RU2678083C2

RU2678083C2 - Терапия и способ внутриопухолевого введения цитотоксического т-лимфоцита и/или nkt-клетки с антителом против tnf и/или антителом против il-10

Info

Publication number: RU2678083C2
Application number: RU2016102172A
Authority: RU
Inventors: Кенитиро ХАСУМИ
Original assignee: Кенитиро Хасуми
Priority date: 2012-06-27
Filing date: 2013-06-27
Publication date: 2019-01-23
Also published as: US8961957B2; GB2534478A; GB201601559D0; RU2016102172A; HK1226099A1; WO2014004809A3; EP3033417A4; EP3033417A2; SG11201510552WA; EP3033417B1; WO2014004809A2; US20140004126A1

Abstract

Группа изобретений относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использована для лечения злокачественных опухолей. Способы по изобретению включают получение и введение внутрь опухоли незрелых дендритных клеток, после этого введение внутрь опухоли цитотоксических T-лимфоцитов и/или NKT-клеток и антитела против TNF и/или антитела против IL-10. Использование изобретений позволяет добиться регрессии, снижения или элиминации опухолевых клеток в опухолевой ткани пациентов. 3 н. и 14 з.п. ф-лы, 4 табл., 4 ил., 4 пр.

Description

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Для настоящей заявки испрашивается приоритет, в соответствии с 35 U.S.C., раздел 119(e), по предварительной заявке 61/664998, озаглавленной «Терапия и способ внутриопухолевого введения цитотоксического T-лимфоцита и/или NKT-клетки с антителом против TNF и/или антителом против IL-10», зарегистрированной 27 июня 2012 года.

Область изобретения

[0001] Изобретение относится к внутриопухолевой терапии и способам применения терапии для лечения пациента со злокачественной опухолью. Изобретение предусматривает введение цитотоксических T-лимфоцитов и/или естественных киллерных T (NKT)-клеток с антителом против фактора некроза опухоли (антителом против TNF) и/или антителом против IL-10 в опухолевую ткань пациента.

Описание известного уровня техники

[0002] Цитотоксические T-лимфоциты являются важным компонентом клеточного иммунитета. Они играют ключевую роль в борьбе со многими инфекциями и злокачественными опухолями. Эти T-клетки отвечают за "выслеживание" других клеток организма, которые являются инфицированными вирусами или содержащими злокачественную клетку, и разрушают их. Например, когда вирус или злокачественная опухоль использует клетку для размножения, клетка предоставляет некоторые белки вирусов или компоненты злокачественной опухоли на своей поверхности. Цитотоксические T-клетки могут распознавать такие белки или компоненты и специализироваться на разрушении инфицированных или содержащих злокачественную опухоль клеток до того, как они могут высвобождать новую инфекцию или злокачественную опухоль в кровоток. Многие вакцины являются эффективными по меньшей мере частично в результате стимуляции активации или ответа этого типа T-клеток. Цитотоксические T-клетки также могут образовывать химические соединения, известные как цитокины, которые содействуют координации того, как иммунная система активируется против заболевания.

[0003] NKT-клетки представляют собой гетерогенную группу T-клеток, которые обладают свойствами как T-клеток, так и естественных киллерных клеток.

[0004] Фактор некроза опухоли (TNF) представляет собой цитокин, который циркулирует во всем организме. TNF является очень важным для эффективного иммунного надзора и является необходимым для правильной пролиферации и функции естественных киллерных клеток, T-клеток, B-клеток, макрофагов и дендритных клеток. Первичная роль TNF заключается в регуляции иммунных клеток. Известно, что TNF может вызывать системное воспаление, которое может приводить к различным хроническим состояниям. Антитела против TNF, также известные как блокаторы или ингибиторы TNF, препятствуют продукции TNF в организме.

[0005] В данной области существует необходимость в разработке терапии и способов применения указанной терапии для регрессии, снижения или элиминации опухолевых клеток в опухолевой ткани пациентов. Желательным является, чтобы терапия и способы применения являлись эффективными в течение приемлемого периода времени, и дополнительно желательным является, чтобы терапия и способы применения являлись настолько минимально инвазивными для пациентов, насколько это разумно возможно. Кроме того, предпочтительным является, если терапия и способы являются эффективными без подвергания пациента лучевой терапии.

Сущность изобретения

[0006] Изобретение преодолевает указанную выше необходимость путем предоставления эффективной терапии и способов регрессии, снижения или элиминации опухолевых клеток в локальной опухолевой ткани пациента и опухолевых клеток в метастазирующих опухолях. В одном из аспектов изобретение относится к способу, который включает сбор моноцитарных клеток от пациента, культивирование моноцитарных клеток с получением незрелых дендритных клеток, введение внутрь опухоли терапевтически эффективного количества незрелых дендритных клеток пациенту, сбор цитотоксических T-лимфоцитов и/или NKT-клеток от пациента, введение внутрь опухоли терапевтически эффективного количества цитотоксических T-лимфоцитов и/или NKT-клеток пациенту и введение внутрь опухоли терапевтически эффективного количества антител против TNF и/или антител против IL-10 пациенту.

[0007] Цитотоксические T-лимфоциты и/или NKT-клетки можно культивировать в среде, содержащей IL-2 и CD3.

[0008] Введение внутрь опухоли антитела против TNF и/или антитела против IL-10 можно проводить до или после, или одновременно с введением внутрь опухоли цитотоксических T-лимфоцитов и/или NKT-клеток.

[0009] Способ может дополнительно включать введение пациенту лекарственного средства, выбранного из группы, состоящей из химиотерапии, лучевой терапии, терапии антителами и их сочетаний.

[0010] В другом аспекте изобретение относится к способу, включающему внутриопухолевое введение терапевтически эффективного количества незрелых дендритных клеток в опухолевую ткань, внутриопухолевое введение терапевтически эффективного количества цитотоксических T-лимфоцитов и/или NKT-клеток в опухолевую ткань и внутриопухолевое введение терапевтически эффективного количества антитела против TNF и/или антитела против IL-10 в опухолевую ткань.

[0011] Терапевтически эффективное количество цитотоксических T-лимфоцитов и/или NKT-клеток можно индуцировать введением незрелых дендритных клеток.

Краткое описание чертежей

[0012] Дополнительное понимание изобретения можно получить из следующего ниже описания предпочтительных вариантов осуществления при чтении в сочетании с сопровождающими чертежами, где:

[0013] фигура 1 представляет собой радиоизотопное изображение левых ребер 7 и 10, демонстрирующее опухолевую ткань до и после терапии в соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения;

[0014] фигура 2 представляет собой радиоизотопное изображение Th10, L1, левой подвздошной кости, левого ребра 6, правой бедренной кости, левого ребра 10, Th12, L3 и правой подвздошной кости, демонстрирующее опухолевую ткань до и после терапии в соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения;

[0015] фигура 3 представляет собой радиоизотопное изображение левого ребра 2, демонстрирующее опухолевую ткань до и после терапии в соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения, и

[0016] фигура 4 представляет собой радиоизотопное изображение левого ребра 3, демонстрирующее опухолевую ткань до и после терапии в соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения.

Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления

[0017] Как используют в настоящем описании, "пациент(ы)" включает млекопитающего(их), которое включает человека(людей).

[0018] Как используют в настоящем описании, термин "терапевтически эффективное количество" относится к такому количеству цитотоксических T-лимфоцитов, NKT-клеток, антител против TNF, антител против IL-10, незрелых дендритных клеток, противовоспалительного средства, адъюванта, химиотерапии, лучевой терапии, терапии антителом или их сочетаний, которое необходимо для получения желаемого эффекта у человека или другого млекопитающего. Во всех возможных случаях на самом базовом уровне желаемое действие представляет собой регрессию, снижение или элиминацию опухолевых клеток в опухолевой ткани пациента по сравнению с опухолевыми клетками в опухолевой ткани пациента до применения способов терапии по изобретению.

[0019] Как используют в настоящем описании, термин "внутриопухолевая терапия" относится к терапии, которая включает введение (например, инъекцию) цитотоксических T-лимфоцитов и/или NKT-клеток с антителом против TNF и/или антителом против IL-10 и, необязательно, противовоспалительного средства, и/или незрелых дендритных клеток и, необязательно, адъюванта непосредственно в опухолевую ткань пациента (человека или животного). Антитело против TNF и/или антитело против IL-10 можно вводить внутрь опухоли до, одновременно или после внутриопухолевого введения цитотоксических T-лимфоцитов и/или NKT-клеток. Кроме того, цитотоксические T-лимфоциты и/или NKT-клетки можно необязательно вводить в сочетании с противовоспалительным средством и незрелые дендритные клетки можно, необязательно, вводить в сочетании с адъювантом. Комбинация цитотоксических T-лимфоцитов и/или NKT-клеток с антителами против TNF и/или антителами против IL-10 и необязательными идентифицированными соединениями, является эффективной в опухолевой ткани для регрессии, снижения и/или элиминации опухолевых клеток.

[0020] В основном изобретение относится к комбинации незрелых дендритных клеток, цитотоксических T-лимфоцитов и/или NKT-клеток с антителом против TNF и/или антителом против IL-10 и внутриопухолевому (например, непосредственному) введению в опухолевую ткань, включая опухолевую ткань, образованную метастазами, пациента.

[0021] Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, полагают, что внутриопухолевая инъекция незрелых дендритных клеток пациенту приводит к индукции цитотоксических T-лимфоцитов и/или NKT-клеток. Это означает, что цитотоксические T-лимфоциты и/или NKT-клетки индуцируются как часть иммунного ответа, вызываемого внутриопухолевой инъекцией незрелых дендритных клеток. Такой иммунный ответ может способствовать реакции TNF, которая в свою очередь может индуцировать воспаление в месте локализации опухоли и прогрессирование роста опухоли. Таким образом, антитела против TNF и/или антитела против IL-10 можно комбинировать (например, совместно вводить или совместно инъецировать) с цитотоксическими T-лимфоцитами и/или NKT-клетками для ингибирования такого воспаления.

[0022] Кроме того, не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, полагают, что цитотоксические T-лимфоциты и/или NKT-клетки, индуцированные естественным образом как часть аутоиммунного ответа, как описано выше, могут являться неэффективными против опухолей, особенно когда опухоли находятся на поздней стадии или являются агрессивно растущими. Причины могут заключаться в том, что такие цитотоксические T-лимфоциты и/или NKT-клетки не индуцируются с соответствующим качеством и/или в соответствующем количестве, и/или таким образом, чтобы своевременно защищать организм пациента от инвазии опухоли. Выявлено, что внутриопухолевая инъекция незрелых дендритных клеток может положительным образом способствовать иммунному ответу для индукции цитотоксических T-лимфоцитов и/или NKT-клеток, обладающих улучшенным качеством, повышенным количеством, и своевременным образом. Однако в дополнение к содействию иммунному ответу внутриопухолевая инъекция незрелых дендритных клеток также может индуцировать уровень TNF в кровотоке пациента и увеличивать воспаление в месте(ах) локализации опухоли, которое может препятствовать иммунному ответу цитотоксических T-лимфоцитов и/или NKT-клеток.

[0023] Антитело против TNF является эффективным для подавления системного воспаления, вызываемого TNF, и цитотоксические T-лимфоциты и/или NKT-клетки не являются ограниченными в своей иммунологической функции подавлением воспаления.

[0024] Таким образом, целью изобретения является предоставление соответствующего количества и качества цитотоксических T-лимфоцитов и/или NKT-клеток в организме пациента и в частности в месте(ах) локализации опухоли для регрессии, снижения или элиминации опухолевых клеток. Кроме того, эти клетки комбинируют с антителом против TNF и/или антителом против IL-10 для ингибирования возможного воспаления в месте(ах) локализации опухоли. Предусмотрено, что количество и качество природных цитотоксических T-лимфоцитов и/или NKT-клеток (т.е. индуцированных внутриопухолевым введением незрелых дендритных клеток пациенту) может являться достаточным (например, терапевтически эффективным количеством) для выполнения этой задачи. Кроме того, также предусмотрено, что количество и качество природных цитотоксических T-лимфоцитов и/или NKT-клеток может являться недостаточным, и, таким образом, изобретение относится к сбору природных цитотоксических T-лимфоцитов и/или NKT-клеток у пациента, необязательно, культивированию таких собранных клеток и их повторному введению в комбинации с антителом против TNF и/или антителом против IL-10 внутрь опухоли пациенту в количестве и качестве, которое является достаточными (например, терапевтически эффективным количеством) для регрессии, снижения или элиминации опухолевых клеток и для ингибирования воспаления в месте(ах) локализации опухоли.

[0025] В основном, антитело против TNF вводят, когда в аутоиммунной системе пациента присутствует достаточное количество цитотоксических T-лимфоцитов, таким образом, что иммунный ответ цитотоксических T-лимфоцитов поддерживается подавлением активности TNF.

[0026] Антитело против TNF может находиться в различных формах. Например, антитело против TNF можно вводить в механизм доставки, такой как жидкий носитель или среда, для облегчения введения (например, инъекции).

[0027] Таким образом, в определенных вариантах осуществления изобретение включает сбор моноцитарных клеток от пациента, культивирование собранных моноцитарных клеток в подходящей среде с получением незрелых дендритных клеток и введение внутрь опухоли терапевтически эффективного количества незрелых дендритных клеток пациенту. Кроме того, после внутриопухолевого введения незрелых дендритных клеток у пациента собирают цитотоксические T-лимфоциты и/или NKT-клетки, культивируют в подходящей среде и объединяют с антителом против TNF и/или антителом против IL-10 для внутриопухолевого введения пациенту в терапевтически эффективном количестве. Антитело против TNF и/или антитело против IL-10 можно вводить внутрь опухоли до, одновременно или после внутриопухолевого введения культивированных цитотоксических T-лимфоцитов и/или NKT-клеток. Изобретение является эффективным для вызывания регрессии, снижения или элиминации опухолевых клеток у пациента. Кроме того, в определенных вариантах осуществления это можно проводить без лучевой терапии.

[0028] Как указано в настоящем описании, изобретение включает комбинацию цитотоксических T-лимфоцитов и/или NKT-клеток с антителом против TNF и/или антителом против IL-10 в опухолевой ткани. В определенных вариантах осуществления цитотоксический T-лимфоцит включает популяцию T-клеток CD8+NKn. Цитотоксические T-лимфоциты и NKT-клетки продуцируются у пациента, и их можно повторно вводить одному и тому же пациенту. Аналогично, моноцитарные клетки продуцируются у пациента, и их повторно вводит в виде незрелых дендритных клеток одному и тому же пациенту. В определенных вариантах осуществления внутриопухолевое введение дендритных клеток, цитотоксических T-лимфоцитов и/или NKT-клеток, и антитела против TNF и/или против IL-10 проводят посредством инъекции пациенту.

[0029] В определенных вариантах осуществления изобретение представляет собой инициированную человеком терапевтическую вакцину с цитотоксическими T-лимфоцитами и/или NKT-клетками в комбинации с антителом против TNF и/или антителом против IL-10.

[0030] Цитотоксические T-лимфоциты и/или NKT-клетки, собираемые от пациента, можно культивировать в среде, выбранной из сред, которые являются известными в данной области. В определенных вариантах осуществления среда содержит IL-2, CD3 или их смеси.

[0031] В определенных вариантах осуществления цитотоксические T-лимфоциты и/или NKT-клетки можно вводить пациенту в сочетании с противовоспалительным средством. Подходящие противовоспалительные средства могут содержать средства, которые являются известными в данной области. Цитотоксические T-лимфоциты и/или NKT-клетки, и противовоспалительное средство можно комбинировать с получением композиции и композицию можно вводить внутрь опухоли пациенту.

[0032] В определенных вариантах осуществления изобретение может необязательно предусматривать предшествующее лечение. Перед введением пациенту (например, путем сбора и культивирования цитотоксических T-лимфоцитов и/или NKT-клеток и повторного введения) внутрь опухоли цитотоксических T-лимфоцитов и/или NKT-клеток пациенту можно проводить лечение, выбранное из химиотерапии, лучевой терапии, терапии антителом и их сочетания. Схемы лечения химиотерапии, лучевой терапии и терапии антителом хорошо известны в данной области, и эти известные схемы лечения являются пригодными для использования в изобретении.

[0033] Необязательно предусматривают, что использование химиотерапии, лучевой терапии, терапии антителом и их сочетаний можно проводить в различные другие моменты времени на всем протяжении способа по изобретению.

[0034] Кроме того, в определенных вариантах осуществления предусмотрено, что терапия по изобретению не предусматривает использования лучевой терапии. Таким образом, терапия по изобретению может являться эффективной для регрессии, снижения или элиминации опухолевой ткани у пациента при отсутствии лучевой терапии.

[0035] В определенных вариантах осуществления изобретение может включать этапы лечения: внутриопухолевого введения незрелых дендритных клеток в терапевтически эффективном количестве в опухолевую ткань пациента; сбор у пациента цитотоксических T-лимфоцитов и/или NKT-клеток, индуцированных введением незрелых дендритных клеток; повторного введения собираемых цитотоксических T-лимфоцитом и/или NKT-клеток в опухолевую ткань того же пациента и введения внутрь опухоли антитела против TNF и/или антитела против IL-10 пациенту. Внутриопухолевое введение незрелых дендритных клеток является необходимым условием для внутриопухолевого введения цитотоксических T-лимфоцитов и/или NKT-клеток с антителом против TNF и/или антителом против IL-10 для индукции природных цитотоксических T-лимфоцитов и/или NKT-клеток.

[0036] В определенных вариантах осуществления индукция цитотоксических T-лимфоцитов и/или NKT-клеток незрелыми дендритными клетками является достаточной (например, терапевтически эффективным количеством), таким образом, что природные цитотоксические T-лимфоциты и/или NKT-клетки не извлекают у пациента и не вводят повторно. Таким образом, антитело против TNF и/или антитело против IL-10 можно вводить внутрь опухоли для ингибирования воспаления при отсутствии внутриопухолевого введения цитотоксических T-лимфоцитов и/или NKT-клеток. Это означает, что внутриопухолевое введение незрелых дендритных клеток можно проводить в комбинации с внутриопухолевым введением антитела против TNF и/или антитела против IL-10.

[0037] В определенных вариантах осуществления изобретение может включать этапы лечения: внутриопухолевого введения незрелых дендритных клеток в терапевтически эффективном количестве в опухолевую ткань пациента; индукции терапевтически эффективного количества цитотоксических T-лимфоцитов и/или NKT-клеток в опухолевой ткани пациента и введения внутрь опухоли антитела против TNF и/или антитела против IL-10 пациенту. Внутриопухолевое введение незрелых дендритных клеток является необходимым условием для индукции цитотоксических T-лимфоцитов и/или NKT-клеток и внутриопухолевого введения антитела против TNF и/или антитела против IL-10.

[0038] Моноцитарные клетки, собираемые от пациента, культивируют в среде, такой как, но, не ограничиваясь ими, IL-4 и GM-CFS. Незрелые дендритные клетки вводят внутрь опухоли пациенту. В определенных вариантах осуществления незрелые дендритные клетки можно вводить в сочетании с адъювантом. Незрелые дендритные клетки и адъювант можно комбинировать с получением композиции и композицию можно вводить внутрь опухоли пациенту.

[0039] Подходящие адъюванты для применения в изобретение могут включать без ограничения адъюванты на основе липидов, белков и полисахаридов, такие как среды для культивирования лимфоцитов, Marignase, Agaricus, OK432, BCG, Lentinan (шиитаке), Reishi, Sarunokoshikake, TNF Meshimakobu, полный или неполный адъювант Фрейнда, LPS, жирные кислоты, TW80, фосфолипиды, цитокины или вирус. В определенных вариантах осуществления адъювант может представлять собой адъювант среды для культивирования лейкоцитов (LCM). Адъювант LCM может содержать по меньшей мере три цитокина, выбранных из группы, состоящей из эотаксина, FGF, G-CSF, GM-CSF, IFNγ, IP10, ILβ, IL1ra, IL2, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IL12, IL13, IL15, IL17, MCP1, MIP1α, MIP1β, PDGFbb, RANTES, TNFα и VEGF.

[0040] В определенных вариантах осуществления терапия по изобретению включает следующие ниже этапы:

[0041] Этап 1: сбор моноцитарных клеток от пациента;

[0042] Этап 2: культивирование моноцитарных клеток, собираемых от пациента, с получением незрелых дендритных клеток;

[0043] Этап 3: внутриопухолевого введения незрелых дендритных клеток тому же пациенту;

[0044] Этап 4: культивирования цитотоксических T-лимфоцитов и/или NKT-клеток (индуцированных незрелыми дендритными клетками) от того же пациента;

[0045] Этап 5: культивирования цитотоксических T-лимфоцитов и/или NKT-клеток, собираемых от пациента;

[0046] Этап 6: внутриопухолевого введения, например, инъекции в терапевтически эффективном количестве культивируемых цитотоксических T-лимфоцитов и/или NKT-клеток пациенту. Цитотоксические T-лимфоциты и NKT-клетки можно вводить совместно (например, в смеси или композиции) или цитотоксические T-лимфоциты можно вводить раздельно с NKT-клетками.

[0047] Этап 7: внутриопухолевого введения, например, инъекции, в терапевтически эффективном количестве антитела против TNF и/или антитела против IL-10 пациенту. Антитело против TNF и антитело против IL-10 можно вводить совместно (например, в смеси композиции) или вводить раздельно.

[0048] В определенных вариантах осуществления этапы 6 и 7 можно комбинировать, таким образом, что культивируемые цитотоксические T-лимфоциты и/или NKT-клетки объединяют с антителом против TNF и/или антителом против IL-10 в смеси композиции.

[0049] Допустимое время для перехода между этапами может изменяться. Например, период времени между введением незрелых дендритных клеток пациенту и введением культивируемых цитотоксических T-лимфоцитов и/или NKT-клеток одному и тому же пациенту может составлять несколько часов или суток, недель или месяцев. Кроме того, например, этапы 6 и 7 можно проводить в течение относительно короткого периода времени или их можно проводить одновременно (например, одномоментно).

[0050] В соответствии с этапом 5 среду для культивирования можно выбирать из сред, известных в данной области, и она может содержать IL-2, CD3 и их смеси. В определенных вариантах осуществления этап 6 можно проводить с использованием противовоспалительного средства в дополнение к культивируемым цитотоксическим T-лимфоцитам и/или NKT-клеткам. Цитотоксические T-лимфоциты и/или NKT-клетки и противовоспалительное средство можно комбинировать с получением композиции и композицию можно вводить внутрь опухоли пациенту. Противовоспалительное средство можно выбирать из известных в данной области противовоспалительных средств.

[0051] Как описано выше, этапы 1, 2 и 3 являются необходимыми этапами для индукции цитотоксических T-лимфоцитов и/или NKT-клеток у пациента.

[0052] Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, полагают, что цитотоксический T-лимфоцит, NKT-клетки и незрелые дендритные клетки (образуемые из моноцитарных клеток), которые продуцируются у пациента и которые собирают от пациента, обеспечивают усиленный желаемый эффект при инъекции тому же пациенту по сравнению с цитотоксическим T-лимфоцитом, NKT-клетками и незрелыми дендритными клетками, продуцируемыми и получаемыми другими средствами. Например, по-видимому, собственные цитотоксический T-лимфоцит, NKT-клетки пациента, которые собирали, культивировали и повторно водили внутрь опухоли, обеспечивают улучшенное сопряжение или взаимодействие с цитотоксическими T-лимфоцитами и NKT-клетками в организме пациента.

[0053] В определенных вариантах осуществления изобретение относится к регрессии, снижению или элиминации опухолевых клеток в опухолевой ткани, которую можно визуально детектировать MRI и/или, CT и/или эхо-сканированием, и/или радиоактивным изотопом.

[0054] Изобретение более конкретно описано в следующих ниже неограничивающих примерах, которые предназначены только иллюстрировать, т.к. различные модификации и изменения в нем будут очевидны специалистам в данной области.

Примеры

Пример 1

[0055] У пациента мужского пола в возрасте 71 года проводили MRI и диагностировали у пациента рак предстательной железы IV стадии и множественные костные метастазы. Пациент страдал злокачественной опухолью на поздней стадии и прогрессирующим заболеванием, которое не реагировало на общепринятые стандартные виды терапии. Для сбора моноцитарных клеток от пациента пациенту проводили аферез. Моноцитарные клетки культивировали с IL4 и GM-CFS. Это приводило к продукции незрелых дендритных клеток. Получали смесь, содержащую приблизительно от 107 до 108 незрелых дендритных клеток и приблизительно от 1,0 до 2,0 мг LCMadj, для получения 10% концентрации в нормальном физиологическом растворе. В зависимости от размера опухоли инъецировали от 2,0 до 5,0 см3 нормального физиологического раствора во множественные очаги опухоли пациента. Пациенту также проводили лучевую терапию и последующую внутриопухолевую инъекцию смеси, содержащей незрелые дендритные клетки и LCMadj.

[0056] Для сбора клеток CTL от пациента пациенту проводили аферез. Культивировали клетки CTL и получали смесь, содержащую от 10×108 до 30×108 культивируемых клеток CTL и от 12,5 мг до 50,0 мг антитела против TNF. Смесь инъецировали во множественные очаги опухоли пациента. Подробный протокол представлен в таблице 1.

[0057] Пациента оценивали по анализу изображений RI. Для четырех обрабатываемых опухолей пациента демонстрировали полную реакцию (CR), для двух обрабатываемых опухолей демонстрировали частичную реакцию (PR) и для всех других обрабатываемых очагов демонстрировали стабильное заболевание (SD). CR определяют как снижение маркеров в сыворотке до нормальных уровней и полное исчезновение всех измеримых очагов. PR определяют как 30% уменьшение размера опухоли, в которую вводили инъекции, снижение уровня маркеров в сыворотке, отсутствие увеличения размера опухоли в других метастатических очагах или появления новых метастазов. SD определяют как демонстрацию менее чем 20% увеличения размера опухоли и менее чем 30% уменьшения размера опухоли при отсутствии повышения уровня опухолевых маркеров в сыворотке.

[0058] На фиг. 1 представлены изображения RI левого ребра 7 и 10 до (например, до инъекции смеси CTL и антител против TNF, как описано выше) и после (например, после инъекции смеси CTL и антител против TNF, как описано выше). Эти обрабатываемые опухоли представляли собой две из четырех обрабатываемых опухолей пациента, для которых демонстрировали полную реакцию.

Пример 2

[0059] У пациента мужского пола в возрасте 74 года диагностировали рак предстательной железы III стадии и множественные костные метастазы. Пациент страдал злокачественной опухолью на поздней стадии и прогрессирующим заболеванием, которое не реагировало на общепринятые стандартные виды терапии. Для сбора моноцитарных клеток от пациента пациенту проводили аферез. Моноцитарные клетки культивировали в IL4 и GM-CFS. Это приводило к продукции незрелых дендритных клеток. Получали смесь, содержащую приблизительно от 107 до 108 незрелых дендритных клеток и приблизительно от 1,0 до 2,0 мг LCMadj, для получения 10% концентрации в нормальном физиологическом растворе. В зависимости от размера опухоли инъецировали от 2,0 до 5,0 см3 нормального физиологического раствора во множественные очаги опухоли пациента. Пациенту также проводили лучевую терапию и последующую внутриопухолевую инъекцию смеси, содержащей незрелые дендритные клетки и LCMadj.

[0060] Для сбора клеток CTL клетки от пациента пациенту проводили аферез. Культивировали клетки CTL и получали смесь, содержащую 30×108 культивируемых клеток CTL и 37,5 мг антитела против TNF. Смесь инъецировали во множественные очаги опухоли пациента, включая крестец, Th7, Th10, Th12, LI, L3, правую подвздошную кость, левую подвздошную кость, левое ребро 6(1)(2), левое ребро 10 и правую бедренную кость. Подробный протокол представлен в таблице 2.

[0061] Пациента оценивали по анализу изображений RI. Для трех обрабатываемых опухолей пациента демонстрировали PR (как определено выше) и для оставшихся обрабатываемых опухолей демонстрировали CR (как определено выше).

[0062] На фиг. 2 представлены изображения RI Th10, L1 и левой подвздошной кости до (например, до инъекции смеси CTL и антитела против TNF, как описано выше) и после (например, после инъекции смеси CTL и антитела против TNF, как описано выше). Эти обрабатываемые опухоли представляли собой три обрабатываемые опухоли пациента, для которых демонстрировали PR. Кроме того, на фиг. 2 представлены изображения RI до проведения лечения левого ребра 6, правой бедренной кости, левого ребра 10, Th12, L3 и правой подвздошной кости. Они представляют собой обрабатываемые опухоли, для которых демонстрировали CR.

Пример 3

[0063] У пациента женского пола в возрасте 51 год диагностировали рак молочной железы IV стадии и метастазы в лимфатическом узле левой подмышечной впадины. Пациент страдал злокачественной опухолью на поздней стадии и прогрессирующим заболеванием, которое не реагировало на общепринятые стандартные виды терапии. Для сбора моноцитарных клеток от пациента пациенту проводили аферез. Моноцитарные клетки культивировали с IL4 и GM-CFS. Это приводило к продукции незрелых дендритных клеток. Получали смесь, содержащую приблизительно от 107 до 108 незрелых дендритных клеток и приблизительно от 1,0 до 2,0 мг LCMadj, для получения 10% концентрации в нормальном физиологическом растворе. В зависимости от размера опухоли инъецировали от 2,0 до 5,0 см³ нормального физиологического раствора во множественные очаги опухоли пациента. Пациенту также проводили лучевую терапию и последующие внутриопухолевые инъекции незрелых дендритных клеток и LCMadj в комбинации с 25,0 мг антитела против TNF. Подробный протокол представлен в таблице 3.

[0064] Пациента оценивали по анализу изображения RI. Для обрабатываемых опухолей пациента демонстрировали PR и CR.

[0065] На фиг. 3 представлены изображения RI до и после (PR и CR) левого ребра 2.

Пример 4

[0066] У пациента женского пола в возрасте 79 лет диагностировали рак легких II стадии и метастазы в головном мозге. Пациент страдал злокачественной опухолью на поздней стадии и прогрессирующим заболеванием, которое не реагировало на общепринятые стандартные виды терапии. Для сбора моноцитарных клеток от пациента пациенту проводили аферез. Моноцитарные клетки культивировали с IL4 и GM-CFS. Это приводило к продукции незрелых дендритных клеток. Получали смесь, содержащую приблизительно от 107 до 108 незрелых дендритных клеток и приблизительно от 1,0 до 2,0 мг LCMadj, для получения 10% концентрации в нормальном физиологическом растворе. В зависимости от размера опухоли инъецировали от 2,0 до 5,0 см3 нормального физиологического раствора во множественные очаги опухоли пациента. Пациенту также проводили лучевую терапию и последующую внутриопухолевую инъекцию смеси, содержащей незрелые дендритные клетки и LCMadj.

[0067] Для сбора клеток CTL от пациента пациенту проводили аферез. Клетки CTL культивировали и получали смесь, содержащую от 10×108 до 40×108 культивируемых клеток CTL и 12,5 мг до 25,0 мг антитела против TNF. Смесь инъецировали во множественные очаги опухоли пациента. Подробный протокол представлен в таблице 4.

[0068] Пациента оценивали по анализу изображений RI. Для обрабатываемых опухолей пациента демонстрировали CR.

[0069] На фиг. 4 представлены изображения RI левого ребра 3 до и после лечения. Для этой обрабатываемой опухоли демонстрировали полную реакцию.

[0070] Специалистам в данной области понятно, что в описанных выше вариантах осуществления можно проводить изменения, не выходя за границы идеи изобретения. Таким образом, следует понимать, что настоящее изобретение не ограничено описанными конкретными вариантами осуществления, а предназначено включать модификации, которые входят в рамки сущности и объема изобретения, как определено прилагаемой формулой изобретения.

ТАБЛИЦА 1 Протокол HITV и CTL-II (внутриопухолевая) Рак предстательной железы (IV стадия), множественные костные метастазы (№0442, 71 год, мужской пол)
2007/02	MRI выявляли рак предстательной железы, костный метастаз Эндокринная терапия: лейплин/касодекс
2007/09	MRE CR (поджелудочная железа), PR (костный метастаз)
2008/11	Rec.
2009/09	Пептид DC, витамин C и озоновая терапия
2010/01	MRE диффузные метастазы в тазе
2010/02	IMRT предстательной железы+метастазы таза
2010/03	MRE множественные костные метастазы
2010/03/25	IMRT: 48,3 Гр/20 фрак./21 сут (первичный, SV, двухсторонний паховый лимфатический узел) 56,2Гр/20F/21 сут (другие костные метастазы)
2010/04/04	Аферез
2010/04/29	Инъекция DC в 20 мест локализации
2010/06/01	Инъекция DC в 30 мест локализации
2010/06/07	IMRT: 40,0 Гр/10 фрак./12 сут
2010/08/06	MRE CR (предстательная железа) PR (грудной отдел позвоночника) Rec. (многие кости)
2010/10/26	RI: Rec. (многие кости)
2010/11/15	IMRT: 26,26 Гр/12 фрак./19 сут (множественные костные метастазы)
2010/12/01	IMRT: 30,00 Гр/5 фрак./9 сут (правая седалищная кость, двухсторонняя бедренная кость)

Таблица 1 (продолжение) Протокол HITV и CTL-II (внутриопухолевая) Рак предстательной железы (IV стадия), множественные костные метастазы (№0442, 71 год, мужской пол)
2010/12/15	Инъекция DC в 21 место локализации
2011/04/21	RI: PR (поясничный~тазовый) PD (шейный~грудной)
2011/07/22	RI: SD (костные метастазы в целом)
2011/12/09	Аферез CTL
2011/12/09	CTL (25,0×10*8) с антителом против TNF 25,0 мг (L4/L5)
2012/01/13	CTL (25,0×10*8) с антителом против TNF 25,0 мг (L3/левая подвздошная кость)
2012/02/03	RI: CR (L4/L3) PR (L5/левая подвздошная кость) Необрабатываемая резидуальная опухоль (левое ребро 7 и 10, грудина)
2012/03/28	CTL (20,0×10*8) с антителом против TNF 25,0 мг (левое ребро 7 и 10, грудина)
2012/05/11	RI: PR (левое ребро 7 и 10) SD (грудина)
2012/05/17	Аферез CTL
2012/06/21	CTL (10,0×10*8) с антителом против TNF 12,5 мг (левое ребро 7)
2012/07/19	Аферез CTL
2012/08/09	CTL (10,0×10*8) с антителом против TNF 12,5 мг (левое ребро 10)
2012/08/10	RI: CR (левое ребро 10 SD (левое ребро 7) Rec. (правая крестцовая кость)

Таблица 1 (продолжение) Протокол HITV и CTL-II (внутриопухолевая) Рак предстательной железы (IV стадия), множественные костные метастазы (№0442, 71 год, мужской пол)
2012/09/03	CTL (30,0×10*8) с антителом против TNF 37,5 мг (грудина/правая крестцовая кость/левая подвздошная кость)
2012/10/04	CTF (30,0×10*8) с антителом против TNF 37,5 мг (Th7/Th8/левое ребро 7)
2012/11/05	Аферез
2012/11/05	CTF (20,0×10*8) с антителом против TNF 50,0 мг (левое 5/правое L5/Th3/Th4)
2012/11/19	RI: CR (левое ребро 7) SD (другие обрабатываемые места локализации)
2012/12/03	DC с антителом против TNF 50,0 мг в каждое место локализации (правое ребро 1/грудина)
2013/01/08	DC с антителом против TNF 50,0 мг в каждое место локализации (Th3)
2013/02/05	DC с антителом против TNF 50,0 мг в каждое место локализации (левое L5/правое L5)

Таблица 2 Протокол HITV и CTL-II (внутриопухолевая) Рак предстательной железы (Rec.), множественные костные метастазы (№0611, 74 года, мужской пол)
2006/05	Рак предстательной железы (III стадия) Брахитерапия
2011/05/12	Сцинтиграфия костей выявила много костных метастазов
2011/05/23	Аферез
2011/06/03	Инъекция DC в 15 костных метастазов
2011/06/08	IMRT: 48,5 Гр/10 фрак./14 сут
2011/06/24	Инъекция DC
2011/07/22	Аферез
2011/08/05	RI: PR (все обрабатываемые места локализации)
2011/09/09	Начинали еженедельную CTL
2012/04/16	RI: всего SD-PR, новый очаг в крестцовой кости и th8
2012/05/30	Аферез
2012/05/30	CTL (30,0×108) с антителом против TNF 37,5 мг в th7, левую подвздошная кость, крестцовая кость
2013/01/24	RI: много костных метастазов
2013/02/08	DC с антителом против TNF 25,0 мг в каждое место локализации: th10, th12, L1, L3, правую подвздошную кость, левую подвздошную кость, левое ребро 6 1 2, левое ребро 10 и правую бедренную кость
2013/02/19	PET-CT: PR~CR, новый очаг C4

Таблица 3 Протокол HITV и CTL-II (внутриопухолевая) Рак молочной железы (IV стадия), метастаз в лимфоузле в подмышечной впадине (№0675, 51 год, женский пол)
2011/10/05	PET-CT: левая молочная железа поглощение FDG (отказ от операции)
2011/10/20	Биопсия: инвазивная протоковая карцинома
2011/10/27	Аферез
2011/12/01	Инъекция DC AT (6 раз)
2012/01/07	Лимфоузел в левой подмышечной впадине (отказ от операции)
2012/01/19	Аферез
2012/01/27	Инъекция DC в левую молочную железу (4 места локализации) и лимфоузел в левой подмышечной области (3 места локализации)
2012/02/06	IMRT: 48,32 Гр/20 фрак./30 сут (левая молочная железа полностью) 60,00 Гр/30 фрак./30 сут (первичная+лимфоузел в левой подмышечной области)
2012/03/09	Инъекция DC в левую молочную железу (2 места локализации) и лимфоузел в левой подмышечной области (4 места локализации)
2012/04/20	PET-CT: CR
2012/07/20	PET-CT: CR
2012/10/27	PET-CT: CR, но новый очаг (левое ребро 2)
2012/11/09	Инъекция DC в левое ребро 2 с антителом против TNF 25,0 мг
2012/11/26	Инъекция DC с антителом против TNF 25,0 мг
2012/12/27	PET-CT: PR
2013/02/14	PET-CT: CR

Таблица 4 Протокол HITV и CTL-II (внутриопухолевая) Рак легких (II стадия), метастаз в головном мозге (№0701, 79 лет, женский пол)
2011/08	Увеличение опухоли: операцию не проводят вследствие ее слабого состояния
2011/12/8	PET-CT: правое легкое первичный очаг S3, правое ребро 2, 3, лимфоузел правого корня легкого
2011/12/28	Аферез
2012/01/16	IMRT: 24,5 Гр/5 фрак./5 сут в первичный очаг S3 40,0 Гр/5 фрак./5 сут в ребра
2012/01/24	Инъекция DC в правый первичный очаг (3 места локализации), лимфоузел правого корня легкого, правое легкое 2 и 3
2012/03/06	PET-CT: PR (правый первичный очаг), CR (правый корень легкого и правые ребра) Новый очаг: правое легкое S5, левое легкое S4 и лимфоузел левого корня легкого
2012/03/14	Аферез
2012/04/26	CTL (40,0×10*8) с антителом против TNF 12,5 мг (правый первичный очаг S3, правая грудная полость)
2012/05/24	CTL (10,0×10*8) с антителом против TNF 25,0 мг (лимфоузел левого корня легкого)
2012/06/06	PET-CT: PR (первичный очаг S3), CR (левый корень легкого) и новый очаг в левом ребре 6
2012/06/13	CTL (10,0×10*8) с антителом против TNF 25,0 мг (левое ребро 6)
2012/09/03	PET-CT: PR (первичный очаг S3), CR (левое ребро 6,) новые очаги отсутствуют
2012/09/27	CTL (10,0×10*8) с антителом против TNF 25,0 мг (правый первичный очаг S3, лимфоузел правого корня легкого)
2012/12/03	PET-CT: оба PR, новый очаг в левом ребре 3
2013/01/22	Инъекция DC с антителом против TNF 25,0 мг в левое ребро 3
2013/03/04	PET-CT: CR

Claims

1. Способ регрессии, снижения или элиминации опухолевых клеток в опухолевой ткани пациента, включающий:

(a) сбор моноцитарных клеток от пациента;

(b) культивирование указанных моноцитарных клеток с получением незрелых дендритных клеток;

(c) введение внутрь опухоли терапевтически эффективного количества незрелых дендритных клеток указанному пациенту;

(d) после стадии (c), сбор цитотоксических T-лимфоцитов и/или NKT-клеток от указанного пациента; введение внутрь опухоли терапевтически эффективного количества цитотоксических T-лимфоцитов и/или NKT-клеток указанному пациенту;

(e) после стадии (d), повторное введение внутрь опухоли терапевтически эффективного количества указанных цитотоксических T-лимфоцитов и/или NKT-клеток от указанного пациента; и

(f) введение внутрь опухоли терапевтически эффективного количества антитела против TNF и/или антитела против IL-10 указанному пациенту.

2. Способ по п. 1, где культивируют собираемые цитотоксические T-лимфоциты и/или NKT-клетки.

3. Способ по п. 2, где культивирование проводят в среде, содержащей IL-2, CD3 и их смеси.

4. Способ по п. 1, где введение культивируемых цитотоксических T-лимфоцитов и/или NKT-клеток проводят в сочетании с противовоспалительным средством.

5. Способ по п. 4, где культивируемые цитотоксические T-лимфоциты и/или NKT-клетки объединяют с противовоспалительным средством с получением композиции.

6. Способ по п. 1, где пациент является человеком.

7. Способ по п. 1, где введение внутрь опухоли антитела против TNF и/или антитела против IL-10 проводят до повторного введения внутрь опухоли цитотоксических T-лимфоцитов и/или NKT-клеток.

8. Способ по п. 1, где введение внутрь опухоли антитела против TNF и/или антитела против IL-10 проводят после повторного введения внутрь опухоли цитотоксических T-лимфоцитов и/или NKT-клеток.

9. Способ по п. 1, где введение внутрь опухоли антитела против TNF и/или антитела против IL-10 проводят одновременно с повторным введением внутрь опухоли цитотоксических T-лимфоцитов и/или NKT-клеток.

10. Способ по п. 1, где цитотоксический T-лимфоцит представляет собой популяцию T-клеток CD8+NK.

11. Способ по п. 1, где лучевую терапию исключают.

12. Способ по п. 1, где пациенту проводят терапию, выбранную из группы, состоящей из химиотерапии, лучевой терапии, терапии антителом и их сочетаний.

13. Способ регрессии, снижения или элиминации опухолевых клеток в опухолевой ткани пациента, включающий:

(a) введение внутрь опухоли терапевтически эффективного количества незрелых дендритных клеток в опухолевую ткань;

(b) сбор цитотоксических T-лимфоцитов и/или NKT-клеток от указанного пациента;

(c) культивирование указанных цитотоксических T-лимфоцитов и/или NKT-клеток, собранных от указанного пациента, для получения культивированных цитотоксических T-лимфоцитов и/или NKT-клеток;

(d) объединение указанных культивированных цитотоксических T-лимфоцитов и/или NKT-клеток с терапевтически эффективным количеством антител против TNF и/или антител против IL-10 для получения смеси; и

(e) введение внутрь опухоли терапевтически эффективного количества указанной смеси указанному пациенту;

где стадию (а) проводят в качестве необходимого условия перед стадиями (b), (c), (d) и (e).

14. Способ по п. 13, дополнительно включающий:

сбор моноцитарных клеток от пациента и

культивирование моноцитарных клеток с получением незрелых дендритных клеток.

15. Способ по п. 13, где терапевтически эффективное количество цитотоксических T-лимфоцитов и/или NKT-клеток индуцируют введением незрелых дендритных клеток.

16. Способ регрессии, снижения или элиминации опухолевых клеток в опухолевой ткани пациента, включающий:

(a) сбор моноцитарных клеток от пациента;

(b) культивирование моноцитарных клеток с получением незрелых дендритных клеток;

(c) введение внутрь опухоли терапевтически эффективного количества незрелых дендритных клеток пациенту;

(d) сбор цитотоксических T-лимфоцитов и/или NKT-клеток от пациента;

(e) культивирование цитотоксических T-лимфоцитов и/или NKT-клеток с получением культивированных цитотоксических T-лимфоцитов и/или NKT-клеток;

(f) повторное введение внутрь опухоли терапевтически эффективного количества цитотоксических T-лимфоцитов и/или NKT-клеток пациенту; и

(g) введение внутрь опухоли терапевтически эффективного количества антитела против TNF и/или антитела против IL-10 пациенту,

где стадии (d), (e) и (f) последовательно проводят после проведения стадий (a), (b) и (c).

17. Способ по п. 16, где стадии (f) и (g) проводят одновременно.