KR20050084189A

KR20050084189A - 종양 치료를 위한 시험관내 부분 성숙된 수지상 세포의투여

Info

Publication number: KR20050084189A
Application number: KR1020057010303A
Authority: KR
Inventors: 마닉스 엘 보쉬
Original assignee: 노쓰웨스트 바이오써라퓨틱스, 인크.
Priority date: 2002-12-06
Filing date: 2003-12-05
Publication date: 2005-08-26
Also published as: ATE486125T1; JP2006510667A; RU2005121256A; WO2004053072A3; JP4859169B2; EP2260861A1; CN102600461A; IL169002A; US20060057120A1; JP5707284B2; AU2003293411A1; EP1567155B1; RU2348418C2; ES2354944T3; PL377209A1; KR101144196B1; MXPA05006042A; DE60334725D1; BR0317064A; BRPI0317064B1

Abstract

본 발명은 종양을 보유한 개체에게 투여하는데 사용될 수 있는 부분 성숙된 수지상 세포를 포함하는 세포 집단을 제공한다. 수지상 세포 성숙 제제와 약 1시간 내지 약 10시간 또는 그 이상동안 접촉시킨 부분 성숙된 수지상 세포는 종양 부위의 구역 내에 존재하는 종양 항원을 효율적으로 흡수하고 가공한 뒤, 완전히 성숙시킨 다음, 치료받는 개체의 림프절로 이동할 수 있다. 일단 림프절에 도달하면 완전 성숙된 항원 제시 수지상 세포는 적당한 사이토카인(예, TNFα 및 IL-12)을 분비하고 T-세포에 접촉하여 실질적인 항종양 면역반응을 유도한다.

Description

종양 치료를 위한 시험관내 부분 성숙된 수지상 세포의 투여{Administration of dendritic cells partially matured in vitro for the treatment of tumors}

수지상 세포(dendritic cells: DC)는 암의 능동 면역요법에 최선책인 매개체로서 인식되고 있다. DC계 면역요법의 잠재성은 마우스의 종양 형성 예방과 확립 종양(established tumor)의 제거에 관한 동물 실험을 통해 입증된 바 있다. 이러한 성공은 소규모 임상 시험으로 이루어진 사람에서도 적어도 부분적으로 중복되었다. 하지만, 소규모 안전성이나 개념 입증 시험에서부터 활성이나 효능을 입증할 수 있는 대규모 시험으로의 이행은 DC 제조의 까다로움과 곤란성으로 인해 방해되었다(이하 설명 참조). 결과적으로, 이 DC 산물의 치료 잠재성이 상당함에도 불구하고 DC계 암 백신의 개발에 투자하는 회사는 거의 없었다.

DC의 종양내(IT) 주사는 DC계 면역요법의 전문 투여 방식이다. 주사 시, DC는 아폽토시스 세포 또는 사멸하는 종양 세포로부터 항원을 흡수하고, 림프절로 이동 후 T 세포에 대한 항원을 제시한다. 실제로, 이러한 현상은, 동물 모델에서 이러한 치료법의 효능이 종양의 아폽토시스 정도와 상관성이 있음을 밝힌 바 있고[참조: Candido et al., Cancer Res. 61:228-236, 2001], 이는 이러한 시도가 DC 주사에 앞서 종양에 대한 화학치료제 또는 방사선 치료와 전적으로 함께 사용될 수 있음을 암시한다. 또한, 몇몇 연구진은 이러한 배합 치료법이 확립 종양에 대해 특히 효과적임을 증명했다[참조: Nikitina et al., Int. J. Cancer 94: 825-833, 2001; Tanaka et al., Int. J. Cancer 101: 265-269, 2002; Tong et al., Cancer Res. 61: 7530-7535,2001].

종양 세포는 항원의 공급원이므로, IT 주사에 이어, 대부분의 시험관내 DC계 치료법의 시도에 통용되는 종양 항원의 선발과 제작이 필요로 된다. 종양 항원의 선발은 종종 독점적 지위가 있는 회사의 요구에 따라 휘둘리기도 하고, 더욱이 현재까지 확인된 종양 세포 중에서 유의적 임상 효과를 제공하는 것으로 증명된 종양 항원은 몇 가지 없다. 또한, 이러한 종양 항원의 사용은 종종 1가 백신을 생성하고, 이는 종양 세포가 면역화에 사용된 항원의 발현을 억제조절한다면 그 효과를 상실할 수 있다. 물론, 우수 의약품 관리 기준(GMP)에서 요구하는 조건하에서 종양 항원을 제작할 필요성은 고전적 DC계 면역화 방법에 추가 비용을 발생시킨다.

DC의 IT 주사는 수지상 세포를 면역억제성 종양 환경에 처하게 한다. 종양은 DC를 불활성화시키거나 T 세포 반응을 덜 효과적인 Th2 타입 반응으로 유도하는 성질이 있는 사이토카인을 생산하는 것으로 알려져 있다. 몇몇 연구진은 이러한 억제성 효과를 특히 사이토카인 인터루킨 12(IL-12; 참조: Nishioka et al., Cancer Res. 59: 4035-4041,1999; Melero et al., Gene Therapy 6: 1779-1784, 1999)의 생성 또는 CD40 리간드의 발현[참조: Kikuchi et al., Blood 96: 91-99, 2000]을 통해 극복하기 위한 시도로서, DC의 유전자 변형을 이용했다. 이러한 연구진에 의해 설명된 고무적 결과들은 DC의 IT 주사를 치료적 방법으로서 사용할 수 있음을 더욱 입증했다.

문헌[참조: Tiozzi et al., Cancer 89: 2647-2654, 2000]에는 전이성 흑색종 또는 유방암을 앓고 있는 환자에 대한 DC의 IT 주사가 기술되어 있다. 이들은 흑색종 환자 4명과 유방암 환자 2명으로부터 종양 퇴행을 수득했다. 퇴행성 병변의 생검은 침윤성 T 세포를 확인했고, 이는 DC가 사실상 종양 세포에 대한 면역반응을 활성화시킨다는 것을 암시한다. 종합해보면, 이러한 데이터들은 DC의 IT 주사가 사람에게 실행가능하며 유의적 임상 효과도 제공할 수 있음을 증명한다. 하지만, 주사된 DC에 대한 MHC 클래스 II 항원 및 B7-2 공동자극 분자의 유의적 억제조절이 관찰되었다. 이러한 주요 분자의 억제 조절은 DC의 면역자극 잠재성을 감소시킬 것으로 예상되지만, 본 발명에서 제시하는 바와 같이 투여 전에 DC를 부분 성숙시키면 상기한 억제조절은 피할 수 있을 것이다.

DC는 항원의 흡수 및 가공을 위해 준비된 미숙 형태로 말초 조직에 존재한다. 이러한 미숙 세포가 GM-CSF 및 IL-4 존재하에 단핵구에서 발생된 DC와 가장 유사한 세포이다. 다양한 자극은 DC의 성숙을 개시시킬 수 있고, 그 과정 동안 DC는 항원을 효율적으로 흡수하는 능력을 상실하고 T 세포 자극능을 획득한다. 이러한 과정은 복잡하고 적어도 시험관내에서 종결되는데 최대 48시간이 소요될 수 있다. 성숙의 다른 결과 중 하나는 세포의 이주성의 변화이다. 예를 들어, 성숙은 고갈 림프절의 T 세포 구역으로 세포를 유도하는 몇몇 케모카인 수용체, 예컨대 CCR7을 유도하고, 이 T 세포 구역에서 성숙 DC는 클래스 I 및 II의 MHC 분자와 관련하여 DC 표면에 존재하는 항원에 대하여 T 세포를 활성화시킨다.

내성 유도는 DC에 의한 항원(자기 항원)의 교차 제시와 연관이 있고[참조: Kurts et al., J. Exp. Med. 186:239-245, 1997], 현재 우세한 가설을 통해 미숙 DC가 내성 유지를 위해 면역계에 항원을 지속적으로 제시한다고 단정지을 수 있는 바[참조: Kurts et al., J. Exp. Med. 184:923-930, 1996], 효과적인 면역자극에는 생체내 DC 성숙이 필요한 것으로 생각될 수 있다. 현재, DC 성숙이 면역자극성 DC 또는 면역억제성 DC를 산출할 수 있음이 밝혀지고 있다[참조: Chakraborty et al., Clin. Immunol. 94:88-98, 1999]. 두 결과 중 어느 하나를 산출하는 성숙 자극의 정확한 특성은 아직 해명되지 않았지만, 일반적으로 면역자극성 DC는 IL-12를 생성하고 CD40 리간드를 발현하는 것으로 인식되고 있다[참조: Albert et al., Nature Immunol. 2: 988-989, 2001; Lanzavecchia, Haematologica 84 Suppl. EHA 4: 23-25,1999]. 따라서, 부분 성숙된 DC는, 특히 미숙 수지상 세포의 성숙에 사용된 자극이 CD40 리간드를 발현하고 IL-12를 생산하는 것으로 밝혀진다면 IT 주사에 사용될 수 있을 것이다.

발명의 개요

본 발명은, 부분 성숙된 수지상 세포가 종양 항원을 흡수하는 능력을 보유하고 개체에 투여된 다음 이어서 면역반응을 유도할 수 있도록, 시험관내에서 부분 성숙시킨 수지상 세포를 포함하는 세포 집단을 투여하는 것을 포함하는, 항종양 면역반응 형성방법을 제공한다. 이 방법은 종양 내의 전반적인 면역억제 환경에도 불구하고 종양 및 종양 베드에 존재하는 종양 항원의 효과적인 흡수와 가공을 제공한다. 이러한 면역억제성 환경은 수지상 세포의 면역자극성에 악영향을 미쳐 수지상 세포의 기능을 방해할 것으로 예상된다. 또한, 성숙 수지상 세포는 항원을 효과적으로 가공하지 못하기 때문에 종양에 투여될 수 없다.

부분 성숙된 수지상 세포는 현존 종양에 직접 투여될 수 있다. 또한, 화학치료, 방사선 치료 또는 이의 배합 치료 등의 치료 전이거나 치료 중이거나 또는 치료 후인 종양의 외과적 제거 또는 절제와 같은 치료 전후의 종양 내부 및 종양 주위의 조직 구역, 종양 베드로 투여될 수 있다. 또한, 부분 성숙된 수지상 세포는 종양 또는 주위 종양 구역을 직접 고갈시키는 림프절이나 림프 영역으로 투여될 수도 있다. 또한, 부분 성숙된 수지상 세포는 종양이나 종양 베드, 또는 종양이 존재하는 기관으로 혈액이나 림프를 직접 전달하는 순환 혈관이나 림프 영역으로 투여될 수 있다. 또한, 부분 성숙된 수지상 세포는 이 세포가 종양 구역으로 전달될 수 있도록 순환계 또는 림프계로 전신 투여될 수 있다.

본 발명에 유용한 수지상 세포 또는 이의 전구체는 예를 들어, 피부, 비장, 골수, 흉선, 림프절, 제대혈 또는 말초 혈액 등에서 수득할 수 있다. 또한, 수지상 세포는 치료받을 개체와 HLA 부합성인 건강한 개체로부터 수득하거나 치료받을 개체로부터 수득할 수 있다. 수지상 세포 또는 이의 전구체는 성숙 제제와 접촉되기 전까지 동결보존되고, 개체에게 투여하기 위한 조성물로 제조될 수 있다.

본 발명의 방법에 사용되는 수지상 세포는 시험관내에서 부분 성숙된 것이다. 수지상 세포 성숙 유도에 적당한 제제에는 예컨대 바실러스 칼메트-구에린(BCG), 인터페론 γ(IFNγ), 지다당류(LPS), 종양 괴사 인자(TNFα), 이미다조퀴놀린 화합물, 예컨대 4-아미노-2-에톡시메틸-α,α-디메틸-1H-이미다졸[4,5-c]퀴놀린-1-에탄올(R848로 지칭됨) 또는 1-(2-메틸프로필)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 및 이의 유도체(WO 00/47719, 전문이 본원에 참고원용됨)와 같은 이미다조퀴놀린-4-아민 화합물, 폴리[I]:폴리[C(12)U] 등과 같은 합성 이본쇄 폴리리보뉴클레오타이드, TLR-3, TLR-4, TLR-7 및/또는 TLR-9와 같은 톨(Toll)류 수용체(TLR)의 효능제, DC 성숙을 유도하는 것으로 알려진 비메틸화 CpG 모티프를 함유하는 핵산 서열 등이나 이의 배합물이 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다.

본 발명에 사용되는 BCG에는 완전 BCG, BCG의 세포벽 성분, BCG 유래의 리포아라비도만난, 또는 기타 다른 BCG 성분이 포함될 수 있다. 특정 구체예에서, BCG는 열불활성화된 BCG 또는 포르말린 처리된 BCG이다. 일반적으로, BCG와 IFNγ의 배합물이 수지상 세포의 부분 성숙에 사용되지만, 대안으로서 BCG가 단독 사용될 수도 있다. BCG의 유효량은 조직 배양 배지 1ml 당 보통 약 10⁵ 내지 10⁷ cfu 범위이며, IFNγ의 유효량은 조직 배양 배지 1ml 당 보통 약 100 내지 약 1000 유닛 범위이다. 다른 구체예에서, 수지상세포 활성화 제제는 이미다조퀴놀린 R898이다. 일반적으로, 효과적인 TLR-4 효능제인 R898의 유효량은 조직 배양 배지 1ml 당 약 1 내지 약 50㎍/ml범위이며, 보다 일반적으로 조직 배양 배지 1ml 당 5 내지 10㎍이 사용된다. 이미다조퀴놀린은 단독으로 사용되거나 또는 예컨대 유효량의 BCG 및/또는 IFNγ와 배합될 수 있다.

또한, 본 발명에는 조성물이 포함되는데, 이 조성물은 종양을 보유한 개체에게 투여할 수 있는 생리적 허용성 담체, 완충액 및/또는 부형제와 배합된 수지상 세포 성숙 제제의 존재하에 시험관내에서 부분 성숙된 수지상 세포를 함유하는 것이다. 이러한 본 발명의 조성물에 사용되는 부분 성숙 수지상 세포는 일반적으로 CD80, CD86 또는 CD54(이에 국한되는 것은 아니다)와 같은 보조자극성 분자에 의해 상승조절 발현된다. 이러한 세포는 세포 표면 마커 CD83을 발현하거나 발현하지 않을 수도 있지만, 항원의 흡수 및 가공은 그대로 수행할 수 있다. 이러한 조성물은 일반적으로 약 10² 내지 약 10¹⁰ 의 부분 성숙된 수지상 세포를 함유하지만, 보다 많은 부분 성숙된 수지상 세포를 함유할 수도 있다. 부분 성숙 후, 수지상 세포는 동결보존하여 개체에게 투여하기 전 일정 시간 동안 보관해 둘 수 있다. 본 발명의 조성물을 구성하는 부분 성숙된 수지상 세포의 생산에 사용되는 세포는 종양을 보유한 환자로부터 분리할 수도 있고, 또는 환자의 HLA와 부합성인 개체로부터 분리된 세포로부터 부분 성숙된 수지상 세포를 생성시킬 수도 있다.

수지상 세포는 다양한 림프성 조직 및 비림프성 조직에서 발견되는 항원 제시 세포의 다양한 집단이다[참조: Liu, Cell 106: 259-62 (2001); Steinman, Ann. Rev. Immunol. 9: 271-96 (1991)]. 수지상 세포에는 비장의 림프성 수지상 세포, 표피의 랑게르한스 세포 및 혈행 중의 주름세포가 포함된다. 총괄적으로, 수지상 세포는 형태, 표면 MHC-클래스 II 발현의 높은 수준 및 T세포, B세포, 단핵구 및 천연 킬러 세포에서 발현되는 임의의 다른 표면 마커의 부재에 근거로 하나의 그룹으로 분류되는 것이다. 구체적으로, 단핵구 유래의 수지상 세포(또한 단핵구 수지상 세포로도 지칭됨)는 일반적으로 CD11c, CD80, CD86을 발현하고, HLA-DR⁺이지만, CD14^-이다.

이에 반해, 단핵구 수지상세포 전구체(일반적으로, 단핵구)는 보통 CD14⁺이다. 단핵구 수지상 세포 전구체는 이들이 존재하는 모든 조직, 구체적으로 비장, 골수, 림프절 및 흉선과 같은 림프성 조직으로부터 수득될 수 있다. 또한, 단핵구 수지상 세포 전구체는 순환계에서 분리될 수도 있다. 단핵구 수지상 세포 전구체를 쉽게 입수할 수 있는 공급원에는 말초 혈액이 있다. 제대혈은 또 다른 단핵구 수지상 세포 전구체의 공급원이다. 단핵구 수지상 세포 전구체는 면역반응이 유도될 수 있는 다양한 유기체로부터 분리할 수 있다. 이러한 유기체에는 사람을 비롯한 동물 및 영장류, 포유동물(예컨대, 개, 고양이, 마우스 및 래트), 조류(예컨대, 병아리), 뿐만 아니라 이의 돌연변이종과 같은 사람을 제외한 동물이 포함된다.

특정 구체예에서, 단핵구 수지상 세포 전구체 및/또는 미숙 수지상 세포는 건강한 검체 또는 면역자극을 필요로 하는 검체, 예컨대 암환자 또는 세포 면역자극이 유익하거나 바람직할 수 있는 기타 다른 검체(즉, 박테리아 또는 바이러스 감염 등을 보유한 검체)로부터 분리할 수 있다. 또한, 수지상 세포 전구체 및/또는 미숙 수지상 세포는 부분 활성화하여 면역자극을 필요로하는 HLA 부합성 검체에게 투여하기 위하여 HLA 부합성인 건강한 개체로부터 수득할 수도 있다.

수지상 세포 전구체 및 미숙 수지상 세포

수지상 세포 전구체 및 미숙 수지상 세포가 고농도인 세포 집단을 다양한 공급원, 예컨대 혈액 및 골수로부터 분리하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 수지상 세포 전구체 및 미숙 수지상 세포는 성분채집술 또는 백혈구성분채집술을 이용한 헤파린처리된 혈액 수거, 연층(buffy coat) 제조, 로제팅(rosetting), 원심분리, 밀도구배 원심분리(예컨대, Ficoll^® (예, FICOLL-PAQUE^®) 사용), PERCOLL^®(비투석성 폴리비닐피롤리돈(PVP)으로 코팅된 콜로이드성 실리카 입자(직경 15 내지 30nm), 슈크로스 등), 세포의 감별 용해, 여과 등을 통해 분리할 수 있다. 특정 구체예에서, 백혈구 집단은 예를 들어 검체로부터 혈액을 수거한 뒤, 탈피브린화하여 혈소판을 제거하고 적혈구 세포를 용해시킨다. 수지상 세포 전구체 및 미숙 수지상 세포는 경우에 따라 PERCOLL^® 구배를 통한 원심분리, 항체 패닝(panning) 등을 통해 단핵구 수지상세포 전구체가 농축된 것일 수 있다.

수지상 세포 전구체 및 미숙 수지상 세포는 경우에 따라 밀폐된 무균 시스템에서 제조될 수 있다. 본 명세서에 사용된 "밀폐된 무균 시스템" 또는 "밀폐 시스템"이란 용어는 미살균된 주위 또는 순환 공기 또는 다른 미살균 조건에 대한 노출이 없거나 최소화된 시스템을 의미한다. 일반적으로, 상부 개방 튜브, 개방 공기하에서의 세포 전달, 조직 배양판 또는 미밀봉 플라스크에서의 세포 배양 등은 수지상 세포 전구체 및 미숙 수지상 세포를 분리하기 위한 밀폐 시스템에서 제외된다. 일반적 구체예로서, 밀폐 시스템에는 미살균 공기에 노출됨이 없이 1차 수집 용기에서부터 밀봉가능한 조직 배양 용기로의 수지상 세포 전구체 및 미숙 수지상 세포의 무균 전달이 포함된다.

수지상 세포 전구체를 분리하는 보고된 방법 중에서 또 다른 방법은 부착 단핵구와 다른 "비수지상 세포 전구체"를 선택적으로 제거하기 위해 상업적으로 처리된 플라스틱 기재(예, 비드 또는 자기 비드)를 이용하는 방법이다(예컨대, 미국 특허 제5,994,126호 및 제5,851,756호 참조). 이 방법에서 부착성 단핵구와 비수지상 세포 전구체는 분류되는 반면 비부착성 세포는 보유되어 생체외 배양과 성숙에 이용된다. 다른 방법에서, 성분채집용 세포는 플라스틱 배양 자루(bag)에서 배양되기도 하는데, 이 플라스틱, 즉 폴리스티렌 또는 스티렌에는 자루의 표면적 증가를 위해 마이크로캐리어 비드가 첨가되었다. 세포는 특정 세포가 비드에 부착하기에 충분한 시간 동안 배양되며 비부착 세포는 자루로부터 세척되어진다[참조: Maffei, et al., Transfusion 40: 1419-1420 (2000); WO 제02/44338호, 본원에 참고원용됨].

다른 특정 구체예에서는, 본원에 참고원용된 WO 제03/010292호에 개시된 바와 같이 단핵구 결합 기재에 부착시켜 단핵구 수지상 세포 전구체를 분리한다. 예를 들어, 백혈구 집단(예, 백혈구성분채집술로 분리)은 단핵구 수지상 세포 전구체가 부착하는 기재와 접촉될 수 있다. 이와 같이 백혈구 집단이 상기 기재와 접촉되면, 백혈구 집단 중의 단핵구 수지상 세포 전구체는 우선적으로 기재에 부착한다. 다른 백혈구(다른 잠재적 수지상 세포 전구체도 포함하여)는 상기 기재에 대해 감소된 결합 친화성을 나타내어, 단핵구 수지상 세포 전구체가 상기 기재 표면에 주로 농축될 수 있다.

적당한 기재에는 예컨대 표면적 대 부피 비가 큰 기재가 포함된다. 이러한 기재는 예컨대 미립 또는 섬유상 기재일 수 있다. 적당한 미립 기재에는 예컨대 유리 입자, 플라스틱 입자, 유리 코팅된 플라스틱 입자, 유리 코팅된 폴리스티렌 입자 및 단백질 흡착에 적당한 기타 다른 비드가 포함된다. 본 발명에 사용하기에 적당한 섬유상 기재에는 미세모세 시험관 및 미세융모 막 등이 포함된다. 이러한 미립 기재 또는 섬유상 기재는 일반적으로 부착된 단핵구 수지상 세포 전구체가 이 부착 세포의 생육성에 실질적 감소를 일으킴이 없이 용출될 수 있도록 한다. 미립 또는 섬유상 기재는 실질적으로 비다공성이어서 기재로부터 단핵구 수지상 세포 전구체 또는 수지상 세포의 용출이 용이할 수 있다. "실질적으로 비다공성"인 기재는 기재에 존재하는 세공의 대부분 이상이 세포 보다 작아서 세포가 기재 내에 거의 포착되지 않는 기재를 의미한다.

단핵구 수지상 세포 전구체의 기재에 대한 부착은 경우에 따라 결합 매질의 첨가를 통해 증가될 수 있다. 적당한 결합 매질에는 예컨대 사이토카인(예, 과립세포/대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 인터루킨 4(IL-4) 또는 인터루킨 13(IL-13)), 혈장, 혈청(예, 자가 혈청 또는 동종이형 혈청과 같은 사람 혈청), 정제된 단백질(예컨대, 혈청 알부민), 이가 양이온(예컨대, 칼슘 이온 및/또는 마그네슘 이온) 및 단핵구 수지상 세포 전구체의 기재에 대한 특이적 부착을 보조하거나 또는 비단핵구 수지상 세포 전구체의 기재에 대한 부착을 차단하는 기타 다른 분자 등이 개별적으로 또는 임의의 배합으로 보충된 단핵구 수지상 세포 전구체 배양 배지(예컨대, AIM-V^®, RPMI 1640, DMEM, X-VIVO 15^® 등)가 포함된다. 특정 구체예에서, 혈장 또는 혈청은 열불활성화될 수 있다. 이와 같이 열불활성화된 혈장은 백혈구와 동종 또는 이종에서 유래하는 것일 수 있다.

단핵구 수지상 세포 전구체를 기재에 부착시킨 후, 비부착성 백혈구는 단핵구 수지상 세포 전구체/기재 복합체로부터 분리해낸다. 복합체로부터 비부착성 세포를 분리해내는 데에는 임의의 적당한 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 비부착성 백혈구와 복합체의 혼합물을 참강시킨 뒤, 비부착성 백혈구와 배지는 따라내거나 배출시킬 수 있다. 또는, 혼합물을 원심분리한 후, 펠릿화된 복합체로부터 비부착성 백혈구를 함유하는 상청액을 따라내거나 배출시킬 수 있다.

또 다른 방법에서, 단핵구 수지상 세포 전구체는 본원에 참고원용된 국제특허출원 PCT/US03/19428(2003.6.19 출원)에 기술된 바와 같이 접선 유동 여과(TFF) 장치를 이용하여 제조한 백혈구 농축 세포 집단으로부터 분리할 수 있다. 단핵구 수지상 세포 전구체가 농축된 세포 집단의 분리에 유용한 접선 유동 여과 장치는 교차류 챔버, 여과액 챔버 및 그 사이에 배치된 필터를 보유한 제거기(remover) 장치를 구비할 수 있다. 필터는 교차류 챔버와 접한 면, 즉 잔류물 표면과 여과액 챔버와 접한 다른 면, 즉 여과액 표면에서 유체 통과성이다. 교차류 챔버는 백혈구를 포함하는 혈액 성분 시료가 교차류 챔버 내로 필터의 잔류물 표면에 평행하게 도입되도록 조정된 유입구를 보유한다. 또한, 배출구는 필터의 잔류물 표면과 대향하는 챔버 부분에서 중심에 배치되어 교차류 챔버에 구비되어 있다. 접선 유동 여과 장치에 사용하기에 적당한 필터는 일반적으로 평균 세공 크기가 약 1 내지 약 10 미크론 범위인 것이다. 이러한 필터는 평균 세공 크기가 약 3 내지 약 7 미크론일 수 있다. 또한, 교차류 챔버의 유입구로 도입되는 시료의 소정의 유입속도를 제공하는 수단 및 필터를 통해 여과액 챔버로 통과되는 여과액의 여과 속도를 조절하는 수단이 구비될 수도 있다. 여과 속도 조절 수단은 여과 속도를 필터의 무저항적 여과 속도 미만으로 제한한다. 혈액 성분을 함유하는 시료는 백혈구성분채집술 장치로부터 수집된 시료를 함유하는 용기 또는 백혈구성분채집용 장치와 같은 공급원 장치를 통해 공급될 수 있다.

단핵구 수지상 세포 전구체 및 이러한 전구체가 농축된 세포 집단은 분화, 부분 성숙 및/또는 확장을 위해 생체내에서 배양될 수 있다. 본 명세서에 사용된, 분리된 미숙 수지상 세포, 수지상 세포 전구체 및 기타 다른 세포는 사람의 손을 통해 본래의 환경에서 분리되어 존재하고, 따라서 천연 산물이 아닌 세포를 의미한다. 분리된 세포는 정제 형태, 반정제 형태로 또는 비천연 환경 상태로 존재할 수 있다. 간략히 설명하면, 생체외 분화는 일반적으로 단핵구 수지상 세포 전구체 또는 수지상 세포 전구체를 보유한 세포 집단을 1종 이상의 분화 제제의 존재하에 배양하는 단계를 수반한다. 적당한 분화 제제에는 예컨대 세포 증식 인자(예, 사이토카인, 예컨대 (GM-CSF), 인터루킨 4(IL-4), 인터루킨 7(IL-7), 인터루킨 13(IL-13) 및/또는 이의 배합물)가 포함될 수 있다. 특정 구체예에서, 단핵구 수지상 세포 전구체는 분화되어 단핵구 유래의 미숙 수지상 세포를 형성할 수 있다.

수지상 세포 전구체는 적당한 배양 조건하에서 배양 및 분화될 수 있다. 적당한 조직 배양 배지에는 AIM-V^®, RPMI 1640, DMEM, X-VIVO 15^® 등이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다. 이러한 조직 배양 배지에는 혈청, 아미노산, 비타민, 사이토카인, 예컨대 GM-CSF 및/또는 IL-4, IL-7, IL-13, 이가 양이온 등이 세포 분화 촉진을 위해 보충될 수 있다. 특정 구체예에서, 수지상 세포 전구체는 무혈청 배지에서 배양될 수 있다. 배양 조건에는 경우에 따라 임의의 동물 유래 산물이 배제될 수 있다. 수지상 세포 배양 배지에 사용되는 일반적인 사이토카인 배합물은 GM-CSF와 IL-4, IL-7 또는 IL-13을 각각 약 500 유닛/ml 포함하는 것이다. 수지상 세포 전구체는 미숙 수지상 세포를 형성하기 위해 분화될 때 피부 랑게르한스 세포와 표현형적으로 유사하다. 미숙 수지상 세포는 일반적으로 CD14^- 및 CD11c⁺이고, 소량의 CD86 및 CD83을 발현하며, 특정 세포내이입을 통해 가용성 항원을 포착할 수 있다.

수지상 세포 성숙 제제에는 BCG, IFNγ, LPS, TNFα, 이미다조퀴놀린 화합물, 예컨대 4-아미노-2-에톡시메틸-α,α-디메틸-1H-이미다졸[4,5-c]퀴놀린-1-에탄올(R848로 지칭됨) 또는 1-(2-메틸프로필)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 및 이의 유도체(WO 제00/47719호, 전문이 본원에 참고원용됨)와 같은 이미다조퀴놀린-4-아민 화합물, 폴리[I]:폴리[C(12)U] 등과 같은 합성 이본쇄 폴리리보뉴클레오타이드, TLR-3, TLR-4, TLR-7 및/또는 TLR-9와 같은 톨(Toll)류 수용체(TLR)의 효능제, DC 성숙을 유도하는 것으로 알려진 비메틸화 CpG 모티프를 함유하는 핵산 서열 등이나 이의 배합물이 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다. BCG의 유효량은 조직 배양 배지 1ml 당 보통 약 10⁵ 내지 10⁷ cfu 범위이다. IFNγ의 유효량은 조직 배양 배지 1ml 당 보통 약 100 내지 약 1000 U 범위이다. 바실러스 칼메트-구에린(BCG)은 엠. 보비스의 무독성 균주이다. 본 명세서에 사용된, BCG는 전체 BCG 뿐만 아니라 세포벽 성분, BCG 유래 리포아라비도만난 및 기타 다른 BCG 성분을 말한다. BCG는 경우에 따라 불활성화되며, 그 예로는 열불활성화된 BCG, 포르말린 처리된 BCG 등이 있다. 이미다조퀴놀린 화합물, 예컨대 4-아미노-2-에톡시메틸-α,α-디메틸-1H-이미다졸[4,5-c]퀴놀린-1-에탄올(R848로 지칭됨)과 같은 이미다조퀴놀린-4-아민 화합물의 유효량은 조직 배양 배지 1ml 당 약 1 내지 약 50㎍범위이며, 보다 일반적으로 조직 배양 배지 1ml 당 5 내지10㎍이 사용된다. 이미다조퀴놀린은 단독으로 사용되거나 또는 예컨대 유효량의 BCG 및/또는 IFNγ 또는 또 다른 TLR 효능제와 배합될 수 있다.

미숙 DC는 일반적으로 수지상 성숙 제제, 예컨대 BCG 및 IFNγ의 유효량과 약 1시간 내지 약 10시간 동안 접촉시킨다. 일반적으로, 완전한 성숙에는 최소한 24시간, 보다 일반적으로 48 내지 약 72시간의 항온배양 기간이 필요로 된다. 미성숙 수지상 세포는 적당한 성숙 배양 조건에서 배양되고 부분 성숙될 수 있다. 적당한 조직 배양 배지에는 AIM-V^®, RPMI 1640, DMEM, X-VIVO 15^® 등이 포함된다. 조직 배양 배지에는 아미노산, 비타민, 사이토카인, 예컨대 GM-CSF 및/또는 IL-15, 이가 양이온 등이 세포의 성숙 촉진을 위해 첨가될 수 있다. 일반적인 사이토카인 배합물은 약 500 유닛/ml의 GM-CSF와 100ng/ml의 IL-15이다.

미숙 수지상 세포의 부분 성숙은 수지상 세포에 대한 당해 기술분야에 공지된 방법을 통해 모니터할 수 있다. 세포 표면 마커는 유동 세포측정계, 면역조직화학법 등과 같은 당해 기술분야에 통상적인 분석법으로 검측할 수 있다. 세포는 또한 사이토카인 생산에 대해서도 모니터할 수 있다(예컨대, ELISA, 또 다른 면역분석법, 또는 올리고뉴클레오타이드 어레이 사용). GM-CSF 및 IL-4와 같은 수지상 세포 성숙 제제의 존재하에 본 발명에 따라 배양 및 부분 성숙된 DC에서, 인산화된 JAK2(야누스 활성화 키나제 2)의 수준 측정은 당해 기술분야에 공지된 방법에 의한 성숙 개시를 나타내는데 사용될 수 있다. 세포 표면 마커 및 사이토카인의 발현 유도 뿐만 아니라 시그널링 분자(예컨대, jak2)의 인산화 역시 수지상 세포가 개체에게 투여되는 즉시 면역반응 유도를 위해 수지상 세포가 조정되었음을 나타내는 표시인자로서 잘 알려져 있다.

미숙 수지상 세포는 수지상 세포를 부분 성숙시키기 위한 일정 기간 동안만 성숙 처리된다. 완전 성숙 DC는 항원을 흡수하는 능력을 상실하고 보조자극성 세포 표면 분자 및 다양한 사이토카인의 상승조절 발현을 나타낸다. 구체적으로, 성숙 DC는 미숙 수지상 세포 보다 높은 수준의 MHC 클래스 I 및 II 항원을 발현하며, 성숙 수지상 세포는 일반적으로 CD80⁺, CD83⁺, CD86⁺ 및 CD14^-로 확인된다. 보다 다량의 MHC 발현은 DC 표면에 항원 밀도를 증가시키는 한편, 보조자극성 분자 CD80 및 CD86의 상승 조절은 T 세포 상에 존재하는 CD28과 같은 보조자극성 분자의 대응물을 통하여 T 세포 활성화를 강화시킨다. 본 발명에 사용되는 부분 성숙 수지상 세포에는 일반적으로 수지상 세포 성숙 제제에 노출되는 즉시 CD80, CD86 및/또는 CD54 등(이에 제한되지 않음)을 포함하는 보조자극 분자의 발현을 상승 조절하는 것으로 나타나는 수지상 세포가 포함된다. 이러한 세포는 CD83을 발현하거나 발현하지 않을 수도 있지만, 항원을 흡수 및 가공하는 성질은 유지한다. 또한, 부분 성숙 수지상 세포는 일반적으로 미숙 수지상 세포에 의해 생산되지 않는 TNF-α, IL-6, IL-10 또는 IL-12를 생산할 수 있다.

완전 성숙 수지상 세포는 항원을 효율적으로 가공하지 못하기 때문에 본 발명에 바람직하지 않다. 또한, 종래 방법에 사용된 바와 같은 미숙 수지상 세포는 항원의 가공이 미숙 수지상 세포에 의해 차단되는 것으로 알려진 사이토카인의 실질적인 농도를 비롯하여 면역억제 환경이 종양 내에서 일반적으로 관찰되기 때문에 바람직하지 않다. 본 발명에서, 미숙 수지상 세포의 부분 성숙은 세포 표면 상에 있는 사이토카인 수용체를 억제조절하여, 종양내 공간에 존재하는 사이토카인의 임의의 면역억제 효과에 덜 민감하거나 덜 반응성이 되게 하며, 종양내 공간에 존재하는 종양 항원을 효율적으로 가공할 수 있는 세포를 제공한다. 부분 성숙 수지상 세포는 TNF-α 및 IL-12 등의 생산 및 케모카인 수용체 CCR7의 발현을 통해 측정되듯이 종양 내에서 성숙되면 그 즉시 림프절로 이동할 수 있고, 여기서, 세포는 T 세포에 접촉하여 종양 항원에 대한 면역반응을 상승조절하게 할 것이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, DC는 환자에게 투여하기 전에 성숙에 앞서 또는 부분 성숙 후에 동결보존 등을 통해 보존될 수 있다. 사용될 수 있는 동결보존제에는 디메틸 설폭사이드(DMSO), 글리세롤, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌 글리콜, 알부민, 덱스트란, 슈크로스, 에틸렌 글리콜, i-에리트리톨, D-리비톨, D-만니톨, D-소르비톨, i-이노시톨, D-락토스, 염화콜린, 아미노산, 메탄올, 아세트아마이드, 글리세롤 모노아세테이트 및 무기 염이 포함되며, 여기에 국한되는 것은 아니다. 조절 서냉 속도는 중요할 수 있다. 다른 동결보존 제제와 다른 세포 종류는 일반적으로 최적의 냉각 속도가 서로 상이하다. 물이 얼음으로 변하는 융해 단계의 열은 일반적으로 최소여야 한다. 냉각 절차는 예컨대 프로그램가능한 동결 장치 또는 메탄올 배쓰 절차를 이용하여 수행할 수 있다. 프로그램가능한 동결 장치는 최적의 냉각 속도를 측정할 수 있게 하며, 재현가능한 표준 냉각을 유용하게 한다. 프로그램가능한 조절 속도 동결기, 예컨대 Cryomed 또는 Planar는 동결 방식이 바람직한 냉각 속도 곡선에 부합하게 조정할 수 있다.

철저히 동결한 후, 단핵구 전구체 세포, 미숙 DC 또는 부분 성숙 DC는 극저온 장기 보관 용기에 신속하게 옮겨 담을 수 있다. 전형적인 구체예에서, 시료는 액체 질소(-196℃) 또는 이의 증기(-165℃) 중에서 극저온으로 보관될 수 있다. 조혈 줄기 세포, 특히 골수 또는 말초 혈액 유래의 줄기 세포의 조작, 동결보존 및 장기 보관을 위한 주의 사항 및 절차는 대부분 본 발명의 세포에도 적용될 수 있다. 이에 대한 논의는 본원에 참고원용된 다음과 같은 문헌에서 찾아볼 수 있다[참조: Taylor et al., Cryobiology 27: 269-78 (1990); Gorin, Clinics in Haematology 15: 19-48 (1986); Bone-Marrow Conservation, Culture and Transplantation, Proceedings of a Panel, Moscow, Jul. 22-26, 1968, International Atomic Energy Agency, Vienna, pp. 107-186].

동결 세포는 신속하게 해동되고(예컨대, 37℃ 내지 41℃로 유지되는 수조에서) 해동 즉시 냉각되는 것이 바람직하다. 해동 시 세포 응집을 방지하기 위하여 세포를 처리하는 것이 필요할 수 있다. 응집 방지에는 다양한 절차가 사용될 수 있는데, 그 예에는 동결 전 및/또는 후에 DNase[참조: Spitzer et al., Cancer 45: 3075-85 (1980)], 저분자량 덱스트란 및 구연산염, 하이드록시에틸 전분[참조: Stiff et al., Cryobiology 20: 17-24 (1983)] 등의 첨가가 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 동결보존제가 사람에게 독성인 경우에는 해동된 부분 성숙 DC를 치료 용도로 사용하기 전에 제거해야 한다. 동결보존제를 제거하는 1가지 방법은 무시되는 농도로 희석하는 것이다. 동결 부분 성숙된 DC가 해동 및 회수되면, 그 즉시 비동결 부분 성숙된 DC에 대해 본 명세서에 기술된 바와 같이 투여할 수 있다.

부분 성숙된 수지상 세포의 생체내 투여

본 발명은 종양을 앓고 있는 검체에게 부분 성숙 수지상 세포 또는 이러한 세포가 농축되고 함유된 세포 집단을 투여하는 방법을 제공한다. 특정 구체예에서, 이러한 방법은 수지상 세포 전구체 또는 미숙 수지상 세포를 수득하는 단계, 이러한 세포를 수지상 세포 성숙 제제, 예컨대 BCG 및 IFNγ 또는 앞서 게재한 바와 같은 기타 다른 성숙 제제의 존재하에 분화 및 부분 성숙시키는 단계를 통해 수행한다. 부분 성숙된 수지상 세포는 당업자에게 공지된 방법 및 조성물에 따라 생리적 허용성 담체, 부형제, 완충제 및/또는 희석제와 함께 배합될 수 있다. 부분 성숙 수지상 세포는 면역자극을 필요로 하는 검체에게 직접 투여될 수 있다. 일반적으로 약 10² 내지 약 10¹⁰ 세포를 약제학적 허용성 담체에 현탁시킨다. 이러한 세포는 종양에 직접 주사하거나 또는 종양 또는 종양 베드 부근 구역이나 인접 영역 또는 혈행이나 림프가 접촉된 구역으로 주사하여 세포가 종양 항원에 접근하도록 한다.

예를 들어, 세포는 종양에 직접 투여되거나, 종양을 수술 제거 또는 절제한 후의 종양 베드에 투여하거나, 종양 둘레에 투여하거나, 종양과 직접 접하고 있는 고갈 림프절로 투여하거나, 종양이나 종양이 존재하는 기관, 예컨대 문맥이나 폐정맥 또는 폐동맥 등에 연결되거나 영양을 공급하는 혈관이나 림프관으로 투여할 수 있다. 본 발명의 부분 성숙 수지상 세포의 투여는 기타 다른 종양 치료, 예컨대 화학요법 또는 방사선요법과 동시에 또는 후속으로 수행할 수 있다. 또한, 본 발명의 부분 성숙 수지상 세포는 수지상 세포의 성숙 및/또는 종양 내에 존재하거나 종양 부근 구역이나 인접 구역에 존재하는 항원의 가공에 대한 보조제로서 작용하는 다른 제제와 함께 공동투여될 수 있다. 또한, 수지상 세포는 종양 항원과 접촉되기 위해 세포가 종양이나 종양 베드에 서서히 방출되도록 종양 또는 종양 베드 내 또는 그 주위 구역으로 이식되는 서방형 매트릭스 중에 배합되거나 혼합될 수 있다.

본 발명의 부분 성숙 수지상 세포는 그 제형과 투여 방식에 적당한 임의의 수단을 통해 투여할 수 있다. 예를 들어, 세포는 약학적 허용성 담체와 혼합되어 주사기, 카테터, 캐뉼라 등을 이용하여 투여할 수 있다. 전술한 바와 같이, 세포는 서방형 매트릭스에 배합될 수 있다. 이러한 방식으로 투여되는 경우, 이 제형은 사용된 매트릭에 적당한 수단을 이용하여 투여할 수 있다. 본 발명에 적용가능한 기타 다른 투여 방법 및 방식은 당업자에게 공지되어 있다.

본 발명의 조성물은 그 자체가 개체 치료용으로 사용될 수 있다. 또한, 조성물은 종양을 치료하기 위한 임의의 다른 방법과 함께 사용할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명은 방법은 종양 수술 절제, 화학요법(세포독성 약물, 아폽토시스 제제, 항체 등), 방사선용법, 냉동요법, 근접치료, 면역요법(항원 특이적 성숙 활성화된 수지상 세포, NK 세포, 종양 항원에 특이적인 항체 등의 투여) 등과 함께 사용될 수 있다. 또한, 이러한 방법들은 모두 임의의 배합으로 사용될 수 있다. 배합 치료는 동시 수행하거나 연속 수행할 수 있고, 담당의의 결정에 따라 임의의 순서로 투여될 수 있다.

다른 구체예에서, 수지상 세포 및 수용 검체는 동일한 MHC(HLA) 일배체형을 갖는 것이다. 검체의 HLA 일배체형을 측정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 관련 구체예에서, 부분 성숙 수지상 세포는 수용 검체의 세포와 동종이형성인 것이다. 동종이형성 세포는 일반적으로 적어도 하나의 MHC 대립유전자 부합성(예컨대, MHC 대립유전자 전체는 아닐지라도 적어도 하나를 공유함)인 것이다. 보다 덜 일반적인 구체예에서, 수지상 세포 및 수용 검체는 모두 서로 동종이형성이고, 모두 공통된 적어도 하나의 MHC 대립유전자를 보유하는 것이다.

다음 실시예는 단지 본 발명의 다양한 양태를 예시하는 것으로서, 어떠한 방식으로든지 본 발명을 제한하는 것으로 이해되어서는 안된다.

실시예 1

본 실시예에서, 접선 유동 여과 방식으로 분리된 단핵구 수지상 세포 전구체는 플라스크 또는 세포 자루에서 2% 사람 혈청 알부민(HSA) 및 500 U/ml의 GM-CSF가 보충된 X-VIVO15^® 1ml 당 10⁶ 단핵구의 농도로 배양했다. 5일 후, 플라스크 및 자루의 DC를 미처리 상태로 방치하거나(iDC) 또는 BCG(1:400 희석율) 및 인터페론 γ(IFNγ, 500 U/ml) 존재하에 4시간 동안 부분 성숙시켰다(pmDC). 이러한 세포를 수거하여 세척하고 동일한 수의 형광 표지된 방사선조사된 PKH67-A549 종양 세포와 48시간 동안 혼합해두었다. 항온배양 후, 세포를 세척하고, 피코에리트린(PE) 표지된, CD11c에 특이적인 모노클론 항체로 염색하고 유동 세포측정계로 분석했다. 표 1에 제시한 값들은 총 DC 중에서 표지된 PKH67 항원에 양성이기도 한 CD11c⁺ 세포의 퍼센트를 나타낸 것이다(MFI = 평균 형광 강도). 대조군으로는, 분석 직전에 PKH67-A549 세포와 혼합된 DC를 사용했다.

처리	CD11c⁺PKH67⁺ 세포 %	MFI
iDC-플라스크	87.6	235.2
pmDC-플라스크	90.7	610.2
iDC-자루	72.8	403.5
pmDC-자루	91.3	557.5

이 데이터는 이 분석 실험에서, 항원을 흡수하는 세포 퍼센트 또는 종양 세포가 흡수한 물질의 양을 통해 측정되듯이, 부분 성숙된 DC가 미숙 수지상 세포 보다 항원 흡수율이 우수함을 입증했다.

다른 예로서, 종양 성장 제거 수술을 받은 환자에 대해 백혈구성분채집술을 실시했다. 백혈구성분채집 산물로부터 접선 유동 여과를 통해 단핵구를 정제했다. 정제된 단핵구는 전술한 바와 같이 분화시키고, 열사멸 및 포르말린 고정된 BCG(5x10⁶ cfu/ml)-IFNγ(500U/ml)에 노출시켜 부분 성숙시켰다. 이와 같이 부분 성숙된 수지상 세포는 투여할 수 있도록 배합한 뒤, 초음파 지침서에 따라 개체의 종양 베드로 주사했다. 이 개체에서 분리한 수지상 세포는 시험관내에서 측정했을 때 종양 특이적 세포독성 T 세포 반응을 유도할 수 있는 것으로 관찰되었다. 또한, 종양 재발이 예방되거나 재발 시간이 실질적으로 지연됨을 알 수 있었다.

실시예 2

본 실시예에서는 사람 결장 암 세포를 마우스에게 이식하여 공지 방법에 따라 종양 이종이식편을 형성시켰다. 종양이 확립된 후, 동물을 그룹으로 나누어 각 그룹의 동물에게 위약, 미숙 수지상 세포 또는 부분 성숙 수지상 세포를 종양 내로 투여했다. 이어서 종양의 크기를 측정하고 각 그룹마다 비교했다.

간략히 설명하면, 사람 CT26 결장 암종 종양은 Balb/c 마우스 암컷의 우측 옆구리 피하로 100,000 종양 세포를 주사하여 형성시켰다. 치료는 15일째 개시했고, 이 때 모든 마우스는 크기가 10 내지 45㎟ 범위인 촉진가능한 종양을 보유하고 있었다.

수지상 세포는 Balb/c 마우스 암컷의 대퇴부 골수로부터 표준 프로토콜에 따라 제조했다. 간략히 설명하면, 적혈구 용해 후 골수 세포를, 10% 태내 송아지 혈청이 보충된 RPMI 1640에서 뮤린 GM-CSF(200 U/ml) 및 IL-4(200 U/ml)와 함께 13 내지 14일 동안 항온배양했고, 3일과 7일 후에는 새 배지를 사이토카인과 함께 첨가했다. 부분 성숙된 수지상 세포를 수득하기 위해, 불활성화 전에 1ml 당 0.5 내지 1 x 10⁶ 콜로니 형성 단위의 활성을 갖는 불활성화된 바실러스 칼메트-구에린(BCG) 400배 희석물 및 1ml 당 500 유닛의 뮤린 인터페론 감마(IFNγ)에 세포를 노출시켰다. 이러한 세포를 8시간 동안 항온배양한 뒤, 14.5% 메트리즈아미드 상에 중층시키고 4℃에서 1750rpm으로 15분 동안 원심분리했다. 계면을 수집하고, 세포를 세척한 뒤 액체 질소 용기 중에서 10% 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 생육가능하게 동결시켰다. 37℃에서 해동한 후, 세포를 2회 세척하고 50㎕당 1x10⁶ 세포 농도로 재현탁시켰다.

종양 보유 마우스는 15일 및 17일째 사이클로포스파미드(50mg/kg)를 복강내로 처리했다. 종양으로의 수지상 세포 주사(인산염 완충 식염수 위약 주사 50㎕, 미숙 DC 또는 8시간 동안 성숙된 DC)는 16일, 17일, 18일 및 21일째 수행했다. 종양 성장은 60일 동안 격일마다 측정했다.

인산염 완충 식염수가 종양내로 처리된 그룹에서, 총 4마리의 마우스는 40일째 또는 그 전에 100㎟ 보다 큰 종양이 형성되어 있었다. 이에 반해, 미숙 DC를 복강내 처리한 마우스는 종양 성장의 감소를 보였고, 마우스 4마리 중 2마리는 40일 째 100㎟ 보다 작은 종양을 갖고 있었다. 부분 성숙된 DC가 처리된 마우스 4마리 중 3마리는 40일 째 100㎟ 보다 작은 종양을 갖고 있었고, 이 중 2마리는 50일 째 종양을 촉진할 수 없었다.

실시예 3

본 실시예에서는 사람 결장 암 세포를 마우스에게 이식하여 공지 방법에 따라 종양 이종이식편을 형성시켰다. 1차 종양 세포 주사에 이어, 2차 용량의 종양 세포를 동물에게 투여했다. 15일 후, 동물을 그룹으로 나누어 각 그룹의 동물에게 위약, 미숙 수지상 세포 또는 부분 성숙 수지상 세포를 종양 내로 투여했다. 이어서 종양의 크기를 측정하고 각 그룹마다 비교했다.

간략히 설명하면, 사람 CT26 결장 암종 종양은 Balb/c 마우스 암컷의 우측 옆구리 피하로 100,000 종양 세포를 주사한 뒤, 3일 째 좌측 옆구리로 100,000 종양 세포를 주사하여 형성시켰다. 치료는 15일째 개시했고, 이 때 모든 마우스는 우측 옆구리에 크기가 10 내지 45㎟ 범위인 촉진가능한 종양을 보유하고 있었다.

수지상 세포는 Balb/c 마우스 암컷의 대퇴부 골수로부터 표준 프로토콜에 따라 제조했다. 간략히 설명하면, 적혈구 용해 후 골수 세포를, 10% 태내 송아지 혈청이 보충된 RPMI 1640에서 뮤린 GM-CSF(200 U/ml) 및 IL-4(200 U/ml)와 함께 13 내지 14일 동안 항온배양했고, 3일과 7일 후에는 새 배지를 사이토카인과 함께 첨가했다. 부분 성숙된 수지상 세포를 수득하기 위해, 불활성화 전에 1ml 당 0.5 내지 1 x 10⁶ 콜로니 형성 단위의 활성을 갖는 불활성화된 바실러스 칼메트-구에린(BCG) 400배 희석물 및 1ml 당 500 유닛의 뮤린 인터페론 감마(IFNγ)에 세포를 노출시켰다. 이러한 세포를 14.5% 메트리즈아미드 상에 중층시키고 4℃에서 1750rpm으로 15분 동안 원심분리했다. 계면을 수집하고, 세포를 세척한 뒤 액체 질소 용기 중에서 10% 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 생육가능하게 동결시켰다. 37℃에서 해동한 후, 세포를 2회 세척하고 50㎕당 1x10⁶ 세포 농도로 재현탁시켰다.

종양 보유 마우스는 15일 및 17일째 사이클로포스파미드(50mg/kg)를 복강내로 처리했다. 우측 옆구리 종양으로의 수지상 세포 주사(인산염 완충 식염수 위약 주사 50㎕, 미숙 DC, 8시간 동안 성숙된 DC 또는 24시간 동안 성숙된 DC)를 16일, 17일, 18일 및 21일째 수행했다. 종양 성장은 60일 동안 격일마다 측정했다.

인산염 완충 식염수가 종양내로 처리된 그룹에서, 총 5마리의 마우스는 35일 전에 100㎟ 보다 큰 종양이 우측 옆구리에 형성되어 있었고, 5마리 중 3마리에서는 40일째 또는 그 전에 100㎟ 보다 큰 종양이 좌측 옆구리에 형성되어 있었다. 이에 반해, 미숙 DC를 복강내(우측에만) 처리한 마우스는 종양 성장의 감소를 보였는데, 마우스 1마리는 6일 째 옆구리 어느 쪽에도 촉진가능한 종양을 갖고 있지 않았고, 마우스 5마리 중 4마리는 40일 째 옆구리 양쪽에 100㎟ 보다 작은 종양을 갖고 있었다. 8시간 부분 성숙된 DC가 처리된 마우스 5마리 중 3마리는 50일 째 옆구리 양쪽 종양이 완전하게 사라졌다. 24시간 동안 부분 성숙된 DC가 처리된 그룹에서는 종양 성장이 훨씬 더 감소되어 있었다. 마우스 5마리 중 3마리에서는 양쪽 옆구리 종양이 50일 째 완전 사라졌고, 1마리에서는 왼쪽 옆구리 종양은 완전 사라지고 우측 옆구리 종양은 부분 제어되어 있었으며(40일 째 100㎟ 미만), 1마리에서는 양쪽 종양이 모두 부분 제어되어 있었다(40일 째 양쪽 모두 50㎟ 미만).

실시예 4

본 실시예에서는 전술한 바와 같이 사람 종양 세포를 사용하여 이종이식 종양을 형성시켰다. 분화된 미숙 수지상 세포는 수지상 세포 성숙 제제 이미다조퀴놀린 R898 또는 BCG 및 IFNγ와 배합된 R898에 세포를 노출시켜 부분 성숙시켰다. 이와 같이 부분 성숙된 수지상 세포, 미숙 수지상 세포 및 위약을 종양에 투여하고 각 그룹의 종양 크기를 비교했다.

간략히 설명하면, 종양은 실시예 2에서와 같이 마우스에 확립시켰다. 수지상 세포도 실시예 2와 3에서와 같이 제조하고, 단 세포의 부분 성숙은 면역반응 개질제(수지상 세포 성숙 제제) R848 5㎍/ml 또는 실시예 2와 3에 사용된 바와 같은 농도의 BCG 및 인터페론 감마와 배합된 면역반응 개질제 R848 5㎍/ml에 세포를 8시간 동안 노출시켜 수행했다.

처리 스케쥴은 실시예 3과 동일하다. 인산염 완충 식염수를 복강내로 주사한 모든 마우스에서는 종양 성장이 전혀 제어되지 않았다. R848만으로 부분 성숙된 DC로 처리된 마우스 5마리 중 1마리는 종양 성장이 완전히 사라졌고, BCG 및 IFNγ와 함께 R848로 부분 성숙된 DC를 복강내로 처리한 마우스 5마리 중 3마리에서도 마찬가지였다. 종양이 완전히 사라졌던 실시예 3과 4의 마우스 9마리에게 종양 소멸 후 약 30일 후에 1x10⁶ 종양 세포를 우측 옆구리로 추가 투여했다. 이 동물들은 모두 검출가능한 종양 성장을 보이지 않았으며, 이는 CT26 종양 세포에 대한 면역학적 예방성을 입증하는 것이다.

실시예 5

본 실시예에서는 전술한 실시예들에서 제조한 수지상 세포들의 특성을 표면 분자 발현에 대해 확인했다. 간략히 설명하면, 실시예 2 내지 4에서 제조한 뮤린 수지상 세포는 형광 항체로 염색한 후에 세포 표면 분자의 발현을 검사하고 유동 세포측정계로 분석했다. 그 결과는 표 2와 표 3에 각각 표현형적 표면 마커에 대해 양성인 세포 비율 및 특정 표면 마커에 대한 평균 형광 강도로서 나타냈다.

실시예 7

고형 종양 진단을 받은 환자에게 화학요법, 방사선요법, 냉동요법 또는 근접치료 및 이어서 부분 성숙된 수지상 세포의 복강내 투여로 처리했다. 처리 후, 종양은 사라졌고, 환자의 종양 재발이 예방되었다.

이상 기술한 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아닌 예시하는 것이다. 그 외 다른 본 발명의 변형예는 당업자라면 쉽게 알 수 있을 것이며 첨부되는 청구의 범위에 포함되는 것이다. 본 명세서에 인용된 모든 공개문헌, 특허, 특허출원 및 기타 다른 참고문헌들은 모두 전문이 본원에 참고원용된 것이다.

Claims

시험관내에서 부분 성숙된 수지상 세포가 항원을 흡수할 수 있고 가공할 수 있으며, 개체에 투여된 후 항-종양 면역반응을 유도할 수 있는 것인, 시험관내에서 부분 성숙시킨 수지상 세포를 포함하는 세포 집단을 종양을 보유한 개체에게 투여하는 것을 포함하는 항종양 면역반응 형성방법.
제1항에 있어서, 수지상 세포가 피부, 비장, 골수, 흉선, 림프절, 제대혈 또는 말초 혈액에서 수득되는 항종양 면역반응 형성방법.
제2항에 있어서, 수지상 세포가 치료되는 개체로부터 수득되는 항종양 면역반응 형성방법.
제2항에 있어서, 수지상 세포가 치료되는 개체와 HLA 부합성인 건강한 개체에서 수득되는 항종양 면역반응 형성방법.
제1항에 있어서, 수지상 세포가 수지상 세포 성숙 제제의 존재하에 부분 성숙되는 항종양 면역반응 형성방법.
제5항에 있어서, 수지상 세포 성숙 제제가 바실러스 칼메트-구에린(BCG), 인터페론 γ(IFNγ), 지다당류(LPS), 종양 괴사 인자 α(TNFα), 이미다조퀴놀린 화합물, 합성 이본쇄 폴리리보뉴클레오타이드, 톨(Toll)류 수용체(TLR)의 효능제, DC 성숙을 유도하는 것으로 알려진 비메틸화 CpG 모티프를 함유하는 핵산 서열 또는 이의 임의의 배합물인 항종양 면역반응 형성방법.
제6항에 있어서, BCG가 완전 BCG, BCG의 세포벽 성분, BCG 유래의 리포아라비도만난, 또는 다른 BCG 성분을 포함하는 항종양 면역반응 형성방법.
제6항에 있어서, BCG가 열불활성화된 BCG 또는 포르말린 처리된 BCG인 항종양 면역반응 형성방법.
제6항에 있어서, BCG의 유효량이 조직 배양 배지 1ml 당 약 10⁵ 내지 10⁷cfu 범위이고, IFNγ의 유효량은 조직 배양 배지 1ml 당 약 100 내지 약 1000유닛 범위인 항종양 면역반응 형성방법.
제6항에 있어서, 이미다조퀴놀린 화합물이 이미다조퀴놀린-4-아민 화합물인 항종양 면역반응 형성방법.
제10항에 있어서, 이미다조퀴놀린-4-아민 화합물이 4-아미노-2-에톡시메틸-α,α-디메틸-1H-이미다졸[4,5-c]퀴놀린-1-에탄올 또는 1-(2-메틸프로필)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민, 또는 이의 유도체인 항종양 면역반응 형성방법.
제6항에 있어서, 합성 이본쇄 폴리리보뉴클레오타이드가 폴리[I]:폴리[C(12)U]인 항종양 면역반응 형성방법.
제1항에 있어서, 부분 성숙된 수지상 세포가 종양 내로 직접 투여되는 항종양 면역반응 형성방법.
제1항에 있어서, 부분 성숙된 수지상 세포가 종양을 수술 제거 또는 절제한 다음 종양 베드로 투여되는 항종양 면역반응 형성방법.
제1항에 있어서, 부분 성숙된 수지상 세포가 종양 주위의 조직 구역으로 투여되는 항종양 면역반응 형성방법.
제1항에 있어서, 부분 성숙된 수지상 세포가 종양 구역을 직접 고갈시키는 림프절로 투여되는 항종양 면역반응 형성방법.
제1항에 있어서, 부분 성숙된 수지상 세포가 혈액이나 림프를 종양이나 종양 보유 기관으로 전달하는 순환 혈관으로 직접 투여되는 항종양 면역반응 형성방법.
제1항에 있어서, 부분 성숙된 수지상 세포가 이 세포가 종양이나 종양 보유 기관으로 전달되도록 순환계로 투여되는 항종양 면역반응 형성방법.
제1항에 있어서, 부분 성숙된 수지상 세포가 방사선 요법, 화학요법 또는 이의 배합 요법에 보조적으로 투여되는 항종양 면역반응 형성방법.
제19항에 있어서, 부분 성숙된 수지상 세포가 방사선요법, 화학요법 또는 이의 배합 요법 전이나 동시에 또는 후속적으로 투여되는 항종양 면역반응 형성방법.
수지상 세포 성숙 제제의 존재하에 시험관내에서 부분 성숙된 수지상 세포를 생체내 투여용 약제학적으로 허용되는 담체와 배합되어 포함하는 조성물.
제21항에 있어서, 부분 성숙된 수지상 세포가 보조자극성 분자 CD80, CD86 및/또는 CD54의 상승조절을 나타내고 항원을 흡수 및 가공하는 성질을 보유하는 조성물.
제21항에 있어서, 약 10² 내지 약 10¹⁰ 범위의 부분 성숙된 수지상 세포를 포함하는 조성물.
제21항에 있어서, 부분 성숙된 수지상 세포가 부분 성숙 이후 동결보존된 조성물.
제21항에 있어서, 부분 성숙된 수지상 세포가 이 세포가 투여되어야 하는 환자로부터 분리된 조성물.
제21항에 있어서, 부분 성숙된 수지상 세포가 이 세포가 투여되어야 하는 개체와 HLA 부합성인 조성물.
제21항에 있어서, 부분 성숙된 수지상 세포가 종양 내로 직접 투여되는 조성물.
제21항에 있어서, 부분 성숙된 수지상 세포가 종양이 수술 제거 또는 절제된 후 종양 베드로 투여되는 조성물.
제21항에 있어서, 부분 성숙된 수지상 세포가 종양 주위의 조직 구역으로 투여되는 조성물.
제21항에 있어서, 부분 성숙된 수지상 세포가 종양 구역을 직접 고갈시키는 림프절로 투여되는 조성물.
제21항에 있어서, 부분 성숙된 수지상 세포가 혈액이나 림프를 종양, 종양 베드 또는 종양 보유 기관으로 전달하는 순환 혈관으로 직접 투여되는 조성물.
제21항에 있어서, 부분 성숙된 수지상 세포가, 이 세포가 종양, 종양 베드, 또는 종양 보유 기관으로 전달되도록 순환계로 투여되는 조성물.