BRPI0317064B1 - composições compreendendo células dendríticas parcialmente amadurecidas in vitro - Google Patents
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Abstract
"ADMINISTRAÇÃO DE CÉLULAS DENDRÍTICAS PARCIALMENTE AMADURECIDAS IN VITRO PARA O TRATAMENTO DE TUMORES". A presente invenção refere-se a populações de células compreendendo células dendríticas parcialmente amadurecidas que podem ser usadas para a administração a indivíduos tendo um tumor. As células dendríticas parcialmente amadurecidas, que estiveram em contato com um agente de amadurecimento de células dendríticas durante cerca de 1 a cerca de 10 horas, ou mais, absorvem e processam antígenos de tumor eficazmente na área do sítio do tumor, completam o amadurecimento e podem, subseqüentemente, migrar para os linfonodos de um indivíduo tratado. Uma vez no linfonodo, as células dendríticas apresentando antígenos agora completamente amadurecidas secretam as citocinas apropriadas (por exemplo TNF (Alfa) e IL-2) e contatam as células T induzindo uma resposta imune antitumor substancial.
Description
Este pedido reivindica prioridade para o pedido provisório dos Estados Unidos número de série 60/431.267, depositado em 6 de dezembro de 2002, que se incorpora aqui por referência em sua totalidade para todos os fins.
As células dendríticas (DCs) são reconhecidas como o veículo de escolha para imunoterapia ativa de câncer. As experiências com animais têm demonstrado o potencial de imunoterapia à base de DC tanto na proteção de camundongos da formação de tumores como a eliminação de tumores estabelecidos. Estes sucessos foram duplicados pelo menos parcialmente em seres humanos em experiências clínicas limitadas. A transição de experiências limitadas com conceito de segurança e comprovação para experiências mais amplas em que a atividade ou eficácia podem ser demonstradas tem sido impedida pela natureza laboriosa e volumosa da preparação de DC (ver abaixo). Como uma conseqüência, poucas empresas tem estado interessadas no desenvolvimento de vacinas para câncer à base de DC apesar do grande potencial terapêutico destes produtos.
A injeção intratumoral (IT) de DCs é uma forma especial de imunoterapia à base de DC. Quando da injeção, as DCs absorvem antígeno de células de tumor apoptóticas ou morrendo e apresentam o antígeno a células T após migração para os linfonodos. De fato, verificou-se que a eficácia destes tratamentos em modelos de animais está correlacionada com o grau de apoptose no tumor (Candido et al., Cancer Res.61: 228 - 236, 2001), que sugere que esta abordagem é completamente compatível com o tratamento de tumores com agentes quimioterapêuticos ou radiação antes da injeção de DCs. Além disso, vários grupos têm demonstrado que esta terapia de combinação é particularmente eficaz contra tumores estabelecidos (Nikitina et al., Int. J. Cancer94: 825 - 833, 2001; Tanaka et al., Int. J. Cancer 101: 265 - 269, 2002; Tong etal., Cancer Res. 61: 7530 - 7535, 2001).
Porque as células de tumor são a fonte de antígeno, a injeção de IT antecipa a necessidade de tanto uma seleção como fabricação de antíge- nos de tumor como eles são atualmente usados na maior parte das aborda- gens de terapia à base de DC in vitro. A seleção de um antígeno de tumor é * “ com freqüência acionada pela necessidade de empresas para ter uma posição proprietária e alguns antígenos de tumor identificados até agora ainda não provaram fornecer um benefício clínico significante. Além disso, o uso destes antígenos de tumor com freqüência resulta em uma vacina monova- 10 lente, que pode perder sua eficácia se as células de tumor regulam descendentemente a expressão do antígeno usado na imunização. Como evidente, a necessidade de fabricar o antígeno de tumor sob as condições requeridas I sob boas práticas de fabricação (GMP) aumenta outros custos aos métodos de imunização à base de DC clássicas.
A injeção de IT de DCs submete as células dendríticas a um meio de tumor imunossupressivo. Os tumores são conhecidos como produzindo citocinas que inativam as DCs ou que têm a capacidade de distorcer a resposta de células T para uma resposta tipo Th2 menos eficaz. Vários grupos tem usado a modificação genética de DCs para tentar superar estes e- 20 feitos supressivos, especialmente através da produção de interleucina 12 de citocina (IL-12; Nishioka et al., Cancer Res. 59: 4035 - 4041, 1999; Melero et al., Gene Therapy6: 1779 - 1784, 1999) ou expressão de ligando CD40 (Kikuchi et al., Biood 96: 91 - 99, 2000). Os resultados encorajadores descritos por estes grupos ainda demonstram a viabilidade de injeção de IT de DCs 25 como uma abordagem terapêutica. Triozzi et al., (Cancer89: 2647 - 2654, 2000) descrevem a injeção de IT de DCs em pacientes com melanoma metastático ou câncer de mama. Eles obtiveram regressão do tumor em 4 pacientes com melanona e em dois pacientes com carcinoma de mama. As biópsias das lesões regre- 30 dindo demonstraram infiltração de células T, sugerindo que as DCs tinham de fato ativado uma resposta imune contra as células de tumor. No todo, estes dados demonstraram que a injeção de IT de DCs foi possível em seres humanos, e poderia prover um significante benefício clínico. No entanto, a regulação descendente significante de antígenos de classe II MHC e de molécula co-estimulatória B7-2 em DCs injetadas foi observada. A regulação descendente destas moléculas críticas poderia ser esperada como reduzindo o potencial imunoestimulatório de DCs, mas como provido na presente invenção, isto pode ser evitado através do amadurecimento parcial das DCs, antes da administração. DCs existem em tecidos periféricos em uma forma imatura, pronta para absorver e processar antígeno. É esta célula imatura que é mais intimamente imitada pelas DCs geradas a partir de monócitos na presença de GM- CSF e IL-4. Vários estímulos podem iniciar o amadurecimento de DCs, durante este processo as células perdem sua capacidade de absorver antígeno de modo eficaz, e ganham suas funções estimulatórias de células T. Este processo é complexo e pelo menos in vitropode levar até 48 horas para completar. Uma outra conseqüência de amadurecimento é uma mudança nas propriedades migratórias das células. Por exemplo, o amadurecimento induz várias receptores de quimiocinas, incluindo CCR7, que dirigem as células para as regiões de células T de drenagem de linfonodos, onde as DCs amadurecidas ativam as células T contra os antígenos que são apresentados na superfície de DC no contexto de moléculas MHC de classe I e classe II.
A indução de tolerância foi ligada à apresentação cruzada de (auto) antígenos por DCs (Kurts etal., J. Exp. Med. 186: 239 - 245, 1997), e a hipótese corrente prevalecente posiciona que DC imatura continuamente apresenta os antígenos para o sistema imune para manter a tolerância (Kurts et al, J. Exp. Med. 184: 923 - 930, 1996), sugerindo que o amadure-cimento de DCs in vivo é requerido para um imunoestímulo eficaz. Foi agora tornado evidente que o amadurecimento de DC pode resultar em DCs ou imunoestimulatórios ou imunossupressivos (Chakraborty et al., Ciin. Immunol.94: 88 - 98, 1999). A natureza precisa dos estímulos de amadurecimento que produzem este resultado não foi elucidada, mas é geralmente aceito que as DCs imunoestimulatórias produzem IL-12 e expressam ligando CD40 (Albert etal., Nature Immunol.2: 988 - 989, 2001; Lanzavecchia, Haematologica 84 Suppl. EHA 4: 23 - 25, 1999). Assim, DC parcialmente amadurecida deve ser usada para injeção de IT, especialmente se os estímulos usados para o amadurecimento de células dendríticas imaturas forem conhecidos como resultando na expressão de ligando de CD40 e na produção de IL-12.
A presente invenção provê um método para produzir uma resposta imune antitumor compreendendo a administração de uma população de células compreendendo células dendríticas que foram parcialmente amadurecidas in vitrode modo que as células dendríticas parcialmente amadurecidas retém a capacidade de absorver antígeno de tumor e podem induzir uma resposta imune subseqüente à administração a um indivíduo. O método provê a eficaz absorção e o processamento de antígenos de tumor dentro do tumor e no leito do tumor apesar do meio imunossupressivo global dentro do tumor. Este meio imunossupressivo deve ser esperado para interferir com a função das células dendríticas por impacto negativo em suas propriedades imunoestimulatórias. Além disso, as células dendríticas amadurecidas não devem ser administradas a tumores porque as células não processam eficazmente o antígeno.
A administração das células dendríticas parcialmente amadurecidas pode ser diretamente em um tumor existente. Além disso, a administração pode ser no leito do tumor, a região do tecido e em torno de um tumor ou antes ou após o tratamento, isto é remoção cirúrgica ou ressecção do tumor, antes de, simultâneo com, ou subseqüente à quimioterapia, terapia de radiação ou combinações dos mesmos, e semelhantes. As células dendríticas parcialmente amadurecidas também podem ser administradas a um linfonodo ou região linfática que diretamente drena o tumor ou uma região de tumor circundante. Além disso, as células dendríticas parcialmente amadurecidas podem ser administradas em um vaso circulatório ou em uma região linfática que libera sangue ou linfa diretamente no tumor ou leito do tumor, ou o órgão afetado por ou com o tumor. Ainda mais, as células dendríticas parcialmente amadurecidas podem ser administradas geralmente no sistema circulatório ou linfático, modo que as células serão distribuídas na região do tumor.
As células dendríticas ou precursores das mesmas, utilizáveis na presente invenção podem ser obtidas de, por exemplo, pele, baço, medula óssea, timo, linfonodos, sangue de cordão umbilical, ou sangue periférico, e semelhantes. Além disso, as células dendríticas podem ser obtidas de um indivíduo a ser tratado ou de HLA de um indivíduo saudável compatível com o indivíduo a ser tratado. As células dendríticas ou precursores das mesmas podem ser crioconservadas antes de serem contatadas com um agente de amadurecimento e formuladas em uma composição para administração a um indivíduo.
As células dendríticas usadas nos métodos da invenção são parcial mente amadurecidas in vitro.Os agentes apropriados para a indução do amadurecimento de células dendríticas incluem, por exemplo, mas não são limitados a Bacilo Calmette-Guerin (BCG), interferon y (IFN y), lipopolissacarí- deo (LPS), fator de necrose de tumor cc (TNF a), um composto imidazoquino- lina, por exemplo um composto imidazoquinolina-4-amina, como 4-amino-2- etoximetil- a, a- dimetil-1 H-imidazol [4,5-c] quinolin-1-etanol (designado R848) ou 1 -(2-metilpropil) -1H-imidazo [4,5-c] quinolin-4-amina, e seus derivados (WO 00/47719, incorporado aqui por referência em sua totalidade) um polirri- bonucleotídeo de filamento duplo sintético por exemplo poly[1]:poly[C(12)U], e semelhantes, agonistas de um receptor semelhante a Toll(TLR), como TLR- 3, TLR-4, TLR-7 e/ou TLR-9, uma seqüência de ácidos nucléicos contendo motivos CpG não-metilados conhecidos como induzindo o amadurecimento de DC, ou qualquer combinação dos mesmos. BCG como usado na presente invenção pode compreender BCG completo, constituintes da parede de células de BCG, lipoarabidomananas derivadas de BCG, ou quaisquer outros componentes de BCG. Em algumas modalidades, o BCG é inativado por calor ou BCG tratado com formalina. Tipicamente, as combinações de BCG e IFN y são usadas para o amadurecimento parcial de células dendríticas, apesar de como uma alternativa BCG poder ser usado sozinho. Uma quantidade eficaz de BCG é tipicamente de cerca de 105a 107 cfu por mililitro de meio de cultura de tecido e a quantidade eficaz de IFN y é tipicamente de cerca de 100 a cerca de 1000 unidades por mililitro de meio de cultura de tecido. Em outra modalidade, o agente ati- vador de células dendríticas é a imidazoquinolina R898. Tipicamente, uma quantidade eficaz de R898, um agonista TLR-4, que é eficaz é cerca de 1 a cerca de 50 pg/ml, mais tipicamente 5 a 10 pg/ml de meio de cultura de teci- do são usados. A imidazoquinolina pode ser usada sozinha ou pode ser combinada com, por exemplo, uma quantidade eficaz de BCG e/ou IFN y.
A presente invenção também compreende composições, a composição compreende células dendríticas parcialmente amadurecidas in vitro na presença de um agente de amadurecimento de células dendríticas com- binado com um veículo fisiologicamente aceitável, tampão e/ou excipiente para administração a um indivíduo com um tumor. As células dendríticas parcialmente amadurecidas usadas nas composições da invenção tipicamente tem uma expressão regulada ascendente de moléculas co- estimulatórias como, mas não são limitadas a CD80, CD86 ou CD54. As cé- lulas podem ou não expressar o marcador de superfície de células CD83, mas ainda podem absorver e processar antígeno. A composição tipicamente irá compreender cerca de 102 a cerca de 1O10, mas pode compreender mais de células dendríticas parcialmente amadurecidas. Subsequente ao amadurecimento parcial, as células dendríticas podem ser crioconservadas e arma- zenadas durante um período de tempo antes da administração a um indivíduo. As células usadas para produzir as células dendríticas parcialmente amadurecidas que compreendem as composições da presente invenção podem ser isoladas do paciente tendo o tumor, ou as células dendríticas parcialmente amadurecidas podem ser produzidas a partir das células que foram isoladas de um indivíduo que foi tornado compatível em HLA ao paciente.
As células dendríticas são uma população diversa de células apresentando antígeno encontradas em vários tecidos linfóides e não- linfóides. (Ver Liu, Cell106: 259 - 62 (2001); Steinman, Ann. Rev. Immunol. 30 9: 271 - 96 (1991)). As células dendríticas incluem células dendríticas linfói des do baço, células de Langerhans da epiderme, e células veladas da circulação sangüínea. Coletivamente, as células dendríticas são classificadas como um grupo com base em sua morfologia, elevados níveis de expressão de MHC-classe II de superfície, e ausência de alguns outros marcadores de superfície expressos em células T, células B, monócitos e células extermi- nadoras naturais. Particularmente, as células dendríticas derivadas de monócitos (também referidas como células dendríticas monocíticas) geralmente expressam CD11c, CD80, CD86, e são HLA-DR+ mas são CD14’.
Em contraste, os precursores de células dendríticas monocíticas (tipicamente monócitos) são geralmente CD14+. Os precursores de células dendríticas monocíticas podem ser obtidos de qualquer tecido onde elas residem, particularmente tecidos linfóides como o baço, medula óssea, linfo- nodos e timo. Os precursores de células dendríticas monocíticas também podem ser isolados do sistema circulatório. O sangue periférico é uma fonte prontamente acessível de precursores de células dendríticas monocíticas. O sangue de cordão umbilical é outra fonte de precursores de células dendríticas monocíticas. Os precursores de células dendríticas monocíticas podem ser isolados de vários organismos em que uma resposta imune pode ser elicitada. Estes organismos incluem animais, por exemplo incluindo seres humanos, e animais não-humanos, como primatas, mamíferos (incluindo cachorros, gatos, camundongos e ratos), pássaros (incluindo galinhas), assim como espécies transgênicas dos mesmos.
Em algumas modalidades, os precursores de células dendríticas monocíticas e/ou células dendríticas imaturas podem ser isoladas de um indivíduo saudável ou de um indivíduo em necessidade de imunoestimula- ção, como por exemplo um paciente com câncer ou outro indivíduo do qual a ímuno-estimulação celular pode ser benéfica ou desejada (isto é, um indiví-duo tendo infecção virai ou bacteriana), e outros). Os precursores de células dendríticas e/ou células dendríticas imaturas podem ser também obtidos de um indivíduo saudável compatibilizado no HLA para ativação parcial e administração a um indivíduo compatibilizado em HLA em necessidade de imu- noestimulação.
Os métodos para isolar as populações de células enriquecidas para Precursores de células dendríticas e células dendríticas imaturas de várias fontes, incluindo sangue e medula óssea, são conhecidos na técnica. Por exemplo, os precursores de células dendríticas e células dendríticas i- maturas podem ser isolados por coleta de sangue heparinizado, por aferese ou leucaferese, por preparação de camada de células brancas, rosetas, centrifugação, centrifugação de gradiente de densidade (por exemplo usando Ficoll ® (como FICOLL-PAQUE®), PERCOLL® (partículas de sílica coloidal (15-30 nm de diâmetro) revestidas com polivinilpirrolidona não-dialisável (PVP)), sacarose, e outros), lise diferencial de células, filtração, e outros. Em algumas modalidades, uma população de leucócitos pode ser preparada, como por exemplo por coleta de sangue de um indivíduo, desfribinação para remover as plaquetas e lise dos glóbulos vermelhos. Os precursores de células dendríticas e células dendríticas imaturas podem ser opcionalmente enriquecidos por precursores de células dendríticas monocíticas por, por exemplo centrifugação através de um gradiente PERCOLL®, "panning"de anticorpos, e outros.
Os precursores de células dendríticas e células dendríticas imaturas podem ser opcíonalmente preparados em um sistema asséptico fechado. Como usado aqui, os termos "sistema asséptico, fechado" ou "sistema fechado" referem-se a um sistema em que a exposição a condições não- estéreis, ambientes, ou de ar circulante ou outras condições não-estéreis, é minimizada ou eliminada. Os sistemas fechados para isolar os precursores de células dendríticas e células dendríticas imaturas geralmente excluem a centrifugação de gradiente de densidade em tubos de topo abertos, transferência em ar aberto de células, cultura de células em placas de cultura de tecidos ou frascos não-vedados, e outros. Em uma modalidade típica, o sistema fechado permite a transferência asséptica dos precursores de células dendríticas e células dendríticas imaturas de um vaso de coleta inicial para um vaso de cultura de tecido vedável sem exposição a ar não-estéril.
Outro método registrado para isolar os precursores de células dendríticas é usar um substrato plástico comercialmente tratado (por exemplo contas ou contas magnéticas) para seletivamente remover os monócitos aderentes e outros "precursores de células não-dendríticas. (Ver, por exemplo, patente U.S. números 5.994.126 e 5.851.756.) Os precursores de células não-dendríticas e monócitos aderentes são descartados enquanto as células não aderentes são retidas para cultura e amadurecimento ex vivo. Em outro método, as células aferéticas foram cultivadas em bolsas plásticas de cultura aos quais contas de microveículos plásticas, isto é, poliestireno ou estireno, foram adicionadas para aumentar a área de superfície da bolsa. As células foram cultivadas durante um período de tempo suficiente para algumas células aderirem às contas e as células não-aderentes foram lavadas da bolsa. (Maffei, et al., Transfusion40: 1419 - 1420 (2000); WO 02/44338, incorporado aqui por referência).
Em algumas outras modalidades, os precursores de células dendríticas monocíticas são isolados por aderência a substrato de ligação a monócitos, como descrito em WO 03/010292, cuja descrição é aqui incorporada por referência. Por exemplo, uma população de leucócitos (por exemplo isolados por leucaferese) pode ser contatada com um substrato aderindo a precursores de células dendríticas monocíticas. Quando a população de leucócitos é contatada com o substrato, os precursores de células dendríticas monocíticas na população de leucócitos preferivelmente aderem ao substrato. Outros leucócitos (incluindo outros precursores de células dendríticas em potencial) demonstram reduzida afinidade de ligação para o substrato, assim permitindo que os precursores de células dendríticas monocíticas sejam preferivelmente enriquecidos sobre a superfície do substrato.
Os substratos apropriados incluem, por exemplo, os tendo uma grande relação de área de superfície para volume. O substrato pode ser, por exemplo, um substrato particulado ou fibroso. Os substratos particulados apropriados incluem, por exemplo, partículas de vidro, partículas de plástico, partículas de plástico revestidas com vidro, partículas de poliestireno revestidas com vidro, e outras contas apropriadas para absorção de proteína. Os substratos fibrosos apropriados para uso na presente invenção incluem tubos microcapilares e membranas microvilosas, e outros. O substrato particulado ou fibroso geralmente permite que os precursores de células dendríticas monocíticos aderidos sejam eluídos sem reduzir substancialmente a viabilidade das células aderidas. Um substrato particulado ou fibroso pode ser substancialmente não-poroso para facilitar a eluição de precursores de células dendríticas monocíticas ou células dendríticas do substrato. Um substra- 5 to "substancialmente não-poroso"é um substrato em que pelo menos uma maior parte dos poros presentes no substrato são menores do que as células para minimizar o aprisionamento de células no substrato.
Aderência dos precursores de células dendríticas monocíticas para o substrato pode ser opcionalmente melhorada pela adição de um meio de ligação. Os meios de ligação apropriados incluem meio de cultura de precursores de células dendríticas monocíticas (por exemplo, AIM-V®, RPMI 1640, DMEM, X-VIVO 15®, e outros) suplementados, individualmente ou em qualquer combinação, com por exemplo citocinas (por exemplo fator estimulante de colônia de granulócitos/macrófagos (GM-CSF), interleucina 4 (IL-4), interleucina 13 (IL-13)), plasma de sangue, soro (por exemplo soro humano, como soro autólogo ou alogênico), proteínas purificadas, como albumina de soro, cátions divalentes, (por exemplo íons cálcio e/ou magnésio) e outras moléculas que auxiliam na aderência específica de precursores de células dendríticas monocíticas ao substrato, ou que evitam a aderência de precur- sores de células dendríticas não-monocíticas ao substrato. Em algumas modalidades, o plasma ou soro no sangue pode ser inativado por calor. O plasma inativado por calor pode ser autólogo ou heterólogo aos leucócitos.
Após aderência de precursores de células dendríticas monocíticas ao substrato, os leucócitos não-aderentes são separados dos complexos de substrato/precursor de células dendríticas monocíticas. Qualquer meio apropriado pode ser usado para separar as células não-aderentes dos complexos. Por exemplo, a mistura de leucócitos não-aderentes e os complexos pode ser deixada assentar, e os leucócitos não-aderentes e o meio decantados ou drenados. Alternativamente, a mistura pode ser centrifugada, e o so- brenadante contendo os leucócitos não-aderentes decantado ou drenado dos complexos peletizados.
Em outro método, os precursores de células dendríticas monocí- ticas podem ser isolados de uma população de células enriquecida em leucócitos preparados pelo uso de um dispositivo de filtração de fluxo tangencial, como descrito no pedido de patente internacional número PCT/US 03/19428, depositado em 19 de junho de 2003, incorporado aqui por referência. Um dispositivo de filtração de fluxo tangencial para o isolamento de uma população de células enriquecida em precursores de células dendríticas monocíticas pode compreender uma unidade de removedor tendo uma câmara de fluxo transversal, uma câmara de filtrado e um filtro disposto entre as mesmas. O filtro está em comunicação de fluido em um lado, a superfície do retido, com a câmara de fluxo cruzado e, por outro lado, a superfície de filtrado, com a câmara de filtrado. A câmara de fluxo cruzado tem uma entrada adaptada para introduzir uma amostra de constituintes de sangue compreendendo leucócitos na câmara de fluxo cruzado e paralelo à superfície do retido do filtro. Uma saída é também provida na câmara de fluxo cruzado centralmente disposta em uma porção da câmara oposta da superfície do retido do filtro. O filtro apropriado para uso no dispositivo de filtração de fluxo tangencial tipicamente tem um tamanho de poro médio na faixa de cerca de 1 a cerca de 10 microns. O filtro pode ter um tamanho de poro médio de cerca de 3 a cerca de 7 microns. Um meio para prover uma taxa de entrada predeterminada da amostra na entrada da câmara de fluxo cruzado e um meio para controlar uma taxa de filtração do filtrado através do filtro e dentro da câmara de filtrado também podem ser incluídos. O meio de controle da taxa de filtração limita a taxa de filtração a menos do que a taxa de fil-tração não-oposta para o filtro. A amostra compreendendo constituintes de sangue pode ser provida por um dispositivo de fonte, como um dispositivo de leucaferese ou um recipiente compreendendo uma amostra coletada de um dispositivo de leucaferese.
Os precursores de células dendríticas monocíticas e as populações de células enriquecidas para os precursores podem ser cultivados ex vivo para diferenciação, e o amadurecimento parcial e/ou expansão. Como usado aqui, as células dendríticas imaturas isoladas, precursores de células dendríticas, e outras células, referem-se a células que, pela mão do homem, existem além de seu meio nativo, e assim não são um produto da natureza. As células isoladas podem existir em forma purificada, em forma semipurifi- cada, ou em meio não-nativo. Breve mente, a diferenciação ex vivo tipicamente envolve o cultivo de precursores de células dendríticas monocíticas, ou populações de células tendo precursores de células dendríticas, na presença de um ou mais agentes de diferenciação. Os agentes de diferenciação apropriados podem incluir, por exemplo, fatores de crescimento celular (por exemplo citocinas tal como (GM-CSF), interleucina 4 (IL-4), interleucina 7 (IL-7), interleucina 13 (IL-13), e/ou combinações dos mesmos). Em algumas modalidades, os precursores de células dendríticas monocíticas são diferenciados para formar células dendríticas imaturas derivadas de monócitos.
Os precursores de células dendríticas podem ser cultivados e diferenciados em condições de cultura apropriadas. Os meios de cultura de tecido apropriados incluem, mas não são limitados a AIM-V®, RPMI 1640, DMEM, X-VIVO 15®, e outros. O meio de cultura de tecidos pode ser suplementado com soro, aminoácidos, vitaminas citocinas, como GM-CSF e/ou IL-4, IL-7, ou IL-13, cátions divalentes, e outros, para promover a diferenciação das células. Em algumas modalidades, os precursores de células dendríticas podem ser cultivados em meio isento de soro. As condições de cultura podem opcionalmente excluir quaisquer produtos derivados de animais. Uma combinação de citocinas típica usada com meio de cultura de células dendríticas compreende cerca de 500 unidades/ml cada de GM-CSF e IL-4, IL-7, ou IL-13. Os precursores de células dendríticas, quando diferenciados para formar células dendríticas imaturas, são fenotipicamente similares a células de Langerhans da pele. As células dendríticas imaturas tipicamente são CD14’ e CD11c+, expressam baixos níveis de CD86 e CD83, e são capazes de capturar antígenos solúveis via endocitose especializada.
Os agentes de amadurecimento de células dendríticas podem incluir, por exemplo, mas não são limitados para CG, IFNy, LPS, TNFa, um composto imidazoquinolina, por exemplo, um composto imidazoquinolina-4-amina, tal como 4-amino-2-etoximetil-α,α-dimetil-1H-imidazo [4,5-c] quinolin-1-etanol (designado R848) ou 1-(2-metilpropil) -1H-imidazo [4,5-c] quinolin-4-amina e seus derivados (WO 00/47719, incorporado aqui por referência, um polirribo- nucleotídeo de filamento duplo sintético por exemplo poly[1]:poly[C(12)U], e semelhantes, agonistas de um receptor semelhante a Toll(TLR), como TLR- 3, TLR-4, TLR-7 e/ou TLR-9, uma seqüência de ácidos nucléicos contendo motivos CpG não-metilados conhecidos como induzindo o amadurecimento de DC, e outros, ou qualquer combinação dos mesmos. As quantidades eficazes de BCG tipicamente estão na faixa de cerca de 105 a 107 cfu por mililitro de meio de cultura de tecido. As quantidades eficazes de IFN y tipicamente estão na faixa de 100- 1000 U por mililitro de meio de cultura de tecido. O Bacilo Calmette-Guerin (BCG) é uma cepa avirulenta de M. bovis. Como usado aqui, BCG refere-se a BCG total assim como componentes da parede celular, lipoarabidomananas derivadas de BCG e outros componentes de BCG. BCG é opcionalmente inativado, como BCG inativado por calor, BCG tratado com formalina, e outros. Uma quantidade eficaz de um composto imidazoquinolina, por exemplo, um composto imidazoquinolina-4-amina, tal como 4-amino-2-etoximetil-α,α-dimetil-1H-imidazol [4,5-c] quinolin-1- etanol (designado R848) pode ser cerca de 1 a cerca de 50 pg/ml de meio de cultura, mais tipicamente de 5 a cerca de 10 pg/ml de meio de cultura é usado. O composto imidazoquinolina pode ser usado sozinho ou pode ser combinado com, por exemplo BCG e/ou IFNy, ou um agonista de TLR adicional.
As DCs imaturas são tipicamente contatadas com quantidades eficazes do agente de amadurecimento de células dendríticas, como BCG e IFN y, durante cerca de uma hora a cerca de 10 horas. Tipicamente, pelo menos um período de incubação de 24 horas é requerido para um completo amadurecimento. Mais tipicamente, 48 a cerca de 72 h de incubação. As células dendríticas imaturas podem ser cultivadas e parcialmente amadurecidas em condições de cultura de amadurecimento apropriado. Os meios de cultura de tecido apropriados incluem AIM-V®, RPMI 1640, DMEM, X-VIVO 15®, e outros. O meio de cultura de tecido pode ser suplementado com ami- noácidos, vitaminas, citocinas como GM-CSF e/ou IL-15, cátions divalentes e outros, para promover o amadurecimento das células. Uma combinação de citocina típica é cerca de 500 unidades/ml de GM-CSF e 100 ng/ml de IL-15.
O amadurecimento parcial de células dendríticas imaturas pode ser monitorado por métodos bem-conhecidos dos versados na técnica de células dendríticas. Os marcadores de superfície de células podem ser detectados em testes familiares na técnica, como citometria de fluxo, imunohis- toquímica, e outros. As células também podem ser monitoradas para a pro-dução de citocinas, (por exemplo por ELISA, outro teste imune, ou pelo uso de um conjunto de oligonucleotídeos). Em DCs cultivadas e parcialmente amadurecidas de acordo com a presente invenção na presença de um agente de amadurecimento de células dendríticas, como GM-CSF e IL-4, os níveis de JAK2 fosforilado (quinase 2 ativada por janus) podem ser medidos para indicar a iniciação de amadurecimento por métodos bem-conhecidos dos versados na técnica. A indução da expressão de marcadores de superfície de células e citocinas, assim como a fosforilação de moléculas de sinalização, por exemplo jak2, é também conhecida como um indicador que as células dendríticas são condicionadas para indução de uma resposta imune uma vez que as células foram administradas a um indivíduo.
As células dendríticas imaturas são submetidas ao amadurecimento somente durante um período de tempo para amadurecer parcialmente as células dendríticas. As DCs completamente amadurecidas perdem a capacidade de absorver antígeno e demonstram a expressão regulada ascendente de moléculas de superfície de células co-estimulatórias e várias citocinas. Especificamente, DCs amadurecidas expressam maiores níveis de antígenos de classe I e II de MHC do que as células dendríticas imaturas, e as células dendríticas amadurecidas são geralmente identificadas como sendo CD80+, CD83+, CD86+, e CD14“. Maior expressão de MHC leva a um aumento em densidade de antígeno sobre a superfície da DC, enquanto a regulação ascendente de moléculas co-estimulatórias CD80 e CD86 reforça o sinal de ativação de células T através das contrapartes das moléculas co- estimulatórias, como CD28 sobre as células T. As células dendríticas parcial mente maduras, como usadas na presente invenção, tipicamente compreendem as células dendríticas que, uma vez expostas a agente de amadure- cimento de células dendríticas, demonstram uma regulação ascendente de expressão de uma molécula co-estimulante incluindo, mas não limitadas a CD80, CD86 e/ou CD54. A célula pode ou não expressar CD83, mas mantém a capacidade de absorver e processar antígeno. Além disso, as células dendríticas parcialmente amadurecidas podem produzir TNF-α, IL-6, IL-10 e ou IL-12 que não são tipicamente produzidos por células dendríticas imaturas.
As células dendríticas completamente amadurecidas não são preferidas para a presente invenção porque elas não processam de modo eficaz o antígeno. Além disso, as células dendríticas imaturas, como usadas nos métodos anteriores, não são desejadas devido ao meio imunossupressi- vo tipicamente encontrado dentro de um tumor, incluindo concentrações substanciais de citocinas conhecidas como evitando o processamento de antígeno por células dendríticas imaturas. Na presente invenção, o amadurecimento parcial das células dendríticas imaturas regula descendentemente os receptores de citocinas sobre a superfície das células, tornando as mesmas menos sensíveis ou respondentes a quaisquer efeitos imunossupressi- vos de citocinas presentes no espaço intratumoral e fornece células que podem processar de modo eficiente os antígenos de tumor presentes dentro do espaço intratumoral. Uma vez que as células dendríticas parcialmente amadurecidas foram amadurecidas dentro do tumor como medido pela produção de, por exemplo, TNF- α e IL-12, e a expressão do receptor de quimiocina CCR7, as células podem migrar para os linfonodos onde as células irão contatar as células T para regular de modo ascendente a resposta imune aos antígenos de tumor.
De acordo com ainda outro aspecto da invenção, DCs podem ser conservados, por exemplo, por crioconservação ou antes do amadurecimento ou após o amadurecimento parcial antes da administração a um paciente. Os agentes de crioconservação que podem ser usados incluem, mas não são limitados a sulfóxido de dimetila (DMSO), glicerol, polivinilpirrolido- na, polietileno glicol, albumina, dextrano, sacarose, etileno glicol, i-eritritol, D- ribitol, D-manitol, D-sorbitol, i-inositol, D-lactose, cloreto de colina, aminoáci- dos, metanol, acetamida, monoacetato de glicerol, e sais inorgânicos. Uma taxa de resfriamento lenta controlada pode ser crítica. Diferentes agentes crioprotetores e diferentes tipos de células têm tipicamente diferentes taxas de resfriamento ótimas. O calor de fase de fusão onde a água vira gelo tipicamente deve ser mínimo. O procedimento de resfriamento pode ser realizado por uso de, por exemplo um dispositivo de congelamento programável ou um procedimento de banho de metanol. Os aparelhos de congelamento programáveis permitem a determinação de taxas de resfriamento ótimas e facilitam o resfriamento reprodutível padrão. Os congeladores de taxa controlada programável como Cryomed ou Planar permitem sintonizar o regime de congelamento na curva da taxa de resfriamento desejada.
Após completo congelamento, as células precursoras monocíticas, DCs imaturas ou DCs parcialmente amadurecidas podem ser rapidamente transferidas para um vaso de armazenamento criogênico a longo prazo. Em uma modalidade típica, as amostras podem ser criogenicamente armazenadas em nitrogênio líquido (-196°C) ou seu vapor (-165°C). As considerações e procedimentos para a manipulação, crioconservação, e armazenamento a longo prazo de células-tronco hematopoiéticas, particularmente de medula óssea ou sangue periférico, são aplicáveis em uma grande extensão às células da invenção. Esta discussão pode ser encontrada, por e- xemplo, nas seguintes referências, aqui incorporadas por referência : Taylor et al., Cryobiology27: 269 - 78 (1990); Gorin, Clinics in Haematology 15:19 - 48 (1986); Bone-Marrow Conservation, Culture and Transplantation, Proceedings of a Panel, Moscow, 22 de julho de 1968, International Atomic Energy Agency, Vienna, pp. 107 -186.
As células congeladas podem ser preferivelmente descongeladas rapidamente (por exemplo em um banho d'água mantido a 37-41 °C) e resfriadas imediatamente quando do descongelamento. Pode ser desejável tratar as células a fim de evitar o agrupamento celular quando do descongelamento. Para evitar o agrupamento, vários procedimentos podem ser usados, incluindo mas não limitados à adição antes e/ou após o congelamento de DNase (Spitzer et αl., Cancer45: 3075 - 85 (1980)), dextrano e citrato de peso molecular baixo, amido de hidroxietila (Stiff et at, Cryobiology 20: 17 - 24 (1983)), e outros. O agente crioprotetor, se tóxico em seres humanos, deve ser removido antes do uso terapêutico das DCs descongeladas parcialmente amadurecidas. Um modo para se remover o agente crioprotetor é por diluição em uma concentração insignificante. Uma vez congelados, as DCs parcialmente amadurecidas foram descongeladas e recuperadas, elas podem ser administradas como descrito aqui com relação a DCs parcialmente amadurecidas não-congeiadas.
Os métodos são providos para a administração de células dendríticas parcialmente amadurecidas, ou uma população de células enriquecida e contendo estas células, a um indivíduo tendo um tumor. Em algumas modalidades, estes métodos são realizados por obtenção de precursores de células dendríticas ou células dendríticas imaturas, diferenciando e parcialmente amadurecendo estas células na presença de um agente de amadurecimento de células dendríticas, como BCG e IFN y, e qualquer outro agente de amadurecimento como os listados acima. As células dendríticas parcialmente amadurecidas podem ser formuladas com veículos fisiologicamente aceitáveis, excipientes, tampões e/ou diluentes usando métodos e composições bem-conhecidas dos versados na técnica. As células dendríticas parcialmente amadurecidas podem ser administradas diretamente a um indivíduo em necessidade de imunoestimulação. Tipicamente, cerca de 102 a cerca de 1O10 células são colocadas em suspensão em um veículo farmaceuticamente aceitável. As células são injetadas ou no tumor diretamente ou em uma região próxima de, ou adjacente a ou em contato circulatório ou linfático com o tumor ou leito de tumor para assegurar que as células tem acesso aos antígenos de tumor.
Por exemplo, mas não por limitação, as células podem ser administradas diretamente em um tumor, em um leito de tumor subseqüente à remoção cirúrgica ou por ressecção do tumor, de modo peritumoral, em uma drenagem de linfonodo em contato direto com o tumor, em um vaso sanguíneo ou duto de linfa levando para dentro ou alimentando um tumor ou órgão afetado pelo tumor, por exemplo a veia portal ou uma veia pulmonar ou artéria, e semelhantes. A administração das células dendríticas parcialmente amadurecidas da invenção pode ser ou simultâneo com ou subsequente a outros tratamentos do tumor, como quimioterapia e/ou terapia de radiação. Além disso, as células dendríticas parcialmente amadurecidas da invenção podem ser co-administradas com outro agente, cujo agente atua como um adjuvante para o amadurecimento de célula dendrítica e/ou o processamento de antígeno dentro do tumor ou região próxima ou adjacente ao tumor. Além disso, as células dendríticas podem ser formuladas ou compostas em uma matriz de liberação lenta para implante em uma região ou em tomo do tumor ou leito do tumor, como que as células são lentamente liberadas dentro do tumor, ou leito de tumor, para contato com os antígenos de tumor.
As células dendríticas parcialmente amadurecidas da presente invenção podem ser administradas por qualquer meio apropriado para a formação e modo de administração. Por exemplo, as células podem ser combinadas com um veículo farmaceuticamente aceitável e administradas com uma seringa, um cateter, uma cânula e semelhantes. Como acima, as células podem ser formuladas em uma matriz de liberação lenta. Quando administrada deste modo, a formulação pode ser administrada por um meio apropriado para a matriz usada. Outros métodos e modos de administração aplicáveis à presente invenção são bem-conhecidos dos versados na técnica.
As composições da presente invenção podem ser usadas sozinhas no tratamento de um indivíduo. Além disso, as composições podem ser usadas em combinação com qualquer outro método para tratar um tumor. Por exemplo, os métodos da presente invenção podem ser usados em combinação com ressecção cirúrgica de um tumor, quimioterapia (drogas citotó- xicas, agentes apoptóticos, anticorpos e outros), terapia de radiação, criote- rapia, braquiterapia, terapia imune (administração de células dendríticas ativadas maduras específicas para antígenos, células NK, anticorpos específicos para antígenos de tumor, etc), e outros. Qualquer um e todos estes métodos podem ser também usados em qualquer combinação. Os tratamentos de combinação podem ser concorrentes ou seqüenciais e podem ser administrados em qualquer ordem, como determinado pelo médico encarregado do tratamento.
Em outra modalidade, as células dendríticas e o indivíduo recipiente tem o mesmo haplótipo de MHC (HLA). Os métodos para a determinação do haplótipo HLA de um indivíduo são conhecidos na técnica. E uma modalidade relacionada, as células dendríticas parcialmente amadurecidas são alogênicas para o indivíduo recipiente. As células alogênicas são tipicamente compatíveis por pelo menos um alelo MHC (por exemplo compartilhando pelo menos um mas não todos os alelos MHC). Em uma modalidade menos típica, as células dendríticas e o indivíduo recipiente são todos alo- genêicos com relação um ao outro, mas todas tem pelo menos um alelo MHC em comum.
Os seguintes exemplos são providos apenas como ilustrativos de vários aspectos da presente invenção e não devem ser construídos como limitando a invenção de algum modo.
No presente exemplo, os precursores de células dendríticas monocíticas, isolados por filtração de fluxo tangencial, foram cultivados em uma concentração de 106 monócitos/ml em X-VIVO 15 ® suplementado com 2% albumina de soro humano (HSA) e 500 U/ml de GM-CSF em frascos ou bolsas de células. Após 5 dias, as DCs dos frascos e das bolsas foram ou deixadas não-tratadas (iDCs) ou foram parcialmente amadurecidas durante 4 horas na presença de BCG (diluição de 1:400) e interferon y (IFN y, 500 U/ml/(pmDCs). As células foram coletadas, lavadas e misturadas com um número igual de células de tumor PKH67-A549 irradiadas, rotuladas fluorescentemente, durante 48 h. Após a incubação, as células foram lavadas, coloridas com anticorpo monoclonal rotulado com ficoeritrina (PE) específico para CD11c, e analisado por citometria de fluxo. Os valores providos na tabela 1 representam a porcentagem de células CD11c+ dentro da porta de DC que foram também positivas para antígeno PKH67 (MFI = intensidade flúores- cente média). Os controles incluíram DCs mistas com células PKH67-A549 logo antes da análise. Tabela 1.
Estes dados demonstram que as DCs parcialmente amadureci das foram melhores em absorção de antígeno neste teste do que as células dendríticas imaturas, como medido ou por porcentagem das células que absorvem antígeno ou pela quantidade de material absorvido pelas células de tumor.
Em outro exemplo, uma leucaferese foi realizada em um paciente subseqüente à cirurgia para remover um crescimento de tumor. Os monó- citos foram purificados do produto de leucaferese por filtração de fluxo tangencial. Os monócitos purificados foram diferenciados como descrito acima e parcialmente amadurecidos por exposição a BCG morto por calor e fixado em formalina (5 x 106 cfu/ml) IFNy (500 U/ml). As células dendríticas parci-almente amadurecidas foram formuladas para administração e injetadas no leito do tumor do indivíduo, sob guia ultra-sônica. As células dendríticas isoladas do indivíduo foram verificadas como capazes de induzir uma resposta de células T citotóxicas específicas para tumor quando medida in vitro.Além disso, verificou-se que o tempo para recorrência de tumor foi evitado ou substancial mente retardado.
Neste exemplo, células de câncer de cólon humano foram enxertadas em camundongos para formar xenoenxertos de tumor por métodos bem-conhecidos. Após os tumores terem estabelecido, os animais foram divididos em dois grupos e os animais de cada grupo foram administrados com ou placebo, células dendríticas imaturas ou células dendríticas parcialmente amadurecidas no tumor. O tamanho do tumor foi subseqüentemente medido e comparado para cada grupo.
Brevemente, os tumores de carcinoma de cólon CT26 humano foram estabelecidos em camundongos fêmeas Balb/c por injeção de 100.000 células de tumor no flanco à direita sob a pele. O tratamento foi iniciado no dia 15, quando então todos os camundongos tinham tumores palpáveis com tamanhos de tumor na faixa de entre 10 mm2 e 45 mm2.
As células dendríticas foram preparadas da medula óssea femu- ral dos camundongos fêmeas Balb/c seguindo protocolos padrão. Brevemente, as células de medula óssea seguindo a lise de glóbulos vermelhos foram incubadas com GM-CSF de murinos (200 U/ml) e IL-4 (200 U/ml) em RPMI 1640 suplementado com 10% de soro bovino fetal durante 13 -14 dias, com adição de meio novo com citocinas após 3 e 7 dias. Para obter células den-dríticas parcialmente amadurecidas, as células foram expostas a diluição de 400 vezes de Bacilo Calmette Guerin (BCG) inativado que tinha uma atividade de 0,5-1 x 106 unidades formadoras de colônias por mililitro antes da inativação, e a 500 unidades de gama interferon de murinos (IFN y) por mililitro. As células foram incubadas durante 8 h e então colocadas em camadas sobre 14,5% metrizamida e centrifugadas durante 15 minutos a 4°C e 1750 rpm. A interface foi coletada e as células foram lavadas e congeladas de modo viável em 10% sulfóxido de dimetila (DMSO) em armazenamento de nitrogênio líquido. Após descongelar a 37°C, as células foram lavadas duas vezes e recolocadas em suspensão em uma concentração de 1 milhão de células por 50 microlitros.
Os camundongos com tumores foram tratados com ciclofosfami- da (50 mg/kg) intraperitoneamente no dia 15 e 17. A injeção de células dendríticas no tumor (ou injeção de imitação de 50 pl de solução salina tampo- nada com fosfato, DC imaturo ou DC amadurecido durante 8 h) foi realizada nos dias 16, 17, 18 e 21). O crescimento do tumor foi medido dia sim dia não durante 60 dias.
No grupo tratado intratumoralmente com solução salina tampo- nada com fosfato, todos os 4 camundongos tinham tumores maiores do que 100 mm2 em ou antes do dia 40. Em contraste, os camundongos tratados intratumoralmente com DC imaturo tinham um crescimento de tumor reduzido e 2 dentre 4 camundongos tinham tumores menores do que 100 m2 no dia 40. Três dos 4 camundongos tratados com DC parcialmente amadurecidas tinham tumores menores do que 100 mm2 no dia 40, e dois destes animais não tinham tumores palpáveis no dia 50.
Neste exemplo, as células de câncer de cólon humano foram injetadas em camundongos de xenoenxertos de tumores por métodos bem- conhecidos. Subseqüente à primeira injeção de células de tumor, os animais foram administrados com uma segunda dose de células de tumor. Após 15 dias, os animais foram divididos em grupos e os animais de cada grupo foram administrados ou com placebo, células dendríticas imaturas ou células dendríticas parcialmente amadurecidas no tumor. O tamanho do tumor foi subsequentemente medido e comparado para cada grupo.
Brevemente, os tumores de carcinoma de cólon CT26 humano foram estabelecidos em camundongos fêmeas Balb/c por injeção de 100.000 células de tumor no flanco à direita sob a pele, seguido por injeção de 100.000 células de tumor no flanco à esquerda no dia 3. O tratamento foi iniciado no dia 15, em cujo tempo todos os camundongos tinham tumores no flanco direito palpáveis com tamanhos de tumor na faixa entre 10 mm2 e 45 2 mm.
As células dendríticas foram preparadas a partir da medula óssea femural dos camundongos fêmeas Balb/c seguindo protocolos padrão. Brevemente, as células de medula óssea seguindo a lise de glóbulos vermelhos foram incubadas com GM-CSF de murinos (200 U/ml) e IL-4 (200 U/ml) em RPMI 1640 suplementado com 10% de soro bovino fetal durante 13-14 dias, com adição de meio novo com citocinas após 3 e 7 dias. Para obter células dendríticas parcialmente amadurecidas, as células foram expostas a diluição de 400 vezes de Bacilo Calmette Guerin (BCG) inativado que tinha uma atividade de 0,5-1 x 106 unidades formadoras de colônias por mililitro antes da inativação, e a 500 unidades de gama interferon de murinos (IFN y) por mililitro. As células foram então colocadas em camadas sobre 14,5% metrizamida e centrifugadas durante 15 minutos a 4°C e 1750 rpm. A interface foi coletada e as células foram lavadas e congeladas de modo viável em 10% sulfóxido de dimetila (DMSO) em armazenamento de nitrogênio líquido. Após descongelar a 37°C, as células foram lavadas duas vezes e recolocadas em suspensão em uma concentração de 1 milhão de células por 50 microlitros.
Os camundongos com tumores foram tratados com ciclofosfami- da (50 mg/kg) intraperitoneamente no dia 15 e 17. A injeção de células dendríticas no tumor do flanco direito (ou injeção de imitação de 50 ul de solução salina tamponada com fosfato, DC imaturo ou DC amadurecido durante 8 h ou DC amadurecido durante 24 horas foi realizada nos dias 16, 17, 18 e 21). O crescimento do tumor foi medido dia sim dia não durante 60 dias.
No grupo tratado intratumoralmente com solução salina tamponada com fosfato, todos os 5 camundongos tinham tumores no flanco direito maiores do que 100 mm2 em ou antes do dia 35, e 3/5 dos animais tinham tumores no flanco esquerdo > 100 mm2 em ou antes do dia 40. Em contraste, os camundongos tratados intratumoralmente (no lado direito apenas) com DC imaturo tinham um crescimento de tumor reduzido: um camundongo não tinha tumor palpável em ambos os lados no dia 60, e 4 dos 5 camundongos tinham tumores < 100 mm2 em ambos os lados no dia 40. Três dos cinco camundongos tratados com DC parcialmente amadurecida durante 8 horas tinham resolvido completamente ambos os tumores pelo dia 50. No grupo tratado com DC que tinha sido parcialmente amadurecida durante 24 horas, o crescimento do tumor foi reduzido ainda mais. Três dos 5 camundongos resolveram completamente os tumores em ambos os lados pelo dia 50, um animal resolveu completamente o tumor no flanco esquerdo, e parcialmente controlou o tumor no flanco direito (< 100 mm2 no dia 40) e um animal parcialmente controlou ambos os tumores (< 50 mm2 em ambos os lados no dia 40).
Neste exemplo, as células de tumor humano foram usadas para formar tumores xenográficos em camundongos, como descrito acima. As células dendríticas imaturas diferenciadas foram parcialmente amadurecidas por exposição das células a agente de amadurecimento de células dendríticas imidazoquinolina R898 ou R898 combinadas com BCG e IFN y. As células dendríticas parcialmente amadurecidas, células dendríticas imaturas e um placebo foram administrados no tumor e o tamanho dos tumores em cada grupo foi comparado.
Brevemente, os tumores foram estabelecidos em camundongos como no exemplo 2. As células dendríticas foram preparadas como nos e- xemplos 2 e 3, mas um amadurecimento parcial das células foi obtido por exposição das células a 5 pig/ml de modificador de resposta imune (agente de amadurecimento de células dendríticas) R848, ou 5 pg/ml de modificador de resposta imune R848 junto com BCG e gama interferon nas concentrações como especificadas nos exemplos 2 e 3, durante 8 horas.
O esquema de tratamento foi idêntico ao exemplo 3. Nenhum dos camundongos injetados intratumoralmente com a solução salina tampo- nada com fosfato controlou o crescimento do tumor. Um dos cinco camundongos tratados com DC parcialmente amadurecida com R848 sozinho resolveu completamente o crescimento do tumor, como fizeram 3 dentre 5 camundongos tratados intratumoralmente com DC parcialmente amadurecida com R848 com BCG e IFN y. Nove camundongos dos exemplos 3 e 4 que tinha resolvido completamente seus tumores foram desafiados aproximadamente 30 dias após a resolução do tumor no flanco direito com 1 milhão de células de tumor. Nenhum dos animais mostrou um crescimento de tumor detectável demonstrando proteção imunológica contra as células de tumor CT26.
Neste exemplo, as células dendríticas preparadas nos exemplos acima foram caracterizadas pela expressão de moléculas de superfície. Brevemente, as células dendríticas de murinos, preparadas como nas experiências 2 -4, foram caracterizadas para expressão de moléculas de superfície de células após coloração com anticorpos fluorescentes e análise citométrica de fluxo. Os resultados são apresentados como a porcentagem de células positivas para os marcadores de superfície fenotípicos e a intensidade de fluorescência média para alguns marcadores de superfície nas tabelas 2 e 3. Tabela 2.
Tabela 3. 
Um paciente diagnosticado com um tumor sólido é tratado com quimioterapia, terapia de radiação, crioterapia, ou braquiterapia e subseqüentemente com células dendríticas parcialmente amadurecidas administradas intratumoralmente. Após o tratamento, o tumor é resolvido e o 10 paciente é protegido da recorrência do tumor.
Os exemplos anteriores são providos para ilustrar, mas não para limitar, o escopo das invenções reivindicadas. Outras variantes das invenções serão prontamente evidentes para os versados na técnica e englobadas pelas reivindicações anexas. Todas as publicações, patentes, pedidos de patentes 15 e outras referências citadas aqui são também incorporadas por referência aqui em sua totalidade.
Claims (4)
1. Composição para produzir uma resposta imune antitumor, carac-terizada pelo fato de que compreende 102a 1010 de uma população de células compreendendo células dendríticas que foram parcialmente amadurecidas in vitroe dimetil sulfóxido (DMSO) 10%, em que as células dendríticas parcial- mente amadurecidas demonstram um fenótipo da superfície da célula consistindo em uma expressão de regulagem ascendente de CD80, CD86 e/ou CD54 quando comparadas com células dendríticas imaturas, um perfil de citocina demonstrando a produção de TNF-oc, IL-6, IL-10 e/ou IL-12 e em que a célula dendrítica parcialmente amadurecida pode absorver e processar antígeno, em que a indução da maturação é realizada com os agentes de amadurecimento Bacilo Calmette Guerin (BCG) inativado e interferon-gama (IFNy), e é realizada em um período de tempo de 4, 8 ou 24 horas.
2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que as células dendríticas foram criopreservadas subsequente à maturação parcial.
3. Composição, caracterizada pelo fato de que compreendei O2 a 1010 de células dendríticas parcialmente amadurecidas in vitrona presença de um agente de amadurecimento de células dendríticas; em que as células dendríticas parcialmente amadurecidas demonstram um fenótipo da superfície da célula consistindo em expressão de regulagem ascendente de CD80, CD86 e/ou CD54 quando comparadas com células dendríticas imaturas, um perfil de citocina demonstrando a produção de TNF-oc, IL-6, IL-10 e/ou IL-12, em que a célula dendrítica parcialmente amadurecida pode absorver e processar antígeno, e em que as células dendríticas parcialmente amadurecidas são combinadas com dimetil sulfóxido (DMSO) 10% para a administração in vivo, em que a indução da maturação é realizada com os agentes de amadurecimento Bacilo Calmette Guerin (BCG) inativado e interferon-gama (IFNy), e é realizada em um período de tempo de 4, 8 ou 24 horas.
4. Composição de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que as células dendríticas parcialmente amadurecidas são ainda formuladas para administração diretamente dentro de um tumor, em um leito de tumor subsequente à remoção cirúrgica ou resseção de um tumor, a uma área de tecido circundando um tumor, em um linfonodo diretamente drenando uma área de tumor, diretamente em um duto de vaso circulatório que distribui sangue ou linfa a um tumor, leito do tumor, ou um órgão afetado pelo 5 tumor, no sistema circulatório de modo que as células são distribuídas a um tumor, leito do tumor ou órgão afetado pelo tumor.
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