-1Ab处理的DC疫苗小鼠(DC疫苗/抗PD-1Ab)之间，淋巴结中的CD8+群体中不存在差异。(B)在每个处理组的淋巴结中发现活化CD8+CD25+T细胞的较小群体，其无统计学不同。(C，D)当与接受单独的DC疫苗接种的组相比较时，抑制性髓样群体在DC疫苗/抗PD-1处理的小鼠中显著减少。(E)与单独的DC疫苗接种相比较，在DC疫苗/抗PD-1处理的小鼠中存在活化细胞毒性肿瘤浸润淋巴细胞的可比较群体。(F)组合DC疫苗/抗PD-1处理显示显著的存活益处。(G)在第75天时，用GL261鼠神经胶质瘤的对侧颅内植入物再攻击来自(F)的存活DC疫苗/抗PD-1处理的鼠，无另外处理。当与对照小鼠相比较时，记录到显著的存活益处。

图4A-B显示肿瘤裂解产物脉冲的树突状细胞下调PD-L1的表达。(A)描述在裂解产物脉冲前和后在PD-L1表达中的变化的代表性直方图。(B)树突状细胞用肿瘤裂解产物脉冲24小时且随后就PD-L1表达进行分析。绘制PD-L1表达的荧光强度中值(MFI)。

发明详述

本公开内容至少部分源于下述开创性认知：连续地、以任一次序地或基本上同时地包括检查点抑制剂和治疗剂的一个或多个周期和/或剂量的组合治疗方案在治疗一些受试者中的癌症中可以是更有效的，和/或可以起始、使实现、增加、增强或延长免疫细胞的活性和/或数目，或通过肿瘤的医学有益应答。

在描述本文组合物和方法之前，应理解本发明并不限于所述的具体组合物、方法和实验条件，因为这样的组合物、方法和条件可以改变。还应理解本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并且不预期是限制性的，因为本发明的范围仅限制于所附权利要求中。

除非另有定义，否则本文使用的所有科学和技术术语均具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。尽管与本文描述的那些相似或等价的任何方法和材料均可用于本发明的实践或测试中，但现在描述优选方法和材料。

如本说明书和所附权利要求中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数参考，除非上下文另有明确说明。因此，例如，对“方法”的提及包括在阅读本公开内容后对于本领域技术人员将是明显的本文所描述的类型的一种或多种方法和/或步骤等等。

如本文使用的，术语“治疗剂”或“治疗剂”指在受试者中产生治疗应答的任何医学产品。

如本文使用的，术语“生物学治疗剂”或“生物药剂”指在生物源中制造或由生物源提取的任何医学产品。生物药剂不同于化学合成的药物产品。生物药剂的例子包括疫苗、血液或血液成分、过敏原、体细胞、基因疗法、组织、重组治疗性蛋白质、包括抗体治疗剂和融合蛋白、以及活细胞。生物制品可以由糖、蛋白质或核酸或这些物质的复杂组合组成，或可以是活实体例如细胞和组织。生物制品从各种天然来源(人、动物或微生物)中分离，并且可以通过生物技术方法和其它技术产生。生物学治疗剂的具体例子包括但不限于免疫刺激试剂、T细胞生长因子、白介素、抗体、融合蛋白和疫苗例如癌症疫苗。

如本文使用的，术语“抗体”指免疫球蛋白或其部分，并且涵盖包含抗原结合位点的任何多肽，与来源、起源物种、生产方法和特征无关。抗体可以包括重和/或轻链或其片段。本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物包括但不限于多克隆、单克隆、多特异性、人、人源化、灵长类动物化或嵌合的抗体、单链抗体、表位结合片段例如Fab、Fab'和F(ab')₂、Fd、Fv、单链Fv(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fv(sdFv)、包含VL或VH结构域的片段、由Fab表达文库产生的片段、以及抗独特型(抗Id)抗体。ScFv分子是本领域已知的，并且在例如美国专利号5,892,019中描述。本发明的免疫球蛋白或抗体分子可以具有任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、种类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类的免疫球蛋白分子。

细胞表面受体是抗体疗法的常见靶，并且包括表皮生长因子受体和HER2。一旦与癌抗原结合，抗体可以诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，活化补体系统，阻止受体与其配体相互作用，或递送化学疗法或辐射的有效载荷，所有这些均可以导致细胞死亡。批准作为治疗剂的抗体包括美罗华(利妥昔单抗)；赛尼哌(达利珠单抗)；舒莱(巴利昔单抗)；Synagis(帕利珠单抗)；类克(英利昔单抗)；赫赛汀(曲妥珠单抗)；Mylotarg(吉妥单抗奥佐米星)；Campath(阿仑珠单抗)；泽娃灵(替伊莫单抗)；Humira(阿达木单抗)；Xolair(奥马珠单抗)；Bexxar(托西莫单抗-I-131)；Raptiva(依法珠单抗)；爱必妥(西妥昔单抗)；阿瓦斯丁(贝伐珠单抗)；Tysabri(那他珠单抗)；Actemra(托珠单抗)；维克替比(帕木单抗)；Lucentis(雷珠单抗)；Soliris(依库珠单抗)；Cimzia(赛妥珠单抗)；Simponi(戈利木单抗)；Ilaris(卡那奴单抗)；Stelara(乌司奴单抗)；Arzerra(奥法木单抗)；Prolia(地舒单抗)；Numax(莫维珠单抗)；ABThrax(雷昔库单抗)；Benlysta(贝利木单抗)；Yervoy(依匹木单抗)；Adcetris(布妥昔单抗)；Perjeta(帕妥珠单抗)；Kadcyla(Ado-曲妥珠单抗emtansine)；和Gazyva(阿托珠单抗)。

如本文使用的，术语“融合蛋白”指嵌合分子，其包含例如具有至少一个靶结合位点的免疫球蛋白抗原结合结构域，和至少一个异源部分(即在自然界中不与其天然连接的部分)。氨基酸序列通常可以存在于分开的蛋白质中，其在融合多肽中聚在一起，或它们通常可以存在于相同蛋白质中，但在融合多肽中以新排列放置。融合蛋白可以例如通过化学合成，或通过生成和翻译多核苷酸进行制备，在所述多核苷酸中，肽区域以所需关系编码。

如本文使用的，术语“靶向疗法”指靶向免疫系统的任何方面的任何治疗分子。

如本文使用的，术语“癌症”指特征在于在体外(例如经转化的细胞)或体内的过度增殖性细胞生长的广泛病症类别。可以通过本发明的组合物和方法治疗或预防的病况包括例如各种赘生物，包括良性或恶性肿瘤，各种增生等等。本发明的化合物和方法可以实现这样的病况中所牵涉的不希望有的过度增殖性细胞生长的抑制和/或逆转。癌症的具体例子包括急性成淋巴细胞性白血病，成人；急性成淋巴细胞性白血病，儿童期；急性髓样白血病，成人；肾上腺皮质癌；肾上腺皮质癌，儿童期；AIDS相关淋巴瘤；AIDS相关恶性肿瘤；直肠癌；星形细胞瘤，儿童期小脑；星形细胞瘤，儿童期大脑；胆管癌，肝外；膀胱癌；膀胱癌，儿童期；骨癌、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤；脑干神经胶质瘤，儿童期；脑瘤，成人；脑瘤，脑干神经胶质瘤，儿童期；脑瘤，小脑星形细胞瘤，儿童期；脑瘤，大脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤，儿童期；脑瘤，室管膜瘤，儿童期；脑瘤，髓母细胞瘤，儿童期；脑瘤，幕上原始神经外胚层肿瘤，儿童期；脑瘤，视通路和下丘脑神经胶质瘤，儿童期；脑瘤，儿童期(其它)；乳腺癌；乳腺癌和妊娠；乳腺癌，儿童期；乳腺癌，男性；支气管腺瘤/类癌瘤，儿童期；类癌瘤肿瘤，儿童期；类癌瘤肿瘤，胃肠道；癌，肾上腺皮质；癌，岛细胞；原发部位不明癌；中枢神经系统淋巴瘤，原发性；小脑星形细胞瘤，儿童期；大脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤，儿童期；宫颈癌；儿童期癌；慢性淋巴细胞性白血病；慢性髓性白血病；慢性骨髓增殖性病症；腱鞘的透明细胞肉瘤；结肠癌；结肠直肠癌，儿童期；皮肤T细胞淋巴瘤；子宫内膜癌；室管膜瘤，儿童期；上皮癌，卵巢；食道癌；食道癌，儿童期；尤因(Ewing)家族肿瘤；颅外生殖细胞瘤，儿童期；性腺外生殖细胞瘤；肝外胆管癌、眼癌，眼内黑素瘤；眼癌，视网膜母细胞瘤；胆囊癌；胃(胃部)癌；胃(胃部)癌，儿童期；胃肠道类癌瘤；生殖细胞瘤，颅外，儿童期；生殖细胞瘤，性腺外；生殖细胞瘤，卵巢；妊娠滋养细胞肿瘤；神经胶质瘤，儿童期脑干；神经胶质瘤，儿童期视通路和下丘脑；多毛细胞白血病；头颈癌；肝细胞(肝)癌，成人(原发性)；肝细胞(肝)癌，儿童期(原发性)；何杰金氏淋巴瘤，成人；何杰金氏淋巴瘤，儿童期；在妊娠期间的何杰金氏淋巴瘤；下咽癌；下丘脑和视通路神经胶质瘤，儿童期；眼内黑素瘤；胰岛细胞癌(内分泌胰腺)；卡波济氏肉瘤；肾癌；喉癌；喉癌，儿童期；白血病，急性成淋巴细胞性，成人；白血病，急性成淋巴细胞性，儿童期；白血病，急性髓样，成人；白血病，急性髓样，儿童期；白血病，慢性淋巴细胞性；白血病，慢性髓性；白血病，多毛细胞；唇和口腔癌；肝癌，成人(原发性)；肝癌，儿童期(原发性)；肺癌，非小细胞；肺癌，小细胞；成淋巴细胞性白血病，成人急性；成淋巴细胞性白血病，儿童期急性；淋巴细胞性白血病，慢性；淋巴瘤，AIDS相关的；淋巴瘤，中枢神经系统(原发性)；淋巴瘤，皮肤T细胞；淋巴瘤，何杰金氏，成人；淋巴瘤，何杰金氏，儿童期；淋巴瘤，在妊娠期间的何杰金氏；淋巴瘤，非何杰金氏，成人；淋巴瘤，非何杰金氏，儿童期；淋巴瘤，在妊娠期间的非何杰金氏；淋巴瘤，原发性中枢神经系统；巨球蛋白血症，瓦尔登斯特伦氏(Waldenstrom's)；男性乳腺癌；恶性间皮瘤，成人；恶性间皮瘤，儿童期；恶性胸腺瘤；髓母细胞瘤，儿童期；黑素瘤；黑素瘤，眼内；梅克尔(Merkel)细胞癌；间皮瘤，恶性；原发部位不明鳞状颈部转移癌；多发性内分泌肿瘤综合征，儿童期；多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤；蕈样肉芽肿病；骨髓增生异常综合征；髓性白血病，慢性；髓样白血病，儿童期急性；骨髓瘤，多发性；骨髓增殖性病症，慢性；鼻腔和鼻旁窦癌；鼻咽癌；鼻咽癌，儿童期；神经母细胞瘤；神经纤维瘤；非何杰金氏淋巴瘤，成人；非何杰金氏淋巴瘤，儿童期；在妊娠期间的非何杰金氏淋巴瘤；非小细胞肺癌；口癌，儿童期；口腔和唇癌；口咽癌；骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤；卵巢癌，儿童期；卵巢上皮癌；卵巢生殖细胞瘤；卵巢低潜在恶性肿瘤；胰腺癌；胰腺癌，儿童期；胰腺癌，岛细胞；鼻旁窦和鼻腔癌；甲状旁腺癌；阴茎癌；嗜铬细胞癌；松果体和幕上原始神经外胚层肿瘤，儿童期；垂体瘤；浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤；胸膜肺母细胞瘤；妊娠和乳腺癌；妊娠和何杰金氏淋巴瘤；妊娠和非何杰金氏淋巴瘤；原发性中枢神经系统淋巴瘤；原发性肝癌，成人；原发性肝癌，儿童期；前列腺癌；直肠癌；肾细胞(肾)癌；肾细胞癌，儿童期；肾盂和输尿管，移行细胞癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤，儿童期；唾液腺癌；唾液腺癌，儿童期；肉瘤，尤因家族肿瘤；肉瘤，卡波济氏；肉瘤(骨肉瘤)/骨恶性纤维组织细胞瘤；肉瘤，横纹肌肉瘤，儿童期；肉瘤，软组织，成人；肉瘤，软组织，儿童期；塞扎里综合征；皮肤癌；皮肤癌，儿童期；皮肤癌(黑素瘤)；皮肤癌，梅克尔细胞；小细胞肺癌；小肠癌；软组织肉瘤，成人；软组织肉瘤，儿童期；原发部位不明鳞状颈癌，转移性；胃(胃部)癌；胃(胃部)癌，儿童期；幕上原始神经外胚层肿瘤，儿童期；T细胞淋巴瘤，皮肤；睾丸癌；胸腺瘤，儿童期；胸腺瘤，恶性；甲状腺癌；甲状腺癌，儿童期；肾盂和输尿管移行细胞癌；滋养细胞瘤，妊娠期；原发部位不明瘤，儿童期；儿童期罕见癌；输尿管和肾盂，移行细胞癌；尿道癌；子宫肉瘤；阴道癌；视通路和下丘脑神经胶质瘤，儿童期；外阴癌；瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症；和肾母细胞瘤。

如本文使用的，术语“改善存活”指患有癌症或增殖性疾病的受试者的寿命或生活质量的增加。例如，改善存活还包括促进癌症缓解，预防肿瘤侵入，预防肿瘤复发，减缓肿瘤生长，预防肿瘤生长，减小肿瘤尺寸，并减少总癌细胞计数。

如本文使用的，术语“预防病症”不意味着是绝对术语。相反，例如癌症的预防指症状的发作延迟，症状频率的减少，与未接受本文描述的方法、组合物或治疗中的至少一种的相似受试者相比较，受试者显示出与病症相关的症状或获得病症的可能性减少，或减少与癌症相关的症状的严重性。预防因此指本领域技术人员应理解的广泛范围的预防措施。在一些情况下，症状的频率和严重性减少至非病理性水平，例如使得个体可以延迟侵入性癌症治疗例如侵袭性化学疗法和手术。

如本文使用的，术语“治疗癌症”不意味着是绝对术语。在一些方面，本发明的组合物和方法寻求减少肿瘤尺寸或癌细胞数目，促使癌症进入缓解，或阻止癌细胞的尺寸或细胞数目的生长。在一些情况下，治疗导致改善的预后。

如本文使用的，术语“需要治疗的受试者”指已诊断有癌症或细胞增殖性病症的个体或受试者。

术语“治疗有效的”、“治疗有效量”、“有效量”或“以有效的量”指促进所需生理应答的足够量或剂量，例如但不限于足以促进T细胞应答的量或剂量。

如本文使用的，术语“PD-1抗体”指通过使PD-1激动来拮抗淋巴细胞的活性和/或增殖的抗体。术语“拮抗活性”指淋巴细胞增殖或活性中至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的下降(或减少)。术语“拮抗”可以与术语“抑制性”和“抑制”互换使用。PD-1介导的活性可以使用如本文描述的T细胞增殖测定法进行定量测定。

本公开内容的一个方面提供了可以充当PD-1的激动剂，从而调整由PD-1调节的免疫应答的抗体。在一个实施方案中，抗PD-1抗体可以是新型抗原结合片段。本文公开的抗PD-1抗体能够结合包括人PD-1且拮抗PD-1，从而抑制表达PD-1的免疫细胞的功能。在一些实施方案中，免疫细胞是表达PD-1的活化淋巴细胞，例如T细胞、B细胞和/或单核细胞。

如本文使用的，术语“肿瘤应答”指细胞应答包括但不限于触发程序性细胞死亡。

如本文使用的，术语“抗肿瘤应答”指免疫系统应答，包括但不限于活化T细胞以攻击抗原或抗原呈递细胞。

如本文使用的，术语“起始”指开始第一抗肿瘤应答或开始第二或“增强的”抗肿瘤应答。

如本文使用的，术语“使实现”指允许受试者响应或肿瘤细胞响应本文公开的治疗，其中所述受试者或肿瘤细胞先前无法响应治疗或具有对治疗的低应答。

如本文使用的，术语“增强”指允许受试者或肿瘤细胞改善其响应本文公开的治疗的能力。例如，增强的应答可以包含应答性中5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％或更多的增加。如本文使用的，“增强”还可以指增加响应治疗例如检查点抑制剂疗法的受试者数目。例如，增强的应答可以指响应治疗的受试者总百分比，其中百分比是5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％或更多。

如本文使用的，术语“小分子”指低分子量(<900道尔顿)有机化合物，其可以帮助调节生物过程，具有在10^-9m级别上的大小。大多数药物是小分子。

本发明描述了基于活化适应性免疫抵抗的新型组合治疗。适应性免疫抵抗机制意味着可以阻断诱导的免疫检查点蛋白质的试剂将是最低限度有效的，因为它们仅在存在预先存在的抗肿瘤免疫应答(即活化的T细胞)时才起作用。对于不具有预先存在的抗肿瘤应答的患者，检查点抑制剂将不是有效的。因此，可以活化抗肿瘤活性(即抗肿瘤免疫应答)且抑制检查点的组合治疗是优选的，因为它将允许不响应单独的任一治疗的受试者获益于组合治疗。

树突状细胞(DC)已显示协调T细胞抗肿瘤应答，并且利用DC以在胶质母细胞瘤受试者中诱导抗肿瘤免疫的主动疫苗接种策略已进行了测试。多个研究报道在DC疫苗处理后显著且有效的免疫应答。用内源自调节机制的佐剂调节进一步促进该免疫疗法的可能性是有利的。

树突状细胞是在各种淋巴样和非淋巴样组织中发现的抗原呈递细胞的多样化群体(参见Liu，Cell106:259-62(2001)；Steinman，Ann.Rev.Immunol.9:271-96(1991))。树突状细胞包括脾的淋巴样树突状细胞、表皮的朗格汉斯细胞、以及血液循环中的褶皱细胞。共同地，树突状细胞基于其形态、高水平的表面MHCII类表达以及在T细胞、B细胞、单核细胞和天然杀伤细胞上表达的某些其它表面标记物的不存在而分类为一组。特别地，单核细胞衍生的树突状细胞(也称为单核细胞树突状细胞)通常表达CD11c、CD80、CD86，并且是HLA-DR⁺，但是CD14^-。

相比之下，单核细胞树突状细胞前体(通常为单核细胞)通常为CD14⁺。单核细胞树突状细胞前体可以得自它们位于其中的任何组织，特别是淋巴样组织例如脾、骨髓、淋巴结和胸腺。单核细胞树突状细胞前体还可以从循环系统中分离。外周血是容易获得的单核细胞树突状细胞前体来源。脐带血是单核细胞树突状细胞前体的另一个来源。单核细胞树突状细胞前体可以从其中可以引发免疫应答的各种生物体中分离。这样的生物体包括动物，例如包括人和非人动物，例如灵长类动物、哺乳动物(包括狗、猫、小鼠和大鼠)、鸟(包括鸡)、及其转基因物种。在某些实施方案中，单核细胞树突状细胞前体和/或未成熟树突状细胞可以从健康受试者或需要免疫刺激的受试者中分离，例如癌症受试者或对于其细胞免疫刺激可以是有益或需要的其它受试者(即，具有细菌或病毒感染等等的受试者)。树突状细胞前体和/或未成熟树突状细胞还可以得自HLA匹配的健康个体，用于部分活化和施用于需要免疫刺激的HLA匹配的受试者。

分离且修饰树突状细胞前体的方法可以在美国专利公开号20060057120中找到，所述美国专利公开通过引用并入本文。

免疫检查点调节免疫系统中的T细胞功能。T细胞在细胞介导的免疫中起关键作用。检查点蛋白质与特异性配体相互作用，所述特异性配体将信号发送到T细胞内，并且基本上关闭或抑制T细胞功能。癌细胞通过在其表面上驱动高水平的检查点蛋白质表达来利用这种系统，其导致在进入肿瘤微环境的T细胞的表面上表达检查点蛋白质的T细胞的控制，因此压制抗癌免疫应答。像这样，检查点蛋白质的抑制将导致T细胞功能的恢复和针对癌细胞的免疫应答。检查点蛋白质的例子包括但不限于CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4(属于CD2分子家族，并且在所有NK、γδ和记忆CD8⁺(αβ)T细胞上表达)、CD160(也称为BY55)、CGEN-15049、CHK1和CHK2激酶、A2aR和各种B-7家族配体。

程序性细胞死亡蛋白质1(PD-1)是288个氨基酸的细胞表面蛋白质分子，在T细胞和前B细胞上表达，并且在其命运/分化中起作用。PD-1具有两种配体，PD-L1和PD-L2，其为B7家族的成员。PD-L1蛋白质响应LPS和GM-CSF处理在巨噬细胞和树突状细胞(DC)上是上调的，并且在TCR和B细胞受体信号传导后在T细胞和B细胞上是上调的，而在静止小鼠中，PD-L1mRNA可以在心脏、肺、胸腺、脾和肾中检测到。PD-1负面调节T细胞应答。

PD-1已显示涉及响应慢性抗原调节T细胞活化和T细胞耐受之间的平衡。例如，PD-1表达已在HIV感染中得到广泛研究。在HIV1感染期间，已发现PD-1的表达在CD4+T细胞中是增加的。当在慢性抗原暴露的存在下观察到T细胞功能障碍时，如在HIV感染的情况下一样，认为PD-1上调与T细胞耗尽(定义为关键效应子功能的进行性丧失)相关联。PD-1上调还可能与在慢性病毒感染期间在这些相同细胞集合中增加的细胞凋亡相关(参见Petrovas等人，(2009)JImmunol.183(2):1120-32)。

PD-1还在肿瘤特异性逃避免疫监视中起作用。已证实PD-1在慢性髓性白血病(CML)和急性髓性白血病(AML)两者中的肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)中高度表达。PD-1还在黑素瘤浸润T淋巴细胞(TIL)中是上调的(参见Dotti(2009)Blood114(8):1457-58)。已发现肿瘤表达PD-1配体(PDL-1和PDL-2)，当与CTL中的PD-1上调组合时，其可以是T细胞功能性丧失和CTL无法介导有效抗肿瘤应答中的贡献因素。研究者已显示在由淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)慢性感染的小鼠中，抗PD-1抗体的施用阻断PD-1-PDL相互作用，并且能够恢复一些T细胞功能性(增殖和细胞因子分泌)，并且导致病毒负荷的减少(Barber等人(2006)Nature439(9):682-687)。

肿瘤细胞自身表达PD-L1，并且被认为经由此机制限制T细胞应答。已进一步显示PD-1的抑制在B16黑素瘤模型中导致效应T细胞的扩增和T调节细胞群体的限制。PD-1、CTLA-4或IDO的阻断恢复IL-2产生，并且允许肿瘤微环境中存在的CD8+T细胞的增殖增加。已显示抗PDL1治疗恢复并允许抗原特异性疫苗生成的CD8+T细胞的扩增以排斥肿瘤。这些数据表明PD-1/PD-L1轴调节活化的肿瘤特异性T细胞。

黑素瘤中的临床试验已显示伴随抗PD-1阻断的强抗肿瘤应答。在晚期黑素瘤、非小细胞肺癌、前列腺癌、肾细胞癌和结肠直肠癌的情况下，使用PD-1抑制的显著利益已得到描述。在鼠模型中的研究已将该证据应用于神经胶质瘤疗法。辅助辐射的抗PD-1阻断在具有神经胶质瘤的小鼠中促进细胞毒性T细胞群体和相关的长期存活益处。当施用IDO、CTLA-4和PD-L1抑制剂的组合治疗时，肿瘤浸润Treg的减少和增加的存活已得到描述。

存在目前在临床试验中测试的几种PD-1抑制剂。CT-011是针对PD-1的人源化IgG1单克隆抗体。近期完成了在患有弥散性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)的受试者中的II期临床试验，所述受试者已经历自体干细胞移植。初步结果证实70％的受试者在随访期结束时是无进展的，相比之下对照组中为47％，并且82％的受试者是存活的，相比之下对照组中为62％。该试验证实CT-011不仅阻断PD-1功能，它还加强天然杀伤细胞的活性，因此强化抗肿瘤免疫应答。

BMS936558是处于I期试验中的靶向PD-1试剂的全人IgG4单克隆抗体，在患有晚期、难治性恶性肿瘤的受试者中BMS-936558的每两周一次施用显示持久的部分或完全缓解。最显著的应答率在患有黑素瘤(28％)和肾细胞癌(27％)的受试者中观察到，但在患有非小细胞肺癌(NSCLC)的受试者中也观察到显著的临床活性，并且一些应答持续超过一年。它还是相对良好耐受的；≥3级的不利事件在14％的受试者中出现。

BMS936559是靶向PD-1配体PD-L1的全人IgG4单克隆抗体。I期结果显示该药物的每两周一次施用导致持久应答，尤其是在患有黑素瘤的受试者中。客观应答率范围为6％-17％，取决于患有晚期NSCLC、黑素瘤、RCC或卵巢癌的受试者中的癌症类型，其中一些受试者经历持续一年或更久的应答。

MK3475是在五部分研究中在I期开发中的人源化IgG4抗PD-1单克隆抗体，所述研究评估药物在患有进行性、局部晚期或转移性癌、黑素瘤或NSCLC的受试者中的给药、安全和耐受性。

MPDL3280A是单克隆抗体，其也靶向PD-L1，经历在患有BRAFV600-突变型转移性黑素瘤的受试者中与BRAF抑制剂维罗非尼组合的I期测试，以及在患有晚期实体瘤的受试者中与靶向血管内皮生长因子受体(VEGFR)的贝伐珠单抗组合，连同或不连同化学疗法的I期测试。

AMP224是第二PD-1配体PD-L2的细胞外结构域和IgG1的融合蛋白，其具有阻断PD-L2/PD-1相互作用的潜力。AMP-224目前作为单一疗法在患有晚期癌症的受试者中经历I期测试。

Medi4736是在患有晚期恶性黑素瘤、肾细胞癌、NSCLC和结肠直肠癌的受试者中的I期临床测试中的抗PD-L1抗体。

CTLA4(细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白质)是下调免疫系统的蛋白质受体。CTLA4在T细胞的表面上发现，其导致对抗原的细胞免疫攻击。T细胞攻击可以通过刺激T细胞上的CD28受体而开启。T细胞攻击可以通过刺激CTLA4受体而关闭。第一类免疫疗法伊匹木单抗(Yervoy)(靶向T细胞表面上的CTLA-4的单克隆抗体)被批准用于黑素瘤的治疗。

相应地，在一个实施方案中，本发明提供了在有此需要的受试者中治疗癌症或者起始、增强或延长抗肿瘤应答的方法，其包括给受试者施用与其为检查点抑制剂的试剂组合的治疗剂。在一个方面，检查点抑制剂是生物学治疗剂或小分子。在另一个方面，检查点抑制剂是单克隆抗体、人源化抗体、全人抗体、融合蛋白或其组合。在一个进一步方面，检查点抑制剂抑制检查点蛋白质，其可以是CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK1、CHK2、A2aR、B-7家族配体或其组合。在一个另外方面，检查点抑制剂与可以是下述的检查点蛋白质的配体相互作用：CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK1、CHK2、A2aR、B-7家族配体或其组合。在一个方面，治疗剂是免疫刺激试剂、T细胞生长因子、白介素、抗体、疫苗或其组合。在一个进一步方面，白介素是IL-7或IL-15。在一个特定方面，白介素是糖基化的IL-7。在一个另外方面，疫苗是树突状细胞疫苗。

在一个进一步方面，检查点抑制剂和治疗剂同时或以任一次序连续施用。在一个另外方面，治疗剂在检查点抑制剂之前施用。在一个特定方面，治疗剂是疫苗，并且检查点抑制剂是PD-1抑制剂。在一个进一步方面，疫苗是树突状细胞疫苗。

在一个方面，治疗由临床结果；通过T细胞的抗肿瘤活性增加、增强或延长；与治疗前的数目相比较，抗肿瘤T细胞或活化T细胞数目的增加，或其组合决定。在另一个方面，临床结果是肿瘤消退；肿瘤缩小；肿瘤坏死；通过免疫系统的抗肿瘤应答；肿瘤扩大，复发或扩散或其组合。在一个另外方面，治疗效应通过T细胞的存在、指示T细胞炎症的基因标记的存在或其组合预测。

在另一个方面，受试者患有癌症。在一个另外方面，癌症是任何实体瘤或液体癌症，包括泌尿生殖癌(例如前列腺癌、肾细胞癌、膀胱癌)、妇科癌症(例如卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌)、肺癌、胃肠癌(例如非转移性或转移性结肠直肠癌、胰腺癌、胃癌、食道癌、肝细胞癌、胆管细胞癌)、头颈癌(例如头颈鳞状细胞癌)、恶性胶质母细胞瘤、恶性间皮瘤、非转移性或转移性乳腺癌(例如激素难治性转移性乳腺癌)、恶性黑素瘤、梅克尔细胞癌或骨与软组织肉瘤、和血液学瘤形成例如多发性骨髓瘤、急性髓性白血病、慢性髓性白血病、骨髓增生异常综合征和急性成淋巴细胞性白血病。在一个优选的实施方案中，疾病是非小细胞肺癌(NSCLC)、乳腺癌(例如激素难治性转移性乳腺癌)、头颈癌(例如头颈鳞状细胞癌)、转移性结肠直肠癌、激素敏感性或激素难治性前列腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、肝细胞癌、肾细胞癌、软组织肉瘤或小细胞肺癌。

在一个进一步方面，该方法进一步包括在用组合疗法治疗之前、与用组合疗法治疗同时、或在用组合疗法治疗之后，给受试者施用化学治疗剂、靶向疗法或辐射。在一个另外方面，肿瘤可以在治疗剂和检查点抑制剂施用之前被切除。

检查点抑制剂包括以统计上显著的方式阻断或抑制免疫系统的抑制途径的任何试剂。这样的抑制剂可以包括小分子抑制剂，或可以包括结合且阻断或抑制免疫检查点受体的抗体或其抗原结合片段，或者结合且阻断或抑制免疫检查点受体配体的抗体。可以被靶向用于阻断或抑制的举例说明性检查点分子包括但不限于CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、GAL9、LAG3、TIM3、VISTA、KIR、2B4(属于CD2分子家族，并且在所有NK、γδ和记忆CD8⁺(αβ)T细胞上表达)、CD160(也称为BY55)、CGEN-15049、CHK1和CHK2激酶、A2aR和各种B-7家族配体。B7家族配体包括但不限于B7-1、B7-2、B7-DC、B7-H1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H5、B7-H6和B7-H7。检查点抑制剂包括抗体或其抗原结合片段、其它结合蛋白、生物学治疗剂或小分子，其结合且阻断或抑制下述中的一种或多种的活性：CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160和CGEN-15049。举例说明性免疫检查点抑制剂包括曲美木单抗(CTLA-4阻断抗体)、抗OX40、PD-L1单克隆抗体(抗B7-H1；MEDI4736)、MK-3475(PD-1阻断剂)、Nivolumab(抗PD1抗体)、CT-011(抗PD1抗体)、BY55单克隆抗体、AMP224(抗PDL1抗体)、BMS-936559(抗PDL1抗体)、MPLDL3280A(抗PDL1抗体)、MSB0010718C(抗PDL1抗体)和Yervoy/伊匹木单抗(抗CTLA-4检查点抑制剂)。检查点蛋白质配体包括但不限于PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、CD28、CD86和TIM-3。

在一个特定实施方案中，本发明涵盖特定类别的检查点抑制剂的使用，其为阻断免疫检查点受体程序性细胞死亡蛋白质1(PD-1)及其配体PDL-1之间的相互作用的药物。参见A.Mullard，“Newcheckpointinhibitorsridetheimmunotherapytsunami,”NatureReviews:DrugDiscovery(2013)，12:489-492。PD-1在T细胞上表达且调节T细胞的活性。具体地，当PD-1未与PDL-1结合时，T细胞可以衔接和杀死靶细胞。然而，当PD-1与PDL-1结合时，它促使T细胞停止衔接和杀死靶细胞。此外，与其它检查点不同，PD-1接近地作用，使得PDL直接在癌细胞上过表达，这导致与PD-1表达T细胞的结合增加。

本公开内容的一个方面提供了其为抗体的检查点抑制剂，其可以充当PD-1的激动剂，从而调整由PD-1调节的免疫应答。在一个实施方案中，抗PD-1抗体可以是抗原结合片段。本文公开的抗PD-1抗体能够结合人PD-1且激动PD-1的活性，从而抑制表达PD-1的免疫细胞的功能。

在一个特定实施方案中，本发明涵盖特定种类的检查点抑制剂的使用，所述检查点抑制剂是抑制CTLA-4的药物。用于本发明的方法中的合适抗CTLA-4拮抗试剂包括但不限于抗CTLA4抗体、人抗CTLA4抗体、小鼠抗CTLA4抗体、哺乳动物抗CTLA4抗体、人源化抗CTLA4抗体、单克隆抗CTLA4抗体、多克隆抗CTLA4抗体、嵌合抗CTLA4抗体、MDX-010(伊匹木单抗)、曲美木单抗、抗CD28抗体、抗CTLA4adnectin、抗CTLA4结构域抗体、单链抗CTLA4片段、重链抗CTLA4片段、轻链抗CTLA4片段、激动共刺激途径的CTLA4的抑制剂、在PCT公开号WO2001/014424公开的抗体、在PCT公开号WO2004/035607中公开的抗体、在美国公开号2005/0201994中公开的抗体、以及在授权的欧洲专利号EP1212422B1中公开的抗体。另外的CTLA-4抗体在美国专利号5,811,097、5,855,887、6,051,227和6,984,720；PCT公开号WO01/14424和WO00/37504；以及美国公开号2002/0039581和2002/086014中描述。可以用于本发明的方法中的其它抗CTLA-4抗体包括例如公开于下述中的那些：WO98/42752；美国专利号6,682,736和6,207,156；Hurwitz等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95(17):10067-10071(1998)；Camacho等人，J.Clin.Oncology，22(145):AbstractNo.2505(2004)(抗体CP-675206)；Mokyr等人，CancerRes.，58:5301-5304(1998)，以及美国专利号5,977,318、6,682,736、7,109,003和7,132,281。

另外的抗CTLA4拮抗剂包括但不限于下述：能够破坏CD28抗原结合其同源配体的能力，抑制CTLA4结合其同源配体的能力，经由共刺激途径加强T细胞应答，破坏B7结合CD28和/或CTLA4的能力，破坏B7活化共刺激途径的能力，破坏CD80结合CD28和/或CTLA4的能力，破坏CD80活化共刺激途径的能力，破坏CD86结合CD28和/或CTLA4的能力，破坏CD86活化共刺激途径的能力，以及破坏一般而言共刺激途径的活化的任何抑制剂。这种必要性包括共刺激途径的CD28、CD80、CD86、CTLA4以及其它成员的小分子抑制剂；针对共刺激途径的CD28、CD80、CD86、CTLA4以及其它成员的抗体；针对共刺激途径的CD28、CD80、CD86、CTLA4以及其它成员的反义分子；针对共刺激途径的CD28、CD80、CD86、CTLA4以及其它成员的adnectin，共刺激途径的CD28、CD80、CD86、CTLA4以及其它成员的RNAi抑制剂(单链和双链两者)，以及其它抗CTLA4拮抗剂。

在一个特定实施方案中，本发明涵盖特定种类的检查点抑制剂的使用，所述检查点抑制剂是抑制TIM-3的药物。阻断TIM-3通过配体的活化导致Th1细胞活化的增加。此外，TIM-3已鉴定为由耗尽的CD8+T细胞表达的重要的抑制受体。TIM-3也已报道为核酸介导的抗肿瘤免疫的关键调节物。在一个例子中，TIM-3已显示在肿瘤相关树突状细胞(TADC)上是上调的。

在一个特定实施方案中，本发明涉及免疫刺激试剂、T细胞生长因子和白介素的使用。免疫刺激试剂是通过诱导免疫系统组分中任一种的活化或增加其组分中任一种的活性来刺激免疫系统的物质(药物和营养素)。免疫刺激剂包括细菌疫苗、集落刺激因子、干扰素、白介素、其它免疫刺激剂、治疗疫苗、疫苗组合和病毒疫苗。

T细胞生长因子是刺激T细胞增殖的蛋白质。T细胞生长因子的例子包括Il-2、IL-7、IL-15、IL-17、IL21和IL-33。

白介素是首先被视为由白血细胞表达的一组细胞因子。免疫系统的功能在很大程度上取决于白介素，并且许多白介素的罕见缺陷已得到描述，全部表征自身免疫疾病或免疫缺陷。白介素中的大多数通过辅助CD4T淋巴细胞，以及通过单核细胞、巨噬细胞和内皮细胞合成。它们促进T和B淋巴细胞以及造血细胞的发育和分化。白介素的例子包括IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15和IL-17。

IL-15是结合复合物且通过复合物发信号的细胞因子，所述复合物由IL-2/IL-15受体β链(CD122)和共同的γ链(γ-C，CD132)组成。IL-15在病毒感染后通过单核吞噬细胞分泌。该细胞因子诱导天然杀伤细胞的细胞增殖；所述天然杀伤细胞是主要作用为杀死病毒感染细胞的先天性免疫系统的细胞。

IL-7是由骨髓和胸腺中的基质细胞分泌的造血生长因子。IL-7刺激多潜能和多能造血干细胞分化成淋巴样祖细胞(与其中分化由IL-3刺激的髓样祖细胞形成对比)。它还刺激淋巴样谱系中的所有细胞(B细胞、T细胞和NK细胞)的增殖。它对于B细胞成熟，T和NK细胞存活、发育和稳态的某些阶段期间的增殖是重要的。IL-7可以是糖基化的。

在本文描述的某些方法或组合物中，另外的第三种、第四种、第五种、第六种、第七种、第八种、第九种或第十种试剂。在某些实施方案中，另外的第三种、第四种、第五种、第六种、第七种、第八种、第九种或第十种试剂是化学治疗剂、细胞因子疗法、干扰素疗法(例如INF-α)、白介素疗法(例如IL-2、IL-7或IL-11)、集落刺激因子疗法(例如G-CSF)、抗体疗法、病毒疗法、基因疗法或其组合。在某些实施方案中，另外的第三种、第四种、第五种、第六种、第七种、第八种、第九种或第十种试剂可以在用本文描述的方法或组合物中的任一种治疗之前、与用本文描述的方法或组合物中的任一种治疗同时、或在用本文描述的方法或组合物中的任一种治疗之后使用。

癌症治疗剂或化学治疗剂的例子包括烷化剂例如噻替派和环磷酰胺(CYTOXAN)；烷基磺酸盐类例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶类例如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；乙撑亚胺类和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺、三乙撑蜜胺、三乙撑磷酰胺、三乙撑硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺(trimethylolomelamine)；氮芥类例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、cholophosphamide、磷雌氮芥、异环磷酰胺、氮芥、盐酸氧氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、松龙苯芥、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；硝基脲类(nitrosureas)例如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；抗生素例如阿克拉霉素(aclacinomysins)、放射菌素、authramycin、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、卡奇霉素、carabicin、洋红霉素(caminomycin)、嗜癌霉素、色霉素、放线菌素D、柔红霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、派来霉素、potfiromycin、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链唑霉素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢物例如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物例如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物例如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫唑鸟嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物例如安西他滨、氮杂胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他宾、氟尿苷、5-FU；雄激素类例如卡鲁睾酮、屈他雄酮丙酸酯、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺药(anti-adrenal)例如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂例如亚叶酸(frolinicacid)；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶；bestrabucil；比生群；依达曲沙；磷胺氮芥(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌；依氟鸟氨酸(elformithine)；依利醋铵；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；硝氨丙吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；鬼臼酸；2－乙基肼；甲基苄肼；PSK.RTM.；丙亚胺；西佐喃；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2',2"-三氯三乙胺；乌拉坦；长春酰胺；氮烯咪胺；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替派；紫杉烷类，例如紫杉醇(TAXOL^TM，Bristol-MyersSquibbOncology，Princeton，N.J.)和多西他赛(TAXOTERE^TM，Rhne-PoulencRorer，Antony，法国)；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物例如顺铂和卡铂；长春碱；曲妥珠单抗、多西他赛、铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺维本；诺消灵；替尼泊苷；道诺霉素；氨喋呤；希罗达；伊班膦酸盐；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸衍生物例如Targretin^TM(贝沙罗汀)，Panretin^TM(阿利维A酸)；ONTAKT^TM(地尼白介素2)；埃斯波霉素；卡培他滨；以及上述任何一种的药物学上可接受的盐、酸或衍生物。这个定义中还包括抗激素剂，所述抗激素剂用于调节或抑制激素对肿瘤的作用，例如抗雌激素剂包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、芳香酶抑制性4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮和托瑞米芬(Fareston)；以及抗雄激素剂例如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及上述任何一种的药物学上可接受的盐、酸或衍生物。进一步的癌症治疗剂包括索拉非尼以及其它蛋白质激酶抑制剂例如阿法替尼、阿西替尼、贝伐珠单抗、西妥昔单抗、克唑替尼、达沙替尼、厄洛替尼、福他替尼、吉非替尼、伊马替尼、拉帕替尼、乐伐替尼、莫立替尼、尼洛替尼、帕尼单抗、帕唑帕尼、哌加他尼、兰尼单抗、鲁索利替尼、曲妥珠单抗、凡德他尼、维罗非尼、和舒尼替尼；西罗莫司(雷帕霉素)、依维莫司以及其它mTOR抑制剂。

另外的化学治疗剂的例子包括拓扑异构酶I抑制剂(例如伊立替康、托泊替康、喜树碱及其类似物或代谢产物、和多柔比星)；拓扑异构酶II抑制剂(例如依托泊苷、替尼泊苷和柔红霉素)；烷化剂(例如美法仑、苯丁酸氮芥、白消安、噻替派、异环磷酰胺、卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀、链唑霉素、氮烯咪胺、氨甲蝶呤、丝裂霉素C和环磷酰胺)；DNA嵌入剂(例如顺铂、奥沙利铂和卡铂)；DNA嵌入剂和自由基生成剂例如博来霉素；和核苷模拟物(例如5-氟尿嘧啶、卡培他滨、吉西他滨、氟达拉滨、阿糖胞苷、巯嘌呤、硫鸟嘌呤、喷司他丁和羟基脲)。此外，破坏细胞复制的示例性化学治疗剂包括：紫杉醇、多西他赛和相关类似物；长春新碱、长春碱和相关类似物；沙利度胺、来那度胺和相关类似物(例如CC-5013和CC-4047)；蛋白酪氨酸激酶抑制剂(例如甲磺酸伊马替尼和吉非替尼)；蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米)；NF-κB抑制剂包括IκB激酶的抑制剂；结合在癌症中过表达的蛋白质的抗体，以及已知在癌症中上调、过表达或活化的蛋白质或酶的其它抑制剂，所述蛋白质或酶的抑制下调细胞复制。

在一个特定实施方案中，本发明涉及治疗疫苗的使用，包括癌症疫苗和树突状细胞疫苗。癌症疫苗的目的是使免疫系统发动针对机体中的癌细胞的攻击。换言之，癌症疫苗通过引发免疫系统攻击机体中的癌细胞来起作用。相应地，代替预防疾病，癌症疫苗意欲使免疫系统攻击已经存在的疾病。癌症疫苗使用癌细胞、细胞的部分或纯抗原，来增加针对已经在机体中的癌细胞的免疫应答。

与传统免疫加强疗法不同，癌症疫苗不只是改善一般而言的免疫系统，它们促使免疫系统攻击具有一种或多种特定抗原的细胞，并且在免疫系统中产生“攻击记忆”。该“攻击记忆”允许免疫系统继续攻击癌细胞以阻止已进入缓解的癌症进展和/或回复。

癌症疫苗可以由实际癌细胞制备，所述癌细胞已从受试者中取出。一旦取出，癌细胞就在实验室中通常用辐射进行修饰，使得它们不能形成更多肿瘤。在实验室中，科学家进一步修饰癌细胞也是常见的。例如，癌细胞通常通过加入化学制品或新基因进行修饰，以使得细胞更可能由免疫系统视为外来的。经修饰的细胞随后注射回受试者内。免疫系统能够识别这些细胞上的抗原，并且通过天然生理过程找出且攻击/杀死表达预期抗原的细胞。

大多数疫苗是自体的。自体疫苗由取自它们以后将用于其中的相同个人的被杀死的(例如用辐射或化学制品处理以致使癌细胞不能复制)细胞制成。换言之，细胞取自受试者，进行修饰且随后注射回相同受试者内。

其它疫苗是同种异体的。同种异体疫苗由取自一个受试者的细胞制成且随后注射到第二个不同受试者内。虽然同种异体疫苗比自体疫苗更容易制备，但使用自体疫苗可能是有益的，以避免外来细胞引入受试者内。

存在多重类型的癌症疫苗。癌症疫苗的非限制性例子包括肿瘤细胞疫苗、抗原疫苗、树突状细胞疫苗、DNA疫苗和基于载体的疫苗。

抗原疫苗通过使用一种或多种抗原来加强免疫系统，与含有数千种抗原的完整肿瘤细胞形成对比。这些抗原一般是肽。抗原疫苗可以对于某一类型的癌症是特异性的，因为每个肿瘤类型可以通过特异性抗原特征谱得到鉴定。为了使这些疫苗的功效达到最大，在疫苗中组合多重抗原可能是有益的，取决于特异性癌症的抗原特征谱。

树突状细胞疫苗通常是自体疫苗，并且必须常常对于每个受试者个别制备。用于制备其的过程是复杂和昂贵的。医生从血液中取出一些免疫细胞，并且使其在实验室中暴露于癌细胞或癌抗原，以及使其变成树突状细胞且帮助其生长的其它化学制品。树突状细胞随后注射回受试者内，在其中它们应引发针对机体中的癌细胞的免疫应答。树突状细胞疫苗的非限制性例子是Sipuleucel-T(下文描述)。

DNA疫苗是第三种非限制性癌细胞疫苗。传统癌细胞疫苗的一个局限性是当肿瘤细胞或抗原作为疫苗注射到体内时，它们可以首先引起所需免疫应答，但它们随着时间过去可以变得较不有效。这是因为免疫系统将其识别为外来的，并且快速破坏其。如果没有任何进一步刺激，免疫系统通常回复至其正常的活性状态(疫苗前)。促进持续免疫应答的一种方式是使用DNA疫苗。

DNA是细胞中的物质，其含有细胞制备的蛋白质的遗传密码。载体可以改造为含有可以注射到受试者内的特定DNA，其导致DNA由细胞吸收。一旦细胞吸收DNA，DNA就使细胞按程序工作以制备特异性抗原，这随后可以引发所需免疫应答。

第四种非限制性癌症疫苗是载体组合物。载体疫苗可以用于施用DNA疫苗的DNA。载体是特定病毒、细菌、酵母细胞或其它结构，其可以用于使抗原或DNA进入受试者的细胞内。载体是特别有用的，因为它们可以用于一次递送超过一种癌抗原，这可以使得受试者的免疫系统更可能发动应答。载体也是特别有用的，因为它们可以单独(无需任何另外的DNA或抗原)触发免疫应答，当与DNA和/或抗原组合时，其将产生更强的免疫应答。

树突状细胞可以直接施用到肿瘤内、在肿瘤的手术摘除或切除后施用到肿瘤床内、在肿瘤周围地(peri-tumorily)施用、施用到与肿瘤直接接触的引流淋巴结内、施用到导入或供给肿瘤或受肿瘤影响的器官的血管或淋巴管内，例如门静脉或肺静脉或动脉等等。部分成熟的树突状细胞的施用可以与用于肿瘤的其它治疗例如化学疗法或放射疗法同时，或者在用于肿瘤的其它治疗例如化学疗法或放射疗法之后。进一步地，部分成熟的树突状细胞可以与另一种试剂共施用，所述试剂充当在肿瘤或者肿瘤附近或邻近的区域内的树突状细胞成熟和/或抗原加工的佐剂。此外，树突状细胞还可以配制或化合在缓慢释放基质中，用于植入在肿瘤或肿瘤床中或者在肿瘤或肿瘤床周围的区域内，使得细胞缓慢释放到肿瘤或肿瘤床内，用于与肿瘤抗原接触。

部分成熟的树突状细胞还可以通过对于制剂和施用方式适当的任何方式进行施用。例如，细胞可以与药学可接受的载体组合，并且用注射器、导管、插管等等施用。如上，细胞可以在缓慢释放基质中配制。当以这种方式施用时，制剂可以通过对于使用的基质适当的方式进行施用。本发明可应用的其它施用方法和模式是技术人员众所周知的。

树突状细胞组合物可以在个体的治疗中单独使用。此外，该组合物可以与任何其它方法组合使用以治疗肿瘤。例如，本发明的方法可以与肿瘤的手术切除、化学疗法(细胞毒性药物、细胞凋亡剂、抗体等等)、放射疗法、冷冻疗法、近距离放射疗法、免疫疗法(抗原特异性成熟的活化树突细胞、NK细胞、对于肿瘤抗原特异性的抗体等的施用)等等组合使用。这些方法中的任一种和全部均可以以任何组合来使用。组合治疗可以是同时或连续的，并且可以以如由治疗医生确定的任何次序施用。

商购可得的癌症疫苗的一个例子是Sipuleucel-T或它是用于治疗晚期前列腺癌的癌细胞疫苗，所述晚期前列腺癌无法通过传统化学治疗或激素疗法治疗。对于这种疫苗，从受试者中分离受试者自身的免疫细胞，并且随后使免疫细胞暴露于化学制品，以使其转换成树突状细胞。使树突状细胞暴露于前列腺酸性磷酸酶(PAP)，当再引入受试者内时，其产生针对前列腺癌的免疫应答。特别重要的是，一旦经修饰的细胞再引入受试者内，受试者的免疫系统就产生“攻击记忆”，并且将受试者内的其它免疫细胞转化成癌症攻击细胞。

树突状细胞疫苗的一个例子是DCVax。DCVax是一种平台技术，其使用活化的树突状细胞(免疫系统的主要细胞)，并且设计为再振作和训练免疫系统，以攻击癌症。DCVax使用许多活性剂来命中癌症上的许多靶(Liau，LM等人JournalofNeurosurgery90:1115-1124，1999；PrinsRM等人JImmunother.2013Feb；36(2):152-7)。

在树突状细胞疫苗包括DCVax中存在使得疫苗在治疗癌症中有效的三个关键方面：(1)树突状细胞疫苗设计为动员整个免疫系统，而不仅是该总体系统中的免疫因子的许多不同类别中的一种。如上所述，DCVax包括活化、经训练的树突状细胞，并且树突状细胞是免疫系统的主要细胞，其动员或帮助整个免疫系统。完全免疫系统涉及许多类型的抗体，以及除抗体外的许多其它种类的因子。树突状细胞动员全部这些不同的因子类别，包含整个免疫系统“军队”，与彼此组合且处于与彼此的天然关系中。(2)树突状细胞疫苗设计为不只是靶向受试者的肿瘤上的生物标记物中的一种而是全部集合，这使得肿瘤更难以突变和转移。(3)树突状细胞疫苗是个人化的，并且靶向在该受试者的肿瘤上表达的特定生物标记物。

为了制备用于受试者的树突状细胞疫苗，通过抽血获得受试者的免疫细胞。对于全身施用，使单核细胞分化成树突状细胞，成熟、活化且装载来自受试者自身的肿瘤组织的生物标记物。生物标记物到树突状细胞内的装载“训练”细胞关于免疫系统需要攻击的那些。活化的经训练的树突状细胞随后以极高纯度分离，并且通过在上臂中的简单皮内注射施用于受试者。树突状细胞随后将肿瘤生物标记物信息传达给免疫系统因子的剩余部分(T细胞、B细胞及其它)，其随后靶向具有这些生物标记物的细胞。

对于瘤内施用，使单核细胞分化成树突状细胞且部分成熟。细胞随后通过直接注射到肿瘤内进行施用。在注射到肿瘤内之后，树突状细胞原位挑选肿瘤生物标记物，并且将肿瘤生物标记物信息传达给免疫系统因子的剩余部分(T细胞、B细胞及其它)，其随后靶向具有这些生物标记物的细胞。

重要的是，疫苗中的每种活化、经训练的树突状细胞具有大的倍增效应，动员数百种T细胞及其它免疫细胞。因此，小剂量的这样的树突状细胞可以动员大且持续的免疫应答。

在一个实施方案中，树突状细胞组合物可以用作第一治疗或引发剂，用于第二检查点抑制剂治疗。通过在检查点抑制剂之前施用树突状细胞组合物，免疫系统(特别是T细胞)变得活化，这允许针对检查点抑制剂的增强应答。

在一个实施方案中，检查点抑制剂首先施用以“解锁”免疫应答的起始，随后为癌症疫苗疗法。例如，将检查点抑制剂施用于受试者，随后为树突状细胞组合物。

在一个特定实施方案中，树突状细胞和受体受试者具有相同MHC(HLA)单体型。测定受试者的HLA单体型的方法是本领域已知的。在一个相关实施方案中，部分成熟的树突状细胞对于受体受试者是同种异体的。同种异体细胞通常对于至少一种MHC等位基因是匹配的(例如共享至少一种而不是全部MHC等位基因)。在一个较不典型的实施方案中，树突状细胞和受体受试者就彼此而言都是同种异体的，但都具有至少一种共同的MHC等位基因。

施用包括在施用治疗剂之前、与施用治疗剂同时、或在施用治疗剂之后，施用检查点抑制剂的一个或多个周期或剂量，所述治疗剂例如为白介素例如IL-7或IL-5，或疫苗例如树突状细胞疫苗，或反之亦然。本领域技术人员可以确定哪种治疗方案在逐个受试者的基础上是适当的，取决于其癌症及其免疫状态(例如T细胞、B细胞或NK细胞活性和/或数目)。

检查点抑制剂和治疗剂的组合在治疗一些受试者中的癌症中可以是更有效的，和/或可以起始、实现、增加、增强或延长免疫细胞(包括T细胞、B细胞、NK细胞和/或其它)的活性和/或数目，或传达通过肿瘤的医学有益应答(包括其消退、坏死或消除)。

在某些方面，使用装载有自体或同种异体(例如来自细胞系)肿瘤抗原的自体或同种异体树突状细胞，在检查点抑制剂施用之前诱导免疫应答，以起始或使实现抗肿瘤免疫应答，随后施用检查点抑制剂。

在某些方面，使用装载有自体或同种异体(例如来自细胞系)肿瘤抗原的自体或同种异体树突状细胞，在检查点抑制剂施用之前诱导免疫应答，以增强预先存在的抗肿瘤免疫应答，随后施用检查点抑制剂。

在某些方面，使用对于自体肿瘤抗原特异性的自体或同种异体T细胞，在检查点抑制剂施用之前诱导或增强免疫应答，以增强预先存在的抗肿瘤免疫应答，随后施用检查点抑制剂。

在某些方面，使用直接施用到肿瘤内或施用至肿瘤外周用于体内抗原装载的自体或同种异体树突状细胞，在检查点抑制剂施用之前诱导免疫应答，以起始或使实现抗肿瘤免疫应答，随后施用检查点抑制剂。

在某些方面，使用直接施用到肿瘤内或施用至肿瘤外周用于体内抗原装载的自体或同种异体树突状细胞，在检查点抑制剂施用之前诱导免疫应答，以增强预先存在的抗肿瘤免疫应答，随后施用检查点抑制剂。

在某些方面，使用装载有自体肿瘤抗原的同种异体树突状细胞，在检查点抑制剂施用之前诱导免疫应答，以起始抗肿瘤免疫应答，随后施用检查点抑制剂。

在某些方面，使用装载有自体肿瘤抗原的同种异体树突状细胞，在检查点抑制剂施用之前诱导免疫应答，以增强预先存在的抗肿瘤免疫应答，随后施用检查点抑制剂。

在某些方面，使用直接施用到肿瘤内或施用至肿瘤外周用于体内抗原装载的同种异体树突状细胞，在检查点抑制剂施用之前诱导免疫应答，以起始抗肿瘤免疫应答，随后施用检查点抑制剂。

在某些方面，使用直接施用到肿瘤内或施用至肿瘤外周用于体内抗原装载的同种异体树突状细胞，在检查点抑制剂施用之前诱导免疫应答，以增强预先存在的抗肿瘤免疫应答，随后施用检查点抑制剂。

在某些方面，使用离体扩增和或活化的自体抗肿瘤T细胞，在检查点抑制剂施用之前诱导免疫应答，以起始抗肿瘤免疫应答，随后施用检查点抑制剂。

在某些方面，使用离体扩增和或活化的抗肿瘤T细胞，在检查点抑制剂施用之前诱导免疫应答，以增强预先存在的抗肿瘤免疫应答，随后施用检查点抑制剂。

在本发明的某些实施方案中，治疗性癌症疫苗或过继性T细胞疗法在检查点抑制剂前按时间顺序施用。在某些实施方案中，治疗性癌症疫苗或过继性T细胞疗法在检查点抑制剂施用之前1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、1个月或其任何组合施用。

在本发明的某些实施方案中，治疗性癌症疫苗或过继性T细胞疗法与检查点抑制剂同时按时间顺序施用。

在本发明的某些实施方案中，治疗性癌症疫苗或过继性T细胞疗法在检查点抑制剂后按时间顺序施用。在某些实施方案中，检查点抑制剂在治疗性癌症疫苗或过继性T细胞疗法施用之前1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、1个月或其任何组合施用。

在上文描述的所有方面，诱导、使实现或增强抗肿瘤应答或免疫应答的方法可以通过首先施用检查点抑制剂，并且在其后时间点施用诱导、使实现或增强抗肿瘤应答或免疫应答的第二试剂来完成。

在另一个实施方案中，本发明提供了用于增强或延长检查点抑制剂的效应，或使得受试者能够响应检查点抑制剂，或使得能够减少检查点抑制剂的毒性或剂量的方法，其包括给有此需要的受试者施用与检查点抑制剂组合的治疗剂，其中所述受试者患有癌症。在一个方面，检查点抑制剂是生物学治疗剂或小分子。在另一个方面，检查点抑制剂是单克隆抗体、人源化抗体、全人抗体、融合蛋白或其组合。在一个进一步方面，检查点抑制剂抑制检查点蛋白质，其可以是CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK1、CHK2、A2aR、B-7家族配体或其组合。在一个方面，检查点抑制剂与可以是下述的检查点蛋白质的配体相互作用：CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK1、CHK2、A2aR、B-7家族配体或其组合。在一个另外方面，治疗剂选自免疫刺激试剂、T细胞生长因子、白介素、抗体和疫苗或其组合。在一个进一步方面，白介素是IL-7或IL-15。在一个方面，白介素是糖基化的IL-7。在一个另外方面，疫苗是树突状细胞疫苗。

在一个进一步方面，检查点抑制剂和治疗剂同时或以任一次序连续施用。在一个另外方面，治疗剂在检查点抑制剂之前施用。在一个特定方面，治疗剂是疫苗，并且检查点抑制剂是PD-1抑制剂。在一个进一步方面，疫苗是树突状细胞疫苗。

在另一个方面，癌症是任何实体瘤或液体癌症，包括泌尿生殖癌(例如前列腺癌、肾细胞癌、膀胱癌)、妇科癌症(例如卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌)、肺癌、胃肠癌(例如非转移性或转移性结肠直肠癌、胰腺癌、胃癌、食道癌、肝细胞癌、胆管细胞癌)、头颈癌(例如头颈鳞状细胞癌)、恶性胶质母细胞瘤、恶性间皮瘤、非转移性或转移性乳腺癌(例如激素难治性转移性乳腺癌)、恶性黑素瘤、梅克尔细胞癌或骨与软组织肉瘤、和血液学瘤形成例如多发性骨髓瘤、急性髓性白血病、慢性髓性白血病、骨髓增生异常综合征和急性成淋巴细胞性白血病。在一个优选的实施方案中，疾病是非小细胞肺癌(NSCLC)、乳腺癌(例如激素难治性转移性乳腺癌)、头颈癌(例如头颈鳞状细胞癌)、转移性结肠直肠癌、激素敏感性或激素难治性前列腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、肝细胞癌、肾细胞癌、软组织肉瘤或小细胞肺癌。

在一个进一步方面，方法进一步包括在用组合疗法治疗之前、与用组合疗法治疗同时、或在用组合疗法治疗之后，给受试者施用化学治疗剂、靶向疗法或辐射。在一个另外方面，肿瘤可以在治疗剂和检查点抑制剂施用之前被切除。在一个进一步的实施方案中，本发明提供了包含与生物学治疗剂组合的检查点抑制剂的药物组合物。在一个方面，生物学治疗剂是疫苗。

在特定实施方案中，使用癌细胞疫苗来诱导、起始或增强免疫应答。具体地，癌症疫苗可以是树突状细胞疫苗。在特定实施方案中，免疫应答可以使用抗肿瘤T细胞来诱导、起始或增强。在特定实施方案中，免疫应答可以通过细胞毒性T细胞的诱导来诱导、起始或增强。

在特定实施方案中，本文描述的方法和组合物可以用于治疗癌症。具体地，本文描述的方法和组合物可以用于减小实体瘤的尺寸，或减少癌症的癌细胞数目。本文描述的方法和组合物可以用于减慢癌细胞生长的速率。本文描述的方法和组合物可以用于停止癌细胞生长的速率。

如本文公开的治疗剂、检查点抑制剂、生物学治疗剂或药物组合物可以通过各种途径施用于个体，包括例如经口或肠胃外，例如静脉内、肌内、皮下、眶内、囊内、腹膜内、直肠内、脑池内、瘤内、鼻内(intravasally)、皮内或者分别使用例如皮肤贴片或透皮离子电渗疗法通过皮肤的被动或促进吸收。治疗剂、检查点抑制剂、生物学治疗剂或药物组合物还可以施用于病理状况的部位，例如静脉内或动脉内进入供应肿瘤的血管内。

在实践本发明的方法中待施用的试剂总量可以作为单一剂量以推注或通过在相对短时间段的输注，施用于受试者，或可以使用分级治疗方案进行施用，其中在延长时间段施用多个剂量。本领域技术人员将知道治疗受试者中的病理状况的组合物的量取决于许多因素，包括受试者的年龄和一般健康、以及施用途径和待施用的治疗次数。考虑到这些因素，技术人员将根据需要调整具体剂量。一般而言，最初，使用I期和II期临床试验测定组合物的配制以及施用途径和频率。

在某些实施方案中，检查点抑制剂以0.01mg/kg、0.05mg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.5mg/kg、0.7mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg或其任何组合的剂量施用。在某些实施方案中，检查点抑制剂每周施用一次、每周施用两次、每周施用三次、每两周施用一次、或每个月施用一次。在某些实施方案中，检查点抑制剂作为单一剂量、在两个剂量中、在三个剂量中、在四个剂量中、在五个剂量中、或在6个或更多个剂量中施用。

在某些实施方案中，本文描述的方法和组合物以试剂盒的形式包装。在某些实施方案中，用于执行方法和使用组合物的说明书包括在试剂盒中。

在其它实施方案中，提供了包含对于治疗上述病症有用的材料的制品。该制品包括容器和标签。适当的容器包括例如瓶、小瓶、注射器和试管。该容器可以由各种材料例如玻璃或塑料制成。该容器包含对治疗病况有效的组合物并可具有无菌入口(例如，容器可以是具有塞子的静脉注射溶液袋或小瓶，所述塞子可被皮下注射针头刺穿)。在组合物中的活性剂是抗体。在容器上或与容器相关联的标签标明组合物用于治疗所选择的病况。该制品可以进一步包括第二个容器，所述第二个容器包含药物学上可接受的缓冲液，例如磷酸盐缓冲盐水、林格(Ringer's)溶液以及葡萄糖溶液。它可以进一步包括从商业和用户立场上所需要的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、过滤器、针、注射器和具有使用说明的包装说明书。

如附图和实施例中所示，神经胶质瘤微环境中的PD-1/PD-L1负面共刺激轴得到表征，并且记录到与裂解产物脉冲的树突状细胞疫苗接种相关的增加的肿瘤浸润调节细胞群体(Treg，iAPC)。用佐剂抗PD-1Ab阻断此机制实现细胞毒性T细胞活化和至肿瘤的运输，并且促进非抑制性肿瘤环境。组合DC疫苗接种和抗PD-1Ab疗法促进鼠神经胶质瘤模型中的显著长期存活。这些机制已得到描绘，且提供了利用MR和新型PET成像探针来体内非侵入性表征免疫功能的实际临床成像关联物。

具体地，附图显示在具有良好建立的颅内神经胶质瘤的小鼠中，肿瘤裂解产物脉冲的DC疫苗接种仍导致活化T淋巴细胞的显著浸润，但没有任何临床利益。进一步地，抑制性髓样细胞群体在颅内GL261神经胶质瘤中累积，并且该群体在DC疫苗接种后显著增加。PD-1阻断性抗体的佐剂处理连同肿瘤裂解产物脉冲的DC疫苗接种一起阻止抑制性髓样细胞在颅内GL261神经胶质瘤中的累积增加。这导致活化T淋巴细胞的瘤内累积中的显著增加，引人注目的存活延长，以及对肿瘤的免疫记忆生成。进一步地，肿瘤裂解产物对DC的过夜脉冲活化这些细胞，并且导致PD-L1的表达减少，表明活化和/或成熟将减少抑制性免疫功能，因为抑制性髓样细胞是DC和巨噬细胞的骨髓衍生的前体群体。

根据本公开内容，本领域技术人员应了解在所公开的具体实施方案中可以作出许多变化或改变，并且仍获得相同或相似结果，而不背离本发明的精神和范围。本发明在范围上并不受限于本文描述的具体实施方案(其仅预期作为本发明的各方面的举例说明)，并且功能等价的方法和组分在本发明的范围内。事实上，本发明的各种修饰加上本文显示且描述的那些，根据前述描述对于本领域技术人员将变得明显。

提供下述实施例以进一步举例说明本发明的实施方案，但不预期限制本发明的范围。虽然它们是可以使用的那些的代表，但可以备选地使用本领域技术人员已知的其它程序、方法或技术。

实施例1

神经胶质瘤微环境拒绝通过DC疫苗接种促进的抗肿瘤免疫应答

在用GL261鼠神经胶质瘤颅内植入的C57BL/6小鼠中，可能存在有限的针对肿瘤的内源免疫应答(图1A)。小鼠颅内植入有GL261鼠神经胶质瘤，并且随后在肿瘤植入后第3和13天时，皮下施用PBS(1x)或裂解产物脉冲的DC疫苗。在第16天时，在第二次处理后72小时，对小鼠实施安乐死，并且收获脾、淋巴和脑半球用于加工。使用裂解产物脉冲的树突状细胞的疫苗接种促进CD3+淋巴细胞的显著肿瘤浸润，其中大多数是活化的CD8+CD25+淋巴细胞。为了测定这些细胞群体的总体生理效应，维持两组具有GL261神经胶质瘤的小鼠(对照和DC疫苗处理的)且监控存活。当DC疫苗接种给予大的颅内肿瘤时，在两组之间未记录到存活益处(图1C)。

实施例2

PD-1/PD-L1T细胞-神经胶质瘤相互作用促进抗炎性肿瘤微环境

为了评估PD-1/PD-L1肿瘤T细胞相互作用的效应，在抗PD-1mAb的存在下，将来自Pmel-1TCR转基因小鼠的gp-100特异性T细胞与GL261-gp100鼠神经胶质瘤细胞共培养。将24小时后收集的上清液进行加工，并且用小鼠32-plex细胞因子/趋化因子Luminex测定法进行分析。促炎细胞因子IFNγ和TNFα显示显著增加，而抗炎信号传导(IL-10和IL-4)随着PD-1抑制而下降。使用xCELLigence系统评估细胞毒性，所述xCELLigence系统提供通过T细胞的肿瘤杀死的实时、基于阻抗的读出。PD-1的抑制有效支持在10小时时间点时更大百分比的肿瘤细胞杀死。

实施例3

在具有神经胶质瘤的小鼠中PD-1/PD-L1负面共刺激轴的抑制促进抗

肿瘤应答

假设通过疫苗接种处理促进的抗肿瘤应答通过肿瘤微环境中的PD-1/PD-L1信号传导得到缓和。在从DC疫苗处理的小鼠收获的肿瘤中存在表达PD-L1的显著抑制性髓样群体(Ly6C+)，其不存在于对照小鼠中。为了评估该群体，检查对于对照和DC疫苗处理的两种另外疗法：抗PD-1mAb处理和组合DC疫苗与抗PD-1mAb处理的组。在植入后第16天(在第二次处理后72小时)收获脾、淋巴和脑半球用于加工。记录到DC疫苗/抗PD-1处理的小鼠的显著活化的细胞毒性TIL和淋巴结。虽然抑制性髓样群体在DC疫苗/抗PD-1处理的小鼠中存留，但当与单独的DC疫苗处理相比较时，它是显著减少的。在抗PD-1小鼠中，它不是显著可检测的。为了评估治疗益处，将小鼠植入、处理且监控存活。组合DC疫苗/抗PD-1处理显示超过其它组的显著存活益处。

利用Ly6C耗尽Ab或临床相关CSF1r抑制药物PLX3397来耗尽抑制性髓样群体。在具有GL261的小鼠中这些细胞的耗尽完全恢复在用DC疫苗/抗PD-1处理的小鼠中观察到的存活益处。在植入后第16天(在第二次处理后72小时)收获脾、淋巴和脑半球用于加工。在肿瘤微环境中这些Ly6C+PD-L1+细胞的不存在得到证实，并且记录到CD3+CD8+CD25+活化淋巴细胞的显著肿瘤浸润群体。在用DC疫苗/抗PD-1处理的小鼠中CD8+细胞的耗尽消除与该处理相关的所有治疗益处(图4c)。组织收获物证实全身和在肿瘤部位处的活化淋巴细胞的不存在。

实施例4

PET和MR成像模式的新型使用允许DC疫苗/抗PD-1疗法的非侵入

性评估

假设DC疫苗/抗PD-1疗法的治疗进展可以利用MRI(磁共振成像)和PET(正电子发射断层扫描术)成像技术进行监控。将颅内植入有GL261的小鼠分成四个处理组(无处理、DC疫苗、抗PD-1mAb和DC疫苗/抗PD-1)，并且用[18F]-L-FAC或[18F]-D-FACPET探针成像，以使运输至肿瘤的活化淋巴细胞成像。在植入后第21天时，使用Bruker7TMR扫描仪(UCLA)使小鼠成像，以获得对比前和对比后T1加权像、T2图以及动态对比增强(DCE)和动态灵敏性对比(DSC)灌注数据。在成像后，对小鼠实施安乐死，并且收获脑组织用于切片和IHC。将PET和对比后T1加权MR数据共同登记，以描绘针对阳性PET探针信号的阳性MR肿瘤对比。当与其它处理组相比较时，DC疫苗处理和DC疫苗/抗PD-1处理组显示减少的肿瘤负荷和增加的免疫浸润。在等价的解剖脑组织切片上，阳性PET和MR信号分别与CD3+和Ki-67+IHC染色关联。

实施例5

材料与方法

细胞系。鼠神经胶质瘤细胞系GL261和GL261-gp100维持在完全DMEM(Mediatech，Inc.Herndon，VA)(补充有10％FBS(GeminiBio-Products，WestSacramento，CA)、1％(v/v)青霉素和链霉素(MediatechCellgro，Manassas，VA))中，并且在5％CO₂的加湿大气中在37℃下进行培养。

Pmel-1T细胞的体外活化。从Pmel-1TCR转基因小鼠(n＝2)中收获脾和淋巴结，并且在补充有2％FBS的XVIVO-15(Lonza，Walkersville，MD)中，与人IL-2(100IU/mL，NCIPreclinicalRepository，DevelopmentalTherapeuticsProgram)和hgp10025-33肽(1ug/mL，NH2-KVPRNQDWL-OH，Biosynthesis，Inc.，Lewisville，TX)一起培养。在72小时后，细胞用PBS1x进行洗涤，并且以1x10⁶细胞/mL的浓度在IL-2和hgp10025-33肽中进行培养。

PD-1的体外抑制。细胞在如上所述补充有1uM抗PD-1Ab(BioXCell，WestLebanon，NH)的适当培养基中进行培养。对于培养的持续时间，培养基每24小时替换为具有抗PD-1Ab的新鲜培养基制剂。

细胞因子/趋化因子Luminex测定法。PmelT细胞和GL261-gp100细胞在补充有1uM抗PD-1Ab的完全DMEM培养基中以10:1的效应物:靶(E:T)比共培养。在24小时后收集上清液，并且在液氮中速冻。使用小鼠32-plex细胞因子/趋化因子Luminex测定法的分析与Dr.ElaineReed(UCLA)合作执行。

xCELLigence实时细胞毒性测定法。用xCELLigenceReal-TimeCellAnalyzerSystem(AceaBiotechnology，SanDiego，CA)评价肿瘤细胞的细胞毒性杀死。将靶GL261-gp100细胞铺平板(10⁵细胞/孔)在150μL培养基中。在肿瘤细胞贴壁至孔底部过夜后，效应细胞(PmelT细胞)以10:1的E:T比加入。对于对照，通过1％TritonX-100加入仅含有肿瘤的另外孔获得最大细胞释放。在24小时内收集细胞指数(CI)值(相对细胞阻抗)。值针对恰在效应细胞铺平板之前的最大CI值标准化。计算在任何时间点的标准化CI(nCI)与初始效应细胞铺平板的nCI的比例，以描绘肿瘤裂解百分比(23)。

GL261裂解产物制备。GL261神经胶质瘤细胞在完全DMEM培养基中进行培养和扩增。随后收获细胞且通过几个冻融循环进行传代，并且随后过滤悬浮液。裂解产物浓度使用Bradford蛋白质测定法进行定量。

骨髓衍生的DC和疫苗接种。来自鼠骨髓祖细胞的DC制剂如先前公开的进行制备(Prins等人，CancerResearch63:8487(2003))。简言之，骨髓细胞在5％CO₂的加湿大气中在37℃下在完全RPMI(Mediatech，Inc.Herndon，VA)(补充有10％FBS、1％(v/v)青霉素和链霉素)中培养过夜。第二天，收集非贴壁细胞，并且与鼠白介素-4(IL-4，400IU/mL，R&DSystems，Minneapolis，MN)和鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF，100ng/ml，R&DSystems，Minneapolis，MN)一起铺平板。在第4天时，贴壁细胞用具有相同细胞因子的新鲜培养基再进料。在第7天时，将DC收获且以1x10⁶细胞/ml重悬浮于完全RPMI中，并且用GL261裂解产物(250μg/mL)进行脉冲。在第8天时，将DC收集且以2x10⁶细胞/ml重悬浮于PBS1x中，并且立即制备用于以0.2ml细胞悬浮液/小鼠注射。注射在背部上的4个部位处皮下(s.c.)给予。

颅内神经胶质瘤植入。6–10周龄的雌性C57BL/6小鼠得自我们的机构育种群。所有小鼠均在UCLA的AALAC批准的AnimalFacilityoftheDivisionofExperimentalRadiationOncology繁育且维持在确定的无菌群病原体条件下。小鼠依照UCLA动物护理政策和批准的动物方案进行处理。小鼠用氯胺酮/赛拉嗪的腹膜内(i.p.)注射进行麻醉。在剃毛且切开聚维酮擦拭的头皮后，伴随小鼠的头部固定在立体定向仪中，使用牙钻在头盖骨中制备前卤横向2.5mm的钻孔。GL261神经胶质瘤细胞(在2μlPBS中2x10⁴)用配备26号针的无菌Hamilton注射器进行立体定向注射。颅内注射在2分钟时期内且在硬膜下3.5mm的深度处发生。在细胞完全输注后将注射器保留在脑中进行另外一分钟，并且随后缓慢抽出以防止细胞泄露到柔脑膜空间内。在颅内肿瘤植入后，NSG小鼠随机化到处理组(n＝6-16)内。

体内抗PD-1mAb处理。抗PD-1mAb在适当的处理日以250mg/kg(大约250μg/小鼠)进行i.p.施用。

组织收获、免疫组织化学和流式细胞术。在第21天时从小鼠中收获脾、淋巴结和肿瘤。在其中需要切片和免疫组织化学的情况下，将组织置于ZincFixative(1x，BDBiosciences，SanJose，CA)中24小时，并且随后转移至70％乙醇，然后在石蜡中包埋。使脾和淋巴结经过70um细胞过滤器，以生成单细胞悬浮液。在低渗裂解后获得淋巴细胞，并且使用台盼蓝拒染法进行计数。为了测定肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的数目，将荷瘤半球小心地称重且随后用解剖刀剁碎。组织随后置于旋转器上处于具有DNA酶的胶原酶中24小时，随后使用30％:70％Percoll梯度分离淋巴细胞。通过台盼蓝拒染法计数在肿瘤内的小单核细胞。大约1x10⁶淋巴细胞用于染色。通过测定CD8+细胞总数目/荷瘤半球来计算TIL。针对CD3、CD4、CD8、CD25、FoxP3、Ly6C、PD-1和PD-L1的荧光染料缀合的抗体得自Biolegend。所有FACS分析均使用LSRII(BDBiosciences)来执行。门控基于同种型特异性对照抗体进行设置(数据未示出)。数据使用FlowJo软件进行分析。

体内PET和MR成像。小鼠用在O₂/N₂流下的1-3％异氟烷进行镇静，并且监控呼吸。使用TP500水泵(GaymarSolidState)，将水循环加热至37℃，来使小鼠保持温暖。在扫描前1小时进行PET探针的尾静脉施用。PET扫描。执行尾静脉导管插入，以在扫描期间的适当时间点施用对比剂(钆，xug/小鼠)。所有图像均在具有定制的2.2-cmRF鸟笼式线圈的7TBrukerBiospec系统上采集。我们收集使用快速低角度拍摄(FLASH)的二维对比前T1加权像；多层多回波(MSME)自旋回波T2加权扫描用于计算定量T2图(16次回波，其中TE范围为10-160ms，间隔为10ms)，78um²平面内分辨率和1mm层面厚度；多翻转角度3DFLASHT1加权像用于计算对比前T1图，使用2-20度的翻转角度；以及高分辨率3D对比后T1加权像。

尽管本发明已参考上述实施例进行描述，但应理解修饰和改变涵盖在本发明的精神和范围内。相应地，本发明仅受限于所附的权利要求书。

Claims (47)

1.一种在有此需要的受试者中治疗癌症或者起始、增强或延长抗肿瘤应答的方法，其包括给所述受试者施用与其为检查点抑制剂的试剂组合的治疗剂。

2.权利要求1的方法，其中所述检查点抑制剂是生物学治疗剂或小分子。

3.权利要求1的方法，其中所述检查点抑制剂选自单克隆抗体、人源化抗体、全人抗体和融合蛋白或其组合。

4.权利要求1的方法，其中所述检查点抑制剂抑制选自下述的检查点蛋白质：CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK1、CHK2、A2aR和B-7家族配体或其组合。

5.权利要求1的方法，其中所述检查点抑制剂与选自下述的检查点蛋白质的配体相互作用：CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK1、CHK2、A2aR和B-7家族配体或其组合。

6.权利要求1的方法，其中所述治疗剂选自免疫刺激试剂、T细胞生长因子、白介素、抗体和疫苗或其组合。

7.权利要求6的方法，其中所述白介素是IL-7或IL-15。

8.权利要求7的方法，其中所述白介素是糖基化的IL-7。

9.权利要求6的方法，其中所述疫苗是树突状细胞疫苗。

10.权利要求1的方法，其中所述检查点抑制剂和所述治疗剂同时或以任一次序连续施用。

11.权利要求10的方法，其中所述治疗剂在所述检查点抑制剂之前施用。

12.权利要求11的方法，其中所述治疗剂是疫苗，并且所述检查点抑制剂是PD-1抑制剂。

13.权利要求12的方法，其中所述疫苗是树突状细胞疫苗。

14.权利要求1的方法，其中所述治疗由临床结果；通过T细胞的抗肿瘤活性增加、增强或延长；与治疗前的数目相比较，抗肿瘤T细胞或活化T细胞数目的增加，或其组合决定。

15.权利要求14的方法，其中所述临床结果选自肿瘤消退；肿瘤缩小；肿瘤坏死；通过免疫系统的抗肿瘤应答；肿瘤扩大、复发或扩散或其组合。

16.权利要求1的方法，其中治疗效应通过T细胞的存在、或指示T细胞炎症的基因标记的存在或其组合预测。

17.权利要求1的方法，其中所述受试者患有癌症。

18.权利要求17的方法，其中所述癌症选自泌尿生殖癌、妇科癌症、肺癌、胃肠癌、头颈癌、恶性胶质母细胞瘤、恶性间皮瘤、非转移性或转移性乳腺癌、恶性黑素瘤、梅克尔细胞癌或骨与软组织肉瘤、血液学瘤形成、多发性骨髓瘤、急性髓性白血病、慢性髓性白血病、骨髓增生异常综合征和急性成淋巴细胞性白血病、非小细胞肺癌(NSCLC)、乳腺癌、转移性结肠直肠癌、激素敏感性或激素难治性前列腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、肝细胞癌、肾细胞癌、胰腺癌、胃癌、食道癌、肝细胞癌、胆管细胞癌、头颈鳞状细胞癌、软组织肉瘤和小细胞肺癌。

19.权利要求1的方法，其进一步包括在用所述组合疗法治疗之前、与用所述组合疗法治疗同时、或在用所述组合疗法治疗之后，给所述受试者施用化学治疗剂、靶向疗法或辐射。

20.一种增强或延长检查点抑制剂的效应，或使得受试者能够响应检查点抑制剂，或使得能够减少检查点抑制剂的毒性或剂量的方法，其包括给有此需要的受试者施用与检查点抑制剂组合的治疗剂，其中所述受试者患有癌症。

21.权利要求20的方法，其中所述检查点抑制剂是生物学治疗剂或小分子。

22.权利要求20的方法，其中所述检查点抑制剂选自单克隆抗体、人源化抗体、全人抗体和融合蛋白或其组合。

23.权利要求20的方法，其中所述检查点抑制剂抑制选自下述的检查点蛋白质：CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK1、CHK2、A2aR和B-7家族配体或其组合。

24.权利要求20的方法，其中所述检查点抑制剂与选自下述的检查点蛋白质的配体相互作用：CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK1、CHK2、A2aR和B-7家族配体或其组合。

25.权利要求20的方法，其中所述治疗剂选自免疫刺激试剂、T细胞生长因子、白介素、抗体和疫苗或其组合。

26.权利要求25的方法，其中所述白介素是IL-7或IL-15。

27.权利要求26的方法，其中所述白介素是糖基化的IL-7。

28.权利要求25的方法，其中所述疫苗是树突状细胞疫苗。

29.权利要求20的方法，其中所述检查点抑制剂和所述生物学治疗剂同时或以任一次序连续施用。

30.权利要求29的方法，其中所述治疗剂在所述检查点抑制剂之前施用。

31.权利要求30的方法，其中所述治疗剂是疫苗，并且所述检查点抑制剂是PD-1抑制剂。

32.权利要求29的方法，其中所述疫苗是树突状细胞疫苗。

33.权利要求20的方法，其中所述癌症选自泌尿生殖癌、妇科癌症、肺癌、胃肠癌、头颈癌、恶性胶质母细胞瘤、恶性间皮瘤、非转移性或转移性乳腺癌、恶性黑素瘤、梅克尔细胞癌或骨与软组织肉瘤、血液学瘤形成、多发性骨髓瘤、急性髓性白血病、慢性髓性白血病、骨髓增生异常综合征和急性成淋巴细胞性白血病、非小细胞肺癌(NSCLC)、乳腺癌、转移性结肠直肠癌、激素敏感性或激素难治性前列腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、肝细胞癌、肾细胞癌、胰腺癌、胃癌、食道癌、肝细胞癌、胆管细胞癌、头颈鳞状细胞癌、软组织肉瘤和小细胞肺癌。

34.权利要求20的方法，其进一步包括在用所述组合疗法治疗之前、与用所述组合疗法治疗同时、或在用所述组合疗法治疗之后，给所述受试者施用化学治疗剂、靶向疗法或辐射。

35.一种药物组合物，其包含与生物学治疗剂组合的检查点抑制剂。

36.权利要求35的组合物，其中所述生物学治疗剂是疫苗。

37.一种药物组合物，其包含树突状细胞疫苗和PD-1抑制剂。

38.一种用于癌症治疗的组合疗法，其中所述组合疗法包含过继性T细胞疗法和检查点抑制剂。

39.权利要求38的组合疗法，其中所述过继性T细胞疗法包含自体T细胞。

40.权利要求39的组合疗法，其中所述自体T细胞靶向针对肿瘤抗原。

41.权利要求38的组合疗法，其中所述过继性T细胞疗法包含同种异体T细胞。

42.权利要求41的组合疗法，其中所述同种异体T细胞靶向针对肿瘤抗原。

43.权利要求38的组合疗法，其中所述检查点抑制剂是PD-1或PDL-1检查点抑制剂。

44.一种增强抗肿瘤或抗癌免疫应答的方法，所述方法包括给受试者施用过继性T细胞疗法和检查点抑制剂。

45.权利要求44的方法，其中所述过继性T细胞疗法在所述检查点抑制剂之前施用。

46.权利要求45的方法，其中所述过继性T细胞疗法在所述检查点抑制剂之前1-30天施用。

47.权利要求44的方法，其中所述抗肿瘤应答选自抑制肿瘤生长，诱导肿瘤细胞死亡、肿瘤消退，阻止或延迟肿瘤复发、肿瘤生长、肿瘤扩散以及肿瘤消除。