PT1567155E - Administração de células dendríticas parcialmente amadurecidas in vitro para o tratamento de tumores - Google Patents
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Description
ΕΡ1567155Β1
DESCRIÇÃO
ADMINISTRAÇÃO DE CÉLULAS DENDRITICAS PARCIALMENTE AMADURECIDAS IN VITRO PARA O TRATAMENTO DE TUMORES
As células dendríticas (CD) são reconhecidas como sendo o veículo de eleição para uma imunoterapia activa do cancro. As experiências com animais demonstraram o potencial da imunoterapia baseada nas CD, quer na protecção contra a formação de tumores em ratos, quer na eliminação de tumores formados. Estes êxitos foram, pelo menos em parte, duplicados em seres humanos na sequência de pequenos ensaios clínicos. A transição de pequenos ensaios seguros ou de validação do conceito ("proof-of-concept") para ensaios de maior dimensão, nos quais é possível demonstrar a actividade ou a eficácia, tem sido afectada pela natureza elaborada e complicada da preparação de CD (ver abaixo). Daqui resulta que poucas empresas se têm mostrado interessadas no desenvolvimento de vacinas contra o cancro baseadas em CD, não obstante o elevado potencial terapêutico de tais produtos. A injecção intratumoral (IT) de CD constitui uma forma especial de imunoterapia baseada em CD. Após a injecção, as CD retiram antigénio das células tumorais necróticas/apoptóticas, e apresentam o antigénio às células T após migração para os gânglios linfáticos. Na verdade, observou-se que a eficácia de tais tratamentos em modelos animais apresenta uma boa correlação com o grau de apoptose no tumor (Candidoet al., Câncer Res. 61:228-236, 2001), o que sugere que esta abordagem é integralmente compatível com o tratamento de tumores por 1 ΕΡ1567155Β1 quimioterapia ou radiação antes da injecção de CD. Além disso, alguns grupos demonstraram que uma tal terapia combinatória é particularmente eficaz contra tumores formados (Nikitinaet al., Int. J Câncer 94:825-833, 2001; Tanaka et al., Int.J. Câncer 101:265-269, 2002; Tonget . al . , Câncer Res. 61:7530-7535, 2001).
Uma vez que as células tumorais são a origem do antigénio, a injecção IT antecede a necessidade, quer da selecção, quer da produção de antigénios tumorais, uma vez que são actualmente usados na maior parte das abordagens terapêuticas in vitro baseadas em CD. A selecção de um antigénio tumoral é frequentemente motivada pela necessidade de as empresas terem uma posição própria e ainda está por provar que os poucos antigénios tumorais identificados até à data apresentem benefícios clínicos significativos. Além disto, o recurso a tais antigénios tumorais resulta frequentemente numa vacina monovalente, que pode perder a sua eficácia se as células tumorais regularem em baixa a expressão do antigénio usado na imunização. É claro que a necessidade de produzir o antigénio tumoral nas condições exigidas pelas Boas Práticas de Fabrico (BPF) constitui um custo adicional aos métodos de imunização clássicos baseados em CD. A injecção IT de CD sujeita as células dendríticas a um ambiente tumoral imunossupressor. Sabe-se que os tumores produzem citocinas que inactivam as CD ou que têm a capacidade para distorcer a resposta das células T no sentido de uma resposta menos eficaz do tipo Th2. Alguns grupos recorreram à modificação genética de CD para procurarem ultrapassar estes 2 ΕΡ1567155Β1 efeitos supressores, sobretudo através da citocina Interleucina 12 (IL-12; Nishiokaet al., Câncer Res. 59:4035-4041, 1999; Meleroet al, Gene Therapy6:1779-1784, 1999) ou expressão do ligando CD40 (Kikuchiet al., Blood96:91-99, 2000). Os resultados encorajadores apresentados por estes grupos constituem uma demonstração adicional da viabilidade da injecção IT de DC como uma abordagem terapêutica.
Triozziet al. {Câncer 89:2647-2654, 2000) descrevem a injecção IT de CD em pacientes com melanoma metastático ou cancro da mama. Este autor obteve uma regressão tumoral em 4 pacientes com melanoma e em 2 pacientes com carcinoma da mama. As biopsias das lesões em regressão demonstraram a infiltração de células T, sugerindo que a CD activou na realidade uma resposta imunitária contra as células tumorais. Globalmente, estes dados demonstraram que a injecção IT de CD era exequível em seres humanos, e susceptível de apresentar benefícios clínicos significativos. Todavia, observou-se uma significativa regulação baixa de antigénios MHC de classe II e da molécula B7-2 co-estimulatória nas CD injectadas. A regulação baixa destas moléculas críticas seria expectável para reduzir o potencial imunoestimulatório das CD, mas nos termos da presente invenção isto pode ser evitado através da maturação parcial das CD antes da administração.
As CD existem em tecidos periféricos numa forma imatura, prontas para capturar e processar antigénios. É esta célula imatura que é mais estreitamente mimetizada pelas CD geradas a partir de monócitos na presença de GM-CSF e IL-4. Diversos estímulos podem desencadear a maturação das CD, processo no 3 ΕΡ1567155Β1 decurso do qual as células perdem a sua capacidade para captar antigénios eficazmente, e adquirem as suas funções estimulatórias de células T. Este processo é complexo e, pelo menos in vitro, pode demorar até 48 horas a ficar concluído. Uma outra consequência da maturação consiste na alteração das propriedades migratórias das células. Por exemplo, a maturação induz vários receptores quimioquina, incluindo CCR7, que direccionam as células para as regiões das células T de drenagem de gânglios linfáticos, onde as CD maduras activam as células T contra os antigénios que são apresentados na superfície das CD no contexto das moléculas mhc das classes I e li. A indução da tolerância foi associada à apresentação cruzada de antigénios (próprios) por CD (Kurtset al., J. Exp. Med, 186:239-245, 1997), e a actual hipótese prevalecente propõe que a CD imatura apresenta continuamente antigénios ao sistema imunitário para manter a tolerância (Kurtset al, J. Exp, Med. 184:923-930,1996), sugerindo que a maturação de CD in vivo é necessária para uma imunoestimulação eficaz. Tornou-se agora óbvio que a maturação de CD pode dar origem a CD imunoestimulatórias ou imunossupressoras (Chakrabortyet al, Clin. Immunol94:88-98, 1999). A natureza precisa dos estímulos de maturação que produzem qualquer um dos resultados não foi esclarecida, mas é geralmente aceite que as CD imunoestimulatórias produzem IL-12 e exprimem o ligando CD40 (Albertet al%NatureImmunol2:988-989,2001; Lanzavecchia, Haematologica 84 SupplEHA4 :23-25,1999). Assim, as CD parcialmente amadurecidas devem ser usadas para a injecção IT, sobretudo se se souber que os estímulos usados para a maturação 4 ΕΡ1567155Β1 de células dendríticas imaturas resultam na expressão do ligando CD40 e na produção de IL-12.
Romaner R. et al: J Urol, Vol. 159, 1998, páginas 1488 a 1492 divulga a maturação de células dendríticas com BCG num período de contacto de 48 horas. As células dendríticas são usadas para ensaios in vitro de proliferação de células T.
Lutz MB et al; Trendslmmunol, Vol. 23, 2002, páginas 445 a 449 divulga um estado de semi-amadurecimento das células dendríticas que são tolerogénicas, ou que requerem activação adicional, por exemplo através de um estímulo LPS secundário in vitro ou que podem responder a outros estímulos após uma injecção subcutânea.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção apresenta uma composição de acordo com as reivindicações. A divulgação apresenta um método para produzir uma resposta imunitária antitumoral compreendendo a administração de uma população de células que inclui células dendríticas parcialmente amadurecidas in vitro de tal forma que as células dendríticas parcialmente amadurecidas mantêm a capacidade para captar antigénios tumorais e podem induzir uma resposta imunitária subsequente à administração a uma pessoa. O método estabelece a captação eficiente e o processamento de antigénios tumorais dentro do tumor e do leito do tumor apesar do ambiente globalmente imunossupressor dentro do tumor. Seria de esperar que este ambiente imunossupressor tivesse um impacto sobre o funcionamento das células dendríticas influenciando 5 ΕΡ1567155Β1 negativamente as suas propriedades imunoestimulatórias. Adicionalmente, as células dendriticas maduras não seriam administradas a tumores porque as células não processam eficientemente os antigénios. A administração de células dendriticas parcialmente amadurecidas pode ser direccionada para um tumor existente. A administração pode também ser para o interior do leito do tumor, a região do tecido no interior e à volta de um tumor, quer antes quer após o tratamento, isto é, remoção cirúrgica ou ressecção do tumor, antes de, em simultâneo com, ou após quimioterapia, terapia de radiação, ou combinações de ambas, entre outras. As células dendriticas amadurecidas podem também ser administradas a um gânglio linfático ou região linfática que drena directamente o tumor ou uma região tumoral circundante. Além disto, as células dendriticas parcialmente amadurecidas podem ser administradas num vaso do sistema circulatório ou numa região linfática que fornece sangue ou linfa directamente ao tumor ou ao leito do tumor, ou ao órgão afectado pelo ou com o tumor. Além disto, as células dendriticas parcialmente amadurecidas podem ser administradas de uma forma geral no sistema circulatório ou linfático de tal modo que as células sejam colocadas na região do tumor.
As células dendriticas ou os seus precursores, que são úteis na presente invenção, podem ser obtidas a partir de, por exemplo e entre outros, pele, baço, medula óssea, timo, gânglios linfáticos, sangue do cordão umbilical, ou sangue periférico. Além disto, as células dendriticas podem ser obtidas de uma pessoa que vai ser submetida a tratamento ou de 6 ΕΡ1567155Β1 um indivíduo saudável com compatibilidade HLA com o indivíduo a tratar. As células dendríticas ou precursores das mesmas podem ser criopreservadas antes de serem colocadas em contacto com um agente de maturação e formuladas numa composição para administração a uma pessoa.
As células dendríticas usadas nos métodos da divulgação são parcialmente amadurecidas in vitro. Entre os agentes adequados para induzirem a maturação de células dendríticas contam-se, a título de exemplo e entre outros, Bacilo de Calmette-Guerin (BCG), interferão y(ifny), lipopolisacarídeo (LPS), factor de necrose tumoral a(TNFa), um composto de imidazoquinolina, por exemplo, um composto de imidazoquinolina-4-amina, como por exemplo 4-amino-2-etoximetilo-a,a-dimetilo-lH-imidazo[4,5-c]quinolina-l-etanol (designado por R848) ou 1-(2-metilpropil)-lH-imidazo[4,5-c]quinolina-4-amina, e respectivos derivados (WO 00/47719, um poli-ribonucleotídeo sintético de cordão duplo, por exemplo, poli[I]:poli[C(12)U], e outros, agonistas de um receptor "Toll-like" (TLR), como por exemplo TLR-3, TLR-4, TLR-7 e/ou TLR-9, uma sequência de ácidos nucleicos contendo motivos CpG não metilados conhecidos por induzirem a maturação de CD, e outros, ou uma sua combinação.
O BCG tal como usado na presente invenção pode compreender BCG total, constituintes da parede celular de BCG, lipoarabidomannans derivados de BCG, ou qualquer outro componente de BCG. Em determinadas formas de realização, o BCG consiste em BCG termo inactivado ou BCG tratado com formalina. As combinações de BCG elFNY são usadas para a maturação parcial das células dendríticas, não obstante poder usar-se apenas BCG 7 ΕΡ1567155Β1 numa versão alternativa. Uma quantidade eficaz de BCG é, normalmente, de cerca de 105 a 107cfu por mililitro de meio de cultura de tecido e uma quantidade eficaz de iFNYé, normalmente, de cerca de 100 a 1000 unidades por mililitro de meio de cultura de tecido. Numa outra forma de realização, o aqente de activação das células dendriticas é a imidazoquinolina R848. Normalmente, uma quantidade eficaz de R848, um agonista de TLR-4, que funciona é de cerca de 1 a cerca de 50 pg/ml, usando-se mais normalmente 5 a 10 pg/ml de meio de cultura de tecido. A imidazoquinolina pode ser usada só ou em combinação com, por exemplo, uma quantidade eficaz de BCG e/ou IFNy. A presente divulgação compreende igualmente composições, a composição compreende células dendriticas parcialmente amadurecidas in vitro na presença de um agente de maturação de células dendriticas combinado com um portador, um tampão e/ou um excipiente fisiologicamente aceitável para administração a uma pessoa com um tumor, possuindo regra geral as células dendriticas parcialmente amadurecidas usadas nas composições da divulgação uma expressão regulada alta de moléculas co-estimulatórias tais como, entre outras, CD80, CD86 ou CD54. As células podem ou não exprimir o marcador da superfície celular CD83, mas ainda podem captar e processar antigénios. Normalmente, a composição compreende cerca de 102 a cerca de 1010, mas pode incluir mais, células dendriticas parcialmente amadurecidas. Subsequentemente à maturação parcial, as células dendriticas podem ser criopreservadas e guardadas por algum tempo antes da administração a uma pessoa. As células utilizadas para produzir as células dendriticas parcialmente 8 ΕΡ1567155Β1 amadurecidas que fazem parte das composições da presente invenção podem ser isoladas a partir do paciente que apresenta o tumor, ou então as células dendríticas parcialmente amadurecidas podem ser produzidas a partir de células que tenham sido isoladas de uma pessoa que possua compatibilidade HLA com o paciente.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
As células dendríticas constituem uma população diversificada de células que apresentam antigénios que se podem encontrar numa variedade de tecidos linfóticos e não linfóticos. (Ver Liu, Cell106:259-62 (2001); Steinman, Ann. Rev. Immunol. 9:271-96 (1991)). As células dendríticas incluem células dendríticas do baço, células de Langerhans da epiderme, e células veladas na circulação sanguínea. Colectivamente, as células dendríticas classificam-se como um grupo que tem por base a respectiva morfologia, elevados níveis de expressão superficial de MHC de classe II, e ausência de determinados marcadores de superfície expressos em células T, células B, monócitos, e células exterminadoras naturais ("natural killer"). Em particular, as células dendríticas derivadas de monócitos (também denominadas de células dendríticas monociticas) exprimem geralmente CDllc, CD80, CD86, e são HLA-DR+, mas são CD14“.
Em contrapartida, os precursores das células dendríticas monociticas (normalmente monócitos) são geralmente CD14+. Os precursores de células dendríticas monociticas podem ser obtidos de qualquer tecido onde residam, particularmente 9 ΕΡ1567155Β1 tecidos linfócitos tais como baço, medula óssea, gânglios linfáticos e timo. Os precursores de células dendriticas monociticas podem também ser isolados a partir do sistema circulatório. 0 sangue periférico constitui uma fonte de fácil acesso a precursores de células dendriticas monociticas. 0 sangue do cordão umbilical é uma outra fonte de precursores de células dendriticas monociticas. Os precursores de células dendriticas monociticas podem ser isolados a partir de uma variedade de organismos dos quais é possível obter uma resposta imunitária. Estes organismos incluem animais, entre os quais se contam seres humanos, primatas, mamíferos (incluindo cães, gatos, ratinhos, e ratos), aves (incluindo galinhas), bem como espécies transgénicas dos mesmos.
Em determinadas formas de realização, os precursores de células dendriticas monociticas e/ou células dendriticas imaturas podem ser isolados de um sujeito saudável ou de um sujeito que necessite de imunoestimulação, tais como, por exemplo, um doente de cancro ou outro sujeito para quem a imunoestimulação celular possa ser benéfica ou desejada (isto é, um sujeito que apresente uma infecção bacteriana ou vírica, e outras). Os precursores de células dendriticas monociticas e/ou células dendriticas imaturas podem também ser obtidos a partir de um indivíduo saudável com compatibilidade HLA para activação parcial e administração a um sujeito com compatibilidade HLA que necessite de imunoestimulação. 10 ΕΡ1567155Β1
Precursores de Células Dendríticas e Células Dendríticas Imaturas
Os métodos para isolar populações de células enriquecidas para precursores de células dendríticas e células dendríticas imaturas a partir de várias origens, incluindo sangue e medula óssea, são conhecidos dos especialistas. Por exemplo, precursores de células dendríticas e células dendríticas imaturas podem ser isolados recolhendo sangue heparinizado, por aférese ou leucaferese, por preparação de camadas leucocitárias, formação de roseta, centrifugação, centrifugação de gradiente de densidade (por exemplo, usando Ficoll® (como por exemplo FICOLL-PAQUE®), PERCOLL® (partículas de silica coloidal (com diâmetro de 15-30 nm) revestidas com polivinilpirrolidona não dialisável (PVP)), sacarose, e outro), lise diferencial de células, filtração e outros. Em determinadas formas de realização, é possível preparar uma população de leucócitos, por exemplo recolhendo sangue de um sujeito, desfibrinando-o para remover as plaquetas e procedendo à lise dos glóbulos vermelhos. Em opção, os precursores de células dendríticas e células dendríticas imaturas podem ser enriquecidos para precursores de células dendríticas monocíticas por, por exemplo, centrifugação através de um gradiente PERCOLL®, selecção de anticorpos, e outros.
Opcionalmente, os precursores de células dendríticas e células dendríticas imaturas podem ser preparados num sistema asséptico fechado. Nos termos da presente invenção, as expressões "sistema asséptico fechado" ou "sistema fechado" referem-se a um sistema no qual se minimiza ou elimina a 11 ΕΡ1567155Β1 exposição a um ambiente, a ar de circulação ou a outras condições de não esterilização. Os sistemas fechados para isolar os precursores de células dendriticas e células dendríticas imaturas podem excluem geralmente centrifugação de gradiente de densidade em tubos abertos, transferência de células ao ar livre, cultura de células em placas de cultura de tecidos ou recipientes não selados, e outros. Numa forma de realização típica, o sistema fechado possibilita a transferência asséptica de precursores de células dendríticas e células dendríticas imaturas a partir de um vaso de recolha inicial para um vaso de cultura de tecidos selado sem exposição a ar não esterilizado.
Um outro método reportado para isolar precursores de células dendríticas consiste em utilizar um substrato de plástico tratado comercialmente (por exemplo, esferas ou esferas magnéticas) para remover selectivamente monócitos aderentes e outros "precursores de células não dendríticas". (Ver, por exemplo, Patentes EUA N°. 5.994.126 e 5.851.756.) Os monócitos aderentes e os precursores de células não dendríticas são eliminados enquanto as células não aderentes são retidas para cultura ex vivo e maturação. Num outro método, cultivaram-se células obtidas por aférese em sacos plásticos de cultura ao qual foram adicionadas esferas microportadoras de plástico, isto é, poliestireno ou estireno, para aumentar a superfície do saco. As células foram cultivadas durante um período de tempo suficiente para que algumas células adiram às esferas e as células não aderentes sejam removidas do saco. (Maffei, et al., Transfusloni0:1419-1420 (2000); WO 02/44338). 12 ΕΡ1567155Β1
Noutras formas de realização, os precursores de células dendríticas monocíticas são isolados por aderência a um substrato ligante de monócitos, tal como divulgado em WO 03/010292. Por exemplo, uma população de leucócitos (por exemplo, isolada por leucaferese) pode ser colocada em contacto com um substrato aderente de precursor de células dendríticas monocíticas. Quando a população de leucócitos é colocada em contacto com o substrato, os precursores de células dendríticas monocíticas na população de leucócitos aderem preferencialmente ao substrato. Outros leucócitos (incluindo outros potenciais precursores de células dendríticas) exibem uma reduzida afinidade de ligação ao substrato, permitindo deste modo que os precursores de células dendríticas sejam preferencialmente enriquecidos na superfície do substrato.
Os substratos adequados incluem, por exemplo, os que apresentam um elevado rácio entre superfície e volume. O substrato pode ser, por exemplo, um substrato de partículas ou de fibras. Os substratos de partículas adequados incluem, por exemplo, partículas de vidro, partículas de plástico, partículas de plástico revestidas de vidro, partículas de poliestireno revestidas de vidro, e outras esferas adequadas à absorção de proteínas. Entre os substratos fibrosos adequados à utilização na presente invenção contam-se tubos microcapilares e membranas com microvilosidades, e outras. Em geral, o substrato de partículas ou fibras permite que os precursores de células dendríticas monocíticas aderentes sejam eluídos sem que ocorra uma redução substancial da viabilidade das células aderentes. Um substrato de partículas ou fibras pode ser substancialmente não poroso para facilitar a eluição de 13 ΕΡ1567155Β1 precursores de células dendríticas monocíticas ou de células dendríticas do substrato. Um substrato "substancialmente não poroso" é um substrato em que há pelo menos uma maioria de poros existentes no substrato mais pequenos do que as células para minimizar o aprisionamento de células no substrato. A aderência dos precursores de células dendríticas monocíticas ao substrato pode, opcionalmente, ser melhorada pela adição de um meio ligante. Os meios ligantes adequados incluem meio de cultura de precursores de células dendríticas monocíticas (por exemplo, AIM-V®, RPMI1640, DMEM, x-vivo 15®, e outros) complementados, individualmente ou em qualquer combinação, com, por exemplo citocinas (por exemplo Factor de Estimulação de Colónia de Macrófagos/Granulócitos (GM-CSF), Interleucina 4 (IL—4), ou Interleucina 13 (IL-13)), plasma sanguíneo, soro (por exemplo, soro humano, tal como soro autólogo ou alogénico), proteínas purificadas, tais como albumina do soro, catiões divalentes(por exemplo, iões cálcio e/ou magnésio) e outras moléculas que contribuem para a aderência específica ao substrato de precursores de células dendríticas monocíticas, ou que impedem a aderência ao substrato de precursores de células dendríticas não monocíticas. Em determinadas formas de realização, o plasma ou soro sanguíneo pode ser inactivado termicamente. 0 plasma inactivado termicamente pode ser autólogo ou heterólogo para os leucócitos.
Na sequência da aderência ao substrato de precursores de células dendríticas monocíticas, os leucócitos não aderentes são separados dos complexos substrato/precursores de células 14 ΕΡ1567155Β1 dendríticas monocíticas. Qualquer meio adequado pode ser usado para separar as células não aderentes dos complexos. Por exemplo, é possível permitir que a mistura dos leucócitos não aderentes e complexos sedimente, sendo os leucócitos não aderentes e o meio decantados ou drenados. Em alternativa, a mistura pode ser centrifugada, e o sobrenadante que contém os leucócitos não aderentes é decantado ou drenado dos complexos peletizados.
Noutro método, os precursores de células dendríticas monocíticas podem ser isolados de uma população de células enriquecida em leucócitos e preparada usando um dispositivo de filtração de fluxo tangencial tal como descrito no Pedido de Patente Internacional n°. PCT/US03/19428, apresentado em 19 de Junho de 2003. Um dispositivo de filtração de fluxo tangencial utilizado para o isolamento de uma população de células enriquecidas em precursores de células dendríticas monocíticas pode compreender uma unidade removedora dotada de uma câmara de fluxo cruzado, uma câmara de filtrado e um filtro colocado entre ambas. 0 filtro está em comunicação com o fluido de um lado, a superfície do concentrado, com a câmara de fluxo cruzado, e do outro lado, a superfície do filtrado, com a câmara do filtrado. A câmara de fluxo cruzado dispõe de uma entrada adaptada para introduzir uma amostra de constituintes de sangue compreendendo leucócitos na câmara de fluxo cruzado e paralela à superfície do concentrado do filtro. Na câmara de fluxo cruzado existe também uma saída colocada centralmente numa secção da câmara oposta à superfície do concentrado do filtro. O filtro adequado para utilização no dispositivo de filtração de fluxo tangencial tem habitualmente uma dimensão 15 ΕΡ1567155Β1 média aproximada do poro compreendida entre 1 e 10 microns. O filtro pode apresentar uma dimensão média aproximada do poro compreendida entre 3 e 7 microns. Pode também ser incluído um meio para providenciar uma velocidade de entrada predefinida da amostra na entrada da câmara de fluxo cruzado e um meio para controlar a velocidade de filtração do filtrado através do filtro e para o interior da câmara de filtrado. O meio de controlo da velocidade de filtração limita a velocidade de filtração a um valor inferior à velocidade de filtração sem oposição para o filtro. A amostra compreendendo constituintes do sangue pode ser disponibilizada por um dispositivo de origem como um dispositivo de leucaferese ou um recipiente que compreende uma amostra recolhida de um dispositivo de leucaferese.
Os precursores de células dendríticas monocíticas e populações de células enriquecidas para os precursores pode ser cultivada ex vivo para efeitos de diferenciação, e maturação parcial e/ou expansão. Tal como aqui usado, as células dendríticas imaturas isoladas, os precursores de células dendríticas, e outras células, referem-se a células que, por acção humana, existem fora do seu ambiente nativo, pelo que não são produtos naturais. As células isoladas podem existir sob forma purificada, sob forma semi-purificada, ou num ambiente não nativo. Resumidamente, a diferenciação ex vivo envolve habitualmente a cultura de precursores de células dendríticas monocíticas, ou de populações de células com precursores de células dendríticas, na presença de um ou mais agentes de diferenciação. Entre os agentes de diferenciação adequados podem contar-se, por exemplo, factores de crescimento celular 16 ΕΡ1567155Β1 (por exemplo, citocinas como (GM-CSF), Interleucina 4 (IL-4), Interleucina 7 (IL-7), Interleucina 13 (IL-13), e/ou combinações das mesmas). Em determinadas formas de realização, os precursores de células dendriticas monociticas são diferenciados para formar células dendriticas imaturas derivadas de monócitos.
Os precursores de células dendriticas podem ser cultivados e diferenciados em condições adequadas de cultura. Os meios de cultura de tecidos adequados incluem, entre outros, AIM-V®, RPMI1640, dmem, X-VIVO 15®, e outros. Os meios de cultura de tecidos podem ser complementados com soro, aminoácidos, vitaminas, citocinas, tais como GM-CSF e/ou IL-4, IL-7, IL-13, catiões divalentes, e outros, para promover a diferenciação das células. Em determinadas formas de realização, os precursores de células dendriticas podem ser cultivados num meio isento de soro. Opcionalmente, as condições de cultura podem excluir qualquer derivado de produtos animais. Uma combinação habitual de citocinas utilizadas com meio de cultura de células dendriticas compreende cerca de 500 unidades/ml cada de GM-CSF e EL-4, IL-7, ou IL-13. Os precursores de células dendriticas, quando diferenciados para formar células dendriticas imaturas, apresentam um fenótipo similar ao das células de Langerhans cutâneas. Habitualmente, as células dendriticas imaturas são CD 14” e CDllc+, exprimem baixos niveis de CD86 e CD83, e são capazes de capturar antigénios solúveis por via de endocitose especializada.
Os agentes de maturação de células dendriticas da divulgação podem incluir, a titulo de exemplo e entre outros, 17 ΕΡ1567155Β1 BCG, IFNy, LPS, TNFa, um composto de imidazoquinolina, por exemplo, um composto de imidazoquinolina-4-amina, tal como 4-amino-2-etoximetilo-a;a-dimetil-lH-imidazo[4,5-c]quinolina-1-etanol (designado por R848) ou 1-(2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolina-4-amina, e respectivos derivados (WO 00/47719), um poliribonucleotídeo sintético de cordão duplo, por exemplo, poli [I]:poli[C (12)U], e outros, agonistas de um receptor "Toll-like" (TLR), como por exemplo TLR-3, TLR-4, TLR-7 e/ou TLR-9, uma sequência de ácidos nucleicos contendo motivos CpG não metilados conhecidos por induzirem a maturação de CD, e outro, ou uma combinação destes. As quantidades eficazes de BCG variam habitualmente entre cerca de 105 e 107cfu por mililitro de meio de cultura de tecidos. As quantidades eficazes de IFNy variam habitualmente entre cerca de 100-1000 U por mililitro de meio de cultura de tecidos. O Bacilo de Calmette-Guerin (BCG) é uma estirpe avirulenta de M. bovis. Tal como usado no presente, BCG refere-se a BCG total bem como a constituintes da parede celular, lipoarabidomannans derivados de BCG, e outros componentes de BCG. Opcionalmente, o BCG é inactivado por várias formas, tais como inactivação térmica, tratamento com formalina, e outras. Uma quantidade eficaz aproximada de um composto de imidazoquinolina, por exemplo, um composto de imidazoquinolina-4-amino, tal como 4-amino-2-etoximetil-a,α-dimetil-lH-imidazo[4,5-c]quinolina-1-etanol (designado por R848) pode estar entre 1 e 50 pg/ml de meio de cultura, usando-se mais habitualmente 5 a 10 pg/ml de meio de cultura. O composto de imidazoquinolina pode ser usado só ou combinado com, por exemplo, BCG e/ou IFNy, ou um agonista TLR adicional. 18 ΕΡ1567155Β1
As CD imaturas são habitualmente contactadas com quantidades eficazes do agente de maturação de células dendriticas, tal como BCG e iFNy, entre cerca de 1 a 10 horas. Habitualmente, é necessário um periodo de incubação de pelo menos 24 horas para a maturação completa. O periodo de incubação mais habitual é de 48 a 72 horas. As células dendriticas imaturas podem ser cultivadas e parcialmente amadurecidas em condições de cultura de maturação adequadas. Os meios de cultura de tecidos adequados incluem AIM-V®, RPMI 1640, DMEM, X-VIVO 15®, e outros. Os meios de cultura de tecidos podem ser complementados com aminoácidos, vitaminas, citocinas, tais como GM-CSF e/ou IL-15, catiões divalentes, e outros, para promover a maturação das células. Uma combinação habitual de citocinas é de cerca de 500 unidades/ml de GM-CSF e 100 pg/ml de IL-15. A maturação parcial de células dendriticas imaturas pode ser monitorizada por métodos conhecidos na especialidade direccionados para células dendriticas. Os marcadores da superfície celular podem ser detectados em ensaios conhecidos na especialidade, tais como citometria de fluxo, imuno-histoquimica, e outros. As células podem também ser monitorizadas para produção de citocinas (por exemplo, por ELISA, outro teste imunitário, ou pelo recurso a um conjunto de oligonucleótidos. Em CD cultivadas e parcialmente amadurecidas em conformidade com a presente invenção na presença de um agente de maturação de células dendriticas, tal como GM-CSF e IL-4, os niveis de JAK2 (Janus cinase 2 activada) fosforilada podem ser medidos para indicar a iniciação da maturação por métodos bem conhecidos na especialidade. A indução da expressão 19 ΕΡ1567155Β1 dos marcadores da superfície celular e das citocinas, bem como a fosforilação de moléculas de sinalização, por exemplo,jak2, é também bem conhecida como um indicador de que as células dendríticas estão condicionadas para indução de uma resposta imunitária depois de as células terem sido administradas a uma pessoa.
As células dendríticas imaturas estão sujeitas a maturação apenas por um período de tempo necessário para maturação parcial das células dendríticas. As CD integralmente amadurecidas perdem a capacidade para captar antigénios e apresentam expressão regulada alta de moléculas co-estimuladoras da superfície celular e diversas citocinas. Especificamente, as CD maduras exprimem níveis mais elevados de antigénios MHC das classes I e II do que de células dendríticas imaturas, e as células dendríticas maduras são geralmente identificadas como sendo CD80+, CD83+, CD86+, e CD 14”. Uma expressão mais elevada de MHC conduz a um aumento na densidade de antigénios na superfície de CD, enquanto a regulação alta de moléculas co-estimuladoras CD80 e CD86 reforça o sinal de activação de células T através dos correspondentes das moléculas co-estimuladoras, tais como CD28 nas células T. As células dendríticas parcialmente maduras tal como usadas na presente invenção compreendem habitualmente as células dendríticas que uma vez expostas a um agente de maturação de células dendríticas demonstram uma regulação alta de expressão de uma molécula co-estimuladora incluindo, entre outras, CD80, CD86 e/ou CD54. A célula pode exprimir ou não CD83, mas mantém a capacidade para captar e processar antigénios. Adicionalmente, as células dendríticas parcialmente maduras 20 ΕΡ1567155Β1 podem produzir TNF-α, IL-6, IL-10 e/ou IL-12 que não são habitualmente produzidas por células dendriticas imaturas.
As células dendriticas integralmente maduras não são recomendadas na presente invenção porque não processam eficientemente antigénios. Adicionalmente, as células dendriticas imaturas tal como usadas em métodos anteriores não são desejadas devido ao ambiente imunossupressor habitualmente encontrado no interior de um tumor, incluindo concentrações substanciais de citocinas conhecidas por evitarem o processamento de antigénios por células dendriticas imaturas. Na presente invenção, a maturação parcial das células dendriticas imaturas é responsável pela regulação baixados receptores de citocinas na superfície da célula tornando-as menos sensíveis ou reactivas a qualquer efeito imunossupressor de citocinas presentes no espaço intratumoral e disponibiliza células que podem processar eficientemente antigénios de tumores presentes no interior do espaço intratumoral. Assim que as células dendriticas parcialmente amadurecidas tenham amadurecido no interior do tumor como se pode medir pela produção de, por exemplo, TNF-α e IL-12, e pela expressão de receptor de quimioquina CCR7, as células podem migrar para os gânglios linfáticos onde as células contactam as células T para regulação alta da resposta imunitária aos antigénios do tumor.
Ainda de acordo com outro aspecto da invenção, as CD podem ser preservadas, por exemplo, por criopreservação quer antes da maturação, quer na sequência da maturação parcial anterior à administração a um paciente. Os agentes de criopreservação que se podem usar incluem, entre outros, dimetilsulfóxido (DMSO), 21 ΕΡ1567155Β1 glicerol, polivinilpirrolidona, polietileno glicol, albumina, dextrano, sacarose, etileno glicol, i-eritritol, D-ribitol, D-manitol, D-sorbitol, i-inositol, D-lactose, cloreto de colina, aminoácidos, metanol, acetamida, monoacetato de glicerol, e sais inorgânicos. Uma velocidade de arrefecimento lenta e controlada pode revelar-se critica. Diferentes agentes crioprotectores e diferentes tipos de células apresentam habitualmente diferentes velocidades óptimas de arrefecimento. 0 calor da fase de fusão na qual a água se transforma em gelo deve habitualmente ser minimo. 0 procedimento de arrefecimento pode ser executado usando, por exemplo, um dispositivo programável de congelamento ou um procedimento com um banho de metanol. Os aparelhos programáveis de congelamento permitem a determinação de velocidades óptimas de arrefecimento e facilitam o arrefecimento normal reprodutível. Os congeladores programáveis de velocidade controlada tais como Cryomed ou Planar permitem sintonizar o regime de congelamento para a curva da velocidade de arrefecimento desejada.
Após um congelamento completo, as células de precursores monociticos, as CD imaturas ou CD parcialmente maduras podem ser rapidamente transferidas para um recipiente de armazenagem criogénica de longa duração. Numa forma de realização habitual, as amostras podem ser guardadas criogenicamente em azoto liquido (-196°C) ou no seu vapor (-165°C) . As considerações e os procedimentos para a manipulação, criopreservação, e armazenagem de longa duração de células estaminais hematopoiéticas, nomeadamente as provenientes da medula óssea ou de sangue periférico, são em grande medida aplicáveis às células da invenção. Um tal debate pode ser encontrado, por 22 ΕΡ1567155Β1 exemplo, nas seguintes referências:Taylor et al., Cryobiology21:269-78 (1990); Gorin, Clinics in Haematologylb:19-48 (1986); Bone-MarrowConservation, CultureandTransplantation, Proceedingsof a Panei, Moscovo, 22 a 26 de Julho de 1968, InternationalAtomicEnergyAgency (Agência Internacional de Energia Atómica), Viena, pp. 107-186.
As células congeladas são, preferencial e rapidamente, descongeladas (por exemplo, num banho de água mantido a 37°-41° C) e imediatamente arrefecidas depois do descongelamento. Pode ser desejável tratar as células no sentido de impedir uma aglomeração celular após descongelamento. Para evitar a aglomeração, podem ser usados vários procedimentos, incluindo entre outros, a adição antes e/ou após congelamento de DNase (Spitzeret alCâncer 45: 3075-85 (1980)), dextrano e citrato de baixo peso molecular, hidroxietil amido (Stiffsal, Cryoblology20: 17-24 (1983)), e outros. O agente crioprotector, se for tóxico para os seres humanos, deve ser removido antes do uso terapêutico das CD descongeladas parcialmente amadurecidas. Uma forma pela qual o agente crioprotector pode ser removido é por diluição para uma concentração insignificante. Depois de as CD parcialmente amadurecidas e congeladas terem sido descongeladas e recuperadas, podem ser administradas tal como descrito no presente no que respeita a CD parcialmente amadurecidas não congeladas. 23 ΕΡ1567155Β1
Administração in vivo de células dendríticas parcialmente amadurecidas São disponibilizados métodos para administração de células dendríticas parcialmente maduras, ou de uma população de células enriquecidas e contendo tais células, a um sujeito que tenha um tumor. Em determinadas formas de realização, tais métodos são executados por obtenção de precursores de células dendríticas ou de células dendríticas imaturas, diferenciando e amadurecendo parcialmente essas células na presença de um agente de maturação de células dendríticas, tal como BCG e IFNy, ou de qualquer outro agente de maturação como os listados acima. As células dendríticas parcialmente amadurecidas podem ser formuladas com portadores fisiologicamente aceites, excipientes, tampões e/ou diluentes usando métodos e composições bem conhecidas de um técnico experiente. As células dendríticas parcialmente amadurecidas podem ser administradas directamente a um paciente que necessite de imunoestimulação. Habitualmente, cerca de 102 a cerca de IO10 células são suspensas num portador aceite do ponto de vista farmacêutico. As células podem ser injectadas directamente no tumor ou numa região próxima do mesmo, adjacente ao mesmo, ou em contacto circulatório ou linfático com o tumor ou o leito do tumor para assegurar que as células têm acesso aos antigénios do tumor. A título de exemplo, mas não limitativo, as células podem ser administradas directamente no leito do tumor subsequentemente à remoção cirúrgica ou ressecção do tumor, peri-tumoralmente, num gânglio linfático em drenagem em contacto directo com o tumor, num vaso sanguíneo ou dueto 24 ΕΡ1567155Β1 linfático que penetre ou alimente um tumor ou órgão afectado pelo tumor, por exemplo, a veia porta ou uma veia pulmonar ou artéria, ou outro. A administração de células dendríticas parcialmente amadurecidas da divulgação pode decorrer em simultâneo com ou na sequência de outros tratamentos ao tumor, tais como quimioterapia ou terapia de radiação. Adicionalmente, as células dendríticas parcialmente amadurecidas da invenção podem ser co-administradas com um outro agente, o qual funciona como um adjuvante da maturação das células dendríticas e/ou o processamento de antigénios no tumor ou na região próxima ou adjacente ao tumor. Além disto, as células dendríticas podem também ser formuladas ou compostas numa matriz de libertação lenta para implantação num região no interior ou circundante ao tumor ou ao leito do tumor de tal modo que as células sejam libertadas lentamente no tumor, ou no leito do tumor, para contacto com os antigénios do tumor.
As células dendríticas parcialmente amadurecidas da presente invenção podem ser administradas por qualquer meio apropriado à formulação ou ao modo de administração. A título de exemplo, as células podem ser combinadas com um portador aceitável do ponto de vista farmacêutico e administradas com uma seringa, um cateter, uma cânula, ou outro meio. Tal como acima, as células podem ser formuladas numa matriz de libertação lenta. Se administrada deste modo, a formulação poder ser administrada por um meio adequado para a matriz utilizada. Outros métodos e modos de administração aplicáveis à presente divulgação são do conhecimento de um técnico experiente. 25 ΕΡ1567155Β1
As composições da presente invenção podem ser usadas por si próprias no tratamento de uma pessoa. Adicionalmente, as composições podem ser usadas em combinação com qualquer outro método para tratar um tumor. A titulo de exemplo, os métodos da presente invenção podem ser usados em combinação com a ressecção cirúrgica de um tumor, quimioterapia (fármacos citotóxicos, agentes apoptóticos, anticorpos, e outros), terapia de radiação, crioterapia, braquiterapia, imunoterapia (administração de células dendriticas amadurecidas especificas de antigénios, células NK, anticorpos específicos para antigénios de tumores, etc.), e outros. Qualquer um destes métodos pode igualmente ser utilizado em qualquer combinação. Os tratamentos de combinação podem ser concorrentes ou sequenciais e podem ser administrados em qualquer ordem conforme determinação do médico responsável pelo tratamento.
Numa outra forma de realização, as células dendriticas e o sujeito receptor possuem o mesmo haplotipo MHC (HLA). Os métodos para determinar o haplotipo HLA de um sujeito são conhecidos nesta especialidade. Numa forma de realização afim, as células dendriticas parcialmente amadurecidas são alogénicas para o sujeito receptor. As células alogénicas são habitualmente adaptadas para pelo menos um alelo MHC(por exemplo, partilhando pelo menos um mas não todos os alelos MHC) . Numa forma de realização menos habitual, as células dendriticas e o sujeito receptor são alogénicos cada um em relação ao outro, mas todos apresentam em comum pelo menos um alelo MHC. 26 ΕΡ1567155Β1
Exemplos
Os exemplos seguintes são apresentados a título meramente exemplificativo de vários aspectos da presente invenção e não devem ser considerados como limitando a invenção por qualquer modo. Quaisquer exemplos que não sejam abrangidos pelo âmbito das reivindicações são apresentados unicamente para efeitos comparativos.
Exemplo 1
No presente exemplo, os precursores de células dendríticas monocíticas, isolados por filtração de fluxo tangencial, foram cultivadas a uma concentração de 106 monócitos/ml em X-VIVO 15® complementado com 2% de albumina de soro humano (HSA) e 500 U/ml de GM-CSF quer em frascos quer em sacos de células. Decorridos 5 dias, as CD dos frascos e dos sacos foram deixadas sem tratamento (iDCs) ou foram parcialmente amadurecidas durante 4 horas na presença de BCG (diluição de 1:400) e interferão γ (TFNy, 500 U/ml)(pmDCs). As células foram colhidas, lavadas e misturadas com um número igual de células tumorais PKH67-A549com uma marcação fluorescente irradiadas durante 48 horas. Na sequência da incubação, as células foram lavadas, marcadas com um anticorpo monoclonal marcado com ficoeritrina (PE) específico para CDllc, e analisadas por citometria de fluxo. Os valores que constam da Tabela 1 representam a percentagem de células CDllc+ dentro da gate das CD que também foram positivas para o antigénio PKH67 marcado (MFI = intensidade de fluorescência média). Os controlos 27 ΕΡ1567155Β1 incluíram CD misturadas com células PKH67-A549 imediatamente antes da análise.
Tabela 1.
Tratamento % de células MFI CDllc+PKH67+ frasco de iDCs 87, 6 235,2 frasco de pmDCs 90, 7 610,2 saco de iDCs 72,8 403,5 saco de pmDCs 91,3 557,5
Estes dados mostram que as CD parcialmente amadurecidas se comportaram melhor na captação de antigénios neste ensaio dos que as células dendriticas imaturas, tal como medido quer pela percentagem de células que captam antigénios, quer pela quantidade de material recolhido pelas células tumorais.
Num outro exemplo, efectuou-se uma leucaferese num paciente subsequente a uma cirurgia para remoção de um crescimento tumoral. Os monócitos foram purificados do produto da leucaferese por filtração de fluxo tangencial. Os monócitos purificados foram diferenciados tal como descrito acima e parcialmente amadurecidos por exposição a BCG inactivado termicamente e fixado por formalina (5 x 106cfu/ml) IFNy (500 u/ml). As células dendriticas parcialmente amadurecidas foram formuladas para administração e injectadas no leito do tumor do paciente, sob orientação por ultra-sons. Verificou-se que as 28 ΕΡ1567155Β1 células dendríticas isoladas do paciente eram capazes de induzir uma resposta das células T citotóxicas específicas do tumor quando medidas in vitro. Adicionalmente, observou-se que o tempo para a recorrência do tumor era evitado ou substancialmente atrasado.
Exemplo 2
Neste exemplo, as células do cancro do cólon humano foram enxertadas em ratos para darem origem a xenoenxertos tumorais por métodos bem conhecidos. Depois de estabelecidos os tumores, os animais foram divididos em grupos e aos animais de cada grupo foi administrado no tumor, em alternativa, placebo, células dendríticas imaturas ou células dendríticas parcialmente amadurecidas. As dimensões do tumor foram subsequentemente medidas e comparadas para cada grupo.
Resumidamente, os tumores do carcinoma do cólon CT26 humano estabeleceram-se em fêmeas de ratos Balb/c injectando subcutaneamente 100 000 células tumorais no flanco direito. O tratamento iniciou-se no dia 15, no momento em que todos os ratos apresentavam tumores palpáveis com dimensões variáveis entre 10 mm2 e 45 mm2.
As células dendríticas foram preparadas a partir de medula óssea femoral de fêmeas de ratos Balb/c seguindo protocolos normalizados. Resumidamente, as células da medula óssea na sequência da lise dos glóbulos vermelhos foram incubadas com GM-CSF (200 U/ml) murina e IL-4 (200 U/ml) em RPMI1640 complementado com 10% de soro fetal bovino durante 13 - 14 29 ΕΡ1567155Β1 dias, com adição de meio fresco com citocinas após 3 e 7 dias. Para obter células dendriticas parcialmente amadurecidas, as células foram expostas a uma diluição de 400vezes de Bacilo de Calmette-Guerin (BCG) inactivado que tinha uma actividade de 0,5 - 1 x 106 unidades formadoras de colónias por mililitro antes da inactivação, e 500 unidades de murina gama interferão (ifny) por mililitro. As células foram incubadas durante 8 horas e de seguida colocadas sobre metrizamida 14,5% e centrifugadas durante 15 minutos a 4°C e 1750 rpm. A interface foi recolhida e as células foram lavadas e descongeladas de forma viável em dimetilsulfóxido 10% (DMSO) e armazenados em azoto liquido. Na sequência do descongelamento a 37°C, as células foram lavadas duas vezes e novamente suspensas numa concentração de 1 milhão de células por 50 microlitros.
Os ratos portadores de tumores foram tratados com ciclofosfamida (50 mg/kg) intraperitonealmente nos dias 15 e 17. A injecção de células dendriticas no tumor (ou a injecção simulada de 50 μΐ de soro fisiológico tamponado com fosfato, CD imaturas ou CD amadurecidas durante 8 horas) foi executada nos dias 16, 17, 18 e 21) . O crescimento do tumor foi medido em todos os restantes dias ao longo de 60 dias.
No grupo tratado intratumoralmente com soro fisiológico tamponado com fosfato, todos os 4 ratos apresentavam tumores com mais de 100 mm2 no dia 40, ou antes. Em contrapartida, os ratos tratados intratumoralmente com CD imaturas tinham um crescimento tumoral reduzido e 2 dos 4 ratos apresentavam tumores inferiores a 100 mm2 no dia 40. Três dos 4 ratos tratados com CD parcialmente amadurecidas tinham tumores 30 ΕΡ1567155Β1 inferiores e 100 mm2 no dia 40, e dois desses animais não apresentavam qualquer tumor palpável no dia 50.
Exemplo 3
Neste exemplo, as células do cancro do cólon humano foram injectadas em ratos para darem origem a xenoenxertos tumorais por métodos bem conhecidos. Subsequentemente à primeira injecção de células tumorais, os animais receberam uma segunda dose de células tumorais. Após 15 dias, os animais foram divididos em grupos e aos animais de cada grupo foi administrado no tumor, em alternativa, placebo, células dendriticas imaturas ou células dendriticas parcialmente amadurecidas. As dimensões do tumor foram subsequentemente medidas e comparadas para cada grupo.
Resumidamente, os tumores do carcinoma do cólon CT26 humano estabeleceram-se em fêmeas de ratos Balb/c injectando subcutaneamente 100 000 células tumorais no flanco direito, a que se seguiu uma injecção de 100 000 células tumorais no flanco esquerdo no dia 3. O tratamento iniciou-se no dia 15, no momento em que todos os ratos apresentavam tumores palpáveis com dimensões variáveis entre 10 mm2 e 45 mm2.
As células dendriticas foram preparadas a partir de medula óssea femoral de fêmeas de ratos Balb/c seguindo protocolos normalizados. Resumidamente, as células da medula óssea na sequência da lise dos glóbulos vermelhos foram incubadas com GM-CSF (200 U/ml) murina e IL-4 (200 U/ml) em RPMI1640 complementado com 10% de soro fetal bovino durante 13 - 14 31 ΕΡ1567155Β1 dias, com adição de meio fresco com citocinas após 3 e 7 dias. Para obter células dendriticas parcialmente amadurecidas, as células foram expostas a uma diluição de 400vezes de Bacilo de Calmette-Guerin (BCG) inactivado que tinha uma actividade de 0,5 - 1 x 106 unidades formadoras de colónias por mililitro antes da inactivação, e 500 unidades de murina gama interferão por mililitro. As células foram de seguidas colocadas sobre metrizamida 14,5% e centrifugadas durante 15 minutos a 4 °C e 1750 rpm. A interface foi recolhida e as células foram lavadas e descongeladas de forma viável em dimetilsulfóxido 10% (DMSO) e armazenados em azoto liquido. Na sequência do descongelamento a 37 °C, as células foram lavadas duas vezes e novamente suspensas numa concentração de 1 milhão de células por 50 microlitros.
Os ratos portadores de tumores foram tratados com ciclofosfamida (50 mg/kg) intraperitonealmente nos dias 15 e 17. A injecção de células dendriticas no tumor do flanco direito (ou injecção simulada de 50 plde soro fisiológico tamponado com fosfato, CD imaturas, CD amadurecidas durante 8 horas ou CD amadurecidas durante 24 horas foi executada nos dias 16, 17, 18 e 21) . O crescimento do tumor foi medido em todos os restantes dias ao longo de 60 dias.
No grupo tratado intratumoralmente com soro fisiológico tamponado com fosfato, todos os 5 ratos apresentavam tumores com mais de 100 mm2 antes do dia 35, e 3/5 animais apresentavam tumores no flanco esquerdo > 100 mm2 no dia 40 ou antes. Em contrapartida, os ratos tratados intratumoralmente (só do lado direito) com CD imaturas tinham um crescimento tumoral 32 ΕΡ1567155Β1 reduzido: um rato não apresentava qualquer tumor palpável em ambos os lados no dia 60, e 4 dos 5 ratos apresentavam tumores < 100 mm2 em ambos os lados no dia 40. Três dos 5 ratos tratados com CD parcialmente amadurecidas durante 8 horas tinham resolvido completamente ambos os tumores no dia 50. No grupo tratado com CD parcialmente amadurecidas durante 24 horas, o crescimento tumoral tinha-se reduzido ainda mais. Três dos 5 ratos resolveram completamente os tumores em ambos os lados no dia 50, um animal resolveu completamente o tumor do flanco esquerdo, e controlou parcialmente o tumor do flanco direito (< 100 mm2 no dia 40) e um animal controlou parcialmente ambos os tumores (< 50 mm2 em ambos os lados no dia 40) .
Exemplo 4
Neste exemplo, usaram-se as células tumorais humanas para formar tumores xenográficos em ratos tal como descrito acima. As células dendríticas imaturas diferenciadas foram parcialmente amadurecidas expondo as células ao agente de maturação de células dendríticas imidazoquinolina R848 ou R848 combinada com BCG e IFNy. As células dendríticas parcialmente amadurecidas, as células dendríticas imaturas e um placebo foram administradas no tumor e compararam-se as dimensões dos tumores em cada grupo.
Resumidamente, estabeleceram-se tumores em ratos tal como no exemplo 2. As células dendríticas foram preparadas como nos exemplos 2 e 3, mas a maturação parcial das células foi obtida expondo as células a 5 pg/ml do modificador da resposta 33 ΕΡ1567155Β1 imunitária (agente de maturação das células dendriticas) R848, ou 5 pg/ml do modificador da resposta imunitária R848 em conjunto com BCG e gama interferão nas concentrações definidas nos exemplos 2 e 3, durante 8 horas. 0 plano de tratamento foi idêntico ao do exemplo 3. Nenhum dos ratos injectados intratumoralmente com soro fisiológico tamponado com fosfato controlou o crescimento tumoral. Um dos cinco ratos tratados com CD parcialmente amadurecidas apenas com R848 resolveu integralmente o crescimento tumoral, tal como o fizeram 3 dos 5 ratos tratados intratumoralmente com CD parcialmente amadurecidas com R848 com BCG e IFNy. Nove ratos dos exemplos 3 e 4 que tinham resolvido completamente os respectivos tumores foram estimulados cerca de 30 dias após a resolução dos tumores no flanco direito com 1 milhão de células tumorais. Nenhum dos animais apresentou crescimento tumoral detectável, demonstrando protecção imunológica contra as células tumorais CT26.
Exemplo 5
Neste exemplo, as células dendriticas preparadas nos exemplos acima foram caracterizadas para a expressão de moléculas de superfície. Resumidamente, as células dendriticas murinas, preparadas como nas experiências 2-4, foram caracterizadas para expressão de moléculas da superfície celular após marcação com anticorpos fluorescentes e análise por citometria de fluxo. Os resultados são apresentados nas Tabelas 2 e 3 sob a forma de percentagem de células positivas 34 ΕΡ1567155Β1 para os marcadores de superfície fenotípica e de intensidade de fluorescência média para certos marcadores de superfície.
Tabela 2.
Percentagem de células positivas tratamento CDllc MHC-II CD80 CD 8 6 CD 5 4 CD40 Imatura 66,9 68,1 62,2 28, 1 62, 6 1,4 R848 (8 hrs) 60,7 76, 4 73,4 31, 3 96, 6 1,5 BCG/IFN (8 hrs) 59,5 85, 5 84, 9 66,0 96,0 2,0 BCG/IFN/R848 (8 hrs) 58,4 88,8 82, 4 61,8 96, 6 2, 6 BCG/IFN (24 hrs) 66,3 91,5 90, 0 84,4 95,3 3, 3
Tabela 3
Intensidade de fluorescência média tratamento MHC-H CD80 CD86 CD54 CD4 0 Imatura 395, 7 50,0 30, 7 53,8 3,0 R848 (8 hrs) 515, 5 54,7 30, 0 90,0 8,0 BCG/IFN (8 hrs) 751,1 79,1 74, 6 120,3 7,2 BCG/IFN/R848 (8 hrs) 757,8 79,3 66,4 132, 9 13,9 BCG/IFN (24 hrs) 876, 8 97, 9 99, 0 126, 9 11,4 35 ΕΡ1567155Β1
Exemplo 7
Um paciente diagnosticado com um tumor sólido é tratado com quimioterapia, terapia de radiação, crioterapia, ou braquiterapia e subsequentemente com células dendriticas parcialmente amadurecidas administradas intratumoralmente. Na sequência do tratamento, o tumor está resolvido e o paciente protegido da recorrência do tumor.
Os exemplos anteriores são apresentados para exemplificar o âmbito das invenções reivindicadas, mas não o limitam. Outras variantes das invenções estarão imediatamente evidentes aos técnicos com competências na especialidade e abrangidas pelas reivindicações apensas.
Lisboa, 20 de Janeiro de 2011 36
Claims (9)
- ΕΡ1567155Β1 REIVINDICAÇÕES 1. Composição que compreende células dendríticas parcialmente amadurecidas in vitro na presença de um agente de maturação de células dendríticas combinado com um portador aceite do ponto de vista farmacêutico para administração in vivo, em que as células dendríticas parcialmente amadurecidas demonstram regulação alta da expressão da molécula co-estimuladora CD80, CD86 e/ou CD54, e fosforilação de JAK2, e mantêm a capacidade para captar e processar antigénios, para uso no tratamento de tumores, caracterizada por a composição se destinar a ser administrada directamente no tumor ou numa região próxima do, adjacente a, ou em contacto circulatório ou linfático com o tumor, ou o leito do tumor; e em que o agente de maturação de células dendríticas é o Bacilo de Calmette-Guerin (BCG) e interferão γ (IFNy) ; BCG, INFy e imidazoquinolina R848; ou apenasR848.
- 2. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que as células dendríticas são obtidas da pele, do baço, da medula óssea, do timo, de gânglios linfáticos, de sangue do cordão umbilical, ou de sangue periférico.
- 3. Composição de acordo com a reivindicação 2, em que as células dendríticas são obtidas da pessoa em tratamento.
- 4. Composição de acordo com a reivindicação 2, em que as células dendríticas são obtidas de um indivíduo saudável com compatibilidade HLA com o indivíduo a tratar.
- 5. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que o BCG compreende BCG total, constituintes da parede celular de BCG, lipoarabidomannans derivados de BCG, componentes de BCG, ou o 1 ΕΡ1567155Β1 BCG consiste em BCG inactivado termicamente ou BCG tratado com formalina.
- 6. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que a quantidade eficaz de BCG é de cerca de 105 a 107cfu por mililitro de meio de cultura de tecidos, a quantidade eficaz de IFNy é de cerca de 100 a cerca de 1000 unidades por mililitro de meio de cultura de tecidos.
- 7. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que as células dendríticas parcialmente amadurecidas são administradas como um adjuvante da terapia de radiação, quimioterapia, ou combinações das mesmas.
- 8. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que a composição compreende cerca de 102 a cerca de 1010 células dendriticas parcialmente amadurecidas.
- 9. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que as células dendriticas parcialmente amadurecidas foram criopreservadas subsequentemente à maturação parcial. Lisboa, 20 de Janeiro de 2011 2
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