DE60032622T2

DE60032622T2 - Zusammensetzung und verfahren zur krebs-antigen-immuntherapie

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Publication number: DE60032622T2
Application number: DE60032622T
Authority: DE
Inventors: Gary W. Kansas City Wood
Original assignee: TVAX Biomedical LLC
Current assignee: TVAX Biomedical LLC
Priority date: 1999-10-05
Filing date: 2000-10-05
Publication date: 2007-12-20
Anticipated expiration: 2020-10-06
Also published as: EP1225870A4; PT1225870E; CY1106400T1; EP1225870B1; DE60032622D1; ES2279772T3; US6406699B1; US20020006409A1; DK1225870T3; CA2388221C; CA2388221A1; WO2001024771A1; AU7856700A; EP1225870A1; ATE349198T1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
A. DAS IMMUNSYSTEM UND KREBS
Das Immunsystem der Säugetiere benützt zwei generelle adaptive Mechanismen, um den Körper gegen pathogene Umwelteinflüsse zu schützen. Der eine ist die nicht-spezifische (oder angeborene) Immunantwort. Der andere ist die spezifische oder erworbene (oder adaptive) Immunantwort. Angeborene Antworten sind grundsätzlich für jede Verletzung gleich. Im Gegensatz dazu sind adaptive Immunantworten auf das jeweilige Pathogen zugeschnitten.
Das Immunsystem erkennt und antwortet auf strukturelle Unterschiede zwischen eigenen und nicht eigenen Proteinen. Proteine, die das Immunsystem als nichteigene erkennt, werden "Antigene" genannt. Pathogene exprimieren große Anzahlen von hochkomplexen Antigenen. Das adaptive Immunsystem hat ein spezielles "Gedächtnis" für antigene Strukturen und wiederholtes Auftreten desselben Antigens erhöht die Antwort, welche das Level des induzierten Schuztes gegen dieses spezielle Pathogen erhöht.
Die adaptive Immunantwort wird durch spezialisierte Immunzellen, die B- und T-Lymphozyten vermittelt. B-Lymphozyten produzieren und führen ihre Funktion durch die Wirkungen von Antikörpern aus. Von B-Lymphozyten abhängige Immunantworten werden "humorale Immunität" genannt, da Antikörper in Körperflüssigkeiten detektiert werden können. Von T-Lymphozyten abhängige Immunantworten werden "zellvermittelte Immunität" genannt, da Effektoraktivitäten direkt mit dem lokalen Auftreten von Effektor-T-Lymphozyten in Zusammenhang steht. Die lokalen Wirkungen von Effektor-T-Lymphozyten werden durch synergetische Wechselwirkungen zwischen T-Lymphozyten und sekundären Effektorzellen, wie zum Beispiel aktivierten Makrophagen, verstärkt. Als Folge wird das Pathogen abgetötet und dadurch davon abgehalten, Krankheiten zu verursachen.
Krebsimmunität wird ausschließlich durch T-Lymphozyten vermittelt, was bedeutet, dass hier zellvermittelte adaptive Immunität eine Rolle spielt, aber nicht B-Lymphozyten oder Antikörper. Eine aktivierte zellvermittelte Immunantwort tötet Krebszellen und stößt Krebs ab.
Medizinische Eingriffe machen sich oft die Tatsache zu Nutze, dass die adaptive Immunantwort künstlich manipuliert werden kann. Individuen einem geschwäch ten Pathogen auszusetzen, induziert eine adaptive Immunantwort, ohne Krankheiten zu verursachen und beschützt das Individuum vor späterer Aussetzung durch dasselbe Pathogen. Der generelle Prozess künstlich protektive Immunantworten hervorzuführen, wird Impfung genannt. Protektive Immunität zu einem bestimmten pathogenen Wirkstoff kann von einem Individuum zu einem anderen durch T-Lymphozyten übertragen werden. Obwohl auch Krebsimmunität zwischen Individuen durch T-Lymphozyten übertragen werden kann, gibt es im Moment noch keinen akzeptierten medizinischen Eingriff, der Übertragung von T-Lymphozyten zwischen Individuen erlaubt.
Impfungen sind hauptsächlich zur Krankheitsvorbeugung sinnvoll. Impfungen wurden benutzt, um einen Schutz gegen eine große Bandbreite von Pathogenen aus der Umwelt, hauptsächlich Viren, zu induzieren. Der dramatische Erfolg, der mit Impfungen erzielt wurde, führte zu einer Suche nach therapeutischen Applikationen. Die Suche nach einer therapeutischen Aids-Impfung ist ein sehr bekanntes Beispiel. Unglücklicherweise stellte sich heraus, dass das Manipulieren des Immunsystems, um schon vorher vorhandene Krankheiten zu behandeln, viel schwieriger ist, als durch Manipulation des Immunsystems einen Schutz zu erzeugen. Der einzig gut dokumentierte Erfolg gegen eine menschliche Krankheit wurde bei Tollwut erzielt. Nach dem Kontakt mit dem Virus können mehrfache Impfungen Tollwut von der Ausbreitung abhalten. Das gleiche Grundprinzip wurde bei der Krebsbehandlung angewandt. Der Gedanke war, dass, da Krebs im Gegensatz zu Viren relativ langsam wächst, es möglich sein könnte, Impfungen zu verwenden, um das Wachstum zu verlangsamen, die Verbreitung oder weiteres Wachstum zu verhindern. Leider konnte nur ein sehr limitierter Erfolg mit Krebsimpfungen erzielt werden.
Es ist nicht nahe liegend, dass bösartige Tumore für Immunmanipulation empfänglich sind. Bösartige Zellen sind genetisch veränderte normale Zellen und keine fremden Pathogene. Das Immunsystem muss im Stande sein, bösartige Zellen als nicht eigene zu erkennen und es muss möglich sein, das Immunsystem so zu manipulieren, dass es Krebszellen, die möglicherweise über entfernte Körperstellen verteilt wurden, abzustoßen. Obwohl bösartige Zellen im eigentlichen Sinn keine fremden Pathogene sind, gibt es die weit verbreitete Meinung, dass man bösartige Zellen als nicht körpereigene Zellen ansehen kann. Krebsantigene werden erzeugt durch die genetischen Veränderungen, die die Krebszellen während der bösartigen Transformation und Progression durchlaufen. Siehe SRIVASTAVA, Do Human Cancers Express Shared Protective Antigens? Or the Necessity of Remembrance of Things Past, Semin. Immunol. 8:295–302 (1996). Dennoch ist das Ausmaß, in welchem das Immunsystem von Patienten mit fortgeschrittenem Krebs manipuliert werden kann, extrem umstritten. Siehe ELLEM et al., The Labyrinthine Ways of Cancer Immunotherapy – T Cell, Tumor Cell Encounter: "How do I Lose The? Let me Count The Ways," Adv.Canc.Res. 75:203–249 (1998). Das ist hauptsächlich auf die Tatsache zurückzuführen, dass, wie die Versuche das Immunsystem zu benützen, um infektiöse Krankheiten zu behandeln, Versuche das Immunsystem für einen therapeutischen Nutzen für Krebspatienten zu manipulieren, größtenteils nicht erfolgreich waren. Kontroversen über das Potenzial der Empfänglichkeit von menschlichem Krebs für Manipulationen des Immunsystems beruhen auch auf der Tatsache, dass weithin die Auffassung herrscht, dass menschliche bösartige Tumore schwach immunogen sind. Dementsprechend hat es sehr wenige systematische Versuche gegeben, die relative Immunogenizität von Tumoren zu bestimmen.
Wie legen Wissenschaftler fest, ob eine Substanz antigen ist oder dass eine adaptive Immunantwort in einem Individuum induziert wurde, das einem Antigen ausgesetzt wurde? Für die humorale Immunität gibt es unzählige in vitro Untersuchungen, um die Zunahme an Serum-Antikörper-Levels zu messen. Es ist jedoch unendlich schwieriger festzustellen, dass eine zellvermittelte Immunantwort induziert wurde. Im Laufe der Jahre bewiesen sich in vivo Protektionsverfahren als die verlässlichsten Indikatoren, wenn das Antigen ein Pathogen ist. Protektionsverfahren funktionieren gut, wenn das fragliche Antigen Krankheiten verursacht und wenn die Studien in Versuchsmodellen durchgeführt werden. Ein Individuum wird mit dem fraglichen Antigen geimpft und dann mit steigenden Mengen des pathogenen Wirkstoffes herausgefordert. Demnach, im Fall von Krebs, wurden Mäuse einer Krebsimpfung ausgesetzt und später wurden ihnen lebende Krebszellen injiziert. Wenn die Krebszellen nicht wachsen können, ist das Tier immun und man kann ableiten, dass die Immunantwort induziert wurde. Dieser Ansatz kann auch verwendet werden, um zu quantifizieren und die Spezifität der Antwort zu bestimmen.
Protektionsexperimente können nicht verwendet werden, um Antikrebs-Immunantworten im Menschen zu messen, da es unethisch wäre, Patienten krebserzeugende Zellen zu injizieren. Da Krebsantigene noch definiert werden müssen und zellvermittelte Immunantworten gegen Krebs ein komplexes wenig verstandenes Zusammenspiel zwischen verschiedenen T-Lymphozyten-Subpopulationen beinhalten, gibt es keinen einfachen verlässlichen Weg, um solche Antworten in vitro zu quantifizieren. Stattdessen wurden vor längerer Zeit delayed type hypersensitivity ("DTH") Hauttestuntersuchungen, das heißt Hypersensitivitäts-Hautuntersuchungen vom verzögerten Typ entwickelt, als Alternative in vivo Untersuchung für zellvermittelte Immunität. Die DTH-Reaktion zieht Vorteile aus der Tatsache, dass ein immunes Tier oder ein immuner Mensch eine adaptive zelluläre Immunreaktion entwickelt, die durch Rötung und Schwellung charakterisiert ist, die innerhalb von 24 Stunden bis 48 Stunden nach der Injektion an dieser Stelle auftritt.
Obwohl es keine in vitro Abläufe gibt, die in Zukunft routinemäßig benutzt werden könnten, ist die DTH-Reaktion die einzige Methode, die bis jetzt benutzt wurde, um die Immunantwort gegen Krebsantigene im Menschen zu messen. Siehe BERD et al., Treatment of Metastic Melanoma with Autologous Tumor Cell Vaccine: Clinical and Immunologic Results in 64 Patients, J. Clin. Oncol. 8:1858-1865 (1990); HOOVER & HANNA, Active Immunotherapy in Colorectal Cancer, Smin. Surg. Oncol. 5:436-440 (1989); LEHNER et al., Postoperative Active Specific Immunization in Curatively Resected Colorectal Cancer Patients with a Virus-Modified Autologous Tumor Cell Vaccine, Cancer Immunol. Immunother. 32:173-178 (1990). Dafür gibt es vier Gründe. Zuerst wurde, obwohl bösartige Zellen immunogen sind, bis jetzt kein humanes Krebsantigen identifiziert, charakterisiert und von solchen Zellen aufgereinigt. Zweitens werden DTH-Antworten, wie Tumor-Immunität, lokal durch eine Kombination von aktivierten Th1-Lymphozyten und nicht-cytotoxischen Th1-ähnlichen CD8 T-Lymphozyten vermittelt. Siehe CHER & MOSMANN, Two Types of Murine Helper T Cell Clone. I. Delayed-Type Hypersensitivity Is Mediated by TH1 Clones, J. Immunol. 138:3688-3694 (1987); MODY et al., CD8 Cells Play a Critical Role in Delayed Type Hypersensitivity to Intact Cryptococcus Neoformans, J. Immunol. 152:3970-3979 (1994). Drittens wurde gezeigt, dass Tumorimmunität mit DTH-Antworten auf Krebsantigene in Tiermodellen korreliert. Siehe PUCCETTI et al., Use of a Skin Test Assay to Determine Tumor-Specific CD8+ T Cell Reactivity, Europ. J. Immunol. 24:1446-1452 (1994); BARTH et al., Interferon y and Tumor Necrosis Factor Have a Role in Tumor Regressions Medaited by Murine CD8+ Tumor-Infiltrating Lymphocytes, J. Exp. Med. 173:647-658 (1991). Schlussendlich, seit kurzem verfügbare in vitro Verfahren für antigenspezifische T-Lymphozytenfunktionen sind technisch schwierig und unverlässlich.
B. KREBSIMMUNTHERAPIE: ANGEBORENE IMMUNANTWORT-STRATEGIEN
Zwei generelle Ansätze wurden beim Versuch das Immunsystem zu stimulieren, um das Fortschreiten des Krebses zu stoppen, verwendet. Der erste Ansatz war, angeborene Immunantworten zu stimulieren. Generell werden Krebspatienten einem Biomodulator ausgesetzt, wie zum Beispiel Bacillus Calmette Guerin ("BCG"), Interleukin 2 ("IL-2"), Tumor Necrosis Faktor ("TNF") oder Interferon ("IFN"), in der Hoffnung, dass nicht-spezifizierte aktivierte Immunzellen ein weiteres Krebswachstum inhibieren. Unglücklicherweise zeigen diese Agenzien, mit wenigen Ausnahmen, eine bescheidene Antikrebsaktivität und, wie andere chemotherapeutische Agenzien, sind sie bei effektiven Konzentrationen hochtoxisch.
Eine Variation dieser angeborenen Immuntherapie-Thematik, die auch genügend evaluiert wurde, war, den Vorteil zu nutzen, dass Biomodulatoren die Antikrebsaktivität von Immunzellen (Makrophagen, Natural Killer ("NK") Zellen und Lymphozyten) in vitro erhöhen. Lymphozyten hohen Konzentration von Agenzien wie IL-2 auszusetzen, produziert Lymphokin-aktivierte Killerzellen ("LAK"), die Teil des angeborenen Immunsystems sind. Obwohl LAK-Zellen besser als normale Zellen in der Lage sind, Krebszellen zu töten, zeigen sie keine Spezifität für Krebsantigene. Das Grundprinzip für therapeutische Studien, die LAK-Zellen verwendeten, war, dass dann, wenn man die Tötungsfähigkeit von Lymphozyten erhöhen könnte, diese gestärkten Lymphozyten in der Lage sein würden, fortschreitenden Krebs in vivo zu zerstören.
Steven ROSENBERG am National Cancer Institute führte den ersten Versuch am Menschen mit autologen LAK-Zellen im Jahr 1985 durch. Die LAK-Zellen wurden aus peripheren Blut-Leukozyten (BPL) von Tumorpatienten erzeugt. Nach dem Züchten der Zellen in hohen Konzentrationen von IL-2 wurden die LAK-Zellen zurück in den Krebspatienten injiziert. Die Krebspatienten wurden auch hohen Konzentrationen (≥ 18 MIU/Patient/Tag) von IL-2 ausgesetzt, nachdem sie die LAK-Zellen erhalten haben. Siehe ROSENBERG, U.S. Patent No. 4,690,915. Signifikante Tumor-Rückgänge wurden primär an Patienten mit Melanomen und Nierenkrebs beobachtet.
Nachfolgende Studien verwendeten LAK-Zellen in Bezug auf Melanome und Nierenkrebs. In acht verschiedenen Studien erzielten 190 Melanompatienten eine Gesamtantwortrate (total und partiell) von 16%. Bezüglich Nierenkrebs zeigten 198 Patienten von acht verschiedenen Studien eine Gesamtantwortrate von 22%. Siehe CHANG, Current Status of Adoptive Immunotherapy of Cancer, Crit. Rev. Oncol. Hem. 22:213-228 (1996). Dennoch wird allgemein geglaubt, dass die therapeutischen Effekte nicht auf den adaptiv transferierten LAK-Zellen, sondern mehr auf der hohen Konzentration (≥ 18 MIU/Patient/Tag) von IL-2 beruhten, die die Patienten erhielten, folgend auf die Infusion von aktivierten Lymphozyten. Spätere Studien an Tiermodellen konnten keine signifikante in vivo Antitumoraktivität für LAK-Zellen selbst dokumentieren.
Eine Variation des gleichen angeborenen Immuntherapie-Themas, das auch von Steven ROSENBERG verfochten wird, ist der adoptive Transfer von tumorinfiltrierenden Lymphozyten ("TIL"). TIL Immuntherapie umfasst das Benützen von hohen Konzentrationen (≥ 1000 IU/ml) von IL-2, um mononukleare Zellen, die ursprünglich von dem inflammatorischen Infiltrat, das um solide Tumore herum anwesend ist, isoliert wurde, zu stimulieren. Die Begründung ist, dass TILs für tumorspezifische, cytotoxische T-Lymphozyten und NK-Zellen angereichert werden können. Forscher stellten die Theorie auf, dass das lymphoide Infiltrat in ei nem Tumor eine ausgewählte Population von Immunzellen repräsentiert, die vorzugsweise zum Tumor migriert sind. Ungleich den LAK-Zellen, aber wie aktivierte T-Lymphozyten, sind TIL-Zellen manchmal fähig, autologe Krebszellen in einer Art und Weise, die hoch spezifisch und begrenzt durch die Major Histocompatibility Complex ("MHC") Klasse I Moleküle sind, zu lysieren. Wissenschaftler behaupten, dass TIL Immuntherapie 50 bis 100mal mehr effizient ist als die LAK-Immuntherapie. Siehe ROSENBERG U.S. Patent No. 5,126,132; ROSENBERG et al., Use of Tumor-Infiltrating Lymphocytes and Interleukin-2 in the Immunotherapy of Patients with Metastatic Melanoma, New Engl. J. Med. 319:1676-80 (1988). Wie bei den LAK-Zellstudien war es schwer, zwischen den in vivo Effekten von TIL und den Antikrebseffekten von hohen Dosen von IL-2 zu unterscheiden.
Eine andere Variante dieses generellen Ansatzes, nicht-spezifische Effektorzellen für den adoptiven Transfer im Patienten zu generieren, ist PBL von Krebspatienten mit Anti-CD3, einem nicht spezifischem Antigenrezeptor-Stimulus, zu stimulieren. Siehe OCHOA et al., U.S. Patent No. 5,443,983; OCHOA et al., U.S. Patent No. 5,725,855; BABBIT et al., U.S. Patent No. 5,766,920; TERMAN et al., U.S. Patent No. 5,728,388. Die Idee war, dass Patienten zirkulierende krebsantigenspezifische T-Lymphozytenvorläufer haben sollten, deren Krebsbekämpfungspotenzial durch Stimulation mit Anti-CD3 in Kultur erhöht werden könnte. Solche nicht-speziell aktivierten T-Lymphozyten haben auch keine signifikanten Tumor-Effekte in vivo, obwohl sie von dem Blut von Krebspatienten generiert wurden.
C. KREBSIMMUNTHERAPIE: ADAPTIVE IMMUNANTWORT STRATEGIEN
Der zweite generelle immuntherapeutische Ansatz unterscheidet sich von den vorherigen nichtspezifischen Strategien hauptsächlich dadurch, dass er entwickelt wird, um eine adaptive Immunantwort gegen die patienteneigenen Krebszellen zu induzieren und sie dann zu verstärken. Der Ansatz ist begründet auf der gut dokumentierten Tatsache, dass das Immunsystem normalerweise keine fortschreitenden bösartigen Tumore erkennt und auf sie antwortet, aber dass es möglich ist, Impfungen zu benützen, um im Krebspatienten eine immunologische Antwort auf Moleküle, die von bösartigen Zellen aber nicht von normalen Zellen exprimiert werden, hervorzurufen. Die einfache Begründung ist, dass Krebs erfolgreich behandelt werden könnte, wenn man eine ausreichend starke adaptive Immunantwort gegen Krebszellen, assoziiert mit Antigenen, induzieren könnte.
Die erfolgreichsten Strategien, die in dieser Kategorie getestet wurden, kombinieren die Tatsache, dass Impfungen eine protektive Immunantwort induzieren und dass protektive Immunität mit aktivierten T-Lymphozyten transferiert werden kann. Der Impfteil dieser Strategie wird oft als aktive spezifische Immun therapie bezeichnet ("ASI"). Der Begriff "aktiv" wird benützt, weil die Impfung aktiv eine Immunantwort induziert. Der Begriff "spezifisch" wird benützt, weil die Strategie entwickelt wurde, um eine Immunantwort gegen Antigene zu induzieren, die von den patienteneigenen Krebszellen exprimiert werden. Der Zelltransferteil der Strategie ist allgemein bekannt als adoptive zelluläre Immuntherapie ("ACI"). Der Begriff "adoptiv" wird benützt, weil die Strategie den Transfer von Immuneffektorzellen von einer Seite auf die andere beinhaltet. Der Begriff "zellulär" wird verwendet, weil die Strategie den Transfer von Immunzellen beinhaltet.
1. Aktiv Spezifische Immuntherapie ("ASI")
Die Idee von ASI in Fachkreisen ist wohl bekannt und zahlreiche ASI-klinische Versuche wurden mit einer großen Anzahl von Quellen für Krebsantigene durchgeführt. Es gibt zwei grundlegende Gründe, diesen Ansatz auszuwählen. Trotz der weit verbreiteten Meinungsverschiedenheit über die Immunogenizität. von speziellen, menschlichen Krebsarten, induzieren Impfungen Krebsimmunität. Es gibt keinen theoretischen Grund, warum eine starke Impfung nicht therapeutisch gegen Krebs sein könnte. Wenn eine Impfung protektive Immunität erzeugen kann, die ausreichend stark ist, um therapeutisch zu sein, sollte es relativ einfach sein, sie zum Rüstzeug der Krebsbehandlung hinzuzufügen.
Mehrere generelle Impfstrategien werden derzeit erforscht. Die einfachste von diesen ist es, die Patienten mit ihren eigenen Krebszellen zu impfen. Die ganze Zellmethode wurde auf ihre therapeutische Effizienz in verschiedenen Studien mit Menschen getestet. Eine dieser Studien beinhaltete das Behandeln von Melanompatienten mit Impfungen mit ihren eigenen chemisch veränderten Krebszellen und BCG. Siehe BERD, U.S. Patent No. 5,290,551; BERD et al., Treatment of Metastatic Melanoma with Autologous Tumor Cell Vaccine: Clinical and Immunologic Results in 64 Patients, J. Clin. Oncol. 8:1858-1865 (1990). Eine zweite Studie beinhaltete die Behandlung von Dickdarmkrebspatienten mit Impfungen mit ihren eigenen Krebszellen und BCG. Siehe HANNA, Jr. et al., U.S. Patent No. 5,484,596; VERMORKEN et al., Active Specific Immunotherapy for Stage II and Stage III Human Colon Cancer: a Randomized Trial, Lancet 353:345-350 (1999).
Zwei generelle Tatsachen wurden über ASI deutlich. Erstens ist die Quelle des Krebsantigens entscheidend für den Erfolg. Gegenwärtig bieten intakte lebensfähige Zellen vom patienteneigenen Krebs die beste Quelle. Zweitens muss das Krebsantigen mit einem immunologischen Adjuvans kombiniert werden, um das Potenzial der Impfung zu erhöhen. BCG wurde bei den meisten klinischen Versuchen mit Menschen und ASI als immunologisches Adjuvans verwendet. Dennoch hat BCG einige Nachteile als Adjuvans, wie seine relativ hohe Toxizität und seine relativ niedrige Wirksamkeit. Aktuellere Ansätze, die Wirksamkeit von autologen Krebszellenimpfungen zu erhöhen, beinhalten das genetische Verändern von Krebszellen, um sie immunogener zu machen. Ein erfolgreicher Ansatz beinhaltete das Insertieren des Gens für das Cytokin, Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor ("GM-CSF"), in Tumorzellen. Siehe BONNEN et al., U.S. Patent No. 5,679,356; DRANOFF et al., U.S. Patent No. 5,637,483; DRANOFF et al., Vaccination wich Irradiated Tumor Cells Engineered to Secrete Murine GM-CSF Stimulates Potent, Specific, Long-Lasting Anti-Tumor Immunity, PNAS (USA) 90:3539-3543 (1993). Sehr aktuelle Untersuchungen lassen jedoch vermuten, dass das einfache Mischen von löslichem GM-CSF mit autologen Krebszellen dem gleichen Zweck dient, d.h., dass GM-CSF alleine ein sehr effektives Adjuvans ist.
In Summe werden die wirksamsten derzeit verfügbaren Impfstrategien Immunantworten in den meisten Patienten gegen ihren eigenen Krebs induzieren und multiple Impfungen möglicherweise das Fortschreiten der bösartigen Zellen verlangsamen. Dennoch erzielt ASI alleine weder im Menschen noch in Tiermodellen eine Heilung.
2. Adoptive zelluläre Immuntherapie ("ACI")
Auch die Idee von ACI ist wohl bekannt in Fachkreisen. Die ersten dokumentierten Experimente, die zellulären Transfer von Immunität beinhalten, traten im Jahr 1942 auf, als Wissenschaftler herausfanden, dass DTH in einfachen chemischen Verbindungen von sensibilisierten (immunen) Donoren zu naiven (nicht immunen) Empfängern mit Zellen von peritonealen Exsudat transfertiert werden können. Siehe LANDSTEINER et al., Experiments on Transfer of Cutaneous Sensitivity to Simple Compounds, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 49:688-690 (1942). Dies ist wichtig für die Krebstherapie, weil das Impfen von Patienten mit ihren eigenen Krebszellen und einem immunologischen Adjuvans eine starke DTH-Antwort induzieren wird. Siehe HOOVER & HANNA, Active Immunotherapy in Colorectal Cancer; Semin Surg. Oncol. 5:436-440 (1989): LEHNER et al., Postoperative Active Specific Immunization in Curatively Resected Colorectal Cancer Patients with a Virus-Modified Autologous Tumor Cell Vaccine, Cancer Immunol. Immunother. 32:173-178 (1990). Seit 1954 hat sich die Phrase "adopitive Immuntherapie" eingeprägt, um den Erwerb von Immunität in einem normalen Subjekt durch die Übertragung von immunologisch aktivierten Lymphzellen zu beschreiben. Siehe BILLINGHAM et al., Quantitative Studies on Tissue Transplantation, Proc. R. Sox. Exp. Biol. 143:58-80 (1954). Vom adoptiven Transfer von Lymphknoten ("LN") Zellen in Mäuse wurde ein Jahr später berichtet. Siehe MICHISON, Studies on the Immunological Response to Foreign Tumor Transplants on the Mouse, J. Exp. Med. 102:157-177 (1955).
Der adoptive Transfer der adaptiven Immunität ist extrem wichtig, weil es eine Technik ist, die Immunologen erlaubte, die zelluläre Basis des Immunsystems freizulegen. Es ist nicht unmittelbar naheliegend, dass der adoptive Transfer von Immunzellen ein nützliches immuntherapeutisches Werkzeug gegen Krankheiten darstellen würde. Tatsache ist, dass während der adoptive Transfer von immunen T-Lymphozyten auf die gleiche Weise Schutz überträgt, wie Impfungen Schutz induzieren, bieten adoptiv transferierte Lymphozyten alleine wenig oder keinen therapeutischen Vorteil. Sie werden fortschreitenden Krebs nicht abstoßen. Obwohl ACI in Fachkreisen wohl bekannt ist, ist es daher nicht offensichtlich, dass ACI die Basis für eine wirksame immuntherapeutische Strategie gegen Krebs bereitstellt.
3. Krebsantigen Immuntherapie ("CAI")
Die Frage, die sich Wissenschaftler als nächstes stellten, war, ob ASI und ACI, die beide beschützend wirken, kombiniert werden könnten, so dass ein additives Produkt produziert wird, das sowohl protektiv als auch therapeutisch ist. Die immuntherapeutische Strategie muss jedoch fähig sein, eine vorher vorhandene Krankheit abzustoßen. Menschen haben bereits Krebs, wenn Versuche begonnen werden, das Immunsystem zu manipulieren. Vielmehr haben sie sogar schon bei der Diagnose normalerweise eine fortgeschrittenere Krankheit als die Versuchstiere, die die Ziele für immuntherapeutische Versuche sind.
Die Begründung für die Kombination von ASI und ACI ist, dass, obwohl weder die Impfung noch der adoptive Transfer von aktivierten Leukozyten von Krebspatienten genügen, um Krebs rückzubilden, möglicherweise die zwei synergetisch sein könnten. Die immunologische Basis für die Kombination der zwei Strategien ist, dass es essenziell ist, im Immunsystem des Patienten die Erkennung und die Antwort auf Antigene, die von bösartigen Zellen exprimiert werden, zu induzieren. Eine Impfung erreicht dies. Wurde einmal eine Immunantwort ausgelöst, könnten die T-Lymphozyten aus dem immunen Individuum entfernt werden, ihre Anzahl und Wirksamkeit könnte im Labor erhöht werden und sie könnten in den Patienten zurückgebracht werden, wo sie an die Orte des Krebswachstums wandern und den fortschreitenden Krebs abstoßen könnten. Dies würde zu einem Gesamtanstieg der Anzahl von Effektor-T-Lymphozyten führen, die in den Tumor eindringen.
Der Beweis dieses Prinzips wurde in Tierstudien erstellt, in welchen die Lymphozyten aus immunen Tieren entfernt wurden, mit Krebszellen und kleinen Mengen (≤ 100 IU/ml) von IL-2 in Kultur stimuliert wurden und adoptiv in tumorbelastete Tiere transferiert wurde. Diese kombinatorische Strategie war im Stande, fortschreitenden Krebs permanent zu heilen. Siehe CHEEVER et al., Specific Adoptive Therapy of Murine Leukemia with Cells Secondarily Sensitized in vitro and Expanded in IL-2, Progr. Cancer Res. Ther. 22:127-133 (1982); COU & SHU, Cellular Interactions and the Role of Interleukin 2 in the Expression and Induction of Immunity Against a Synergenetic Murine Sarcoma, J. Immunol. 139:2103-2109 (1987); HOLLADAY et al., Cytotoxic T lymphocytes, but not Lymphokine Activated Killer Cells, Exhibit Anti-Tumor Activity Against Established Intracerebral Gliomas, J. Neurosurg. 77:757-762 (1992). Diese Studien zeigten klar, dass therapeutische Fehlschläge, assoziiert mit Impfungen alleine mit der Unfähigkeit von Impfungen eine hohe Anzahl von krebsantigenspezifischen Effektor-T-Lymphozyten zu produzieren in Zusammenhang stand und dass dieses Defizit durch eine vorherige Aktivierung der T-Lymphozyten ex vivo im Labor und dann einen adoptiven Transfer der aktivierten Zellen in den Tumorträger behoben werden konnte. So entwickelte sich durch die Kombination von ASI und ACI eine effektive therapeutische Strategie.
Spätere Studien zeigten, dass immune krebsantigenspezifische T-Lymphozyten stimuliert werden könnten, um zu Effektor-T-Lymphozyten zu differenzieren, die nicht-spezifische Antigen-Rezeptor-Stimuli wie Anti-CD3 benutzen. Der kritische Schritt in diesen Studien war, dass Lymphozyten vorher mit dem Antigen geprägt werden mussten, Bevor sie Anti-CD3 ausgesetzt wurden. Siehe YOSHIZAWA et al., Specific Adoptive Immunotherapy Mediated by Tumor-Draining Lymph Node Cells Sequentially Activated with Anti-CD3 Activated CD4+ T Cells Plus Cyclophosphamide and Liposome Encapsulated Interleukin 2 Cure Murine MC-38 and 3LL Tumors and Establish Tumor Specific Immunity, Blood 89:2529-2536 (1997); SHU et al., Stimulation of Tumor-Draining Lymph Node Cells with Superantigenetic Staphylococcal Toxin Leads to the Generation of Tumor-Specific Effector T cells, J. Immunol. 152:1277-88 (1994); BALDWIN et al., Ex Vivo Expansion of Tumor Draining Lymph Node Cells Using Compounds which Activate Intracellular Signal Transduction, J. Neuro. Oncol. 32:19-28 (1997). An einer großen Vielfalt von experimentellen Krebsarten, wurde eine Empfänglichkeit für diese Strategien gezeigt.
Die Kombination von Krebsantigenimpfungen und adoptivem Transfer von aktivierten T-Lymphozyten ist bekannt als Krebsantigen-Immuntherapie ("CAI"). Diese kombinatorische Strategie sollte unterschieden werden von anderen Formen von ASI und ACI, speziell von diesen, die nicht direkt eine induzierte adaptive Immunantwort gegen die patienteneigenen Krebszellen beinhalten.
CHANG und seine Kollegen waren die ersten, die von der Anwendung einer Form von CAI bei Menschen berichteten. Sie impften Melanom- und Nierenzellkrebspatienten mit bestrahlten autologen Krebszellen und BCG. Lymphozyten wurden dann vom Lymphknoten-Drainage-Impfort gewonnen, in vitro mit autologen Krebszellen und niedrig dosiertem IL-2 stimuliert und in den Patienten mit einer begleitenden intravenösen Verabreichung von niedrig dosiertem IL-2 infundiert. Siehe CHANG et al., Clinical Observations on Adoptive Immunotherapy With Vaccine-Primed Lymphocytes Secondarily Sensitized with Tumor In Vitro, Canc. Res. 53:1043-1050 (1993). Es wurden keine klinisch signifikanten Ergebnisse beobachtet.
HOLLADAY und seine Kollegen führten eine ähnliche Studie bei Patienten mit fortgeschrittenem Hirnkrebs durch. Patienten wurden geimpft mit ihren eigenen Krebszellen und BCG. Periphere Blut-T-Lymphozyten wurden mit autologen Tumorzellen und niedrig dosiertem IL-2 in vitro stimuliert und in die Patienten zurücküberführt. Siehe HOLLADAY et al., Autologous Tumor Cell Vaccination Combined With Adopotive Cellular Immunotherapy in Patients with Grad III/IV Astrocytoma, J. Neuro-Oncol. 27:179-189 (1996). Wieder wurden keine klinisch signifikanten Ergebnisse beobachtet.
Kürzlich ersetzte CHANG's Gruppe Tumorzellen durch Anti-CD3 als den in vitro T-Lymphozyten Stimulus. Siehe CHANG et al., Adoptive Immunotherapy with Vaccine Primed Lymph Node Cells Secondarily Activated with Anti CD3 and Interleukin 2, J. Clin. Oncol. 15.79-807 (1997). Es wurden dann die Lymphozyten aus den Lymphknoten-Drainagen-Impforten gewonnen, in vitro mit Anti-CD3 und niedrig dosiertem IL-2 stimuliert und in die Patienten, begleitet von IL-2, intravenös infundiert. Einige der behandelten Tumore bildeten sich zurück, aber das Überleben der Patienten wurde nicht signifikant verlängert.
Eine andere Gruppe von Wissenschaftlern untersuchte die Umsetzbarkeit, Toxizität und den potenziellen therapeutischen Nutzen einer anderen Art von CAI in Patienten mit bösartigen Gehirntumoren. Siehe PLAUTZ et al., Systematic T Cell Adoptive Immunotherapy of Malignant Gliomas, J. Neurosurg. 89:42-51 (1998). Lymphozyten wurden aus Lymphknoten-Drainagen-Impforten gewonnen und in vitro mit Staphylococcal Enterotoxin A, Anti-CD3 und IL-2 stimuliert und in Patienten mit einer begleitenden intravenösen Verabreichung von IL-2 infundiert. Wieder wurden keine klinisch signifikanten Ergebnisse beobachtet.
Aufgrund der beachtlichen Auswahl an immunologischen Krebsbehandlungsstrategien sollte es klar sein, dass es keine unmittelbar offensichtliche CAI-Strategie gibt. Es gibt auch keine Strategie, die sich als die beste immunologische Behandlung für menschlichen Krebs etabliert hat. Es gibt keinen FDA-geprüften immuntherapeutischen Ansatz zur Krebsbehandlung. Selbst unter Immuntherapeuten ist es ein weit verbreiteter Glaube, dass nur wenige Melanome und Nierenzellenkrebsarten eine mäßige Immunogenizität exprimieren und dass menschliche bösartige Tumore, anders als Melanome und Nierenkrebs, nicht immunogen und daher nicht empfänglich für Immuntherapie sind. Demnach gibt es wenige klinische Studien bezüglich Immuntherapie, die die Behandlung von menschlichen Krebsarten behandeln, ausgenommen Melanome oder Nierenkrebs, welche relativ seltene Krebsarten sind. Es ist auch ein weit verbreiteter Glaube, dass selbst dann, wenn menschlicher Krebs immunogen ist, antigenspezifische Toleranz und Immunsupression die Generation einer produktiven Immunantwort verhindern würde. Siehe ELLEM et al., The Labyrinthine Ways of Cancer Immunotherapy – T Cell, Tumor Cell Encounter: "How Do I Lose The? Let Me Count the Ways," Adv. Canc. Res. 75:203-249 (1998).
Der beachtlichte Erfolg der durch die Verwendung von CAI in präklinischen Modellen erreicht wurde, sagt voraus, dass CAI wenigstens einen mäßigen Erfolg als Behandlung für menschlichen Krebs erreichen sollte. Dennoch unterstützen die klinischen Ergebnisse, die bis jetzt in der menschlichen Phase I/II in den klinischen Versuchen erzielt wurden, diese Behauptung nicht. Obwohl die Ungleichheit fundamentalen immunologischen Unterschieden zwischen menschlichen und experimentellen bösartigen Tumoren zugeschrieben werden könnte oder der Tatsache, dass es technisch nicht möglich ist, CAI am Menschen durchzuführen, ist dies wahrscheinlich nicht die Erklärung. Die Ungleichheit ist höchstwahrscheinlich nicht aufgrund der konzeptuellen oder technischen Defizite in der Übersetzung von CAI von Tieren auf die Menschen, aber vielmehr aufgrund von unangemessenen Erwartungen gegeben. Es gab keinen stichhaltigen Unterschied in den Impfstrategien, noch in den Auswirkungen der Impfung in den Versuchstieren und in den Menschen. Die Menschen und die Versuchstiere wurden beide erfolgreich mit ganzen Krebszellen und einem immunologischen Adjuvans geimpft, um eine Immunantwort gegen ihre eigenen bösartigen Zellen hervorzurufen. Autologe krebsantigenspezifische T-Lymphozyten wurden erfolgreich aus dem lymphoiden Gewebe erworben und diese T-Lymphozyten wurden erfolgreich in vitro in Versuchstieren und Menschen aktiviert. In beiden Fällen wiesen diese T-Lymphozyten die Fähigkeit auf, einen Tumor in vitro zu zerstören. Es war möglich, aktivierte T-Lymphozyten in den Blutstrom von Versuchstieren und menschliche krebsbelastete Individuen zu infundieren. Die infundierten T-Lymphozyten besaßen die Fähigkeit, einen Rückgang von wachsendem Krebs in beiden, Versuchstieren und Menschen, auszulösen. Dennoch war der Unterschied in den Ergebnissen tiefgreifend. 100% der behandelten Tiere wurden in den meisten Modellsystemen geheilt, während signifikante Antikrebs-Effekte nur in einem kleinen Teil von behandelten Krebspatienten beobachtet und ein paar Heilungen dokumentiert wurden.
Basierend auf dem Vorangegangenen existiert ein klarer Bedarf, eine CAI-Strategie zu entwickeln, die effektiv, nicht toxisch und in menschlichen Krebspatienten durchführbar ist.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von Effektor-Lymphozyten gemäß Anspruch 1 und ein Präparat gemäß Anspruch 10.
Andere Merkmale und Eigenschaften der Erfindung werden in den abhängigen Ansprüchen definiert.
FIGURENBESCHREIBUNG
1 zeigt eine Serie von CT-Scans von Patient HT-98-3, welche den Krebsrückgang im Laufe der CAI darstellt. Der Patient erhielt eine hochdosierte Chemotherapie im März 1998. CAI wurde am 29. Juni 1998 und am 25. August 1998 durchgeführt. Der Pfeil kennzeichnet eine Parenchym-Verdichtung.
2 zeigt die Überlebenskurve für Patienten, die CAI erhielten, nachdem sie sich einer hochdosierten Chemotherapie und der Verpflanzung von Stammzellen unterzogen haben.
3 zeigt eine Serie von Magnetresonanztomografien eines Astrocytom-Patienten, der mit CAI behandelt wurde. Die Scans zeigen das Astrocytom des Patienten am 16. Februar 1995, drei Monate nach der Operation und direkt vor der Immuntherapie (oberste Reihe), am 15. März 1995, zwei Monate später nach der Immuntherapie (mittlere Reihe), am 20. November 1995, acht Monate nach der Immuntherapie (unterste Reihe).
4 zeigt eine Serie von MRT-Scans eines anderen Astrocytom-Patienten, der mit CAI behandelt wurde. Die Scans zeigen das Astrocytom des Patienten am 4. Jänner 1996 direkt vor der Operation (oberste Reihe), am 27. März 1996, drei Monate nach der Operation und direkt nach dem Abschluss der Immuntherapie, und am 20. Oktober 1997, achtzehn Monate nach der Immuntherapie.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
A. KREBSANTIGEN IMMUNTHERAPIE
Schritt 1: Impfung
Der erste Schritt in der vorliegenden Erfindung ist die Immunisierung der Patienten mit Antigenen von ihrem eigenen bösartigen Tumor. In Patienten, die ei nen festen bösartigen Tumor haben, wird der Krebs operativ entfernt, um eine einzellige Suspension von bösartigen Zellen zu kreieren. Die chirurgische Probe wird enzymatisch verdaut mit Enzymen, hergestellt von LIFE TECHNOLOGIES INC., mit dem Namen Viacell. In Patienten, die hämatologische bösartige Tumore oder feste bösartige Tumore mit freien Zellen in der Lunge haben, perikardial oder peritoneal flüssig, wurden die bösartigen Zellen aus dem Blut, dem Rückenmark, pleuralen oder perikardialen Ergüssen oder der Ascites-Flüssigkeit gewonnen. Die isolierten bösartigen Zellen werden mit ca. 5000rads bestrahlt, um lokales Wachstum zu vermeiden. Die Zellen werden eingefroren aufbewahrt, bis die Impfung durchgeführt wird.
Zur Zeit der Impfung werden die bösartigen Zellen mit einem immunologischen Adjuvans kombiniert, vorzugsweise löslichem, rekombinantem, menschlichem GM-CSF, das von IMMUNER INC. unter dem Namen Leukin hergestellt wird. In der bevorzugten Ausführungsform wird die Impfung intradermal, subkutan oder intramuskulär an verschiedenen (annäherungsweise 3 bis 4) Körperstellen verabreicht. Jeder Injektionsort erhält mindestens 5 × 10⁶ bösartige Zellen und mindestens 100 Mikrogramm GM-CSF. Da bestrahlte bösartige Zellen nicht toxisch sind, könnte eine höhere Anzahl gefahrlos injiziert werden, um die Immunantwort zu verbessern.
Dem Patienten werden dann täglich für mindestens drei Tage ca. 100 Mikrogramm/Stelle GM-CSF an den ursprünglichen Impfstellen injiziert. Andere Konzentrationen oder andere Impfrezepturen von GM-CSF könnten auch effektiv sein. Da bestrahlte bösartige Zellen nicht toxisch sind, können mehrere Impfungen gefahrlos durchgeführt werden, um die Immunantwort zu verbessern.
In einer separaten Ausführungsform enthält die Impfung ein Antigen, das vom bösartigen Tumor des Patienten selbst exprimiert wurde, so dass die primäre Aktivierung der T-Lymphozyten des Patienten induziert wird. Zum Beispiel könnte das Antigen ein aufgereinigtes Extrakt des Krebses, ein genetisch manipuliertes Antigen oder ein antigenes Peptid, das von Krebsen geteilt wird, sein.
Schritt 2: Produktion und Proliferation von Effektor-T-Lymphozyten
Der zweite Schritt bei CAI beinhaltet die Aktivierung von peripheren Blut-T-Lymphozyten von immunisierten Patienten. Die lokale Immunisierung führt zur Produktion von geprägten antigenspezifischen T-Lymphozyten in der lymphoiden Gewebsdrainage an den Immunisierungsorten. Die geprägten T-Lymphozyten werden dann vom lymphoiden Gewebe ins Blut entlassen, so dass sie zu den Orten der Antigen-Exponierung getragen werden könnten. Da die geprägten T-Lymphozyten ins Blut entlassen werden, sollte das periphere Blut die reichste Quelle für krebsantigenspezifischen T-Lymphozyten Effektorvorläufern bilden. Das bevorzugte Verfahren, um periphere Blut-Lymphozyten zu gewinnen, ist durch Leukapherese. Die bevorzugte Zeit um Leukapherese durchzuführen, ist innerhalb der zwei Wochen nach der zweiten Impfung.
In der bevorzugten Ausführungsform findet die Aktivierung und Proliferation von T-Lymphozyten in einer in vitro Zellkultur statt, durch die kooperative Interaktion zwischen adhärenten Monozyten und nicht adhärenten T-Lymphozyten. Rote Blutzellen ("RBCs") werden von den Leukapheresenproben durch selektive Lyse mit Tris-Ammonium Chlorid entfernt. Mononukleare Zellen aus dem peripheren Blut werden dann in Plastikgewebekulturflaschen angezüchtet, die Zellanhaftung im Gewebekulturmeduim, das Serum enthält, erlauben. Autologes Serum wird verwendet, aber es kann durch andere Serumquellen ersetzt werden.
In der bevorzugten Ausführungsform werden die peripheren Blut-T-Lymphozyten in Kultur mit Maus-monoklonalem Anti-CD3 stimuliert, das von ORTHO PHARMACEUTICALS unter dem Namen OKT3 hergestellt wird. Es können jedoch andere nichtspezifische T-Lymphozyten Stimuli, wie Staphylococcus Enterotoxin oder Bryostatin-1, Anti-CD3 ersetzen. Obwohl der Stimulus nicht fähig sein muss, den Antigenrezeptor oder antigenrezeptorassoziierte Proteine zu binden, muss der Stimulus fähig sein, geprägte T-Zellen zu stimulieren, um sie in Effektor-T-Lymphozyten zu differenzieren, die Tumorantigenspezifität und Effektoraktivität besitzen. In der bevorzugten Ausführungsform ist die optimale Konzentration von Anti-CD3 für die Stimulation zur Differenziation von antigengeprägten T-Lymphozyten in Effektor-T-Lymphozyten zwischen 0,01 und 100,0 Nanogramm/Milliliter. In der bevorzugten Ausführungsform sind die peripheren Blut-T-Lymphozyten Anti-CD3 für ca. 24 bis 48 Stunden ausgesetzt, danach wird IL-2 zu den Kulturen hinzugefügt. Interleukin-2 wird von CHIRON PHARMACEUTICAL INC. unter dem Proleukin hergestellt.
In der bevorzugten Ausführungsform werden die stimulierten Effektor-Zellen in Kultur unter Verwendung von IL-2 vermehrt. Andere Cytokine, die im Stande sind, die Proliferation von T-Lymphozyten, wie IL-15, zu stimulieren, könnten IL-2 ersetzen. In der bevorzugten Ausführungsform liegt die optimale Konzentration von IL-2 zur Stimulierung der Proliferation von aktivierten T-Lymphozyten zwischen ca. 10 und 100 IU/Milliliter.
Schritt 3: Infusion der aktivierten T-Lymphozyten
Nachdem die stimulierten Zellen von der Kultur geerntet wurden, werden die Zellen intravenös infundiert. Obwohl der Patient im Allgemeinen mit ca. 10¹⁰-10¹² Lymphozyten in einem Zeitraum von 1 bis 6 Stunden infundiert wird, hängt die Anzahl der verabreichten mononuklearen Zellen ausschließlich von der Anzahl der gebildeten Zellen während dem Proliferationsschritt ab. Über 10¹² autologe Lymphozyten wurden gefahrlos in Krebspatienten infundiert.
Die vorliegende Erfindung wird weiters durch die folgenden Beispiele spezifischer erklärt. Dennoch ist der Rahmen der vorliegenden Erfindung nicht durch die Beispiele limitiert.
13. BEISPIEL BRUSTKREBS
Schritt 1: Impfung
An diesem Beispiel hatten alle gewählten Patienten ein funktionsfähiges histopathologisch nachgewiesenes Stufe IV Karzinom in der Brust und hatten keinen Erfolg mit einer Standard-Chemotherapie für Stufe IV (metastasenbildenden) Brustkrebs.
Frische Tumorproben wurden steril bei einer operativen Ektomie entfernt. Wie in Tabelle 1 gezeigt, wurden die Proben von verschiedenen Körperstellen entnommen. Die Proben wurden in einer isotonischen Salzlösung bei Raumtemperatur ins Labor transportiert. Das Gewebe wurde steril bearbeitet. Einzellige Suspensionen wurden durch Rühren der Gewebefragmente für ca. zwei bis drei Stunden bei annäherungsweise 37°C in einem Enzymmix in einer Trypsinisierungsflasche hergestellt. Die Zellen wurden gezählt und die Lebensfähigkeit wurde durch Trypan Blue Exclusion festgelegt. Ein Teil der Zellen wurde im Gewebekulturmedium, das mit ca. 20% fetalem Rinderserum ergänzt wurde, angezüchtet, um Zelllinien der bösartigen Zellen der Patienten zu entwickeln und die Sterilität zu testen. Der Rest der Zellen wurde mit annäherungsweise 5000rads bestrahlt und bei ca. –70°C im Gewebekulturmedium, das mit Antibiotika ergänzt wurde, ca. 10% Dimethylsulfoxid und ca. 20% humanem Serum, gefroren aufbewahrt.
Unmittelbar vor der Impfung der Patienten wurden die Zellen aufgetaut und im Gewebekulturmedium, das mit 20% humanem AB⁺-Serum ergänzt wurde, suspendiert. Annäherungsweise 10⁷ Zellen von der ursprünglichen Krebsprobe wurden sedimentiert und dann mit 1,0 ml von GM-CSF (500 Mikrogramm) gemischt. Tabelle 1. Tumor Charakteristika

¹ Anzahl der Zellen, die von der chirurgischen Probe gewonnen wurden. Zusätzliche Zellen wurden für die Impfung und für Hauttests von wachsenden Zellen in Kultur gewonnen.
² (+) – Kein mikrobielles Wachstum
³ (+) – Tumorzellen wuchsen aus der chirurgischen Probe

Die Tumorzellen wurden an drei oder vier intradermalen Stellen injiziert, bilateral in den vorderen Oberschenkel und bilateral in die vordere obere Brust. Patienten, die eine totale Mastektomie mit unilateraler Entfernung von Lymphknotendrainagen hatten, wurden nur an drei Stellen injiziert. Das Injektionsvolumen war annäherungsweise 0,25 ml/Injektionsort. Die ursprünglichen Injektionsorte wurden markiert und an jeder Stelle wurden ca. 100 Mikrogramm GM-CSF täglich für weitere vier Tage injiziert. Eine zweite Impfung die 10⁷ Tumorzellen und die gleiche Menge GM-CSF enthält, wurde zwei Wochen später am gleichen allgemeinen Bereich genauso verabreicht.
An den Patienten wurden Hauttests durchgeführt, um die Entwicklung einer autologen krebsantigenspezifischen DTH-Antwort in der Zeit der zweiten Impfung zu beurteilen. Die Theorie, der DTH-Hauttests unterliegen, ist, dass eine DTH-Reaktion stattfindet, weil einige geprägte krebsantigenspezifische T-Lymphozyten das periphere Blut verlassen, in die Haut eindringen und mit dem Krebsantigen und den antigenpräsentierenden Zellen interagieren, um eine lokale Immunantwort hervorzurufen. Die Intensität der Antwort ist direkt proportional zu dem Durchmesser des Erythems und der Induration, die lokal an der Injektionsstelle auftritt und zur Anzahl von antigenspezifischen T-Lymphozyten, die an der Stelle eindringen. In anderen Worten, die Intensität der Antwort ist direkt proportional zu der Immunität, die das Individuum zum Antigen, das für die Hauttests verwendet wurde, besitzt. Folglich stellen Hauttests eine einfache und verlässliche in vivo Untersuchung für Krebsimmunität dar, die eine relativ kleine Anzahl von Krebszellen benötigt. Die DTH-Antwort stellt eine gut etablierte Messung von zellvermittelter Immunität dar, die ausführlich an Versuchstieren und Menschen geprüft wurde. Es wurde gezeigt, dass die Intensität der Antwort direkt mit der protektiven Immunität in unzähligen natürlichen und experimentellen Modellsystemen korreliert. Es wurde auch gezeigt, dass die Intensität der Antwort direkt mit den Ergebnissen von verschiedenen in vitro Immunfunktionsuntersuchungen korreliert.
Hauttests wurden mit einer intradermalen Injektion von ca. 10⁷ Krebszellen in den linken vorderen Unterarm durchgeführt. Wenn verfügbar, wurden gezüchtete Krebszellen für Hauttests benutzt. Gezüchtete Krebszellen waren frei von Verdauungsenzymen und menschlichen Serumproteinen, da die Zellen durch mehrere Zyklen im Medium, das fetales Rinderserum enthielt, gewachsen waren. Ferner glaubt man, dass mehrfache Zyklen in Kultur kontaminierende Bindegewebszellen, die sich nicht so schnell wie bösartige Zellen replizieren, eliminiert werden. Reaktionen gegen GM-CSF oder verunreinigende Substanzen, die mit GM-CSF assoziiert sind, wurden ausgeschlossen, da GM-CSF auch nicht in das Hauttestreagens inkludiert war. Demnach waren autologe Krebszellen die einzigen potenziellen antigenen Substanzen, die die ursprüngliche Impfung und das Hauttestreagenz gemeinsam hatten. Falls die Anzahl der gezüchteten Zellen ungenügend für die Hauttests war, wurden die Patienten entweder mit Zellen von der eigentlichen Tumorprobe hautgetestet oder die Impfstelle wurde als Immunantwortindikator verwendet. DTH-Reaktionen wurden an allen Hautteststellen ca. 24 und 48 Stunden nach der Injektion gemessen. Eine positive Antwort wurde definiert als eine Wheal and Flare Reaktion mit einem Durchmesser ≥ 4 mm. Um zu bestimmen, ob GM-CSF selbst die lokale Reaktion stimulierte, wurden 100 Mikrogramm GM-CSF intradermal in den rechten vorderen Unterarm injiziert und diese Orte wurden gleichwertig beurteilt.
Schritt 2: Produktion und Proliferation von Effektor-T-Lymphozyten
Zwei Wochen nach der zweiten Immunisierung wurden mononukleare weiße Blutzellen ("WBCs") vom nicht mobilisierten peripheren Blut mit Hilfe eines Quinton Katheter in der Vene unter dem Schlüsselbein unter Verwendung eines Zellseparators isoliert. Die Gesamtzahl von Leukozyten, die aus einer einzelnen Leukapherese gewonnen wurden, variierten zwischen ca. 5 × 10⁹ und 3 × 10¹⁰. An den Patienten wurden die Leukapheresen zwei- oder dreimal an aufeinanderfolgenden Tagen für jede Behandlung durchgeführt. Verschiedene Anzahlen wur den aus allen Proben erhalten. Die Lymphozyten betrugen zwischen 40% und 90% der gesamten Zellen. RBCs wurden von allen Proben durch selektive Lyse mit Tris-Ammonium Chlorid vor der Kultivierung entfernt. WBCs wurden im Gewebekulturmedium, ergänzt mit Antibiotika und autologem Serum (Kulturmedium), suspendiert. Anti-CD3 ("OKT3") wurde der Zellmischung hinzugefügt und die Zellen wurden in Gewebekulturflaschen platziert. Die Zellen wurden bei annäherungsweise 37°C für ca. 48 Stunden inkubiert. IL-2 (100 IU/ml) wurde dann zu den Anti-CD3-stimulierten Zellen hinzugefügt. Dann wurden die Zellen drei bis fünf Tage wachsen gelassen und nachdem sie die maximale Dichte erreicht hatten, wurden die Zellen in IV Infusionsbeutel geerntet. Anzahl und Lebensfähigkeit wurden festgestellt. Die morphologische Analyse wurde mit unterschiedlichen Auszählungen von cytozentrifugierten gefärbten Zellen durchgeführt. Die geernteten Zellen wurden auf Endotoxin, mikrobielle und Pilzkontamination getestet.
Schritt 3: Infusion von aktivierten T-Lymphozyten
Die Patienten erhielten Compazine^® (10 mg IV push), Benadryl^® (25-50 mg IV push) und Tylenol^® (650 mg PO) vor der Infusion der Zellen. Sterile endotoxinfreie Zellen wurden in die Patienten infundiert, in einem Zeitraum von 1 bis 3 Stunden über eine periphere Vene über eine Ambulanz-IV-Infusionseinrichtung. Die Anzahl der Zellen, die infundiert wurden, wird in Tabelle 3 detailliert dargestellt. Falls die Patienten Schüttelfrost bekamen, erhielten sie Demerol^® (25 mg IV push), was wiederholt wurde, wenn es benötigt wurde. Die Patienten wurden in den 3 Stunden nach dem Abschluss der Zellinfusion auf Toxizität kontrolliert.
Die Patienten erhielten auch IL-2 durch die Bolus-Gabe einer IV-Infusion einmal am Tag. Die Patienten erhielten ca. 3 × 10⁶ IU IL-2 pro Tag, an alternierenden Tagen für 10 Tage (5 Behandlungen). Diese Menge an IL-2, die allgemein als niedrig dosiert angesehen wird, wurde nicht mit klinischen Effekten assoziiert, wenn sie alleine entweder in Tiermodellen oder im Menschen verwendet wurde.
Ergebnisse: Impfung
Wie oben diskutiert, wurde die DTH-Antwort ausschließlich gegen Brustkrebs zellassoziierte Antigene gerichtet. Die DTH-Ergebnisse der Brustkrebs-Patienten werden in Tabelle 2 genau beschrieben. Mit einer Ausnahme versagten die DTH-Reaktionen in der Entwicklung an den primären Immunisierungsorten, was demonstriert, dass die Impfung nicht unspezifisch die lokalen Entzündungsantworten stimulierte. Positive DTH-Antworten wurden nach der ersten Impfung an 14 von 15 Patienten ermittelt. Die physikalischen Charakteristika und die Kinetik der Antworten waren typisch für klassische DTH-Reaktionen. Tabelle 2. Impfungsergebnisse

¹ NA– keine Angabe; ND – nicht durchgeführt

Die Ergebnisse zeigten zum ersten Mal klar, dass Brustkrebszellen im ursprünglichen Wirt immunogen sind und dass die meisten, wenn auch nicht alle, Brustkrebspatienten immunogene Krebsarten haben. Das heißt, dass Brustkrebs möglicherweise empfänglich für Immuntherapie ist. Die Studie hat auch gezeigt, dass die Anwesenheit von einem fortgeschrittenen, bösartigen Brusttumor nicht die Bildung von autologen krebsantigenspezifischen Immunantworten verhindert. Die Patienten erlangten keine immunologische Toleranz gegen ihren eigenen Krebs. Es ist unwahrscheinlich, dass systemisch spezifische oder nicht-spezifische Immunsupression die Erklärung für die Unfähigkeit von Krebspatienten ist, eine Immunität gegen ihre eigenen fortschreitenden bösartigen Tumore zu entwickeln. Die Ergebnisse zeigten auch, dass verschiedene Formen von Standard- und experimenteller Chemotherapie, einschließlich hoch dosierter Chemotherapie gefolgt von Stammzellwiedereinsetzung, die routinemäßig benutzt werden, um Brustkrebs zu behandeln, krebsantigenspezifische Immunantworten nicht permanent davon abhalten, in vivo gebildet zu werden.
Ergebnisse: Wachstumscharakteristika von OKT3-stimulierten Zellen
Wie oben besprochen, regt eine Impfung mit autologen Krebszellen T-Lymphozyten an und induziert Immunantworten, die geimpfte Tiere vor dem Entwickeln von Tumoren beschützt. Der adoptive Transfer von krebsantigenspezifischen Ef fektor-T-Lymphozyten produziert eine Abstoßung von fortschreitenden bösartigen Tumoren. Das Stimulieren von T-Lymphozyten von immunisierten Tieren mit Anti-CD3 wandelt Lymphozytpopulationen, die eine hohe Anzahl von geprägten krebsantigenspezifischen T-Lymphozyten enthalten, in Lymphozytpopulationen, die eine hohe Anzahl von krebsantigenspezifischen Effektor-T-Lymphozyten beinhalten, um. Anti-CD3 ist folglich eines der meist effektiven Verfahren von T-Lymphozytaktivierung für die Tumorbehandlung und hat den Vorteil, leicht anwendbar für die Entwicklung von ähnlichen Strategien für Menschen zu sein. Trotz der Tatsache, dass Anti-CD3 ein nicht-spezifisches T-Lymphozyt-Stimulans ist, sind die in vivo Antikrebseffekte der Effektor-T-Lymphozyten krebsantigenspezifisch. Eine zweite Absicht des gegenwärtigen Beispiels war daher festzustellen, ob aktivierte T-Lymphozyten routinemäßig aus dem peripherem Blut von immunisierten Brustkrebspatienten unter Verwendung einer Anti-CD3/IL-2 Stimulationsstrategie produziert werden könnten.
Wie in Tabelle 3 zu sehen, zeigen alle Zellen der Patienten starkes Wachstum als Antwort auf OKT3 und IL-2. Unterschiedliche allgemeine Untersuchungen können aus den Wachstumsmustern gemacht werden, die sich entwickelten, als die Kulturen fortschritten. Monozyten hefteten sich an die Oberfläche der Kulturflaschen innerhalb der ersten Stunde an. Nach 24 Stunden hatten sich die Lymphozyten auf der Oberfläche von einigen der adhärenten Zellen angeheftet und Monozyt/Lymphozyt-Cluster gebildet. Lymphozyten, die an adhärenten Zellen angeheftet waren, durchlebten auch morphologische Veränderungen, hauptsächlich gezeigt durch die Zunahme an Größe. Im Gegensatz dazu zeigten Kulturen, die kein OKT3 (IL-2 Kontrolle) enthielten, keine Lymphozytenanhaftung an adhärente Zellen oder morphologische Veränderungen. Die Lymphozyten verblieben klein und rund und frei in Lösung. Obwohl die Anzahl der angehafteten Lymphozyten mit der Zeit zunahm und das Verhältnis der adhärenten Zellen mit angehafteten Lymphozyten auch mit der Zeit zunahm, gab es keinen Beweis für Zellproliferation während der OKT3-Phase. Es gab keinen Anstieg der Zellzahl, als die Zellzählungen, an Kulturen, denen kein IL-2 zugefügt wurde (OKT3 Kontrolle), durchgeführt wurden. Tabelle 3. Wachstum von mononuklearen Zellen von Patienten nach der Anti-CD3/IL-2-Stimulation

¹ Lymphozyten/Monozyten/Granulozyten erhalten von nicht immunisierten Brustkrebspatienten
² ND – nicht durchgeführt

Verschiedene nennenswerte Veränderungen fanden nach der Zugabe von IL-2 statt. Es gab eine dramatische Zunahme in der Größe von Lymphozyten in den adhärenten Zellkomplexen. Die Anzahl der Zellen in den Komplexen nahm zu und während das Zellwachstum in den Komplexen fortschritt, lösten sich die Komplexe schrittweise von der Oberfläche der Flasche ab. Die Kultur bestand dann aus schwimmenden Zellkomplexen und freien Lymphozyten. Morphologische Untersuchungen der Zellen in den schwimmenden Komplexen enthüllten zahlreiche mitotische Zellen. Während sich die Lymphozyten vermehrten, wurden die Komplexe schrittweise kleiner, bis bei den meisten Patienten die Endpopulation, die verabreicht wurde, monodispersiv mit sehr wenigen offensichtlichen Lymphozytkomplexen war. Fast alle Monozyten, die in den ursprünglichen Kulturen anwesend waren, wurden in die Komplexe inkludiert, aber als die Kulturen beendet wurden, blieben sehr wenige Monozyten/Makrophagen über. Wie in Tabelle 3 gezeigt, bestehen die geernteten Kulturen fast immer hauptsächlich aus T-Lymphozyten. Die Anzahl von B-Lymphozyten (CD20+ Zellen) die in Kultur verblieben, war vernachlässigbar (Werte nicht gezeigt). Die Anzahl von zellexprimierenden NK oder oder aktivierten NK Markern war vernachlässigbar.
Wachstumskontrollen wurden durchgeführt, um OKT3 und IL-2 stimulierte Differenzierung und Proliferation zu kontrollieren. Mononukleare Zellen, die in Abwesenheit von OKT3 und bis zu 100 IU/ml IL-2 gezüchtet wurden, verblieben lebensfähig aber zeigten keine Anzeichen für entweder Differenzierung oder Proliferation. Mononukleare Zellen, die in Anwesenheit von OKT3 gezüchtet wurden, aber während dem Kultivierungszeitraum nie IL-2 erhielten, zeigten die OKT3 stimulierten morphologischen Veränderungen, aber konnten sich nicht in signifikantem Ausmaß proliferieren. Zellen, die 48 Stunden in Abwesenheit von OKT3 gezüchtet wurden und dann mit IL-2 stimuliert wurden, zeigten keine Komplexformation, morphologische Veränderungen oder Anzeichen für Proliferation.
T-Lymphozyten, die am Ende der Kultivierungsperiode geerntet wurden, exprimierten ausnahmslos hohe Grade von T-Lymphozytaktivierungsmarkern einschließlich CD25, CD69 und HLADr, wie in Tabelle 4 dargestellt. Unstimulierte zirkulierende T-Lymphozyten exprimieren normalerweise keine signifikanten Grade von diesen Markern, aber die Startpopulationen waren nicht komplett negativ, da CD69 und HLADr positiv nicht-T-Lymphozyten auch anwesend waren. Tabelle 4. Phänotypische Veränderungen in mononuklearen Zellen induziert durch Anti-CD3/IL-2

¹ sind ausgedrückt als Prozent von positiven Zellen vor und nach der Züchtung.

Es gab mehrere Gründe für die Wahl des peripheren Blutes als T-Lymphozytenquelle. Erstens ist es einfach zugänglich und erneuerbar. Außerdem ist das derzeitige Verständnis, wie sich Immunantworten nach einer Impfung entwickeln, dass die lokale Injektion von Antigen zu einer Produktion von geprägten antigenspezifischen T-Lymphozyten in Lymphknotendrainagen-Immunisierungsorten führt. Die geprägten T-Lymphozyten werden dann vom Lymphknoten in die Zirkulation entlassen, so dass sie zu den Orten des Antigenkontaktes gebracht werden können. Dies muss während der vorliegenden Studie stattgefunden haben, wie durch die Tatsache, dass DTH-Reaktionen an Hautteststellen stattfanden, bewiesen wurde. Einige der zirkulierenden geprägten krebsantigenspezifischen T-Lymphozyten verließen das periphere Blut, gelangten in die Haut und interagierten mit dem Krebsantigen und antigenpräsentierenden Zellen, um eine lokale Immunantwort hervorzurufen. Deshalb enthält das periphere Blut von geimpften Patienten geprägte krebsantigenspezifische T-Lymphozyten, die in Effektor-Zellen durch eine Anti-CD3/IL-2 Stimulation umgewandelt werden können. Da alle antigengeprägten T-Lymphozyten aus dem lymphoiden Gewebe in die Zirkulation entlassen werden sollten, sollte das periphere Blut theoretisch die beste Quelle für Effektorvorläufer-Zellen sein.
Zusammengefasst zeigte dieses Beispiel, dass die Kombination von OKT3 und IL-2 selektive Expansion des peripheralen Blut T-Lymphozytenkompartements in Brustkrebspatienten, die mit ihren eigenen Krebszellen immunisiert wurden, hervorruft. Man kann von ähnlichen Tierstudien ableiten, dass die Anzahl von krebsantigenspezifischen Effektor-Zellen in Endpopulationen direkt proportional zu der Anzahl von geprägten krebsantigenspezifischen T-Lymphozyten, die am Anfang anwesend waren, war.
Ergebnisse: Toxizität
Die klinischen Versuche der Phase I haben die zusätzliche Absicht, es zu erlauben, die relative Toxizität zu bestimmen. Die Impfung unter Verwendung von GM-CSF als Adjuvans rief nur die schwankende Klasse I/II Toxizität hervor. Schwankendes Fieber war die häufigste Nebenwirkung. Schwankende Wheal and Flare Reaktionen wurden an den sekundären Impforten beobachtet. Es gab keine lokale Gewebszerstörung. Kein lokales Wachstum von bestrahlten Krebszellen fand statt. Es kann zusammengefasst werden, dass Tumorzellen selbst keine signifikante Toxizität hervorgerufen haben und dass die effektive Dosis GM-CSF keine signifikante Toxizität hervorgerufen hat. Die Anzahl von Zellen, die in Tabelle 3 dargestellt wurden, wurden mit keiner signifikant assoziierten Toxizität infundiert. Es gab nur die schwankende Stufe I/II Toxizität mit Fieber als die häufigste Nebenwirkung. Die Infusion von IL-2 hatte ähnliche Wirkungen. Zusammengefasst, wurde CAI in dieser Gruppe von Brustkrebspatienten ohne signifikante Toxizität durchgeführt.
Ergebnisse: Wirksamkeit
Zwei allgemeine Punkte können über die klinischen Antworten, die während der vorliegenden Studie über CAI an Brustkrebspatienten untersucht wurden, gesagt werden. Erstens rief CAI wirklich Antworten in den behandelten Brustkrebspatienten hervor. Als Beispiel zeigt 1 das Verschwinden eines metastasischen Lungenknötchens in dem behandelten Patienten HT-98-3. HT-98-3 hatte eine fortgeschrittene Brustwanderkrankung, genauso wie eine parenchymale Lungenerkrankung. Die Brustwandverdickung, die in einem interkostalen Spalt lokalisiert wurde, wurde von einem Herzchirurgen chirurgisch entfernt. Die Diagnose Brust krebs wurde bestätigt und das Gewebe wurde dem Immuntherapielabor zur Impfungsvorbereitung geschickt. Der Patient unterzog sich dann einer hochdosierten Therapie und einer Stammzellverpflanzung. Sechs bis zwölf Wochen nach der Transplantation gab es beim Patienten noch immer den Hinweis auf einen 1 × 1 cm großen Tumor. Der Patient wurde zu dieser Zeit mit CAI behandelt und die Läsion verschwand. Diese Behandlung war vor mehr als 1,5 Jahren und der Patient erlebte kein Wiederauftreten der Krankheit.
Beim zweiten Patienten, HT-98-18, wurde ein anfängliches CR gewonnen, nach einer hochdosierten Chemotherapie und einer Stammzellverpflanzung für einen chemotherapieresistenten metastasischen Brustkrebs. Der Patient zeigte dann bei einer routinemäßigen radiologischen Nachfolgeuntersuchung die linke Achsellymphdrüse, genauso wie einige mediastinalen Drüsen. Die Achsellymphdrüse wurde entfernt und beim Gewebe wurde festgestellt, dass es Brustkrebs enthält und wurde dann für CAI verwendet. Die Lymphadenopathie zeigte eine Involution. Nach mehreren Monaten wurden wieder bestimmte mediastinale Drüsen auffällig. Eine Biopsie wurde vorgenommen, um weiteres Gewebe für die Immuntherapie zu gewinnen. Es wurde jedoch gezeigt, dass keine der Drüsen bösartiges Gewebe enthielt. Der Patient fährt derzeit mit einer operativen CR fort.
Ein dritter Patient, HT-99-2, der mehrere Lebermetastasen hatte, wurde vor kurzem behandelt. Ein kompletter Rückgang der Leberknoten wurde bei einem CT-Scan aufgezeigt. Zu diesem Zeitpunkt ist es zu früh, um zu wissen, ob dieses CR mit einem erhöhten Überleben korreliert.
Zweitens ist es in dieser Hinsicht hervorzuheben, dass alle Brustkrebspatienten, die in diesem Beispiel enthalten sind, fortgeschrittenen chemoresistenten Krebs hatten und die meisten bereits eine missglückte hochdosierte Chemotherapie und Stammzellenverpflanzung hinter sich hatten. Die zwei Jahre-Überlebensrate für diese Gruppe von Patienten ist sehr niedrig. Trotz allem überlebte ein hoher Anteil von behandelten Patienten bis heute. Viele dieser Patienten erhielten keine weitere Behandlung nach der Immuntherapie. Aktuelle Überlebensergebnisse sind in 2 zusammengefasst.
Zusammengefasst haben die Ergebnisse der klinischen Versuche der Phase I bewiesen, dass Brustkrebs immunogen ist und dass starke Immunantworten durch die Immunisierung der Patienten mit Brustkrebszellen und GM-CSF hervorgerufen werden können. Große Anzahlen von aktivierten T-Lymphozyten können aus dem peripheren Blut vom Patienten mit fortgeschrittenem Brustkrebs erzeugt werden. Der adoptive Transfer dieser aktivierten T-Lymphozyten in Patienten kann gefahrlos ausgeführt werden und wird wirklich klinische Antworten erzeu gen. Die Risiken eines prognostizierten therapeutischen Erfolges einer Behandlungsmodalität von Phase I-Daten sind wohl bekannt.
C. BEISPIEL ASTROCYTOM
Stufe 1: Impfung
In diesem Beispiel hatten neun ausgewählte Patienten alle ein operables wiederkehrendes Grad III oder IV Astrocytom, einen Karnovsky score ≥ 60 und es wurden allmählich die Steroide abgesetzt. Alle Patienten hatten davor eine fehlgeschlagene totale Ektomie, gefolgt von einer konventionellen Bestrahlung (55-60 Gy) und einer Chemotherapie. Die wiederkehrenden Tumore wurden reseziert und die histopathologische Diagnose wurde durch den wiederkehrenden Tumor bestätigt. Alle Patienten hatten den radiologischen Beweis für großflächigen, fortschreitenden Krebs und wurden mit Steroiden behandelt, um die Gehirnschwellung zur Zeit als ihre wiederkehrenden Tumore für die Immuntherapie entfernt wurden, zu kontrollieren.
Das Krebsgewebe wurde mit Scheren zerkleinert und in einem Medium suspendiert, das ein Enzymgemisch von Life Technologies enthielt. Der komplette Verdau wurde innerhalb von 1,5 bis 2,0 Stunden bei ca. 37°C in einem Trypsinierungs-Fläschchen durchgeführt. Die Zellen wurden in einem Medium, dem 20% humanes AB+ Serum zugefügt wurden, suspendiert und gezählt. Die Zellen wurden bei annäherungsweise 5000 rads bestrahlt und bei ca. –70°C gefroren aufbewahrt. Alle Zellpräparationen waren zu mehr als 80% lebensfähig und steril.
Zur Zeit der Impfung wurden ca. 10⁷ Krebszellen mit einer einzelnen Ampulle BCG, die annäherungsweise 10⁸ lebensfähige Bazillen enthielt, gemischt. Das Gemisch wurde an vier intradermalen Stellen (0,25 ml/Stelle) injiziert, eine jeweils in die linke und rechte Achselhöhle und in die linke und rechte Leiste, gewählt nach den maximalen Lymphdrainagen. Alle Patienten wurden mindestens zweimal in zwei Wochenintervallen immunisiert.
Schritt 2: Produktion und Proliferation von Effektor-T-Lymphozyten
Zwei Wochen nach der zweiten Immunisierung wurden mononukleare weiße Blutkörperchen vom peripheren Blut durch Leukapherese isoliert. Der Ertrag variierte zwischen 5 × 10⁹ und 2 × 10¹⁰ Zellen pro Leukapherese. An den Patienten wurde dreimal an erfolgreichen Tagen für jede Behandlung Leukapherese durchgeführt. Die Lymphozyten betrugen zwischen 30% und 80% der Gesamtzellzahl. Die weißen Blutkörperchen wurden in Gewebekulturmedium suspendiert, dem autologes Serum zugefügt wurde. OKT3 wurde zu dem Zellgemisch hinzugefügt und die Zellen wurden in Gewebekulturflaschen platziert. Die Zellen wurden bei ca. 37°C für ca. 48 Stunden inkubiert. 48 Stunden später wurde die Zellmixtur im Kulturmedium, das IL-2 enthielt, suspendiert. Nachdem die maximale Dichte erreicht wurde, wurden die Zellen gepoolt und in einen IV Infusionsbeutel geerntet. Anzahl und Lebensfähigkeit wurden festgestellt. Eine morphologische Analyse wurde durchgeführt durch die verschiedene Anzahl von cytozentrifugierten gefärbten Zellen. Die Zellen wurden immunphänotypisiert durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierungsanalyse mit Antikörpern nach CD3, CD4, CD8, CD25, CD71 und HLADr. Die geernteten Zellen wurden auch auf Endotoxin, mikrobielle und Pilzkontaminationen getestet.
Schritt 3: Infusion von aktivierten T-Lymphozyten
Sterile endotoxinfreie Lymphozyten wurden in alle neun Patienten infundiert. Die aktivierten Zellen wurden während einer sechsstündigen Periode in den Blutstrom infundiert, während die Patienten im Spital waren. Die Patienten blieben für mindestens 48 Stunden nach dem Erhalt der Zellen auf der Intensivstation des Spitals zur Überwachung. Die Patienten wurden neurologisch und durch eine komplette laboratorische Aufarbeitung alle vier Stunden während der ersten 48 Stunden überwacht. Die Patienten wurden auf Toxizität überwacht, unter Verwendung der NCI Common Toxicity Criteria.
Ergebnisse: Astrocytom
Kein Patient erfuhr mehr als 1+ Toxizität, die eine milde, kurzlebige Toxizität ist. Die meisten Patienten entwickelten schwankendes Fieber, Schüttelfrost und/oder Übelkeit während und direkt folgend auf die intravenöse Verabreichung der kultivierten Zellen. Die Antwortrate, krankheitsfreies Überleben und gesamtes Überleben wurde verwendet, um die Antwort auf die Behandlung zu messen. Das Tumorwachstum wurde überwacht unter Verwendung von Magnetresonanztomographie (MRI). Die Patienten erhielten MRI-Scans vor der Behandlung, ein Monat nach der Behandlung und drei Monate danach.
Die klinischen Antworten sind detailliert in 3, 5 und Tabelle 5 dargestellt. Patient #1 wurde drei Monate nach einer Operation am wiederkehrenden Tumor behandelt, zu einer Zeit, als fortschreitendes Tumorwachstum klinisch und am MRI dokumentiert wurde. Wie man in 3 sieht, verkleinert sich der Krebs von Patient #1 fortlaufend nach zwei Durchläufen von Immuntherapie bis zu dem Punkt wo nur ein kleiner oder kein Krebs detektiert wurde in dem letzten MRI. Der Patient ist derzeit am Leben und gesund, obwohl die Hemiparese und Sprachschwierigkeiten, die schon vor der Immuntherapie präsent waren, unverändert blieben. Der Krebs von Patient #3 wies einen flüchtigen teilweisen Rückgang in der Größe nach einer einzigen Behandlung auf und setzte dann das Wachstum fort. Es gab keinen Effekt aufs Überleben. Wie in 4 gezeigt wird, verkleinerte sich der Krebs von Patient #5 fortlaufend nach zwei Durchläufen von Immuntherapie bis zum dem Punkt, wo ein kleiner Tumor im letzten MRI detektiert wurde. Der Patient lebt und ist gesund mit keinen erwähnenswerten Symptomen. Er kehrte zur Vollzeitbeschäftigung zurück. Kein Patient erhielt eine andere möglicherweise cytoreduktive Behandlung als die Immuntherapie. Zu der Zeit, als ein Misserfolg bei der Behandlung dokumentiert wurde, durch Post-Immuntherapie Tumorfortschritt, erhielten die Patienten Steroide um das Anschwellen des Gehirns zu kontrollieren, bis sie starben. Tabelle 5. Effekt der Immuntherapie auf das Überleben der Patienten

¹ zwischen ursprünglicher Entfernungsoperation und Entfernungsoperation für Immuntherapie.
² T-Lymphozyten wurden entweder intravenös (IV) in eine Armvene oder intraarteriell (IA) durch die Halsschlagader infundiert. Einige Patienten erhielten die Zellen auf beide Wege, intraarteriell und intravenös.
³ Zeit von operativer Entfernung des wiederkehrenden Tumors bis zum Tod.

Diese Ergebnisse zeigen, dass CAI klinisch effektiv gegen Gehirnkrebs ist. Adoptiv transferierte Lymphozyten produzierten tatsächliche Rückgänge in drei von neun behandelten Patienten und der Rückgang korrelierte mit dem verbesserten klinischen Status von zwei dieser Patienten. Zur Zeit, als die operative Ektomie und Immuntherapie initiiert wurden, hatten alle Patienten in dieser Studie schnell fortschreitende Grad III/IV Astrocytome, die Steroide benötigten, um die Gehirnschwellung zu kontrollieren. Historisch schreitet dieser Krebs ausnahmslos fort und die Patienten sterben innerhalb von wenigen Monaten. Operative Ektomie alleine verlängert nicht dramatisch das Überleben des Patienten. Keiner der antwortenden Patienten benötigte oder erhielt eine zusätzliche Behandlung. Die Tatsache, dass zwei der Patienten mehr als drei Jahre später immer noch am Leben sind, ohne dass der Tumor wieder wächst, ist eine Neuheit, die nur CAI zugeschrieben werden kann.
D. BEISPIEL NIERENZELLKARZINOM
Ein Schlüsselunterschied zwischen der Anwendung von CAI auf experimentelle und humane Tumore war das Timing und der Unterschied im Ergebnis könnte direkt in Zusammenhang mit diesen Unterschieden stehen. In Tiermodellen hatten die behandelten Individuen kleine homogene Krebsarten, die ein paar Tage davor durch die Injektion von Krebszellen erzeugt wurden. Im Gegensatz dazu, mit nur wenigen Ausnahmen, hatten die Krebspatienten die mit CAI in Phase I Studien behandelt wurden, alle weit verbreiteten Stufe IV Krebs, der verschiedenen nicht immunologischen Behandlungsstrategien standgehalten hat. CAI hatte keinen offensichtlichen Effekt auf das Fortschreiten der Krankheit, wenn es an Versuchstieren angewendet wurde, die eine ausgedehnte Krankheit hatten. Deshalb wird ein einziger Fall beschrieben werden, um ein mögliches CAI-Ergebnis zu veranschaulichen, wenn CAI in frühem Krankheitsfortschritt verabreicht wird, zu einer Zeit, als die Patienten nur mikro-metastasische Krankheit haben.
An einem 34 Jahre alten Mann wurde Nierenkrebs diagnostiziert. Eine exploratorische Laparotomie wurde durchgeführt und es wurde herausgefunden, dass die linke Niere des Patienten eine große Anhäufung enthielt, die sich später als Nierenzellkarzinom herausstellte. Die Niere wurde entfernt und der Krebs wurde zur pathologischen Analyse verwendet. Der Krebs wog ca. 2,2 kg (5 Ibs.), hatte eingedrungene Blutgefäße und wurde als Stufe IIIb Nierenzellkarzinom diagnostiziert. Operative Entfernung des Krebs ist die einzige effektive Behandlung für Nierenzellkarzinom. Nierenzellkarzinome werden weitläufig als resistent gegen alle Formen der Chemotherapie angesehen. Die Prognose für Patienten mit Stufe III Nierenzellkrebs ist sehr schlecht. Der Patient meldete sich freiwillig für meinen klinischen Versuch. Der Patient wurde zweimal geimpft mit seinen eigenen Krebszellen und entwickelte eine positive DTH-Reaktion. Dann wurde er mit ei nem einzigen Durchgang von CAI behandelt, bei dem er ca. 4,8 × 10¹⁰ Anti-CD3 aktivierte autologe T-Lymphozyten erhielt, gefolgt von einem 5-Tagesdurchlauf von IL-2 bei ca. 3 × 10⁶ IU/Tag. Der Patient lebt und ist krankheitsfrei für bis jetzt mehr als 4 Jahre später. Die Wahrscheinlichkeit einer operativen Heilung ist relativ niedrig im Patienten bei dieser fortgeschrittenen Krankheit.
Zwei zusätzliche Nierenzellkrebspatienten wurden erfolgreich mit CAI während der letzten zwei Jahre behandelt. Beide Patienten hatten eine Stufe IV Erkrankung zu dem Zeitpunkt der Behandlung, sie wurden zweimal behandelt und verbleiben krankheitsfrei, mehr als eineinhalb Jahre später. Obwohl die Stichprobengröße klein ist, lassen die Messwerte vermuten, dass CAI effektiv gegen Stufe III und IV Nierenzellkrebs sein kann, und könnte tatsächlich in der Lage sein, Krebszellen permanent von dem Körper des Patienten zu entfernen.
E. ZUSAMMENFASSUNG
Die Brustkrebsstudie zeigte, dass viele, wenn auch nicht alle, Brustkrebsarten immunogen sind und dass starke Immunantworten hervorgerufen werden können durch die Immunisierung der Patienten mit Brustkrebszellen und GM-CSF. Die Frage, die sich augenblicklich stellt, ist, ob diese Impfungsergebnisse auf andere Typen von bösartigen Tumoren zu verallgemeinern sind. Mit anderen Worten, heißt die Tatsache, dass Brustkrebsarten immunogen sind, dass Gehirnkrebsarten, Darmkrebsarten, Eierstockkrebsarten, Leukämiearten, Lungenkrebsarten, Lymphome, Nierenkrebsarten, Prostatakrebsarten und andere übliche Typen von Krebs gleichermaßen immunogen sind? Die theoretische Antwort ist, dass alle Krebsarten durch die gleichen generellen Typen von genetischen Veränderungen zu bösartigen Transformationen führen und empfänglich für zusätzliche genetische Veränderungen während der folgenden bösartigen Proliferation sind. Es sind diese genetischen Veränderungen, die für die Immunogenizität von bösartigen Zellen verantwortlich sind. Daher sollten andere bösartige Tumore gleichermaßen immunogen sein. Die experimentelle Antwort ist, dass bei Studien unter Verwendung von autologen Krebszellen und BCG als Impfungen festgestellt wurde, dass einige Hirnkrebsarten, Dickdarmkrebsarten, Eierstockkrebsarten, Melanome und Nierenzellkrebsarten immunogen sind. Im Lauf meiner Studien, die Verwendung von Impfungen mit autologen Krebszellen und GM-CSF, wurden über 50 Patienten geimpft mit einer großen Vielfalt von anderen fortgeschrittenen bösartigen Tumoren einschließlich Astrocytomen (23), Neuroblastomen (2), Medulloblastomen (1), Eierstockkarzinome (3), Nierenzellkarzinome (8), Melanome (16), Dickdarmkarzinome (6), Lungenkarzinome (3). Die Antworten, die in diesen Patienten erhalten wurden, von denen alle einen bösartigen fortgeschrittenen Tumor hatten, waren qualitativ und quantitativ gleich den Antworten, die oben für Brustkrebspatienten detailliert aufgelistet sind. Die bedeutet, dass die Patienten immunogene Neoplasmae hatten.
Es versteht sich, dass die Beispiele und Darstellungen, die hier erklärt wurden, nur zu Darstellungszwecken dienen und, dass verschiedene Modifikationen oder Abänderungen in ihrem Licht für den Fachmann naheliegend sind und innerhalb des Schutzbereiches der beigefügten Patentansprüche liegen.

Claims

Verwendung von Effektor-T-Lymphozyten zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparats für die Krebstherapie, wobei die Effektor-T-Lymphozyten erzeugt werden a. durch Stimulierung von geprägten T-Lymphozyten, so dass sie sich in vitro in Effektor-Lymphozyten differenzieren; und b. durch Stimulierung der Effektor-T-Lymphozyten, so dass sie sich in vitro proliferieren; wobei die geprägten T-Lymphozyten erzeugt werden c. durch Impfung eines Patienten mit einem Impfstoff, der aus dem malignen Tumor des Patienten selbst und einem immunologischen Adjuvans gewonnen wird; d. durch Entnahme von geprägten T-Lymphozyten aus dem peripheren Blut des Patienten.
Verwendung der Effektor-T-Lymphozyten nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als immunologisches Adjuvans GM-CSF eingesetzt wird.
Verwendung der Effektor-T-Lymphozyten nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Entnahmeschritt mittels Leukapherese vorgenommen wird.
Verwendung der Effektor-T-Lymphozyten nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Differenzierungsschritt unter Anwendung von Anti-CD3 vorgenommen wird.
Verwendung der Effektor-T-Lymphozyten nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Proliferationsschritt unter Anwendung von IL-2 vorgenommen wird.
Verwendung der Effektor-T-Lymphozyten nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der maligne Tumor des Patienten Brustkrebs sein kann.
Verwendung der Effektor-T-Lymphozyten nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der maligne Tumor des Patienten Astrocytoma sein kann.
Verwendung der Effektor-T-Lymphozyten nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Impfung mit mindestens 5 × 10⁵ der malignen Zellen vorgenommen wird.
Verwendung der Effektor-T-Lymphozyten nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass vor der Impfung eine Bestrahlung der isolierten malignen Zellen des Patienten vorgenommen wird.
Ein Präparat bestehend aus Effektor-T-Lymphozyten, welche gewonnen werden durch a. in-vitro-Stimulierung von geprägten T-Lymphozyten eines Patienten, so dass sie sich in Effektor-Lymphozyten differenzieren, und Stimulierung der Effektor-T-Lymphozyten, so dass sie sich in vitro proliferieren; b. Entnahme der geprägten T-Lymphozyten des peripheren Blutes, nachdem der Patient mit einem Impfstoff aus seinen eigenen malignen Tumorzellen und einem immunologischen Adjuvans geimpft wurde.
Das Präparat nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass als immunologisches Adjuvans GM-CSF eingesetzt wird.
Das Präparat nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Entnahmeschritt durch Leukapherese erfolgt.
Das Präparat nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Differenzierungsschritt mittels Anti-CD3 vorgenommen wird.
Das Präparat nach einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Proliferationsschritt unter Anwendung von IL-2 vorgenommen wird.