KR20180063320A - T 세포 요법을 위한 t 세포를 제조하는 방법 - Google Patents

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아리안 페레즈
마리아나 사바티노
스티븐 에이. 로젠버그
니콜라스 피. 레스티포
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카이트 파마 인코포레이티드
더 유나이티드 스테이츠 오브 어메리카, 애즈 리프리젠티드 바이 더 세크러테리, 디파트먼트 오브 헬쓰 앤드 휴먼 서비씨즈
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Abstract

T 세포 요법을 필요로 하는 대상체로부터의 하나 이상의 T 세포를 AKT 억제제, 및 외인성 인터류킨-7 (IL-7) 및 외인성 인터류킨-15 (IL-15) 중 적어도 하나와 접촉시키는 단계를 포함하는, T 세포 요법을 위해 시험관내에서 T 세포 성숙 또는 분화를 지연시키거나 또는 억제하는 방법이며, 여기서 생성된 T 세포는 지연된 성숙 또는 분화를 나타내는 것인, T 세포 요법을 위해 시험관내에서 T 세포 성숙 또는 분화를 지연시키거나 또는 억제하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 T 세포 요법을 필요로 하는 대상체에게 하나 이상의 T 세포를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.

Description

T 세포 요법을 위한 T 세포를 제조하는 방법
정부 이권의 진술
본 발명은 미국 보건복지부의 기관인 국립 암 연구소 (NCI)와의 협동 연구 개발 협정 하에 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에 있어서 특정 권리를 갖는다.
발명의 분야
본 발명은 T 세포 요법을 위한 하나 이상의 T 세포를 제조하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 하나 이상의 T 세포를 AKT 억제제 ("AKTi"), 및 외인성 인터류킨-7 (IL-7) 및 외인성 인터류킨-15 (IL-15) 중 적어도 하나와 접촉시킴으로써 T 세포 요법의 효능을 개선시키는 방법에 관한 것이다.
배경기술
인간의 암은 본질적으로 비정상적인 암 세포가 되도록 유전적 또는 후성적 전환을 겪은 정상 세포로 구성된다. 그리하여, 암 세포는 정상 세포에 의해 발현되는 것들과 다른 단백질 및 다른 항원을 발현하기 시작한다. 이들 이상 종양 항원은 암 세포를 특이적으로 표적화하고 사멸시키도록 신체의 선천성 면역계에 의해 사용될 수 있다. 그러나, 암 세포는 면역 세포, 예컨대 T 및 B 림프구가 성공적으로 암 세포를 표적화하는 것을 방지하기 위해 다양한 메카니즘을 사용한다.
인간 T 세포 요법은 대상체, 예를 들어, 환자에서 암 세포를 표적화하고 사멸시키기 위해 생체외-풍부화 또는 변형된 인간 T 세포에 의존한다. 종양 항원을 표적화하거나 또는 공지된 암 항원을 특이적으로 표적화하도록 T 세포를 유전자 변형시킬 수 있는 자연 발생 T 세포의 농도를 풍부화시키기 위한 다양한 기술이 개발되었다. 이들 요법은 종양 크기 및 환자 생존에 대해 유망한 효과가 있는 것으로 입증되었다. 그러나, 주어진 T 세포 요법이 각각의 환자에서 효과적일지 여부를 예측하는 것은 어려운 것으로 입증되었다.
T 세포의 혼합 집단의 이식은 T 세포 요법이 그의 최대 잠재력에 도달하는 것을 방해하는 인자 중 하나이다. 통상적인 T 세포 요법에서, 공여자 T 세포는 수집되고, 특정한 항원 (예를 들어, 종양 세포)을 표적화하도록 임의로 변형되거나 또는 항종양 특징 (예를 들어, 종양 침윤 림프구)에 대해 선택되고, 시험관내에서 확장되고, 그를 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 전형적으로, 생성된 T 세포는 다수가 최종 분화된, 대체로 성숙한 세포의 혼합 집단을 포함한다. 그 결과, 이들 세포의 예측된 생체내 지속성은 제한될 수 있고, 초기에 관찰된 긍정적 효과는 종양이 이식된 T 세포의 부재 하에 재발함에 따라 시간 경과에 따라 무효화될 수 있다. 따라서, T 세포 요법에 사용하기 위해 T 세포의 생체내 지속성을 증가시킬 필요가 남아있다.
본 개시내용은 T 세포 요법을 필요로 하는 대상체로부터의 하나 이상의 T 세포를 AKTi, 및 외인성 IL-7 및 외인성 IL-15 중 적어도 하나와 접촉시키는 단계를 포함하는, T 세포 요법을 위해 시험관내에서 T 세포 성숙 또는 분화를 지연시키거나 또는 억제하는 방법을 제공하며, 여기서 생성된 T 세포는 지연된 성숙 또는 분화를 나타낸다.
본 개시내용은 하나 이상의 T 세포를 AKTi, 및 외인성 IL-7 및 외인성 IL-15 중 적어도 하나를 포함하는 배지 중에서 배양하는 단계를 포함하는, 시험관내에서 T 세포 성숙 또는 분화를 지연시키거나 또는 억제하는 방법을 추가로 제공한다.
본 개시내용은 배지 중에서 하나 이상의 T 세포를 배양하는 단계를 포함하고 하나 이상의 T 세포를 AKTi, 및 외인성 IL-7 및 외인성 IL-15 중 적어도 하나와 접촉시키는 단계를 포함하는, 줄기-세포 유사 CD8+ T 세포를 생성하는 방법을 추가로 제공한다.
본 개시내용은 또한 대상체에게 투여하기 전에 하나 이상의 T 세포를 AKTi, 및 외인성 IL-7 및 외인성 IL-15 중 적어도 하나와 접촉시키는 단계를 포함하는, 입양 세포 요법에서 하나 이상의 T 세포의 생체내 지속성을 연장시키는 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 하나 이상의 T 세포를 그를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 T 세포 요법을 필요로 한다.
본 개시내용은 T 세포 요법을 필요로 하는 대상체에게 하나 이상의 T 세포를 투여하는 단계를 포함하는, T 세포 요법을 필요로 하는 대상체에서 종양을 치료하는 방법을 추가로 제공하며, 여기서 하나 이상의 T 세포는 (i) AKTi 및 (ii) 외인성 IL-7 및/또는 외인성 IL-15와 접촉된다.
본 개시내용은 또한 T 세포 요법을 필요로 하는 대상체에게 하나 이상의 T 세포를 투여하는 단계를 포함하는, T 세포 요법을 필요로 하는 대상체에서 종양의 크기를 축소 또는 감소시키거나 또는 종양의 성장을 억제하는 방법을 제공하며, 여기서 하나 이상의 T 세포는 (i) AKTi 및 (ii) 외인성 IL-7 및/또는 외인성 IL-15와 접촉된다.
특정 실시양태에서, T 세포 요법은 조작된 CAR 세포 요법 또는 조작된 TCR 세포 요법을 포함한다. 한 실시양태에서, 조작된 CAR 세포 또는 조작된 TCR 세포 요법은 대상체에서 종양을 치료한다.
도 1A - 도 1F는 제7일 및 제14일에서의 IL-2의 존재 하의 또는 IL-7 및 IL-15의 존재 하의 배양 후 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 표현형을 나타낸다. 도 1A 및 도 1C는 IL-2 및 IL-7/IL-15 처리된 세포에 대한 제7일에서의 나이브 T 세포 또는 중심 기억 T 세포 (Tcm)로 특징화된, 각각 배양된 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 총 집단의 퍼센트를 나타낸다. 도 1B 및 도 1D는 IL-2 및 IL-7/IL-15 처리된 세포에 대한 제7일에서의 이펙터 기억 T 세포 (Tem) 또는 이펙터 T 세포 (Teff)로 특징화된, 각각 배양된 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 총 집단의 퍼센트를 나타낸다. 도 1E는 IL-2 및 IL-7/IL-15 처리된 세포에 대한 제14일에서의 나이브 T 세포 또는 중심 기억 T 세포 (Tcm)로 특징화된 배양된 CD8+ T 세포의 총 집단의 퍼센트를 나타낸다. 도 1F는 IL-2 및 IL-7/IL-15 처리된 세포에 대한 제14일에서의 이펙터 기억 T 세포 (Tem) 또는 이펙터 T 세포 (Teff)로 특징화된 배양된 CD8+ T 세포의 총 집단의 퍼센트를 나타낸다. 개별 데이터 점은 개별 샘플을 반영한다. 수평선은 평균을 나타내고, 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 통계적 유의성은 p 값에 의해 나타내어진다 ("ns"는 "유의하지 않음"을 나타냄).
도 2A 내지 도 2D는 제7일 및 제14일에서의 IL-7 및 IL-15의 존재 하의 또는 IL-7, IL-15, 및 AKTi의 존재 하의 배양 후 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 표현형을 나타낸다. 도 2A 및 도 2C는 IL-7/IL-15 및 IL-7/IL-15/AKTi 처리된 세포에 대한 제7일에서의 나이브 T 세포 또는 Tcm 세포로 특징화된, 각각 배양된 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 총 집단의 퍼센트를 나타낸다. 도 2B 및 도 2D는 IL-7/IL-15 및 IL-7/IL-15/AKTi 처리된 세포에 대한 제7일에서의 Tem 또는 Teff 세포로 특징화된, 각각 배양된 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 총 집단의 퍼센트를 나타낸다. 개별 데이터 점은 개별 샘플을 반영한다. 수평선은 평균을 나타내고, 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 통계적 유의성은 p 값에 의해 나타내어진다 ("ns"는 "유의하지 않음"을 나타냄).
도 3A는 IL-2 단독; IL-2 및 AKTi; IL-7 및 IL-15; 및 IL-7, IL-15, 및 AKTi와 접촉된 공여자 T 세포의 형질도입 효율을 나타낸다. 형질도입 효율은 CD3+이고 양성 가용성 MHC-사량체 염색 (Tet+)을 갖는 총 T 세포의 퍼센트에 의해 나타내어진다. 암회색 막대는 IL-2와 접촉된 T 세포 샘플에서의 CD3+ Tet+ 세포의 퍼센트를 나타낸다. 하향-줄무늬 막대는 IL-2 및 AKTi와 접촉된 T 세포 샘플에서의 CD3+ Tet+ 세포의 퍼센트를 나타낸다. 담회색 막대는 IL-7 및 IL-15와 접촉된 T 세포 샘플에서의 CD3+ Tet+ 세포의 퍼센트를 나타낸다. 상향-줄무늬 막대는 IL-7, IL-15, 및 AKTi와 접촉된 T 세포 샘플에서의 CD3+ Tet+ 세포의 퍼센트를 나타낸다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 도 3B는 IL-2 단독; IL-2 및 AKTi; IL-7 및 IL-15; 및 IL-7, IL-15, 및 AKTi의 존재 하의 배양 후, 공여자 1 (원), 공여자 2 (정사각형), 및 공여자 3 (삼각형)으로부터의 세포에 대한 사량체 평균 형광 강도 (MFI)를 나타낸다. 통계적 분석은 사량체 MFI의 어떠한 차이도 유의하지 않았음을 나타내었다 (p=ns).
도 4A-4D는 IL-2 (원); IL-2 및 AKTi (정사각형); IL-7 및 IL-15 (삼각형); 또는 IL-7, IL-15, 및 AKTi (역삼각형)의 존재 하에 배양된 4명의 공여자로부터의 세포에 대한 7일의 과정에 걸친 세포 확장을 예시한다. 도 4A-4D는 각각 단일 공여자 세포주에 대한 세포 확장을 나타낸다. 확장 프로토콜을 위한 공급원 물질은 말초 혈액 단핵 세포였다.
도 5A-5C는 부류 I TCR (HPV-E6)로 형질도입되고 IL-2 (원); IL-2 및 AKTi (정사각형); IL-7 및 IL-15 (삼각형); 또는 IL-7, IL-15, 및 AKTi (역삼각형)의 존재 하에 배양된 3명의 공여자로부터의 세포에 대한 9일의 과정에 걸친 세포 확장을 나타낸다. 도 5A-5C는 각각 단일 공여자 세포주에 대한 세포 확장을 나타낸다. 확장 프로토콜을 위한 공급원 물질은 말초 혈액 단핵 세포였다.
도 6A-6C는 부류 II TCR (MAGE-A3)로 형질도입되고 IL-2 (원); IL-2 및 AKTi (정사각형); IL-7 및 IL-15 (삼각형); 또는 IL-7, IL-15, 및 AKTi (역삼각형)의 존재 하에 배양된 3명의 공여자로부터의 단리된 CD4+ 및 CD8+ 세포에 대한 10일의 과정에 걸친 세포 확장을 나타낸다. 도 6A-6C는 각각 단일 공여자 세포주에 대한 세포 확장을 나타낸다.
도 7A-7C는 부류 II TCR (MAGE-A3)로 형질도입되고 IL-2 (원); IL-2 및 AKTi (정사각형); IL-7 및 IL-15 (삼각형); 또는 IL-7, IL-15, 및 AKTi (역삼각형)의 존재 하에 배양된 3명의 공여자로부터의 단리된 CD4+ 세포에 대한 10일의 과정에 걸친 세포 확장을 나타낸다. 도 7A-7C는 각각 단일 공여자 세포주에 대한 세포 확장을 나타낸다.
도 8A-8C는 부류 II TCR (MAGE-A3)로 형질도입되고 IL-2 (원); IL-2 및 AKTi (정사각형); IL-7 및 IL-15 (삼각형); 또는 IL-7, IL-15, 및 AKTi (역삼각형)의 존재 하에 배양된 3명의 공여자로부터의 단리된 CD8+ 세포에 대한 10일의 과정에 걸친 세포 확장을 나타낸다. 도 8A-8C는 각각 단일 공여자 세포주로부터 세포를 나타낸다.
도 9A-9D는 부류 II TCR (MAGE-A3)로 형질도입된 3명의 공여자로부터의 CD4+ 및 CD8+ 세포에 대한 8일의 과정에 걸친 세포 확장을 나타낸다. 세포는 IL-7 및 IL-15 (도 9A: 원; 도 9B-9C: 정사각형) 또는 IL-7, IL-15, 및 AKTi (도 9A: 정사각형; 도 9B-9C: 원)의 존재 하에 배양되었다. 세포는 주리(XURI)™ 세포 확장 시스템에서 큰 제조 규모로 성장되었다. 도 9A-9D는 각각 단일 공여자 세포주에 대한 세포 확장을 나타낸다. 확장 프로토콜을 위한 공급원 물질은 단리된 CD4+ 및 CD8+ 세포였다.
도 10은 부류 I TCR (HPV-E6)로 형질도입된 T 세포에 대한 형질도입 효율을 나타낸다. 세포는 IL-2 단독; IL-2 및 AKTi; IL-7 및 IL-15; 또는 IL-7, IL-15, 및 AKTi의 존재 하에 배양되었다. 세포는 제2일에 형질도입되었고, 형질도입 효율은 형질도입된 TCR을 특이적으로 인식하는 항-mTCRb 항체로 세포를 염색함으로써 제10일에 측정되었다. 각각의 배양 조건 (x-축)에 대해 양성 항-mTCRb 염색을 나타내는 세포의 퍼센트 (y-축)가 제시된다.
도 11A-11F는 2명의 공여자로부터의 CD4+/CD8+ T 세포의 부류 II TCR (MAGE-A3)로 형질도입된 T 세포에 대한 형질도입 효율을 나타낸다. 세포는 IL-2 단독; IL-2 및 AKTi; IL-7 및 IL-15; 또는 IL-7, IL-15, 및 AKTi의 존재 하에 배양되었다. 세포는 제2일에 형질도입되었고, 형질도입 효율은 항-mTCRb 항체 (mC TCR PE)로 세포를 염색함으로써 제10일에 측정되었다 (도 11A 및 11D). 각각의 배양 조건에 대한 항-mTCRb 염색의 MFI는 도 11B 및 11E에 제시된다. 도 11C 및 11F는 공여자 둘 다에 대한 CDR 및 형질도입된 TCR을 발현하는 세포의 분포의 FACS 분석을 나타낸다.
도 12는 4회의 제조 규모 실행 (16, 21, 22, 및 23)으로부터의 T 세포에 대한 부류 II TCR (MAGE-A3)로 형질도입된 T 세포에 대한 형질도입 효율을 나타낸다. 각각의 실행에 대해, 세포는 2개의 배양 조건으로 분류되었다: 나타내어진 바와 같이 IL-7 및 IL-15의 첨가 및 IL-7, IL-15, 및 AKTi의 첨가. 형질도입 효율은 항-mTCRb 항체 (mC TCR PE)로 세포를 염색함으로써 측정되었다. 각각의 실행 (x-축)에 대해 양성 항-mTCRb 염색을 나타내는 세포의 퍼센트 (y-축)가 제시된다.
도 13A-13F는 부류 II TCR (MAGE-A3)로 형질도입되고 AKTi의 존재 및 부재 하의 다양한 조건 하에 배양된 CD4+/CD8+ T 세포의 분화 상태를 나타낸다. 공여자 1 (도 13A 및 13D), 공여자 2 (도 13B 및 13E), 및 공여자 3 (도 13C 및 13E)으로부터의 T 세포는 IL-2 단독; IL-2 및 AKTi; IL-7 및 IL-15; 또는 IL-7, IL-15, 및 AKTi의 존재 하에 배양되고, 이어서 분화의 초기 단계에 있는 세포의 마커인 CD62L 발현에 대해 염색되었다. 각각의 공여자에 대한 각각의 배양 조건 (x-축)에 대한 CD3+ 및 CD62L+ 세포의 퍼센트 (y-축)는 도 13A-13C에 나타내어진다. 각각의 공여자 세포주에 대한 각각의 배양 조건 (x-축)에 대한 CD62L 염색의 MFI (y-축)는 도 13D-13E에 제시된다.
도 14A-14B는 3회의 제조 규모 실행 (21, 22, 및 23)으로부터의 T 세포에 의한 시토카인 생산에 의해 입증된 바와 같은, T 세포 기능에 대한 배양 조건의 효과를 나타낸다. 부류 II TCR (MAGE-A3)로 형질도입된 공여자 T 세포는 IL-7 및 IL-15 또는 IL-7, IL-15, 및 AKTi의 존재 하에 주리™ 생물반응기 세포 확장 시스템에서 배양되었다. CD3 및 IFNg (도 14A) 및 CD3 및 TNFa (도 14B)에 대해 양성으로 염색된 세포의 퍼센트는 각각의 실행 21, 22, 및 23에 대해 AKTi의 존재 또는 부재 하에 배양된 세포에 대해 제시된다.
도 15는 부류 II TCR (MAGE-A3)로 형질도입되고 양성 및 음성 표적 종양 세포주와 공동배양된 공여자 T 세포에 대한 IFNg 생산에 의해 입증된 바와 같은 T 세포 활성을 나타낸다. 2회의 제조 규모 실행 (21 및 22)으로부터의 T 세포는 부류 II TCR로 형질도입되고 IL-7 및 IL-15 또는 IL-7, IL-15, 및 AKTi의 존재 하에 주리™ 생물반응기 세포 확장 시스템에서 배양되었다. 세포는 이어서 TCR 표적 항원을 발현하는 종양 세포주 (H1299, HT1197, 또는 HT1367) 또는 TCR 표적 항원을 발현하지 않는 종양 세포주 (DU145, SK MEL 28, 또는 SK MEL 5)와 함께 밤새 공동배양되었다. T 세포 활성은 각각의 배양 조건에 대한 각각의 세포주 (x-축)에 대한 pg/mL로서 제시된 IFNg 생산 (y-축)에 의해 나타내어진다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 16A-16D는 부류 I TCR (HPV-E6)로 형질도입되고 AKTi의 존재 또는 부재 하에 배양된 3개의 공여자 T 세포주에 대한 IFNg 생산에 의해 입증된 바와 같은 T 세포 활성을 나타낸다. 도 16A는 IL-2 단독; IL-2 및 AKTi; IL-7 및 IL-15; 또는 IL-7, IL-15, 및 AKTi의 존재 하에 TCR 항원을 발현하는 종양 세포주 (Caski; 자궁경부 암종 세포주)와의 공동배양 후 3명의 공여자로부터의 T 세포 (x-축)에 의해 생산된 IFNg의 양 (pg/mL; y-축)을 나타낸다. 도 17B-17D는 공여자 1 (도 16B), 공여자 2 (도 16C), 및 공여자 3 (도 16D) T 세포에 대한 IL-2 단독 (원); IL-2 및 AKTi (정사각형); IL-7 및 IL-15 (삼각형); 또는 IL-7, IL-15, 및 AKTi (역삼각형)의 존재 하에, 적정된 양의 SCR-특이적 펩티드 (표적 펩티드; x-축)와 함께 로딩된, T2 세포와의 공동배양 후 공여자 T 세포에 대한 IFNg 생산 (pg/mL; y-축)을 나타낸다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 17A-17D는 AKTi의 존재 (도 17B 및 17D) 또는 부재 (도 17A 및 17C) 하의 배양 후 T 세포 증식을 나타내는 FACS 히스토그램이다. 공여자 3으로부터의 T 세포는 IL-2 (도 17A), IL-2 및 AKTi (도 17B), IL-7 및 IL-15 (도 17C) 및 IL-7, IL-15 및 AKTi (도 17D) 중에서 성장되고, 부류 II TCR (MAGE-A3)로 형질도입되고, TCR 항원을 발현하는 종양 세포주와 함께 4일 동안 공동배양되었다. T 세포 증식은 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르 (CFSE) 염색에 의해 측정되었다 (도 17A-17D). L = 후기 증식; M = 중기 증식; 및 E = 초기 증식.
도 18A 및 18B는 2회의 대규모 제조 배양 실행: 21 (도 18A) 및 22 (도 18B)로부터의 T 세포의 세포 증식을 나타내는 FACS 히스토그램이다. T 세포는 IL-2 중에서 및 IL-7, IL-15 및 AKTi 중에서 성장되고 부류 II TCR (MAGE-A3)로 형질도입되었다. T 세포는 4일 동안 IL-7 및 IL-15 또는 IL-7, IL-15, 및 AKTi의 존재 하에 TCR 표적 항원을 발현하는 종양 세포주 ("양성 표적") 또는 TCR 표적 항원을 발현하지 않는 종양 세포주 ("음성 표적")와 함께 공동배양되었다. T 세포 증식은 각각의 실행 21 (도 18A) 및 22 (도 18B)에 대해 도시된 바와 같이, CFSE 염색에 의해 측정되고, 모드에 대해 정규화되고, comp-FITC-A 염색과 비교되었다.
본 발명은 T 세포 요법에 사용하기 위해 T 세포를 제조하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 하나 이상의 T 세포를 AKTi, 및 외인성 IL-7 및 외인성 IL-15 중 적어도 하나와 접촉시킴으로써 시험관내에서 T 세포 성숙 또는 분화를 조정하는, 예를 들어, 지연시키거나 또는 억제하는 방법에 관한 것이다. T 세포 성숙 또는 분화를 지연시키거나 또는 억제함으로써, 공여자 T 세포의 집합은 미성숙한, 덜 분화된 T 세포 (예를 들어, 나이브 T 세포 또는 중심 기억 Tcm 세포)가 풍부화될 수 있으며, 이는 대상체, 예를 들어, 환자에게 투여되면 하나 이상의 T 세포의 잠재적 지속성을 증가시킨다. 그 결과, 미성숙 T 세포의 풍부화된 집단은 혼합된 분화 단계에 있는 T 세포의 집단보다 지속적인 항종양 효과를 생성할 가능성이 더 크다.
정의
본 개시내용이 보다 용이하게 이해될 수 있도록, 특정 용어가 먼저 정의된다. 본 출원에 사용된 바와 같이, 본원에 달리 명확하게 제공된 경우를 제외하고는, 각각의 하기 용어는 하기 제시된 의미를 가질 것이다. 추가의 정의가 본 출원 전체에 걸쳐 제시된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 본 개시내용이 관련된 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어, 문헌 [Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; 및 the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press]은 본 개시내용에 사용된 많은 용어의 일반적 사전을 통상의 기술자에게 제공한다.
단위, 접두어, 및 기호는 시스템 인터내셔날 드 유니테(Systeme International de Unites) (SI)에 의해 용인된 형태로 나타내어진다. 수치 범위는 범위를 정의하는 수를 포함한다. 본원에 제공된 표제는 본 개시내용의 다양한 측면을 제한하는 것이 아니며, 이는 본 명세서 전체를 참조할 수 있다. 따라서, 바로 하기에 정의되는 용어는 명세서를 그 전문으로 참조하여 보다 충분히 정의된다.
본원에 사용된 단수 형태는 임의의 언급되거나 또는 열거된 성분 중 "하나 이상"을 지칭하는 것으로 이해되어야 한다.
용어 "약" 또는 "본질적으로 포함하는"은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정된 바와 같은 특정한 값 또는 조성에 대해 허용 오차 범위 내의 값 또는 조성을 지칭하며, 이는 부분적으로, 값 또는 조성이 측정되거나 또는 결정되는 방법, 즉 측정 시스템의 한계에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, "약" 또는 "본질적으로 포함하는"은 관련 기술분야의 관례에 따라 1 또는 1 초과의 표준 편차 내에 존재한다는 것을 의미할 수 있다. 대안적으로, "약" 또는 "로 본질적으로 구성되는"은 10%까지의 범위 (즉, ±10%)를 의미할 수 있다. 예를 들어, 약 3 mg은 2.7 mg 내지 3.3 mg의 임의의 수를 포함할 수 있다 (10%의 경우). 게다가, 특히 생물학적 시스템 또는 과정과 관련하여, 용어는 값의 최대 한 자릿수 또는 최대 5-배를 의미할 수 있다. 특정한 값 또는 조성이 본 출원 및 청구범위에 제공되는 경우, 달리 언급되지 않는 한, "약" 또는 "본질적으로 포함하는"의 의미는 그 특정한 값 또는 조성에 대한 허용 오차 범위 내에 존재하는 것으로 가정되어야 한다.
본원에 기재된 바와 같이, 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비 범위 또는 정수 범위는 달리 나타내지 않는 한, 언급된 범위 내의 임의의 정수 값, 및 적절한 경우에, 그의 분율 (예컨대 정수의 1/10 및 1/100)을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에 사용된 경우의 용어 "및/또는"은 2개의 명시된 특색 또는 성분 각각을 함께 또는 따로따로 구체적으로 개시하는 것으로서 이해되어야 한다. 따라서, 본원에서 "A 및/또는 B"와 같은 어구에서 사용된 용어 "및/또는"은 "A 및 B", "A 또는 B", "A" (단독), 및 "B" (단독)를 포함하는 것으로 의도된다. 마찬가지로, "A, B, 및/또는 C"와 같은 어구에 사용된 용어 "및/또는"은 하기 측면 각각을 포괄하도록 의도된다: A, B, 및 C; A, B, 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A (단독); B (단독); 및 C (단독).
측면이 표현 "포함하는"을 사용하여 본원에 기재된 경우에, "로 이루어진" 및/또는 "로 본질적으로 이루어진"과 관련하여 기재된 다른 유사한 측면이 또한 제공되는 것으로 이해된다. 용어 "활성화" 또는 "활성화된"은 검출가능한 세포 증식을 유도하도록 충분히 자극된 면역 세포, 예를 들어, T 세포의 상태를 지칭한다. 활성화는 또한 유도된 시토카인 생산 및 검출가능한 이펙터 기능과 연관될 수 있다. 특히, 용어 "활성화된 T 세포"는 세포 분열이 진행 중인 T 세포를 지칭한다. T 세포 활성화는 CD57, PD1, CD107a, CD25, CD137, CD69, 및/또는 CD71을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 하나 이상의 바이오마커의 증가된 T 세포 발현을 특징으로 할 수 있다.
"투여하는"은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다양한 방법 및 전달 시스템 중 임의의 것을 사용하여 작용제를 대상체에게 물리적으로 도입하는 것을 지칭한다. 본원에 개시된 방법에 의해 제조된 T 세포에 대한 예시적인 투여 경로는 예를 들어 주사 또는 주입에 의한 정맥내, 근육내, 피하, 복강내, 척수 또는 다른 비경구 투여 경로를 포함한다. 본원에 사용된 어구 "비경구 투여"는 통상적으로 주사에 의한, 경장 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미하고, 비제한적으로, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 림프내, 병변내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 각피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입 뿐만 아니라, 생체내 전기천공을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 방법에 의해 제조된 T 세포는 비경구 경로를 통해, 예를 들어, 경구로 투여된다. 다른 비-비경구 경로는 국소, 표피 또는 점막 투여 경로, 예를 들어 비강내, 질내, 직장, 설하 또는 국소 투여를 포함한다. 투여는 또한 예를 들어 1회, 복수회, 및/또는 하나 이상의 연장된 기간에 걸쳐 수행될 수 있다.
용어 "AKT 억제제," "AKTI," 또는 "AKTi"는 상호교환가능하게 사용될 수 있고 AKT의 활성을 차단하거나, 저하시키거나, 또는 억제할 수 있는 소분자, 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, DNA 또는 RNA), 또는 폴리펩티드 (예를 들어, 항체 또는 그의 항원-결합 부분)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 임의의 분자 (예를 들어, AKT 길항제)를 지칭한다. AKT는 단백질 키나제 B 또는 PKB로도 공지된 세린/트레오닌 키나제이다. AKT 억제제는 예를 들어, AKT에 결합함으로써 AKT에 직접적으로 작용할 수 있거나, 또는 이는 예를 들어, AKT와 결합 파트너 사이의 상호작용을 방해함으로써 또는 PI3K-AKT-mTOR 경로의 또 다른 구성원의 활성을 억제함으로써 간접적으로 작용할 수 있다. AKTi의 비제한적 예는 본 출원의 다른 섹션에 제시된다.
용어 "항체" (Ab)는, 비제한적으로, 항원에 특이적으로 결합하는 이뮤노글로불린을 포함한다. 일반적으로, 항체는 디술피드 결합에 의해 상호연결된 적어도 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)를 포함할 수 있다. 각각의 H 쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 VH로서 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 3 또는 4개의 불변 도메인, CH1, CH2 CH3, 및/또는 CH4를 포함할 수 있다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 VL로서 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 1개 불변 도메인, CL을 포함할 수 있다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역 (FR)으로 명명된, 보다 보존되는 영역이 점재된, 상보성 결정 영역 (CDR)으로 명명된 초가변 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단으로부터 카르복시-말단으로 하기 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR을 포함한다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원, 예를 들어, AKT와 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다.
이뮤노글로불린은 IgA, 분비형 IgA, IgG 및 IgM을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 통상적으로 공지된 이소형 중 임의의 것으로부터 유래할 수 있다. IgG 하위부류는 또한 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. "이소형"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 코딩되는 Ab 부류 또는 하위부류 (예를 들어, IgM 또는 IgG1)를 지칭한다. 용어 "항체"는, 예로서, 자연 발생 및 비-자연 발생 둘 다의 Ab; 모노클로날 및 폴리클로날 Ab; 키메라 및 인간화 Ab; 인간 또는 비인간 Ab; 완전 합성 Ab; 및 단일 쇄 Ab를 포함한다. 비인간 Ab는 인간에서 그의 면역원성을 저하시키기 위한 재조합 방법에 의해 인간화될 수 있다. 명시적으로 언급되지 않는 경우에, 및 문맥상 달리 나타내지 않는 한, 용어 "항체"는 또한 상기 언급된 이뮤노글로불린 중 임의의 것의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 부분을 포함하고, 1가 및 2가 단편 또는 부분, 및 단일 쇄 Ab를 포함한다.
"항원 결합 분자" 또는 "항체 단편"은 전체보다 적은 항체의 임의의 부분을 지칭한다. 항원 결합 분자는 항원 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함할 수 있다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편, dAb, 선형 항체, scFv 항체, 및 항원 결합 분자들로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
용어 "자가"는 이후에 자신이 재도입될 동일한 개체로부터 유래된 임의의 물질을 지칭한다. 예를 들어, 본원에 기재된 조작된 자가 세포 요법 (eACT™) 방법은 공여자, 예를 들어, 환자로부터 림프구를 수집하고, 이어서 이는 예를 들어 CAR 구축물을 발현하도록 조작되고, 이어서 동일한 공여자, 예를 들어, 환자에게 다시 투여되는 것을 수반한다.
용어 "동종"은 한 개체로부터 유래되고 이어서 동일한 종의 또 다른 개체에 도입되는 임의의 물질, 예를 들어, 동종 T 세포 이식을 지칭한다.
"암"은 신체 내에서의 비정상 세포의 비제어된 성장을 특징으로 하는 다양한 질환의 광범위한 군을 지칭한다. 비조절된 세포 분열 및 성장은 이웃 조직을 침습하는 악성 종양의 형성을 일으키고 또한 림프계 또는 혈류를 통해 신체의 원위 부분으로 전이할 수 있다. "암" 또는 "암 조직"은 다양한 병기에 있는 종양을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 암 또는 종양은 0기이며, 예를 들어 암 또는 종양은 발생의 매우 초기이고 전이되지 않았다. 일부 실시양태에서, 암 또는 종양은 I기이며, 예를 들어 암 또는 종양은 크기가 비교적 작고, 근처의 조직으로 퍼지지 않았고, 전이되지 않았다. 다른 실시양태에서, 암 또는 종양은 II기 또는 III기이며, 예를 들어, 암 또는 종양은 0기 또는 I기에서보다 더 크고, 이웃 조직 내로 성장하였으나, 잠재적으로 림프절로는 제외하고, 전이하지 않았다. 다른 실시양태에서, 암 또는 종양은 IV기이며, 예를 들어 암 또는 종양은 전이하였다. IV기는 진행성 또는 전이성 암으로도 지칭될 수 있다.
본원에 사용된 "항종양 효과"는 종양 부피의 감소, 종양 성장의 억제, 종양 세포 수의 감소, 종양 세포 증식의 감소, 전이 수의 감소, 전체 또는 무진행 생존의 증가, 기대 수명의 증가, 또는 종양과 연관된 다양한 생리학적 증상의 호전으로서 나타날 수 있는 생물학적 효과를 지칭한다. 항종양 효과는 또한 종양 발생의 방지, 예를 들어, 백신을 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 PFS로 약기될 수 있는 용어 "무진행 생존"은 치료일로부터 악성 림프종에 대한 IWG 반응 기준(IWG Response Criteria for Malignant Lymphoma) 개정판에 따른 질환 진행일 또는 임의의 원인으로부터의 사망일까지의 시간을 지칭한다.
"질환 진행"은 방사선사진 또는 다른 방법에서의 악성 병변의 측정이 유해 사례로서 보고되지 않아야 하는 것에 의해 평가된다. 징후 또는 증상의 부재 하에 질환 진행으로 인한 사망은 원발성 종양 유형 (예를 들어, DLBCL)으로서 보고되어야 한다.
본원에 사용된 바와 같은, DOR로 약기될 수 있는 "반응 지속시간"은 대상체의 첫번째 객관적 반응에서 악성 림프종에 대한 IWG 반응 기준 개정판에 따라 질환 진행 확인일 또는 사망일까지의 기간을 지칭한다.
OS로 약기될 수 있는 용어 "전체 생존"은 치료일로부터 사망일까지의 시간으로서 정의된다.
본원에 사용된 "시토카인"은 대식세포, B 세포, T 세포, 및 비만 세포를 포함한 면역 세포에 의해 방출되어 면역 반응을 전파할 수 있는 비-항체 단백질을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 시토카인은 T 세포 요법에 반응하여 방출된다. 특정 실시양태에서, T 세포 요법에 반응하여 분비된 그 시토카인은 효과적인 T 세포 요법의 징후일 수 있다.
본원에 사용된 "치료 유효량" 또는 "치료 유효 투여량"은 본 방법에 의해 생산되고, 단독으로 또는 또 다른 치료제와 조합되어 사용되는 경우에 대상체를 질환의 발병으로부터 보호하거나 또는 질환 증상 중증도의 감소, 질환의 무증상 기간의 빈도 및 지속기간의 증가, 또는 질환 고통으로 인한 손상 또는 장애의 방지에 의해 입증되는 질환 퇴행을 촉진하는 T 세포 또는 DC 세포의 양을 지칭한다. 질환 퇴행을 촉진하는 T 세포 또는 DC 세포의 능력은 예컨대, 임상 시험 동안 인간 대상체에서, 인간에서의 효능을 예측하는 동물 모델 시스템에서, 또는 시험관내 검정에서 작용제의 활성을 검정함으로써 숙련된 진료의에게 공지된 다양한 방법을 사용하여 평가될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "유효량" 또는 "유효 용량"은 T 세포 성숙의 하나 이상의 억제제 (예를 들어, AKTi, IL-7, 및 IL-15)의 양을 지칭하며, 이는 함께 목적하는 반응을 도출한다. 따라서, T 세포 분화 또는 성숙을 지연시키거나 또는 억제하기 위한 AKTi의 유효량, IL-7의 유효량, 및 IL-15의 유효량은 AKTi 단독의 유효량, IL-7 단독의 유효량, 또는 IL-15 단독의 유효량보다 더 낮을 수 있다. 다른 실시양태에서, AKTi의 유효 용량은 AKT 활성을 목적하는 양만큼, 예컨대 적어도 약 10%, 적어도 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 약 100%만큼 저하시키는 AKTi의 양, 예를 들어 농도를 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "림프구"는 자연 킬러 (NK) 세포, T 세포, 또는 B 세포를 포함할 수 있다. NK 세포는 선천성 면역계의 주요 성분을 나타내는 세포독성 (세포 독성) 림프구 유형이다. NK 세포는 종양 및 바이러스에 감염된 세포를 거부한다. 이는 아폽토시스 또는 프로그램화된 세포 사멸의 과정을 통해 작용한다. 이들은 세포를 사멸시키기 위해 활성화를 필요로 하지 않기 때문에 "자연 킬러"로 명명된다. T-세포는 세포-매개-면역 (어떠한 항체도 수반되지 않음)에서 주요 역할을 한다. 그의 T-세포 수용체 (TCR)가 이들을 다른 림프구 유형으로부터 구별한다. 면역계의 특수 기관인 흉선이 T 세포의 성숙을 주로 담당한다.
여러 유형의 T-세포, 즉 헬퍼 T-세포 (예를 들어, CD4+ 세포, 이펙터 TEFF 세포), 세포독성 T-세포 (TC, 세포독성 T 림프구, CTL, T-킬러 세포, 세포용해 T 세포, CD8+ T-세포 또는 킬러 T 세포로도 공지됨), 기억 T-세포 ((i) 줄기 기억 TSCM 세포, 예컨대 나이브 세포는 CD45RO-, CCR7+, CD45RA+, CD62L+ (L-셀렉틴), CD27+, CD28+ 및 IL-7Rα+이지만, 이들은 또한 다량의 CD95, IL-2Rβ, CXCR3, 및 LFA-1을 발현하고, 기억 세포에 독특한 수많은 기능 속성을 나타내고; (ii) 중심 기억 TCM 세포는 L-셀렉틴을 발현하고, CCR7+ 및 CD45RO+이고 이들은 IL-2를 분비하지만 IFNγ 또는 IL-4를 분비하지 않고, (iii) 그러나, 이펙터 기억 TEM 세포는 L-셀렉틴 또는 CCR7을 발현하지 않지만 CD45RO를 발현하고 이펙터 시토카인 예컨대 IFNγ 및 IL-4를 생산함), 조절 T-세포 (Treg, 억제인자 T 세포, 또는 CD4+CD25+ 조절 T 세포), 자연 킬러 T-세포 (NKT), 및 감마 델타 T-세포가 존재한다. 종양 내에서 발견되는 T 세포는 "종양 침윤 림프구" 또는 " TIL"로 지칭된다. 다른 한편으로는, B-세포는 체액성 면역 (항체가 수반됨)에서 주요한 역할을 한다. 이는 항체 및 항원을 생성하고, 항원-제시 세포 (APC)의 역할을 수행하고, 항원 상호작용에 의한 활성화 후에 기억 B-세포로 변한다. 포유동물에서, 미성숙 B-세포는 그의 명칭이 유래되는 골수에서 형성된다.
"나이브" T 세포는 면역학적으로 미분화로 남아있는 성숙 T 세포를 지칭한다. 흉선에서의 양성 및 음성 선택 후에, T 세포는 CD4+ 또는 CD8+ 나이브 T 세포로서 나타난다. 그의 나이브 상태에서, T 세포는 L-셀렉틴 (CD62L+), IL-7 수용체-α (IL-7R-α), 및 CD132를 발현하나, 이들은 CD25, CD44, CD69, 또는 CD45RO를 발현하지는 않는다. 본원에 사용된 "미성숙"은 또한 나이브 T 세포 또는 미성숙 T 세포의 표현형 특징을 나타내는 T 세포, 예컨대 TSCM 세포 또는 TCM 세포를 지칭할 수 있다. 예를 들어, 미성숙 T 세포는 L-셀렉틴 (CD62L+), IL-7Rα, CD132, CCR7, CD45RA, CD45RO, CD27, CD28, CD95, IL-2Rβ, CXCR3, 및 LFA-1 중 하나 이상을 발현할 수 있다. 나이브 또는 미성숙 T 세포는 최종 분화된 이펙터 T 세포, 예컨대 TEM 세포 및 TEFF 세포와 대조될 수 있다.
본원에 언급된 "T 세포 기능"은 건강한 T 세포의 정상적인 특징을 지칭한다. 일부 실시양태에서, T 세포 기능은 T 세포 증식을 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 기능은 T 세포 활성을 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 기능은 세포용해 활성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법, 예를 들어, AKT 억제제 (및 임의로 IL-7 및/또는 IL-15)의 존재 하에 T 세포를 배양하는 것은 하나 이상의 T 세포 기능을 증가시킴으로써, T 세포를 T 세포 요법에 보다 적합하고/거나 보다 강력하게 만든다. 일부 실시양태에서, 본 방법에 따라 배양된 T 세포는 AKT 억제제 (또는 AKTi, IL-7, 및 IL-15)가 결여된 조건 하에 배양된 T 세포와 비교하여 증가된 T 세포 기능을 갖는다. 특정 실시양태에서, 본 방법에 따라 배양된 T 세포는 AKT 억제제 (또는 AKTi, IL-7, 및 IL-15)가 결여된 조건 하에 배양된 T 세포와 비교하여 증가된 T 세포 증식을 갖는다. 특정 실시양태에서, 본 방법에 따라 배양된 T 세포는 AKT 억제제 (또는 AKTi, IL-7, 및 IL-15)가 결여된 조건 하에 배양된 T 세포와 비교하여 증가된 T 세포 활성을 갖는다. 특정 실시양태에서, 본 방법에 따라 배양된 T 세포는 AKT 억제제 (또는 AKTi, IL-7, 및 IL-15)가 결여된 조건 하에 배양된 T 세포와 비교하여 증가된 세포용해 활성을 갖는다.
본원에 사용된 세포 "증식"은 세포 분열을 통해 다수로 성장하는 T 세포의 능력을 지칭한다. 증식은 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르 (CFSE)로 세포를 염색함으로써 측정될 수 있다. 세포 증식은 시험관내에서, 예를 들어, T 세포 배양 동안, 또는 생체내에서, 예를 들어, T 세포 요법의 투여 후에 발생할 수 있다.
본원에 사용된 "T 세포 활성"은 건강한 T 세포에게는 흔한 임의의 활성을 지칭한다. 일부 실시양태에서, T 세포 활성은 시토카인 생산을 포함한다. 특정 실시양태에서, T 세포 활성은 인터페론 감마 (IFNg), 조직 괴사 인자 알파 (TNFa), 및 둘 다로부터 선택된 하나 이상의 시토카인의 생산을 포함한다.
본원에 사용된 "세포용해 활성" 또는 "세포독성"은 표적 세포를 파괴하는 T 세포의 능력을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 표적 세포는 암 세포, 예를 들어, 종양 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 T 세포 수용체 (TCR)를 발현하고, 표적 세포는 표적 항원을 발현한다.
용어 "유전자 조작된", "유전자 편집", 또는 "조작된"은 코딩 또는 비-코딩 영역 또는 그의 부분을 결실시키거나 또는 코딩 영역 또는 그의 부분을 삽입하는 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 세포의 게놈을 변형시키는 방법을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 변형되는 세포는 림프구, 예를 들어, T 세포이며, 이는 환자 또는 공여자로부터 수득될 수 있다. 세포는 세포의 게놈 내로 혼입되는 외인성 구축물, 예컨대, 예를 들어, 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 T 세포 수용체 (TCR)를 발현하도록 변형될 수 있다.
"면역 반응"은 침입 병원체, 병원체로 감염된 세포 또는 조직, 암성 또는 다른 비정상 세포, 또는 자가면역 또는 병리학적 염증의 경우에 정상 인간 세포 또는 조직을 선택적으로 표적화하고/거나, 이에 결합하고/거나, 이에 대해 손상을 입히고/거나, 이를 파괴시키고/거나, 이를 척추동물의 신체로부터 제거시키는, 면역계의 세포 (예를 들어, T 림프구, B 림프구, 자연 킬러 (NK) 세포, 대식세포, 호산구, 비만 세포, 수지상 세포 및 호중구), 및 이들 세포 중 임의의 것 또는 간에 의해 생산된 가용성 거대분자 (Ab, 시토카인, 및 보체 포함)의 작용을 지칭한다.
용어 "면역요법"은 면역 반응을 유도하거나, 증진시키거나, 억제하거나 또는 달리 변형시키는 것을 포함하는 방법에 의해, 질환을 앓고 있거나, 또는 질환에 걸릴 위험이 있거나 또는 질환의 재발을 앓게 될 위험이 있는 대상체의 치료를 지칭한다. 면역요법의 예는 T 세포 요법을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. T 세포 요법은 입양 T 세포 요법, 종양-침윤 림프구 (TIL) 면역요법, 자가 세포 요법, 조작된 자가 세포 요법 (eACT™), 및 동종 T 세포 이식을 포함할 수 있다. 그러나, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 개시된 T 세포를 제조하는 방법이 임의의 이식된 T 세포 요법의 유효성을 증진시킬 것임을 인식할 것이다. T 세포 요법의 예는 미국 특허 공개 번호 2014/0154228 및 2002/0006409, 미국 특허 번호 5,728,388, 및 국제 공개 번호 WO 2008/081035에 기재되어 있다.
면역요법의 T 세포는 관련 기술분야에 공지된 임의의 공급원으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, T 세포는 시험관내에서 조혈 줄기 세포 집단으로부터 분화될 수 있거나, 또는 T 세포는 공여자로부터 수득될 수 있다. 공여자는 대상체, 예를 들어, 항암 치료를 필요로 하는 대상체일 수 있다. T 세포는 예를 들어, 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위로부터의 조직, 복수, 흉막 삼출물, 비장 조직, 및 종양으로부터 수득될 수 있다. 게다가, T 세포는 관련 기술분야에서 입수가능한 하나 이상의 T 세포주로부터 유래될 수 있다. T 세포는 또한 통상의 기술자에게 공지된 다수의 기술, 예컨대 피콜(FICOLL)™ 분리 및/또는 분리반출술을 사용하여 대상체로부터 수집된 단위 혈액으로부터 수득될 수 있다. T 세포는 또한 인간 흉선 환경을 모조하여 1차 및 재프로그램화된 만능 줄기 세포로부터의 T-세포의 충분한 생체외 분화를 지지하는 인공 흉선 유사기관 (ATO) 세포 배양 시스템으로부터 수득될 수 있다. T 세포 요법을 위해 T 세포를 단리하는 추가의 방법은 미국 특허 공개 번호 2013/0287748에 개시되어 있으며, 이는 전문이 본원에 참조로 포함된다.
"eACT™"으로 약기될 수 있는 용어 "조작된 자가 세포 요법" (입양 세포 전달로도 공지됨)은 환자 자신의 T 세포가 수집되고, 후속하여 하나 이상의 특정한 종양 세포 또는 악성종양의 세포 표면에서 발현된 하나 이상의 항원을 인식하고 표적화하도록 이를 유전자 변경시키는 과정이다. T 세포는 예를 들어, 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 T 세포 수용체 (TCR)를 발현하도록 조작될 수 있다. CAR 양성 (+) T 세포는 공동자극 도메인 및 활성화 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 부분에 연결된, 특정한 종양 항원에 대한 특이성이 있는 세포외 단일 쇄 가변 단편 (scFv)을 발현하도록 조작된다. 공동자극 도메인은 예를 들어, CD28, CTLA4, CD16, OX-40, 4-1BB/CD137, CD2, CD7, CD27, CD30, CD40, 프로그램화된 사멸-1 (PD-1), 프로그램화된 사멸 리간드-1 (PD-L1), 유도성 T 세포 공동자극인자 (ICOS), ICOS-L, 림프구 기능-연관 항원-1 (LFA-1 (CDl la/CD18), CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD247, CD276 (B7-H3), LIGHT (종양 괴사 인자 슈퍼패밀리 구성원 14; TNFSF14), NKG2C, Ig 알파 (CD79a), DAP-10, Fc 감마 수용체, MHC 부류 I 분자, TNF 수용체 단백질, 이뮤노글로불린-유사 단백질, 시토카인 수용체, 인테그린, 신호전달 림프구성 활성화 분자 (SLAM 단백질), 활성화 NK 세포 수용체, BTLA, 톨 리간드 수용체, ICAM-1, B7-H3, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8, CD8알파, CD8베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CDl ld, ITGAE, CD103, ITGAL, CDl la, LFA-1, ITGAM, CDl lb, ITGAX, CDl lc, ITGBl, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRT AM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Lyl08), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드, 또는 그의 임의의 조합으로부터 유래될 수 있다. 활성화 도메인은, 예를 들어, CD3, 예컨대 CD3 제타, 엡실론, 델타, 감마 등으로부터 유래될 수 있다. 특정 실시양태에서, CAR은 2, 3, 4개, 또는 그 초과의 공동자극 도메인을 갖도록 설계된다. CAR scFv는 모든 정상 B 세포 및 NHL, CLL, 및 비-T 세포 ALL을 포함하나 이에 제한되지는 않는 B 세포 악성종양을 포함한 B 세포 계통에서의 세포에 의해 발현되는 막횡단 단백질인, 예를 들어, CD19를 표적화하도록 설계될 수 있다. 예시적인 CAR+ T 세포 요법 및 구축물은 미국 특허 공개 번호 2013/0287748, 2014/0227237, 2014/0099309, 및 2014/0050708에 기재되어 있고, 이들은 그의 전문이 참조로 포함된다.
본원에 사용된 "환자"는 암 (예를 들어, 림프종 또는 백혈병)을 앓고 있는 임의의 인간을 포함한다. 용어 "대상체" 및 "환자"는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 용어 "공여자 대상체"는 본원에서 세포가 추가의 시험관내 조작을 위해 수득되는 대상체를 지칭한다. 공여자 대상체는 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 세포의 집단으로 치료되는 암 환자 (즉, 자가 공여자)일 수 있거나, 또는 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 세포의 집단의 생성 시에 상이한 개체 또는 암 환자의 치료를 위해 사용될 림프구 샘플을 공여하는 개체 (즉, 동종 공여자)일 수 있다. 본 방법에 의해 제조된 세포를 받는 그 대상체는 "수용자 대상체"로 지칭될 수 있다.
본원에 사용된 "자극"은 자극성 분자와 그의 동족 리간드의 결합에 의해 유도된 1차 반응을 지칭하고, 여기서 결합은 신호 전달 사건을 매개한다. "자극성 분자"는 항원 제시 세포 상에 존재하는 동족 자극성 리간드와 특이적으로 결합하는 T 세포 상의 분자, 예를 들어, T 세포 수용체 (TCR)/CD3 복합체이다. "자극성 리간드"는 항원 제시 세포 (예를 들어, 인공 항원 제시 세포 (aAPC), 수지상 세포, B-세포 등) 상에 존재하는 경우 T 세포 상의 자극성 분자와 특이적으로 결합함으로써, 활성화, 면역 반응 개시, 증식 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는, T 세포에 의한 1차 반응을 매개할 수 있는 리간드이다. 자극성 리간드는 펩티드가 로딩된 MHC 부류 I 분자, 항-CD3 항체, 초효능제 항-CD28 항체, 및 초효능제 항-CD2 항체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본원에 사용된 "활성화된" 또는 "활성"은 자극된 T 세포를 지칭한다. 활성 T 세포는 CD137, CD25, CD71, CD26, CD27, CD28, CD30, CD154, CD40L, 및 CD134로부터 선택되는 하나 이상의 마커의 발현을 특징으로 할 수 있다.
용어 "외인성"은 외부 공급원으로부터 유래된 임의의 물질을 지칭한다. 예를 들어, 외인성 IL-7 또는 외인성 IL-15는 상업적으로 입수되거나 또는 재조합적으로 생산될 수 있다. "외인성 IL-7" 또는 "외인성 IL-15"는, 하나 이상의 T 세포 내에 첨가되거나 또는 그와 접촉되는 경우에, IL-7 및/또는 IL-15가 T 세포에 의해 생산되지 않는다는 것을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 외인성 IL-7 또는 IL-15와 혼합되기 전의 T 세포는 T 세포에 의해 생산되거나 또는 T 세포를 갖는 대상체로부터 단리된 미량의 IL-7 및/또는 IL-15 (즉, 내인성 IL-7 또는 IL-15)를 함유할 수 있다. 본원에 기재된 하나 이상의 T 세포는, 배양물에의 단리된 IL-7 및/또는 IL-15의 첨가, 배양 배지 중에의 IL-7 및/또는 IL-15의 포함, 또는 하나 이상의 T 세포 이외의 배양물 중 하나 이상의 세포, 예컨대 피더 층에 의한 IL-7 및/또는 IL-15의 발현을 포함한, 관련 기술분야에 공지된 임의의 수단을 통해 외인성 IL-7 및/또는 외인성 IL-15와 접촉될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "지속성"은 예를 들어, 대상체에게 투여된 하나 이상의 이식된 T 세포 또는 그의 자손 (예를 들어, 분화된 또는 성숙된 T 세포)의 일정 기간 동안 검출가능한 수준으로 대상체에 잔류하는 능력을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 하나 이상의 이식된 T 세포 또는 그의 자손 (예를 들어, 분화된 또는 성숙된 T 세포)의 지속성을 증가시키는 것은 이식된 T 세포가 투여 후에 대상체에서 검출가능한 시간의 양을 증가시키는 것을 지칭한다. 예를 들어, 하나 이상의 이식된 T 세포의 생체내 지속성은 적어도 약 1일, 적어도 약 2일, 적어도 약 3일, 적어도 약 4일, 적어도 약 5일, 적어도 약 6일, 적어도 약 7일, 적어도 약 8일, 적어도 약 9일, 적어도 약 10일, 적어도 약 11일, 적어도 약 12일, 적어도 약 13일, 적어도 약 14일, 적어도 약 3주, 적어도 약 4주, 적어도 약 1개월, 적어도 약 2개월, 적어도 약 3개월, 적어도 약 4개월, 적어도 약 5개월, 또는 적어도 약 6개월만큼 증가될 수 있다. 게다가, 하나 이상의 이식된 T 세포의 생체내 지속성은 본원에 개시된 본 방법에 의해 제조되지 않은 하나 이상의 이식된 T 세포와 비교하여 약 1.5-배, 적어도 약 2-배, 적어도 약 2.5-배, 적어도 약 3-배, 적어도 약 3.5-배, 적어도 약 4-배, 적어도 약 4.5-배, 적어도 약 5-배, 적어도 약 6-배, 적어도 약 7-배, 적어도 약 8-배, 적어도 약 9-배, 또는 적어도 약 10-배만큼 증가될 수 있다.
용어 "저하시키는" 및 "감소시키는"은 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 원래의 것보다 적은 임의의 변화를 나타낸다. "저하시키는" 및 "감소시키는"은 상대적인 용어이며, 이전 측정과 이후 측정 사이의 비교를 필요로 한다. "저하시키는" 및 "감소시키는"은 완전 고갈을 포함한다. 일부 실시양태에서, 용어 "저하시키는" 및 "감소시키는"은 본원에 개시된 방법 (예를 들어, AKTi, 및 IL-7 및 IL-15 중 적어도 하나와 접촉시키는 단계)에 의해 제조된 T 세포와 제조되지 않은 T 세포 사이의 T 세포 효과의 비교를 포함한다.
본원에 사용된 용어 T 세포 성숙을 "조정하는"은 하나 이상의 T 세포의 성숙, 예를 들어, 분화를 제어하기 위한 본원에 기재된 임의의 개입의 사용을 지칭한다. 일부 실시양태에서, "조정하는"은 T 세포 성숙을 지연시키거나 또는 억제하는 것을 지칭한다. 다른 실시양태에서, "조정하는"은 T 세포 성숙을 가속화하거나 또는 촉진하는 것을 지칭한다. 특히, 본원에 사용된 "T 세포 성숙을 지연시키거나 또는 억제하는"은 하나 이상의 T 세포를 미성숙 또는 미분화된 상태로 유지하는 것을 지칭한다. 예를 들어, "T 세포 성숙을 지연시키거나 또는 억제하는"은 T 세포를, TEM 또는 TEFF 상태로 진행시키는 것이 아니라, 나이브 또는 TCM 상태로 유지하는 것을 지칭할 수 있다. "T 세포 성숙을 지연시키거나 또는 억제하는"은 또한 T 세포의 혼합 집단 내 미성숙 또는 미분화된 T 세포 (예를 들어, 나이브 T 세포 및/또는 TCM 세포)의 전체 백분율을 증가시키거나 또는 풍부화시키는 것을 지칭할 수 있다. T 세포의 상태 (예를 들어, 성숙 또는 미성숙)는, 예를 들어, 다양한 유전자의 발현 및 T 세포의 표면 상에 발현된 다양한 단백질의 존재에 대해 스크리닝함으로써 결정될 수 있다. 예를 들어, L-셀렉틴 (CD62L+), IL-7R-α, CD132, CR7, CD45RA, CD45RO, CD27, CD28, CD95, IL-2Rβ, CXCR3, LFA-1, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커의 존재는 덜 성숙한, 미분화된 T 세포를 나타낼 수 있다.
대상체의 "치료" 또는 이를 "치료하는"은 질환과 연관된 증상, 합병증 또는 병태, 생화학적 지표의 발병, 진행, 발달, 중증도 또는 재발을 역전시키거나, 완화하거나, 호전시키거나, 억제하거나, 저속화시키거나 또는 방지하는 목적을 갖는 대상체에게 수행되는 임의의 유형의 개입 또는 과정, 또는 그에게 본 발명에 의해 제조된 하나 이상의 T 세포를 투여하는 것을 지칭한다. 한 실시양태에서, "치료" 또는 "치료하는"은 부분적 완화를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, "치료" 또는 "치료하는"은 완전 완화를 포함한다.
본 발명의 다양한 측면은 하기 서브섹션에서 추가로 상세히 기재된다.
면역 세포를 제조하는 방법
본 개시내용은 세포 요법에 사용하기 위한 면역 세포 (예를 들어, 림프구 또는 수지상 세포)를 제조하는 방법에 관한 것이다. 특정 시험관내 조작된 세포 (예를 들어, CAR T 세포, TCR 세포, 또는 수지상 세포)가 시험관내 조작 후에 환자에게 투여되는 경우 그렇게 효과적이지는 않다는 것이 밝혀졌다. 어떠한 이론에도 얽매이지 않으면서, 림프구가 환자에게 투여되기 전에 시험관내에서 조기에 분화될 수 있다는 것이 하나의 이유일 수 있다는 점이 주목된다. 본 개시내용은, 특정 실시양태에서, AKTi, 및 외인성 IL-7 및 외인성 IL-15 중 적어도 하나를 첨가함으로써 시험관내에서 세포의 조기 분화를 지연시키거나, 방지하거나 또는 억제하는 방법을 제시한다.
한 실시양태에서, 본 개시내용은 공여자 대상체로부터 수득된 하나 이상의 세포를 AKT 억제제, 및 외인성 IL-7 및 외인성 IL-15 중 적어도 하나 (또는 둘 다)와 접촉시킴으로써 시험관내에서 T 세포 또는 DC 세포 성숙 또는 분화를 조정하는, 예를 들어, 지연시키거나 또는 억제하는 방법에 관한 것이다. T 세포 또는 DC 세포 성숙 또는 분화를 지연시키거나 또는 억제하는 것은 수집된 T 세포 또는 DC 세포의 집단 내의 미성숙한, 덜 분화된 세포 (예를 들어, 나이브 T 세포 또는 중심 기억 Tcm 세포)의 백분율을 증가시킬 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 방법은 세포 요법 (예를 들어, T 세포 요법 또는 DC 세포 요법)에서 이식된 T 세포 또는 DC 세포 또는 그의 자손의 생체내 지속성을 증가시키는 데 사용될 수 있다. 게다가, 본 개시내용은 생성된 T 세포 또는 DC 세포가 시험관내 및 생체내에서 증가된 확장 및 우수한 항종양 활성을 나타낸다는 것을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 세포 요법 (예를 들어, T 세포 요법)을 필요로 하는 대상체로부터의 하나 이상의 세포 (예를 들어, T 세포 또는 DC 세포)를 (i) AKT 억제제, 및 외인성 인터류킨-7 (IL-7) 및 외인성 인터류킨-15 (IL-15) 중 적어도 하나와 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포 요법 (예를 들어, T 세포 요법)을 위해 시험관내에서 세포 (예를 들어, T 세포) 성숙 또는 분화를 조정하는, 예를 들어, 지연시키거나 또는 억제하는 방법을 포함하며, 여기서 생성된 T 세포는 지연된 성숙 또는 분화를 나타낸다. 접촉시키는 단계는 (i) AKT 억제제 및 (ii) 외인성 IL-7 및/또는 외인성 IL-15를 직접 하나 이상의 T 세포에 또는 T 세포를 함유하는 완충제 또는 배지에 첨가하는 단계, (i) AKT 억제제 및 (ii) 외인성 IL-7 및/또는 외인성 IL-15를 다른 성분과 혼합하는 단계, 및/또는 (i) AKT 억제제 및 (ii) 외인성 IL-7 및/또는 외인성 IL-15를 포함하는 배지 중에 하나 이상의 세포를 첨가하는 단계를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 T 세포는 외인성 인터류킨-2 (IL-2)와 접촉되지 않는다. T 세포의 추가의 제조는 본원의 다른 곳에서 기재된다.
본 개시내용은 하나 이상의 T 세포 또는 DC 세포를 시험관내에서 AKT 억제제, 및 IL-7 및 IL-15 중 적어도 하나와 접촉시키는 단계가 보다 최종 분화된 T 세포의 농도에 비해, 샘플 중에서 나이브 T 세포 및 TCM 세포의 농도를 증가시킬 수 있다는 것을 나타낸다. 따라서, 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 (i) AKT 억제제 및 (ii) 외인성 IL-7, 외인성 IL-15, 또는 둘 다를 포함하는 배지 중에 하나 이상의 T 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 줄기 세포-유사 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포를 생성하는 방법을 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) 대상체로부터 하나 이상의 T 세포를 수득하는 단계; (b) 하나 이상의 T 세포를 (i) AKT 억제제 및 (ii) 외인성 IL-7, 외인성 IL-15, 또는 둘 다와 접촉시키는 단계; 및 (c) AKT 억제제, 및 외인성 IL-7, 외인성 IL-15, 또는 둘 다의 존재 하에 하나 이상의 T 세포를 확장시키는 단계를 포함하는, 샘플 중 CD8+/CD45RA+/CCR7+ T 세포의 집단을 풍부화시키는 방법을 포함한다. 미성숙 및 미분화된 T 세포 또는 DC 세포의 증가된 농도를 생성하는 것은 세포 요법 (예를 들어, T 세포 요법 또는 DC 세포 요법)을 필요로 하는 대상체에게의 이식시 세포의 생체내 지속성을 증가시킬 수 있다. 따라서, 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 대상체에게 투여하기 전에 하나 이상의 T 세포 또는 DC 세포를 (i) AKT 억제제 및 (ii) 외인성 IL-7, 외인성 IL-15, 또는 둘 다와 접촉시키는 단계를 포함하는, 입양 세포 요법에서 하나 이상의 T 세포 또는 DC 세포의 생체내 지속성을 연장시키는 방법을 포함하며; 여기서 생체내 지속성은 AKT 억제제, 및 외인성 IL-7, 외인성 IL-15, 또는 둘 다와 접촉되지 않은 하나 이상의 이식된 T 세포에 비해 연장되었다.
본원에 개시된 방법은 시험관내에서 하나 이상의 T 세포 또는 DC 세포의 성숙 또는 분화를 조정하는, 예를 들어, 지연시키거나 또는 억제하는 단계를 포함한다. 하나 이상의 T 세포 또는 DC 세포의 성숙 또는 분화의 지연 또는 억제는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 T 세포 또는 DC 세포의 성숙 또는 분화의 지연 또는 억제는 하나 이상의 바이오마커의 존재를 검출함으로써 측정될 수 있다. 하나 이상의 바이오마커의 존재는 면역조직화학 및/또는 형광-활성화 세포 분류 (FACS)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 검출될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 바이오마커는 L-셀렉틴 (CD62L+), IL-7Rα, CD132, CCR7, CD45RA, CD45RO, CD27, CD28, CD95, IL-2Rβ, CXCR3, LFA-1, 또는 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 T 세포 또는 DC 세포의 성숙 또는 분화의 지연 또는 억제는 L-셀렉틴 (CD62L+), IL-7Rα, 및 CD132 중 하나 이상의 존재를 검출함으로써 측정될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 방법이 수집된 세포의 집단에서 미성숙 및 미분화된 T 세포 또는 DC 세포의 상대적인 비율을 증가시킬 수 있으나, 일부 성숙 및 분화된 세포가 여전히 존재할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 그 결과, 하나 이상의 T 세포 또는 DC 세포의 성숙 또는 분화의 지연 또는 억제는 하나 이상의 세포를 AKT 억제제, 및 외인성 IL-7 및 외인성 IL-15 중 적어도 하나와 접촉시키기 전 및 후에 세포 집단에서의 미성숙 및 미분화된 세포의 총 퍼센트를 계산함으로써 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 T 세포 집단에서 미성숙 및 미분화된 T 세포의 백분율을 증가시킨다. 특정 실시양태에서, AKT 억제제, 및 외인성 IL-7 및 외인성 IL-15 중 적어도 하나와 접촉된 하나 이상의 T 세포는 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 약 100%의 미성숙 또는 미분화된 T 세포를 포함한다. 다른 실시양태에서, AKT 억제제, 및 외인성 IL-7 및 외인성 IL-15 중 적어도 하나와 접촉된 하나 이상의 T 세포 또는 DC 세포는 적어도 약 10% 내지 적어도 약 90%, 적어도 약 20% 내지 적어도 약 80%, 적어도 약 30% 내지 적어도 약 70%, 적어도 약 40% 내지 적어도 약 60%, 적어도 약 10% 내지 적어도 약 50%, 적어도 약 20%, 적어도 약 40%, 적어도 약 35% 내지 적어도 약 45%, 적어도 약 20% 내지 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 50% 내지 적어도 약 90%의 미성숙 또는 미분화된 T 세포 또는 DC 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 미성숙 또는 미분화된 T 세포는 나이브 T 세포 및/또는 중심 기억 Tcm 세포이다.
본원에 개시된 방법은 하나 이상의 T 세포 또는 DC 세포를 AKT 억제제, 및 외인성 IL-7 및 외인성 IL-15 중 하나 이상과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 하나 이상의 T 세포 또는 DC 세포를 AKT 억제제, 외인성 IL-7, 및 외인성 IL-15와 접촉시키는 단계를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 방법은 하나 이상의 T 세포 또는 DC 세포를 AKT 억제제 및 외인성 IL-7과 접촉시키는 단계를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 방법은 하나 이상의 T 세포 또는 DC 세포를 AKT 억제제 및 외인성 IL-15와 접촉시키는 단계를 포함한다. 하나의 특정한 실시양태에서, 하나 이상의 T 세포 또는 DC 세포는 또한 외인성 IL-2와 접촉된다. 또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 T 세포 또는 DC 세포는 외인성 IL-2와 접촉되지 않는다.
하나 이상의 T 세포 또는 DC 세포는 관련 기술분야에 공지된 임의의 수단을 통하여 AKT 억제제 및 외인성 IL-7 및/또는 IL-15와 접촉될 수 있다. 예를 들어, AKT 억제제 및 IL-7/IL-15는 하나 이상의 T 세포 또는 DC 세포를 배양하기 위해 사용된 배양 배지에 첨가될 수 있다. 대안적으로, AKT 억제제 및 IL-7/IL-15는 하나 이상의 T 세포 또는 DC 세포와 공동-배양된 하나 이상의 세포에 의해, 예를 들어, 피더 세포 층에 의해 생산될 수 있다. AKT 억제제, IL-7, 및 IL-15는 함께 첨가될 수 있거나 또는 개별적으로 첨가될 수 있다. 예를 들어, AKT 억제제는 배양 배지에 첨가될 수 있고 IL-7 및/또는 IL-15는 하나 이상의 T 세포와 공동-배양된 세포에 의해 생산될 수 있다.
게다가, 하나 이상의 T 세포 또는 DC 세포는 AKT 억제제, 및 외인성 IL-7 및/또는 외인성 IL-15와 동시에, 상이한 시점에, 중첩되는 시점에, 또는 순차적으로 접촉될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 T 세포 또는 DC 세포는 AKT 억제제와 접촉되기 전에 외인성 IL-7 및/또는 외인성 IL-15와 접촉될 수 있다. 대안적으로, 하나 이상의 T 세포 또는 DC 세포는 외인성 IL-7 및/또는 외인성 IL-15와 접촉되기 전에 AKT 억제제와 접촉될 수 있다. 하나의 특정한 실시양태에서, 하나 이상의 T 세포 또는 DC 세포는 먼저 외인성 IL-7 및/또는 외인성 IL-15 단독과 접촉되고 이어서 AKT 억제제, 및 외인성 IL-7 및/또는 외인성 IL-15와 공동으로 접촉된다. 또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 T 세포 또는 DC 세포는 먼저 AKT 억제제 단독과 접촉되고 이어서 AKT 억제제, 및 외인성 IL-7 및/또는 외인성 IL-15와 공동으로 접촉된다. 일부 실시양태에서 하나 이상의 T 세포 또는 DC 세포는 AKT 억제제, 외인성 IL-7, 및/또는 외인성 IL-15를 제거하기 위해 세척된다.
본 개시내용의 하나 이상의 T 세포 또는 DC 세포는 T 세포 또는 DC 세포 요법에 사용하기 위해 대상체에게 투여될 수 있다. 따라서, 하나 이상의 T 세포 또는 DC 세포는 T 세포 요법을 필요로 하는 대상체로부터 또는 공여자로부터 수집될 수 있다. 일단 수집되면, 하나 이상의 T 세포는 대상체에게 투여되기 전에 임의의 적합한 기간 동안 처리될 수 있다. 이 시간 동안, 하나 이상의 T 세포는 공여자로부터의 T 세포의 수집과 대상체에게의 투여 사이의 임의의 기간 동안 AKT 억제제, 외인성 IL-7, 및/또는 외인성 IL-15와 접촉될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 T 세포는 적어도 약 1일, 적어도 약 2일, 적어도 약 3일, 적어도 약 4일, 적어도 약 5일, 적어도 약 6일, 적어도 약 7일, 적어도 약 8일, 적어도 약 9일, 적어도 약 10일, 적어도 약 11일, 적어도 약 12일, 적어도 약 13일, 또는 적어도 약 14일 동안 AKT 억제제, 외인성 IL-7, 및/또는 외인성 IL-15와 접촉, 예를 들어, 그의 존재 하에 배양될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 T 세포는 약 1일 내지 약 14일, 약 1일 내지 약 10일, 약 1일 내지 약 7일, 약 1일 내지 약 6일, 약 1일 내지 약 5일, 약 1일 내지 약 4일, 약 1일 내지 약 3일, 약 1일 내지 약 2일, 약 2일 내지 약 3일, 약 2일 내지 약 4일, 약 2일 내지 약 5일, 또는 약 2일 내지 약 6일 동안 AKT 억제제, 외인성 IL-7, 및/또는 외인성 IL-15와 접촉, 예를 들어, 그의 존재 하에 배양된다. 하나의 특정한 실시양태에서, 하나 이상의 T 세포는 T 세포가 수집된 날 (예를 들어, 제0일)부터 T 세포가 대상체에게 투여되는 날까지 AKT 억제제, 외인성 IL-7, 및/또는 외인성 IL-15와 접촉, 예를 들어, 그의 존재 하에 배양된다. 또 다른 실시양태에서, T 세포는 제0일부터 투여까지, 제1일부터 투여까지, 제2일부터 투여까지, 제3일부터 투여까지, 제4일부터 투여까지, 제5일부터 투여까지, 또는 제6일부터 투여까지 AKT 억제제, 외인성 IL-7, 및/또는 외인성 IL-15와 접촉, 예를 들어, 그의 존재 하에 배양된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 T 세포는 AKT 억제제, 외인성 IL-7, 및/또는 외인성 IL-15를 제거하기 위한 투여 전에 세척된다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 공여자 대상체로부터 수득된 하나 이상의 T 세포 또는 DC 세포를 AKT 억제제, 및 외인성 IL-7 및 외인성 IL-15 중 적어도 하나 (또는 둘 다)와 접촉시킴으로써 시험관내에서 T 세포 또는 DC 세포 성숙 또는 분화를 조정하는, 예를 들어, 지연시키거나 또는 억제하는 방법에 관한 것이며, 여기서 하나 이상의 세포는 외인성 IL-2와 접촉되지 않는다. 한 실시양태에서, AKTi, 및 IL-7 및 IL-15 중 적어도 하나 (또는 둘 다)를 사용하여, 그러나 IL-2는 사용하지 않고 처리된 하나 이상의 세포는 IL-2 단독 또는 IL-2 및 AKTi를 사용하여 처리된 하나 이상의 세포보다 더 높은 지연된 또는 억제된 성숙 또는 분화를 나타내었다. 하나 이상의 T 세포 또는 DC 세포는 IL-2 단독 또는 IL-2 및 AKTi를 사용하여 처리된 하나 이상의 T 세포 또는 DC 세포와 비교하여 미성숙한, 덜 분화된 세포 (예를 들어, 나이브 T 세포 또는 중심 기억 Tcm 세포)의 증가된 백분율을 나타낼 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 방법은 세포 요법 (예를 들어, T 세포 요법 또는 DC 세포 요법)에서 이식된 T 세포 또는 DC 세포 또는 그의 자손의 생체내 지속성을 증가시키는 데 사용될 수 있다. 게다가, 본 개시내용은 생성된 T 세포 또는 DC 세포가 시험관내 및 생체내에서 증가된 확장 및 우수한 항종양 활성을 나타낸다는 것을 제공한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 T 세포는 CD4 세포이다. 다른 실시양태에서, 하나 이상의 T 세포는 CD8 세포이다. 특정한 실시양태에서, AKTi, 및 IL-7 및 IL-15 중 적어도 하나와 접촉시키는 단계는 적어도 1, 적어도 약 2, 적어도 약 3, 적어도 약 4, 적어도 약 5, 적어도 약 6, 적어도 약 7, 적어도 약 8, 적어도 약 9, 적어도 약 10, 적어도 약 11, 적어도 약 12, 또는 약 13일 동안 수행된다. 다른 실시양태에서, AKTi, 및 IL-7 및 IL-15 중 적어도 하나와 접촉시키는 단계는 1일 초과 내지 14일 미만, 13일 미만, 12일 미만, 11일 미만, 10일 미만, 9일 미만, 또는 8일 미만 동안 수행된다.
본원에 기재된 방법은 공여자로부터 수득된 림프구의 집단을 풍부화시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 림프구, 예를 들어, 하나 이상의 T 세포 집단의 풍부화는 분리 배지의 사용 (예를 들어, 피콜-파크(FICOLL-PAQUE)™, 로제트셉(ROSETTESEP)™ HLA 총 림프구 풍부화 칵테일, 림프구 분리 배지 (LSA) (엠피 바이오메디칼(MP Biomedical) 카탈로그 번호 0850494X) 등), 여과 또는 현탁분리에 의한 세포 크기, 형태 또는 밀도 분리, 면역자기 분리 (예를 들어, 자기-활성화 세포 분류 시스템, MACS), 형광 분리 (예를 들어, 형광 활성화 세포 분류 시스템, FACS), 또는 비드 기반 칼럼 분리를 포함하나, 이에 제한되지는 않는, 임의의 적합한 분리 방법에 의해 달성될 수 있다.
본원에 기재된 방법은 적합한 조건 하에 림프구의 집단을 하나 이상의 T-세포 자극제로 자극하여 활성화된 T 세포의 집단을 생산하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 하나 이상의 적합한 T-세포 자극제의 임의의 조합이 T-세포 자극 또는 공동-자극 분자를 표적화하는 항체 또는 그의 기능적 단편 (예를 들어, 항-CD2 항체, 항-CD3 항체, 항-CD28 항체, 또는 그의 기능적 단편), 또는 임의의 다른 적합한 미토겐 (예를 들어, 테트라데카노일 포르볼 아세테이트 (TPA), 피토헤마글루티닌 (PHA), 콘카나발린 A (conA), 리포폴리사카라이드 (LPS), 미국자리공 미토겐 (PWM)), 또는 T-세포 자극 또는 공동-자극 분자에 대한 천연 리간드를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 활성화된 T 세포의 집단을 생산하기 위해 사용될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이 림프구의 집단을 자극하기 위한 적합한 조건은 소정의 온도, 소정량의 시간, 및/또는 소정의 수준의 CO2의 존재를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 자극을 위한 온도는 약 34℃, 약 35℃, 약 36℃, 약 37℃, 또는 약 38℃이다. 특정 실시양태에서, 자극을 위한 온도는 약 34-38℃이다. 특정 실시양태에서, 자극을 위한 온도는 약 35-37℃이다. 특정 실시양태에서, 자극을 위한 온도는 약 36-38℃이다. 특정 실시양태에서, 자극을 위한 온도는 약 36-37℃ 또는 약 37℃이다.
본원에 기재된 바와 같이 림프구의 집단을 자극하기 위한 또 다른 조건은 자극을 위한 시간을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 자극을 위한 시간은 약 24-72시간이다. 일부 실시양태에서, 자극을 위한 시간은 약 24-36시간, 약 30-42시간, 약 36-48시간, 약 40-52시간, 약 42-54시간, 약 44-56시간, 약 46-58시간, 약 48-60시간, 약 54-66시간, 또는 약 60-72시간이다. 하나의 특정한 실시양태에서, 자극을 위한 시간은 약 48시간 또는 적어도 약 48시간이다. 다른 실시양태에서, 자극을 위한 시간은 약 44-52시간이다. 특정 실시양태에서, 자극을 위한 시간은 약 40-44시간, 약 40-48시간, 약 40-52시간, 또는 약 40-56시간이다.
본원에 기재된 바와 같이 림프구의 집단을 자극하기 위한 다른 조건은 CO2. 수준을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 자극을 위한 CO2의 수준은 약 1.0-10% CO2이다. 일부 실시양태에서, 자극을 위한 CO2의 수준은 약 1.0%, 약 2.0%, 약 3.0%, 약 4.0%, 약 5.0%, 약 6.0%, 약 7.0%, 약 8.0%, 약 9.0%, 또는 약 10.0% CO2이다. 한 실시양태에서, 자극을 위한 CO2의 수준은 약 3-7% CO2이다. 다른 실시양태에서, 자극을 위한 CO2의 수준은 약 4-6% CO2이다. 또 다른 실시양태에서, 자극을 위한 CO2의 수준은 약 4.5-5.5% CO2이다. 하나의 특정한 실시양태에서, 자극을 위한 CO2의 수준은 약 5% CO2이다.
림프구의 집단을 자극하기 위한 조건은 소정의 온도, 소정의 자극을 위한 시간, 및/또는 소정의 수준의 CO2의 존재를 임의의 조합으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 림프구의 집단을 자극하는 단계는 림프구의 집단을 약 36-38℃의 온도에서, 약 44-52시간 동안, 및 약 4.5-5.5% CO2의 CO2 수준의 존재 하에 하나 이상의 T-세포 자극제로 자극하는 것을 포함할 수 있다.
본원의 방법에 유용한 림프구의 농도는 약 1.0 - 10.0 x 106개 세포/mL이다. 특정 실시양태에서, 림프구의 농도는 약 1.0 - 2.0 x 106개 세포/mL, 약 1.0 - 3.0 x 106개 세포/mL, 약 1.0 - 4.0 x 106개 세포/mL, 약 1.0 - 5.0 x 106개 세포/mL, 약 1.0 - 6.0 x 106개 세포/mL, 약 1.0 - 7.0 x 106개 세포/mL, 약 1.0 - 8.0 x 106개 세포/mL, 1.0 - 9.0 x 106개 세포/mL, 또는 약 1.0 - 10.0 x 106개 세포/mL이다. 특정 실시양태에서, 림프구의 농도는 약 1.0 - 2.0 x 106개 세포/mL이다. 특정 실시양태에서, 림프구의 농도는 약 1.0 - 1.2 x 106개 세포/mL, 약 1.0 - 1.4 x 106개 세포/mL, 약 1.0 - 1.6 x 106개 세포/mL, 약 1.0 - 1.8 x 106개 세포/mL, 또는 약 1.0 - 2.0 x 106개 세포/mL이다. 특정 실시양태에서, 림프구의 농도는 적어도 약 1.0 x 106개 세포/mL, 적어도 약 1.1 x 106개 세포/mL, 적어도 약 1.2 x 106개 세포/mL, 적어도 약 1.3 x 106개 세포/mL, 적어도 약 1.4 x 106개 세포/mL, 적어도 약 1.5 x 106개 세포/mL, 적어도 약 1.6 x 106개 세포/mL, 적어도 약 1.7 x 106개 세포/mL, 적어도 약 1.8 x 106개 세포/mL, 적어도 약 1.9 x 106개 세포/mL, 적어도 약 2.0 x 106개 세포/mL, 적어도 약 4.0 x 106개 세포/mL, 적어도 약 6.0 x 106개 세포/mL, 적어도 약 8.0 x 106개 세포/mL, 또는 적어도 약 10.0 x 106개 세포/mL이다.
항-CD3 항체 (또는 그의 기능적 단편), 항-CD28 항체 (또는 그의 기능적 단편), 또는 항-CD3 및 항-CD28 항체의 조합이 림프구의 집단을 자극하는 단계에 따라 사용될 수 있다. 임의의 가용성 또는 고정화 항-CD2, 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체 또는 그의 기능적 단편이 사용될 수 있다 (예를 들어, 클론 OKT3 (항-CD3), 클론 145-2C11 (항-CD3), 클론 UCHT1 (항-CD3), 클론 L293 (항-CD28), 클론 15E8 (항-CD28)). 일부 측면에서, 항체는 밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotec), 비디 바이오사이언시스(BD Biosciences) (예를 들어, MACS GMP CD3 퓨어(pure) 1 mg/mL, 파트 번호 170-076-116), 및 이바이오사이언스, 인크. (eBioscience, Inc.)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는, 관련 기술분야에 공지된 공급처로부터의 상업적으로 구입될 수 있다. 추가로, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 표준 방법에 의해 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체를 생산하는 방법을 이해할 것이다. 일부 실시양태에서, 림프구의 집단을 자극하는 단계에 따라 사용되는 하나 이상의 T 세포 자극제는 T 세포 시토카인의 존재 하에 T-세포 자극 또는 공동-자극 분자를 표적화하는 항체 또는 그의 기능적 단편을 포함한다. 한 측면에서, 하나 이상의 T 세포 자극제는 항-CD3 항체 및 IL-2를 포함한다. 특정 실시양태에서, T 세포 자극제는 항-CD3 항체를 약 20 ng/mL-100 ng/mL의 농도로 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-CD3 항체의 농도는 약 20 ng/mL, 약 30 ng/mL, 약 40 ng/mL, 약 50 ng/mL, 약 60 ng/mL, 약 70 ng/mL, 약 80 ng/mL, 약 90 ng/mL, 또는 약 100 ng/mL이다. 하나의 특정한 실시양태에서, 항-CD3 항체의 농도는 약 50 ng/mL이다. 대안적 실시양태에서, T 세포 활성화는 필요하지 않다. 이러한 실시양태에서, 활성화된 T 세포의 집단을 생산하기 위해 림프구의 집단을 자극하는 단계는 방법으로부터 생략되고, T 림프구에 대해 풍부화될 수 있는 림프구의 집단은 하기 단계에 따라 형질도입된다.
본원에 기재된 방법은 활성화된 T 세포의 집단을 단일 사이클 형질도입을 사용하여 세포 표면 수용체를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 바이러스 벡터로 형질도입시켜 형질도입된 T 세포의 집단을 생산하는 단계를 포함할 수 있다. 여러 재조합 바이러스가 유전 물질을 세포로 전달하기 위한 바이러스 벡터로서 사용되었다. 형질도입 단계에 따라 사용될 수 있는 바이러스 벡터는 재조합 레트로바이러스 벡터, 재조합 렌티바이러스 벡터, 재조합 아데노바이러스 벡터, 및 재조합 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터를 포함하나, 이에 제한되지는 않는, 임의의 동종향성 또는 양종향성 바이러스 벡터일 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 하나 이상의 T 세포를 레트로바이러스로 형질도입시키는 단계를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 활성화된 T 세포의 집단을 형질도입시키기 위해 사용되는 바이러스 벡터는 MSGV1 감마 레트로바이러스 벡터이다. 특정 실시양태에서, 활성화된 T 세포의 집단을 형질도입시키기 위해 사용되는 바이러스 벡터는 문헌 [Kochenderfer, J. Immunother . 32(7): 689-702 (2009)]에 의해 기재된 PG13-CD19-H3 벡터이다. 이러한 실시양태의 한 측면에 따라, 바이러스 벡터는 바이러스 벡터 제조에 특이적인 배지에서의 현탁 배양물 중에서 성장되며 이는 본원에서 "바이러스 벡터 접종물"로 지칭된다. 바이러스 벡터의 성장을 위한 임의의 적합한 성장 배지 및/또는 보충물이 본원에 기재된 방법에 따라 바이러스 벡터 접종물에 사용될 수 있다. 일부 측면에 따라, 바이러스 벡터 접종물은 이어서 형질도입 단계 동안 하기 기재되는 무혈청 배양 배지에 첨가될 수 있다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 T 세포는 레트로바이러스로 형질도입될 수 있다. 한 실시양태에서, 레트로바이러스는 세포 표면 수용체를 코딩하는 이종 유전자를 포함한다. 하나의 특정한 실시양태에서, 세포 표면 수용체는 표적 세포의 표면 상의, 예를 들어, 종양 세포의 표면 상의 항원에 결합할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이 활성화된 T 세포의 집단을 형질도입시키기 위한 조건은 특정한 시간, 특정한 온도 및/또는 특정한 수준의 CO2의 존재를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 형질도입을 위한 온도는 약 34℃, 약 35℃, 약 36℃, 약 37℃, 또는 약 38℃이다. 한 실시양태에서, 형질도입을 위한 온도는 약 34-38℃이다. 또 다른 실시양태에서, 형질도입을 위한 온도는 약 35-37℃이다. 또 다른 실시양태에서, 형질도입을 위한 온도는 약 36-38℃이다. 또 다른 실시양태에서, 형질도입을 위한 온도는 약 36-37℃이다. 하나의 특정한 실시양태에서, 형질도입을 위한 온도는 약 37℃이다.
특정 실시양태에서, 형질도입을 위한 시간은 약 12-36시간이다. 일부 실시양태에서, 형질도입을 위한 시간은 약 12-16시간, 약 12-20시간, 약 12-24시간, 약 12-28시간, 또는 약 12-32시간이다. 다른 실시양태에서, 형질도입을 위한 시간은 약 20시간 또는 적어도 약 20시간이다. 한 실시양태에서, 형질도입을 위한 시간은 약 16-24시간이다. 다른 실시양태에서, 형질도입을 위한 시간은 적어도 약 14시간, 적어도 약 16시간, 적어도 약 18시간, 적어도 약 20시간, 적어도 약 22시간, 적어도 약 24시간, 또는 적어도 약 26시간이다.
특정 실시양태에서, 형질도입을 위한 CO2의 수준은 약 1.0-10% CO2이다. 다른 실시양태에서, 형질도입을 위한 CO2의 수준은 약 1.0%, 약 2.0%, 약 3.0%, 약 4.0%, 약 5.0%, 약 6.0%, 약 7.0%, 약 8.0%, 약 9.0%, 또는 약 10.0% CO2이다. 한 실시양태에서, 형질도입을 위한 CO2의 수준은 약 3-7% CO2이다. 또 다른 실시양태에서, 형질도입을 위한 CO2의 수준은 약 4-6% CO2일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 형질도입을 위한 CO2의 수준은 약 4.5-5.5% CO2이다. 하나의 특정한 실시양태에서, 형질도입을 위한 CO2의 수준은 약 5% CO2이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 활성화된 T 세포의 집단을 형질도입시키는 단계는 특정한 시간 동안, 특정한 온도에서 및/또는 특정한 수준의 CO2의 존재 하에 (임의의 조합 하에): 약 36-38℃의 온도, 약 16-24시간 동안, 약 4.5-5.5% CO2의 CO2 수준의 존재 하에 수행될 수 있다.
본원에 기재된 방법은 조작된 T 세포의 집단을 생산하기 위해 특정한 시간 동안 형질도입된 하나 이상 T 세포의 집단을 확장시키는 단계를 포함할 수 있다. 확장을 위한 미리 결정된 시간은 (i) 환자에게 투여하기 위한 적어도 1회 용량을 위한 조작된 T 세포의 집단 내의 충분한 수의 세포, (ii) 전형적인 보다 긴 과정에 비해 소아 세포의 유리한 비율을 갖는 조작된 T 세포의 집단, 또는 (iii) (i) 및 (ii) 둘 다의 생산을 허용하는 임의의 적합한 시간일 수 있다. 이러한 시간은 T 세포에 의해 발현되는 세포 표면 수용체, 사용되는 벡터, 치료 효과를 얻기 위해 필요한 용량, 및 다른 변수에 따라 달라질 것이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 확장을 위한 미리 결정된 시간은 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 또는 21일 초과일 수 있다. 일부 측면에서, 확장을 위한 시간은 관련 기술분야에 공지된 확장 방법보다 더 짧다. 예를 들어, 확장을 위한 미리 결정된 시간은 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%만큼 더 짧을 수 있거나, 또는 75% 초과만큼 더 짧을 수 있다. 한 측면에서, 확장을 위한 시간은 약 3일이고, 림프구의 집단의 풍부화부터 조작된 T 세포를 생산하기까지의 시간은 약 6일이다.
형질도입된 T 세포의 집단을 확장시키기 위한 조건은 소정의 온도 및/또는 소정의 수준의 CO2의 존재를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 온도는 약 34℃, 약 35℃, 약 36℃, 약 37℃, 또는 약 38℃이다. 한 실시양태에서, 온도는 약 34-38℃이다. 또 다른 실시양태에서, 온도는 약 35-37℃이다. 또 다른 실시양태에서, 온도는 약 36-38℃이다. 또 다른 실시양태에서, 온도는 약 36-37℃이다. 하나의 특정한 실시양태에서 온도는 약 37℃이다. 특정 실시양태에서, CO2의 수준은 1.0-10% CO2이다. 다른 실시양태에서, CO2의 수준은 약 1.0%, 약 2.0%, 약 3.0%, 약 4.0%, 약 5.0%, 약 6.0%, 약 7.0%, 약 8.0%, 약 9.0%, 또는 약 10.0% CO2이다. 한 실시양태에서, CO2의 수준은 약 4.5-5.5% CO2이다. 또 다른 실시양태에서, CO2의 수준은 약 5% CO2이다. 다른 실시양태에서, CO2의 수준은 약 3.5%, 약 4.0%, 약 4.5%, 약 5.0%, 약 5.5%, 또는 약 6.5% CO2이다. 일부 실시양태에서, 형질도입된 T 세포의 집단을 확장시키기 위한 조건은 소정의 온도 및/또는 소정의 수준의 CO2의 존재를 임의의 조합으로 포함한다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 형질도입된 T 세포의 집단을 확장시키기 위한 조건은 약 36-38℃의 온도 및 약 4.5-5.5% CO2의 CO2 수준의 존재를 포함한다.
본원에 기재된 방법의 각각의 단계는 폐쇄 시스템에서 수행될 수 있다. 특정 실시양태에서, 폐쇄 시스템은 임의의 적합한 세포 배양 백 (예를 들어, 밀테니 바이오텍 MACS® GMP 세포 분화 백, 오리겐 바이오메디칼 퍼마라이프(Origen Biomedical PermaLife) 세포 배양 백)을 사용하는 폐쇄 백 배양 시스템이다. 일부 실시양태에서, 폐쇄 백 배양 시스템에서 사용되는 세포 배양 백은 형질도입 단계 동안 재조합 인간 피브로넥틴 단백질로 코팅된다. 재조합 인간 피브로넥틴 단편은 3개의 기능적 도메인을 포함할 수 있다: 중심 세포-결합 도메인, 헤파린-결합 도메인 II, 및 CS1-서열. 재조합 인간 피브로넥틴 단편은 표적 세포 및 바이러스 벡터의 공동-국재화를 도움으로써 면역 세포의 레트로바이러스 형질도입의 유전자 효율을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 재조합 인간 피브로넥틴 단편은 레트로넥틴(RETRONECTIN)® (다카라 바이오(Takara Bio), 일본)이다. 특정 실시양태에서, 세포 배양 백은 약 1-60 μg/mL 또는 약 1-40 μg/mL의 농도에서 재조합 인간 피브로넥틴 단편으로 코팅된다. 다른 실시양태에서, 세포 배양 백은 약 1-20 μg/mL, 20-40 μg/mL, 또는 40-60 μg/mL의 농도에서 재조합 인간 피브로넥틴 단편으로 코팅된다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 백은 약 1 μg/mL, 약 2 μg/mL, 약 3 μg/mL, 약 4 μg/mL, 약 5 μg/mL, 약 6 μg/mL, 약 7 μg/mL, 약 8 μg/mL, 약 9 μg/mL, 약 10 μg/mL, 약 11 μg/mL, 약 12 μg/mL, 약 13 μg/mL, 약 14 μg/mL, 약 15 μg/mL, 약 16 μg/mL, 약 17 μg/mL, 약 18 μg/mL, 약 19 μg/mL, 또는 약 20 μg/mL의 재조합 인간 피브로넥틴 단편으로 코팅된다. 다른 실시양태에서, 세포 배양 백은 약 2-5 μg/mL, 약 2-10 μg/mL, 약 2-20 μg/mL, 약 2-25 μg/mL, 약 2-30 μg/mL, 약 2-35 μg/mL, 약 2-40 μg/mL, 약 2-50 μg/mL, 또는 약 2-60 μg/mL의 재조합 인간 피브로넥틴 단편으로 코팅될 수 있다. 특정 실시양태에서, 세포 배양 백은 적어도 약 2 μg/mL, 적어도 약 5 μg/mL, 적어도 약 10 μg/mL, 적어도 약 15 μg/mL, 적어도 약 20 μg/mL, 적어도 약 25 μg/mL, 적어도 약 30 μg/mL, 적어도 약 40 μg/mL, 적어도 약 50 μg/mL, 또는 적어도 약 60 μg/mL의 재조합 인간 피브로넥틴 단편으로 코팅된다. 하나의 특정한 실시양태에서, 세포 배양 백은 적어도 약 10 μg/mL의 재조합 인간 피브로넥틴 단편으로 코팅될 수 있다. 폐쇄 백 배양 시스템에서 사용되는 세포 배양 백은 형질도입 단계 동안 인간 알부민 혈청 (HSA)으로 차단될 수 있다. 대안적 실시양태에서, 세포 배양 백은 형질도입 단계 동안 HSA로 차단되지 않는다.
다른 측면에서, (a) 림프구의 집단을 AKT 억제제, 및 외인성 IL-7 및 외인성 IL-15 중 적어도 하나와 접촉시키는 단계, (b) 림프구의 집단의 자극하는 단계, (c) 활성화된 T 세포의 집단을 형질도입시키는 단계, 및 (d) 형질도입된 T 세포의 집단을 확장시키는 단계 중 적어도 하나는 혈청을 첨가하지 않은 무혈청 배양 배지를 사용하여 수행된다. 일부 측면에서, (a) 내지 (d)는 각각 혈청을 첨가하지 않은 무혈청 배양 배지를 사용하여 수행된다. 또 다른 측면에서, (a) 림프구의 집단을 AKT 억제제, 및 외인성 IL-7 및 외인성 IL-15 중 적어도 하나와 접촉시키는 단계, (b) 림프구의 집단을 자극하는 단계, (c) 활성화된 T 세포의 집단을 형질도입시키는 단계, 및 (d) 형질도입된 T 세포의 집단을 확장시키는 단계 중 적어도 하나는 무혈청 배양 배지를 사용하여 수행된다. 일부 측면에서, (a) 내지 (d)는 각각 혈청을 첨가하지 않은 무혈청 배양 배지를 사용하여 수행된다. 본원에 언급된 용어 "무혈청" 또는 "무혈청 배양 배지"는 사용되는 성장 배지가 혈청 (예를 들어, 인간 혈청 또는 소 혈청)으로 보충되지 않음을 의미한다. 다시 말해서, 일부 실시양태에서, 배양된 세포의 생존율, 활성화 및 성장을 지지하기 위한 개별적으로 분리된 별개의 성분으로서 어떠한 혈청도 배양 배지에 첨가되지 않는다. 임의의 적합한 배양 배지 T 세포 성장 배지가 본원에 기재된 방법에 따라 현탁액 중에서 세포를 배양하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, T 세포 성장 배지는 적합한 양의 완충제, 마그네슘, 칼슘, 피루브산나트륨, 및 중탄산나트륨을 포함한 멸균 저 글루코스 용액을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 한 실시양태에서, T 세포 성장 배지는 옵티마이저(OPTMIZER)™ (라이프 테크놀로지스(Life Technologies))이다. 조작된 T 세포를 생산하기 위한 전형적인 방법과 대조적으로, 본원에 기재된 방법은 혈청 (예를 들어, 인간 또는 소)으로 보충되지 않은 배양 배지를 사용할 수 있다.
AKT 억제제
AKT 키나제 패밀리는 3종의 고도로 상동인 이소형: AKT1 (PKBα), AKT2 (PKBβ)과 AKT3 (PKBγ)을 가지며, 이는 각각 특유한 및 중첩된 기능을 갖는다. PI3K-AKT-mTOR 신호전달 경로의 일부로서, AKT는 mTOR을 활성화시키기 위해 PI3K의 하류로 작용하며, 세포에서 생존, 성장, 증식, 이동, 및 대사를 포함한 다양한 반응을 도출한다.
관련 기술분야에 공지된 임의의 AKT 억제제가 본 발명에 사용될 수 있으며, 이는 AKT1, AKT2, AKT3, 또는 그의 임의의 조합의 임의의 억제제를 포함한다. AKT 억제제의 경우, A6730, B2311, 124018, GSK2110183 (아푸레세르팁), 페리포신 (KRX-0401), GDC-0068 (이파타세르팁), RX-0201, VQD-002, LY294002, A-443654, A-674563, Akti-1, Akti-2, Akti-1/2, AR-42, API-59CJ-OMe, ATI-13148, AZD-5363, 에루실포스포콜린, GSK-2141795 (GSK795), KP372-1, L-418, NL-71-101, PBI-05204, PIA5, PX-316, SR13668, 트리시리빈, GSK 690693 (CAS # 937174-76-0), FPA 124 (CAS # 902779-59-3), 밀테포신, PHT-427 (CAS # 1 191951-57-1), 10-DEBC 히드로클로라이드, Akt 억제제 III, Akt 억제제 VIII, MK-2206 디히드로클로라이드 (CAS # 1032350-13-2), SC79, AT7867 (CAS # 857531-00-1), CCT128930 (CAS # 885499-61-6), A-674563 (CAS # 552325-73-2), AGL 2263, AS-041 164 (5-벤조[1,3]디옥솔-5-일메틸렌-티아졸리딘-2,4-디온), BML-257 (CAS # 32387-96-5), XL-418, CAS # 612847-09-3, CAS # 98510-80-6, H-89 (CAS # 127243-85-0), OXY-1 1 1 A, 3-[1-[[4-(7-페닐-3H-이미다조[4,5-g]퀴녹살린-6-일)페닐]메틸]피페리딘-4-일]-1H-벤즈이미다졸-2-온, 및 그의 임의의 조합으로부터 선택될 수 있다. AKT 억제제는 또한 1-{1-[4-(7-페닐-1H-이미다조[4,5-g]퀴녹살린-6-일)벤질]피페리딘-4-일}--1,3-디히드로-2H-벤즈이미다졸-2-온; N,N-디메틸-1-[4-(6-페닐-1H-이미다조[4,5-g]퀴녹살린-7-일)페닐]메탄아민; 1-{1-[4-(3-페닐벤조[g]퀴녹살린-2-일)벤질]피페리딘-4-일}-1,-3-디히드로-2H-벤즈이미다졸-2-온; 1-{1-[4-(7-페닐-1H-이미다조[4,5-g]퀴녹살린-6-일)벤질]피페리딘-4-일}--1,3-디히드로-2H-벤즈이미다졸-2-온; N,N-디메틸-1-[4-(6-페닐-1H-이미다조[4,5-g]퀴녹살린-7-일)페닐]메탄아민; 1-{1-[4-(3-페닐벤조[g]퀴녹살린-2-일)벤질]피페리딘-4-일}-1,-3-디히드로-2H-벤즈이미다졸-2-온 (3-[1-[[4-(7-페닐-3H-이미다조[4,5-g]퀴녹살린-6-일)페닐]메틸]피페리딘-4-일]-1H-벤즈이미다졸-2-온으로도 불림); 그의 전문이 본원에 참조로 포함된, 2007년 9월 25일에 공개된 미국 특허 번호 7,273,869에 개시된 화학식 I, 화학식 II, 화학식 III, 화학식 IV, 화학식 V, 화학식 VI, 화학식 VII, 및 화학식 VIII를 포함하는 구조를 갖는 화합물; 그의 입체이성질체; 그의 전문이 본원에 참조로 포함된, 2007년 9월 25일에 공개된 미국 특허 번호 7,273,869에 개시된 임의의 AKTi; 및 그의 임의의 조합으로부터 선택될 수 있다. 한 예에서, AKTi는 화학식 I을 포함한다.
하나의 특정한 실시양태에서, AKT 억제제는 3-[1-[[4-(7-페닐-3H-이미다조[4,5-g]퀴녹살린-6-일)페닐]메틸]피페리딘-4-일]-1H-벤즈이미다졸-2-온이다. 또 다른 실시양태에서, AKT 억제제는 Akt 억제제 VIII이다.
일부 실시양태에서, AKT는 화학식 I에 의해 예시된 화학식 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 입체이성질체를 포함한다:
Figure pct00001
상기 식에서, a는 0 또는 1이고; b는 0 또는 1이고; m은 0, 1 또는 2이고; n은 0, 1 또는 2이고; p는 0, 1, 2 또는 3이고; r은 0 또는 1이고; s는 0 또는 1이고; t는 2, 3, 4, 5 또는 6이고; u, v 및 x는 독립적으로 CH 및 N으로부터 선택되고; w는 결합, CH 및 N으로부터 선택되고; y 및 z는 독립적으로 CH 및 N으로부터 선택되고, 단 y 및 z 중 적어도 1개는 N이고; R1은 독립적으로 1) (C=O)aObC1-C10 알킬, 2) (C=O)aOb아릴, 3) C2-C10 알케닐, 4) C2-C10 알키닐, 5) (C=O)aOb 헤테로시클릴, 6) (C=O)aObC3-C8 시클로알킬, 7) CO2H, 8) 할로, 9) CN, 10) OH, 11) ObC1-C6 퍼플루오로알킬, 12) Oa(C=O)bNR7R8, 13) NRc(C=O)NR7R8, 14) S(O)mRa, 15) S(O)2NR7R8, 16) NRcS(O)mRa, 17) 옥소, 18) CHO, 19) NO2, 20) NRc(C=O)ObRa, 21) O(C=O)ObC1-C10 알킬, 22) O(C=O)ObC3-C8 시클로알킬, 23) O(C=O)Ob아릴, 및 24) O(C=O)Ob-헤테로사이클로부터 선택되고; 상기 알킬, 아릴, 알케닐, 알키닐, 헤테로시클릴, 및 시클로알킬은 Rz로부터 선택된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환되고; R2는 독립적으로 1) (C=O)aObC1-C10 알킬, 2) (C=O)aOb아릴, 3) C2-C10 알케닐, 4) C2-C10 알키닐, 5) (C=O)aOb 헤테로시클릴, 6) (C=O)aObC3-C8 시클로알킬, 7) CO2H, 8) 할로, 9) CN, 10) OH, 11) ObC1-C6 퍼플루오로알킬, 12) Oa(C=O)bNR7R8, 13) NRc(C=O)NR7R8, 14) S(O)mRa, 15) S(O)2NR7R8, 16) NRcS(O)mRa, 17) CHO, 18) NO2, 19) NRc(C=O)ObRa, 20) O(C=O)ObC1-C10 알킬, 21) O(C=O)ObC3-C8 시클로알킬, 22) O(C=O)Ob아릴, 및 23) O(C=O)Ob-헤테로사이클로부터 선택되고; 상기 알킬, 아릴, 알케닐, 알키닐, 헤테로시클릴, 및 시클로알킬은 Rz로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 치환기로 임의로 치환되고; R3 및 R4는 독립적으로 H, C1-C6-알킬 및 C1-C6-퍼플루오로알킬로부터 선택되거나, 또는 R3 및 R4는 독립적으로 H, C1-C6-알킬 및 C1-C6-퍼플루오로알킬로부터 선택되거나, 또는 R3 및 R4는 조합되어 -(CH2)t-를 형성하며 여기서 탄소 원자 중 1개는 O, S(O)m, -N(Rb)C(O)-, 및 -N(CORa)-로부터 선택된 모이어티에 의해 임의로 대체되고; R5 및 R6은 독립적으로 1) H, 2) (C=O)ObRa, 3) C1-C10 알킬, 4) 아릴, 5) C2-C10 알케닐, 6) C2-C10 알키닐, 7) 헤테로시클릴, 8) C3-C8 시클로알킬, 9) SO2Ra, 및 10) (C=O)NRb 2로부터 선택되고, 상기 알킬, 시클로알킬, 아릴, 헤테로시클릴, 알케닐, 및 알키닐은 Rz로부터 선택된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환되거나, 또는 R5 및 R6은 이들이 부착되어 있는 질소와 함께 각각의 고리에 5-7개의 구성원을 갖고 질소에 더하여, N, O 및 S로부터 선택된 1 또는 2개의 추가의 헤테로원자를 임의로 함유하는 모노시클릭 또는 비시클릭 헤테로사이클을 형성할 수 있고, 상기 모노시클릭 또는 비시클릭 헤테로사이클은 Q로 임의로 치환되고 또한 Rz로부터 선택된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환되고; Q는 -NR7R8, 아릴 및 헤테로시클릴로부터 선택되고, 상기 아릴 및 헤테로시클릴은 Rz로부터 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환되고; R7 및 R8은 독립적으로 1) H, 2) (C=O)ObC1-C10 알킬, 3) (C=O)ObC3-C8 시클로알킬, 4) (C=O)Ob아릴, 5) (C=O)Ob헤테로시클릴, 6) C1-C10 알킬, 7) 아릴, 8) C2-C10 알케닐, 9) C2-C10 알키닐, 10) 헤테로시클릴, 11) C3-C8 시클로알킬, 12) SO2Ra, 및 13) (C=O)NRb 2로부터 선택되고; 상기 알킬, 시클로알킬, 아릴, 헤테로시클릴, 알케닐, 및 알키닐은 Rz로부터 선택된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환되거나, 또는 R7 및 R8은 이들이 부착되어 있는 질소와 함께 각각의 고리에 5-7개의 구성원을 갖고 질소에 더하여, N, O 및 S로부터 선택된 1 또는 2개의 추가의 헤테로원자를 임의로 함유하는 모노시클릭 또는 비시클릭 헤테로사이클을 형성할 수 있고; 상기 모노시클릭 또는 비시클릭 헤테로사이클은 Rz로부터 선택된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환되고; Rz는 1) (C=O)rOs(C1-C10)알킬, 2) Or(C1-C3)퍼플루오로알킬, 3) (C0-C6)알킬렌-S(O)mRa, 4) 옥소, 5) OH, 6) 할로, 7) CN, 8) (C=O)rOs(C2-C10)알케닐, 9) (C=O)rOs(C2-C10)알키닐, 10) (C=O)rOs(C3-C6)시클로알킬, 11) (C=O)rOs(C0-C6)알킬렌-아릴, 12) (C=O)rOs(C0-C6)알킬렌-헤테로시클릴, 13) (C=O)rOs(C0-C6)알킬렌-N(Rb)2, 14) C(O)Ra, 15) (C0-C6)알킬렌-CO2Ra, 16) C(O)H, 17) (C0-C6)알킬렌-CO2H, 18) C(O)N(Rb)2, 19) S(O)mRa, 20) S(O)2N(Rb)2, 21) NRc(C=O)ObRa, 22) O(C=O)ObC1-C10 알킬, 23) O(C=O)ObC3-C8 시클로알킬, 24) O(C=O)Ob아릴, 및 25) O(C=O)Ob-헤테로사이클로부터 선택되고; 상기 알킬, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 아릴, 및 헤테로시클릴은 Rb, OH, (C1-C6)알콕시, 할로겐, CO2H, CN, O(C=O)C1-C6 알킬, 옥소, 및 N(Rb)2로부터 선택된 최대 3개의 치환기로 임의로 치환되고; Ra는 치환된 또는 비치환된 (C1-C6)알킬, 치환된 또는 비치환된 (C2-C6)알케닐, 치환된 또는 비치환된 (C2-C6)알키닐, 치환된 또는 비치환된 (C3-C6)시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴, (C1-C6)퍼플루오로알킬, 2,2,2-트리플루오로에틸, 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로시클릴이고; Rb는 H, (C1-C6)알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 벤질, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클릴, (C3-C6)시클로알킬, (C=O)OC1-C6 알킬, (C=O)C1-C6 알킬 또는 S(O)2Ra이고; Rc는 1) H, 2) C1-C10 알킬, 3) 아릴, 4) C2-C10 알케닐, 5) C2-C10 알키닐, 6) 헤테로시클릴, 7) C3-C8 시클로알킬, 8) C1-C6 퍼플루오로알킬로부터 선택되고, 상기 알킬, 시클로알킬, 아릴, 헤테로시클릴, 알케닐, 및 알키닐은 Rz로부터 선택된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환된다.
특정 실시양태에서, AKT 신호전달은 직접적으로, 예를 들어, AKT에 결합하는 분자에 의해, 또는 간접적으로, 예를 들어, PI3K-AKT-mTOR 신호전달 경로의 또 다른 구성원을 방해함으로써 억제될 수 있다. 따라서, AKT 억제제는 PI3K-AKT-mTOR 신호전달 경로의 하나 이상의 구성원의 활성을 억제하는 분자일 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 T 세포는 AKT 억제제, PI3K 억제제, mTOR 억제제, 또는 그의 임의의 조합과 접촉될 수 있다.
본원에 기재된 방법에 유용한 AKT 억제제의 양은 하나 이상의 T 세포에서 AKT의 활성을 저하시키거나 또는 억제할 수 있는 양 (즉, 유효량)일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명에 유용한 AKT 억제제의 양은 외인성 IL-7 및/또는 외인성 IL-15와 조합되어 시험관내에서 T 세포 또는 DC 세포의 성숙 또는 분화를 지연시키거나 또는 억제할 수 있는 양일 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 하나 이상의 T 세포는 AKT 억제제, 예를 들어, 3-[1-[[4-(7-페닐-3H-이미다조[4,5-g]퀴녹살린-6-일)페닐]메틸]피페리딘-4-일]-1H-벤즈이미다졸-2-온과 적어도 약 1 nM, 적어도 약 10 nM, 적어도 약 50 nM, 적어도 약 100 nM, 적어도 약 200 nM, 적어도 약 300 nM, 적어도 약 400 nM, 적어도 약 500 nM, 적어도 약 1 μM, 적어도 약 2 μM, 적어도 약 3 μM, 적어도 약 4 μM, 적어도 약 5 μM, 적어도 약 6 μM, 적어도 약 7 μM, 적어도 약 8 μM, 적어도 약 9 μM, 적어도 약 10 μM, 적어도 약 11 μM, 적어도 약 12 μM, 적어도 약 13 μM, 적어도 약 14 μM, 적어도 약 15 μM, 적어도 약 16 μM, 적어도 약 17 μM, 적어도 약 18 μM, 적어도 약 19 μM, 적어도 약 20 μM, 적어도 약 25 μM, 적어도 약 30 μM, 적어도 약 35 μM, 적어도 약 40 μM, 적어도 약 45 μM, 적어도 약 50 μM, 적어도 약 60 μM, 적어도 약 70 μM, 적어도 약 80 μM, 적어도 약 90 μM, 적어도 약 100 μM, 적어도 약 200 μM, 적어도 약 300 μM, 적어도 약 400 μM, 적어도 약 500 μM, 또는 적어도 약 1 mM의 농도에서 접촉될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 T 세포는 AKT 억제제, 예를 들어, 3-[1-[[4-(7-페닐-3H-이미다조[4,5-g]퀴녹살린-6-일)페닐]메틸]피페리딘-4-일]-1H-벤즈이미다졸-2-온과 약 1 nM 내지 약 1 mM, 약 10 nM 내지 약 1 mM, 약 100 nM 내지 약 1 mM, 약 1 μM 내지 약 1 mM, 약 10 μM 내지 약 1 mM, 약 100 μM 내지 약 1 mM, 약 1 nM 내지 약 100 μM, 약 1 nM 내지 약 10 μM, 약 1 nM 내지 약 1 μM, 약 1 nM 내지 약 100 nM, 약 1 nM 내지 약 50 nM, 약 100 nM 내지 약 100 μM, 약 500 nM 내지 약 50 μM, 약 1 μM 내지 약 50 μM, 약 1 μM 내지 약 10 μM, 또는 from 약 5 μM 내지 약 10 μM의 농도에서 접촉될 수 있다.
AKT 활성의 임의의 저하가 본 방법에 따라 달성될 수 있다. 예를 들어, AKT 활성은 AKT 억제제에 의해 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 또는 약 100%만큼 저하 또는 억제될 수 있다.
외인성 IL-7 및 외인성 IL-15
인터류킨-7 (IL-7)은 림프구 항상성을 촉진하는 시토카인이고 T 세포 발달을 위해 필요하다. 내인성 IL-7은 흉선 및 골수의 상피 세포에 의해 생산되고 그의 수용체, IL-7 수용체-α (IL-7R-α)는 나이브 T 세포 및 TCM 세포를 포함한 T 세포의 하위세트에 의해 발현된다. IL-7 신호전달은 야누스 키나제/전사 (Jak/STAT) 경로의 신호 전달인자 및 활성화인자, PI3K, 및 Src 패밀리 티로신 키나제를 포함한, 다양한 티로신 키나제를 통해 일어난다.
임의의 외인성 IL-7이 본원에 기재된 방법에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 외인성 IL-7은 인간 IL-7이다. 일부 실시양태에서, 외인성 IL-7은 야생형 IL-7이다. 다른 실시양태에서, 외인성 IL-7은 재조합 IL-7이다. IL-7은 하나 이상의 IL-7 생산 세포로부터의 IL-7을 단리하거나 또는 상업적으로 입수가능한 IL-7을 입수하는 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 생산되고 입수될 수 있다.
임의의 농도의 IL-7이 본원에 기재된 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 방법은 하나 이상의 T 세포를 적어도 약 0.001 ng/ml IL-7, 적어도 약 0.005 ng/ml IL-7, 적어도 약 0.01 ng/ml IL-7, 적어도 약 0.05 ng/ml IL-7, 적어도 약 0.1 ng/ml IL-7, 적어도 약 0.5 ng/ml IL-7, 적어도 약 1.0 ng/ml IL-7, 적어도 약 1 ng/ml IL-7, 적어도 약 2 ng/ml IL-7, 적어도 약 3 ng/ml IL-7, 적어도 약 4 ng/ml IL-7, 적어도 약 5 ng/ml IL-7, 적어도 약 6 ng/ml IL-7, 적어도 약 7 ng/ml IL-7, 적어도 약 8 ng/ml IL-7, 적어도 약 9 ng/ml IL-7, 적어도 약 10 ng/ml IL-7, 적어도 약 11 ng/ml IL-7, 적어도 약 12 ng/ml IL-7, 적어도 약 13 ng/ml IL-7, 적어도 약 14 ng/ml IL-7, 적어도 약 15 ng/ml IL-7, 적어도 약 20 ng/ml IL-7, 적어도 약 25 ng/ml IL-7, 적어도 약 30 ng/ml IL-7, 적어도 약 35 ng/ml IL-7, 적어도 약 40 ng/ml IL-7, 적어도 약 45 ng/ml IL-7, 적어도 약 50 ng/ml IL-7, 적어도 약 100 ng/ml IL-7, 적어도 약 200 ng/ml IL-7, 적어도 약 300 ng/ml IL-7, 적어도 약 400 ng/ml IL-7, 적어도 약 500 ng/ml IL-7, 또는 적어도 약 1000 ng/ml IL-7과 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 하나 이상의 T 세포는 약 0.001 내지 약 500 ng/ml IL-7, 약 0.01 내지 약 100 ng/ml IL-7, 약 0.1 내지 약 50 ng/ml IL-7, 약 1 내지 약 10 ng/ml IL-7, 약 1 내지 약 5 ng/ml IL-7, 약 5 내지 약 10 ng/ml IL-7, 약 3 내지 약 7 ng/ml IL-7, 또는 약 4 내지 약 6 ng/ml IL-7과 접촉된다. 하나의 특정한 실시양태에서, 하나 이상의 T 세포는 약 5 ng/ml IL-7과 접촉된다.
인터류킨-15 (IL-15)는 T 세포 증식을 촉진하는 시토카인이다. 이는 단핵구/대식세포 계통의 구성원, 혈액-유래 수지상 세포, 골수 기질 세포, 및 흉선의 상피 세포에 의해 발현된다. IL-15는 그의 수용체, IL-15 수용체를 통해 신호전달하여, 예를 들어, Jak/STAT 경로를 활성화시키고, Ras/Raf/MAPK 경로를 자극하고, NF-κB를 활성화시킨다.
임의의 외인성 IL-15가 본원에 기재된 방법에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 외인성 IL-15는 인간 IL-15이다. 일부 실시양태에서, 외인성 IL-15는 야생형 IL-15이다. 다른 실시양태에서, 외인성 IL-15는 재조합 IL-15이다. IL-15는 하나 이상의 IL-15 생산 세포로부터의 IL-15를 단리하거나 또는 상업적으로 입수가능한 IL-15를 입수하는 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 생산되고 입수될 수 있다.
임의의 농도의 IL-15가 본원에 기재된 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 방법은 하나 이상의 T 세포를 적어도 약 0.001 ng/ml IL-15, 적어도 약 0.005 ng/ml IL-15, 적어도 약 0.01 ng/ml IL-15, 적어도 약 0.05 ng/ml IL-15, 적어도 약 0.1 ng/ml IL-15, 적어도 약 0.5 ng/ml IL-15, 적어도 약 1.0 ng/ml IL-15, 적어도 약 1 ng/ml IL-15, 적어도 약 2 ng/ml IL-15, 적어도 약 3 ng/ml IL-15, 적어도 약 4 ng/ml IL-15, 적어도 약 5 ng/ml IL-15, 적어도 약 6 ng/ml IL-15, 적어도 약 7 ng/ml IL-15, 적어도 약 8 ng/ml IL-15, 적어도 약 9 ng/ml IL-15, 적어도 약 10 ng/ml IL-15, 적어도 약 11 ng/ml IL-15, 적어도 약 12 ng/ml IL-15, 적어도 약 13 ng/ml IL-15, 적어도 약 14 ng/ml IL-15, 적어도 약 15 ng/ml IL-15, 적어도 약 20 ng/ml IL-15, 적어도 약 25 ng/ml IL-15, 적어도 약 30 ng/ml IL-15, 적어도 약 35 ng/ml IL-15, 적어도 약 40 ng/ml IL-15, 적어도 약 45 ng/ml IL-15, 적어도 약 50 ng/ml IL-15, 적어도 약 100 ng/ml IL-15, 적어도 약 200 ng/ml IL-15, 적어도 약 300 ng/ml IL-15, 적어도 약 400 ng/ml IL-15, 적어도 약 500 ng/ml IL-15, 또는 적어도 약 1000 ng/ml IL-15와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 하나 이상의 T 세포는 약 0.001 내지 약 500 ng/ml IL-15, 약 0.01 내지 약 100 ng/ml IL-15, 약 0.1 내지 약 50 ng/ml IL-15, 약 1 내지 약 10 ng/ml IL-15, 약 1 내지 약 5 ng/ml IL-15, 약 5 내지 약 10 ng/ml IL-15, 약 3 내지 약 7 ng/ml IL-15, 또는 약 4 내지 약 6 ng/ml IL-15와 접촉된다. 하나의 특정한 실시양태에서, 하나 이상의 T 세포는 약 5 ng/ml IL-15와 접촉된다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 T 세포는 외인성 IL-7과 접촉되고 외인성 IL-15와는 접촉되지 않는다. 다른 실시양태에서, 하나 이상의 T 세포는 외인성 IL-15와 접촉되고 외인성 IL-7과는 접촉되지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 T 세포는 외인성 IL-7 및 외인성 IL-15 둘 다와 접촉된다. 하나 이상의 T 세포가 외인성 IL-7 및 외인성 IL-15 둘 다와 접촉되는 경우에, 하나 이상의 T 세포는 동등하거나 또는 상이한 농도의 외인성 IL-7 및 외인성 IL-15와 접촉될 수 있다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 T 세포는 동등한 농도의 외인성 IL-7 및 외인성 IL-15와 접촉된다. 다른 실시양태에서, 하나 이상의 T 세포는 상이한 농도의 외인성 IL-7 및 외인성 IL-15와 접촉된다. 한 실시양태에서, 하나 이상의 T 세포는 외인성 IL-15보다 더 높은 농도의 외인성 IL-7과 접촉된다. 또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 T 세포는 외인성 IL-15보다 더 낮은 농도의 외인성 IL-7과 접촉된다. 하나의 특정한 실시양태에서, 하나 이상의 T 세포는 약 5 ng/ml 외인성 IL-7 및 약 5 ng/ml 외인성 IL-15와 접촉된다.
게다가, 하나 이상의 T 세포는 외인성 IL-7 및 외인성 IL-15와 동시에, 예를 들어, 공동으로, 또는 상이한 시점에, 예를 들어, 순차적으로 접촉될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 T 세포는 외인성 IL-15 이전에 외인성 IL-7과 접촉된다. 다른 실시양태에서, 하나 이상의 T 세포는 외인성 IL-7 이전에 외인성 IL-15와 접촉된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 T 세포는 외인성 IL-7 및 외인성 IL-15와 동시에 접촉된다.
T 세포
본원에 기재된 하나 이상의 T 세포는 예를 들어, 인간 공여자를 포함한 임의의 공급원으로부터 수득될 수 있다. 공여자는 항암 치료, 예를 들어, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 하나의 T 세포를 사용한 치료를 필요로 하는 대상체 (즉, 자가 공여자)일 수 있거나, 또는 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 세포의 집단의 생성 시에 상이한 개체 또는 암 환자의 치료를 위해 사용될 림프구 샘플을 공여하는 개체 (즉, 동종 공여자)일 수 있다. 림프구의 집단은 관련 기술분야에서 사용되는 임의의 적합한 방법에 의해 공여자로부터의 수득될 수 있다. 예를 들어, 림프구의 집단은 임의의 적합한 체외 방법, 정맥천자, 또는 혈액 및/또는 림프구의 샘플이 수득되는 다른 혈액 수집 방법에 의해 수득될 수 있다. 한 실시양태에서, 림프구의 집단은 분리반출술에 의해 수득된다. 하나 이상의 T 세포는 종양을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 하나 이상의 T 세포를 포함하는 임의의 조직으로부터 수집될 수 있다. 일부 실시양태에서, 종양 또는 그의 부분은 대상체로부터 수집되고, 하나 이상의 T 세포는 종양 조직으로부터 단리된다. T 세포 요법에 적합한 임의의 T 세포를 포함한, 임의의 T 세포가 본원에 개시된 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 유용한 하나 이상의 세포는 종양 침윤 림프구 (TIL), 세포독성 T 세포, CAR T 세포, 조작된 TCR T 세포, 자연 킬러 T 세포, 수지상 세포, 및 말초 혈액 림프구로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 하나의 특정한 실시양태에서, T 세포는 종양 침윤 백혈구이다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 T 세포는 CD8을 발현하며, 예를 들어, CD8+ T 세포이다. 다른 실시양태에서, 하나 이상의 T 세포는 CD4를 발현하며, 예를 들어, CD4+ T 세포이다.
본원에 기재된 방법은 공여자로부터의 하나 이상의 T 세포를 AKT 억제제, 및 외인성 IL-7 및 외인성 IL-15 중 적어도 하나와 접촉시킴으로써 시험관내에서 T 세포 성숙 또는 분화를 지연시키거나 또는 억제하는 데 사용될 수 있다. 본 발명자들은 AKT 억제제 및 IL-7 및/또는 IL-15를 사용한 하나 이상의 T 세포의 치료가 시험관내에서 나이브 및 미성숙 T 세포의 농도를 증가시킨다는 것을 발견하였다. 특히, 치료 후에, 하나 이상의 T 세포는 미분화된 또는 미성숙 T 세포를 나타내는 1종 이상의 유전자를 발현할 수 있다. 미분화된 또는 미성숙 T 세포를 나타내는 1종 이상의 유전자는 군 CD8, CD45RA, CCR7, CD45RO, CD62L, CD28, CD95, IL-7Rα, CXCR4, TCF7, FOXO1, ID3, BCL6, 및 그의 임의의 조합으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 T 세포를 AKT 억제제 및 IL-7 및/또는 IL-15와 접촉시키는 단계는 CD8, CD45RA, CCR7, 및 그의 임의의 조합으로부터 선택된 미분화된 또는 미성숙 T 세포를 나타내는 1종 이상의 유전자를 발현하는 세포의 퍼센트의 증가를 일으킬 수 있다.
다른 실시양태에서, 하나 이상의 T 세포는 AKT 억제제, 및 외인성 IL-7 및/또는 외인성 IL-15와의 접촉 후에 CCR7 및 CD45RO를 발현한다. 하나의 특정한 실시양태에서, 보다 큰 백분율의 하나 이상의 T 세포는 AKT 억제제, 및 외인성 IL-7 및 외인성 IL-15 중 적어도 하나와 접촉되기 전과 비교하여 그 후에 CCR7 및 CD45RO를 발현한다. 또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 T 세포는 AKT 억제제, 및 외인성 IL-7 및/또는 외인성 IL-15와의 접촉 후에 CCR7 및 CD45RA를 발현한다. 하나의 특정한 실시양태에서, 보다 큰 백분율의 하나 이상의 T 세포는 AKT 억제제, 및 외인성 IL-7 및 외인성 IL-15 중 적어도 하나와 접촉되기 전과 비교하여 그 후에 CCR7 및 CD45RA를 발현한다. 또 다른 실시양태에서, T 세포는 AKT 억제제, 및 외인성 IL-7 및/또는 외인성 IL-15와 접촉되지 않은 T 세포에 의한 CCR7, CD45RO, 및 CD45RA의 발현과 비교하여, AKT 억제제, 및 외인성 IL-7 및/또는 외인성 IL-15와의 접촉 후에 CCR7, CD45RO, CD45RA, 또는 그의 임의의 조합의 증가된 발현을 나타낸다.
다른 실시양태에서, 하나 이상의 T 세포는 AKT 억제제, 및 외인성 IL-7 및/또는 외인성 IL-15와의 접촉 후에 CD62L, CD28, 또는 둘 다를 발현한다. 하나의 특정한 실시양태에서, 보다 큰 백분율의 하나 이상의 T 세포는 AKT 억제제, 및 외인성 IL-7 및 외인성 IL-15 중 적어도 하나와 접촉되기 전과 비교하여 그 후에 CD62L, CD28, 또는 둘 다를 발현한다. 또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 T 세포는 AKT 억제제, 및 외인성 IL-7 및/또는 외인성 IL-15와 접촉되지 않은 T 세포에 의한 CD62L 및 CD28의 발현과 비교하여 AKT 억제제, 및 외인성 IL-7 및/또는 외인성 IL-15와의 접촉 후에 CD62L, CD28, 또는 둘 다의 증가된 발현을 나타낸다.
하나의 특정한 실시양태에서, T 세포는 AKT 억제제, 및 외인성 IL-7 및/또는 외인성 IL-15와 접촉되지 않은 T 세포에 의한 CD95, IL-7 수용체 알파 (IL-7Rα), CXCR4, TCF7, FOXO1, ID3, BCL6, CD62L, 및 CD45RA의 발현과 비교하여, AKT 억제제 및 외인성 IL-7, 외인성 IL-15, 또는 둘 다와의 접촉 후에 CD95, IL-7 수용체 알파 (IL-7Rα), CXCR4, TCF7, FOXO1, ID3, BCL6, CD62L, CD45RA, 또는 그의 임의의 조합의 증가된 발현을 나타낸다.
T 세포 요법
본 발명은 T 세포 요법을 필요로 하는 대상체로부터의 하나 이상의 T 세포를 (i) AKT 억제제, 및 외인성 인터류킨-7 (IL-7) 및 외인성 인터류킨-15 (IL-15) 중 적어도 하나와 접촉시키는 단계를 포함하는, T 세포 요법을 위해 시험관내에서 T 세포 성숙 또는 분화를 조정하는, 예를 들어, 지연시키거나 또는 억제하는 방법을 제공하며, 여기서 생성된 T 세포는 지연된 성숙 또는 분화를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 방법은 하나 이상의 T 세포를 그를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 기재된 방법에 의해 생산된 하나 이상의 T 세포가 환자에게 하나 이상의 T 세포를 투여하는 단계를 포함하는, 환자를 치료하는 임의의 방법에 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
예를 들어, 비제한적으로, 본원에 기재된 방법은 종양-침윤 림프구 (TIL) 면역요법, 자가 세포 요법, 조작된 자가 세포 요법 (eACT™), 동종 T 세포 이식, 비-T 세포 이식, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 입양 T 세포 요법일 수 있는 T 세포 요법의 유효성을 증진시킬 수 있다. 입양 T 세포 요법은 종양 세포를 인식하고 이에 결합할 수 있는 자가 또는 동종 T 세포를 선택하고, 시험관내에서 풍부화시키고, 환자에게 투여하는 임의의 방법을 광범위하게 포함한다. TIL 면역요법은 종양 조직에 침윤할 수 있는 림프구가 단리되고, 시험관내에서 풍부화되고, 환자에게 투여되는 유형의 입양 T 세포 요법이다. TIL 세포는 자가 또는 동종일 수 있다. 자가 세포 요법은 환자로부터 종양 세포를 표적화할 수 있는 T 세포를 단리하고, T 세포를 시험관내에서 풍부화시키고, T 세포를 동일한 환자에게 다시 투여하는 것을 수반하는 입양 T 세포 요법이다. 동종 T 세포 이식은 생체외에서 확장된 자연 발생 T 세포 또는 유전자 조작된 T 세포의 이식을 포함할 수 있다. 상기에 보다 상세히 기재된 바와 같은 조작된 자가 세포 요법은 환자 자신의 림프구가 단리되고, 종양 표적화 분자를 발현하도록 유전자 변형되고, 시험관내에서 확장되고, 환자에게 다시 투여되는 입양 T 세포 요법이다. 비-T 세포 이식은 자연 킬러 (NK) 세포와 같은, 그러나 이에 제한되지는 않는 비-T 세포를 사용한 자가 또는 동종 요법을 포함할 수 있다.
하나의 특정한 실시양태에서, 본 발명의 T 세포 요법은 조작된 자가 세포 요법 (eACT™)이다. 이러한 실시양태에 따라, 방법은 혈액 세포를 공여자에서 수집하는 단계를 포함할 수 있다. 단리된 혈액 세포 (예를 들어, T 세포)는 이어서, AKT 억제제, 및 외인성 IL-7 및 외인성 IL-15 중 하나 이상과 접촉될 수 있다. T 세포는 이어서 키메라 항원 수용체 ("조작된 CAR T 세포") 또는 T 세포 수용체 ("조작된 TCR T 세포")를 발현하도록 조작될 수 있다. 하나의 특정한 실시양태에서, AKT 억제제, 및 외인성 IL-7 및 외인성 IL-15 중 하나 이상과 접촉된 조작된 CAR T 세포 또는 조작된 TCR T 세포는 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 조작된 T 세포는 대상체에서 종양을 치료한다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 T 세포는 세포 표면 수용체를 코딩하는 이종 유전자를 포함하는 레트로바이러스로 형질도입된다. 하나의 특정한 실시양태에서, 세포 표면 수용체는 표적 세포의 표면 상의, 예를 들어, 종양 세포의 표면 상의 항원에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서 세포 표면 수용체는 키메라 항원 수용체 또는 T 세포 수용체이다.
한 실시양태에서, 하나 이상의 T 세포는 키메라 항원 수용체를 발현하도록 조작될 수 있다. 키메라 항원 수용체는 종양 항원에 대한 결합 분자를 포함할 수 있다. 결합 분자는 항체 또는 그의 항원 결합 분자일 수 있다. 예를 들어, 항원 결합 분자는 scFv, Fab, Fab', Fv, F(ab')2, 및 dAb, 및 그의 임의의 단편 또는 조합으로부터 선택될 수 있다.
키메라 항원 수용체는 힌지 영역을 추가로 포함할 수 있다. 힌지 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgD, IgE, IgM, CD28, 또는 CD8 알파의 힌지 영역으로부터 유래될 수 있다. 하나의 특정한 실시양태에서, 힌지 영역은 IgG4의 힌지 영역으로부터 유래된다.
키메라 항원 수용체는 또한 막횡단 도메인을 포함할 수 있다. 막횡단 도메인은 면역 세포 상의 보조-수용체인 임의의 막횡단 분자의 막횡단 도메인, 또는 이뮤노글로불린 슈퍼패밀리의 구성원의 막횡단 도메인일 수 있다. 특정 실시양태에서, 막횡단 도메인은 CD28, CD28T, CD8 알파, CD4, 또는 CD19의 막횡단 도메인으로부터 유래된다. 하나의 특정한 실시양태에서, 막횡단 도메인은 CD28 막횡단 도메인으로부터 유래된 도메인을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 막횡단 도메인은 CD28T 막횡단 도메인으로부터 유래된 도메인을 포함한다.
키메라 항원 수용체는 하나 이상의 공동자극 신호전달 영역을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 공동자극 신호전달 영역은 CD28, CD28T, OX-40, 41BB, CD27, 유도성 T 세포 공동자극인자 (ICOS), CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD247, Ig 알파 (CD79a), 또는 Fc 감마 수용체의 신호전달 영역일 수 있다. 하나의 특정한 실시양태에서, 공동자극 신호전달 영역은 CD28 신호전달 영역이다. 또 다른 실시양태에서, 공동자극 신호전달 영역은 CD28T 신호전달 영역이다.
한 실시양태에서, 키메라 항원 수용체는 CD3 제타 신호전달 도메인을 추가로 포함한다.
키메라 항원 수용체는 특정한 종양 항원을 표적화하도록 조작될 수 있다. 일부 실시양태에서, 종양 항원은 707-AP (707 알라닌 프롤린), AFP (알파 (a)-태아단백질), ART-4 (T4 세포에 의해 인식되는 선암종 항원), BAGE (B 항원; b-카테닌/m, b-카테닌/돌연변이), BCMA (B 세포 성숙 항원), Bcr-abl (절단점 클러스터 영역-아벨슨(Abelson)), CAIX (탄산 안히드라제 IX), CD19 (분화 클러스터 19), CD20 (분화 클러스터 20), CD22 (분화 클러스터 22), CD30 (분화 클러스터 30), CD33 (분화 클러스터 33), CD44v7/8 (분화 클러스터 44, 엑손 7/8), CAMEL (흑색종 상 CTL-인식 항원), CAP-1 (암배아성 항원 펩티드 - 1), CASP-8 (카스파제-8), CDC27m (세포-분열 주기 27 돌연변이), CDK4/m (시클린-의존성 키나제 4 돌연변이), CEA (암배아성 항원), CT (암/고환 (항원)), Cyp-B (시클로필린 B), DAM (분화 항원 흑색종), EGFR (표피 성장 인자 수용체), EGFRvIII (표피 성장 인자 수용체, 변이체 III), EGP-2 (상피 당단백질 2), EGP-40 (상피 당단백질 40), Erbb2, 3, 4 (적모구성 백혈병 바이러스 종양유전자 상동체-2, -3, 4), ELF2M (신장 인자 2 돌연변이), ETV6-AML1 (Ets 변이체 유전자 6/급성 골수성 백혈병 1 유전자 ETS), FBP (폴레이트 결합 단백질), fAchR (태아 아세틸콜린 수용체), G250 (당단백질 250), GAGE (G 항원), GD2 (디시알로강글리오시드 2), GD3 (디시알로강글리오시드 3), GnT-V (N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 V), Gp100 (당단백질 100kD), HAGE (헬리코스 항원), HER-2/neu (인간 표피 수용체-2/신경계; EGFR2로도 공지됨), HLA-A (인간 백혈구 항원-A) HPV (인간 유두종 바이러스), HSP70-2M (열 쇼크 단백질 70 - 2 돌연변이), HST-2 (인간 반지세포 종양 - 2), hTERT 또는 hTRT (인간 텔로머라제 리버스 트랜스크립타제), iCE (장 카르복실 에스테라제), IL-13R-a2 (인터류킨-13 수용체 서브유닛 알파-2), KIAA0205, KDR (키나제 삽입 도메인 수용체), κ-경쇄, LAGE (L 항원), LDLR/FUT (저밀도 지질 수용체/GDP-L-푸코스: b-D-갈락토시다제 2-a-L푸코실트랜스퍼라제), LeY (루이스(Lewis)-Y 항체), L1CAM (L1 세포 부착 분자), MAGE (흑색종 항원), MAGE-A1 (흑색종-연관 항원 1), MAGE-A3, MAGE-A6, 메소텔린, 뮤린 CMV 감염 세포, MART-1/멜란-A (T 세포-1에 의해 인식되는 흑색종 항원/흑색종 항원 A), MC1R (멜라노코르틴 1 수용체), 미오신/m (미오신 돌연변이), MUC1 (뮤신 1), MUM-1, -2, -3 (흑색종 편재 돌연변이 1, 2, 3), NA88-A (환자 M88의 NA cDNA 클론), NKG2D (자연 킬러 그룹 2, 구성원 D) 리간드, NY-BR-1 (뉴욕 유방 분화 항원 1), NY-ESO-1 (뉴욕 식도 편평 세포 암종-1), 종양태아성 항원 (h5T4), P15 (단백질 15), p190 마이너 bcr-abl (190KD bcr-abl의 단백질), Pml/RARa (전골수구성 백혈병/레티노산 수용체 a), PRAME (흑색종의 우선적으로 발현되는 항원), PSA (전립선-특이적 항원), PSCA (전립선 줄기 세포 항원), PSMA (전립선-특이적 막 항원), RAGE (신장 항원), RU1 또는 RU2 (신장 편재 1 또는 2), SAGE (육종 항원), SART-1 또는 SART-3 (편평 항원 거부 종양 1 또는 3), SSX1, -2, -3, 4 (활막 육종 X1, -2, -3, -4), TAA (종양-연관 항원), TAG-72 (종양-연관 당단백질 72), TEL/AML1 (전위 Ets-패밀리 백혈병/급성 골수성 백혈병 1), TPI/m (트리오스포스페이트 이소머라제 돌연변이), TRP-1 (티로시나제 관련 단백질 1, 또는 gp75), TRP-2 (티로시나제 관련 단백질 2), TRP-2/INT2 (TRP-2/인트론 2), VEGF-R2 (혈관 내피 성장 인자 수용체 2), 또는 WT1 (윌름스 종양 유전자), 및 그의 임의의 조합으로부터 선택된다. 하나의 특정한 실시양태에서, 종양 항원은 CD19이다.
또 다른 실시양태에서, T 세포 요법은 환자에게 T 세포 수용체를 발현하는 조작된 T 세포 ("조작된 TCR T 세포")를 투여하는 것을 포함한다. T 세포 수용체 (TCR)는 종양 항원에 대한 결합 분자를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 종양 항원은 707-AP, AFP, ART-4, BAGE, BCMA, Bcr-abl, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44v7/8, CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27m, CDK4/m, CEA, CT, Cyp-B, DAM, EGFR, EGFRvIII, EGP-2, EGP-40, Erbb2, 3, 4, ELF2M, ETV6-AML1, FBP, fAchR, G250, GAGE, GD2, GD3, GnT-V, Gp100, HAGE, HER-2/neu, HLA-A, HPV, HSP70-2M, HST-2, hTERT 또는 hTRT, iCE, IL-13R-a2, KIAA0205, KDR, κ-경쇄, LAGE, LDLR/FUT, LeY, L1CAM, MAGE, MAGE-A1, 메소텔린, 뮤린 CMV 감염 세포, MART-1/멜란-A, MC1R, 미오신/m, MUC1, MUM-1, -2, -3, NA88-A, NKG2D 리간드, NY-BR-1, NY-ESO-1, 종양태아성 항원, P15, p190 마이너 bcr-abl, Pml/RARa, PRAME, PSA, PSCA, PSMA, RAGE, RU1 또는 RU2, SAGE, SART-1 또는 SART-3, SSX1, -2, -3, 4, TAA, TAG-72, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2, VEGF-R2, WT1, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, TCR은 바이러스 종양유전자에 대한 결합 분자를 포함한다. 하나의 특정한 실시양태에서, 바이러스 종양유전자는 인간 유두종 바이러스 (HPV), 엡스타인-바르 바이러스 (EBV), 및 인간 T-림프향성 바이러스 (HTLV)로부터 선택된다.
또 다른 실시양태에서, TCR은 고환, 태반 또는 태아 종양 항원에 대한 결합 분자를 포함한다. 하나의 특정한 실시양태에서, 고환, 태반 또는 태아 종양 항원은 NY-ESO-1, 활막 육종 X 중단점 2 (SSX2), 흑색종 항원 (MAGE), 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 실시양태에서, TCR은 계통 특이적 항원에 대한 결합 분자를 포함한다. 하나의 특정한 실시양태에서, 계통 특이적 항원은 T 세포가 인식하는 흑색종 항원 1 (MART-1), gp100, 전립선 특이적 항원 (PSA), 전립선 특이적 막 항원 (PSMA), 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA), 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, T 세포 요법은 환자에게 CD19에 결합하고 CD28 공동자극 도메인 및 CD3-제타 신호전달 영역을 추가로 포함하는 키메라 항원 수용체를 발현하는 조작된 CAR T 세포를 투여하는 것을 포함한다. 특정한 실시양태에서, T 세포 요법은 환자에게 KTE-C19를 투여하는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 항원 모이어티는 또한 엡스타인-바르 바이러스 (EBV) 항원 (예를 들어, EBNA-1, EBNA-2, EBNA-3, LMP-1, LMP-2), A형 간염 바이러스 항원 (예를 들어, VP1, VP2, VP3), B형 간염 바이러스 항원 (예를 들어, HBsAg, HBcAg, HBeAg), C형 간염 바이러스 항원 (예를 들어, 외피 당단백질 E1 및 E2), 단순 포진 바이러스 유형 1, 유형 2, 또는 유형 8 (HSV1, HSV2, 또는 HSV8) 바이러스 항원 (예를 들어, 당단백질 gB, gC, gC, gE, gG, gH, gI, gJ, gK, gL. gM, UL20, UL32, US43, UL45, UL49A), 시토메갈로바이러스 (CMV) 바이러스 항원 (예를 들어, 당단백질 gB, gC, gC, gE, gG, gH, gI, gJ, gK, gL. gM 또는 다른 외피 단백질), 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 바이러스 항원 (당단백질 gp120, gp41, 또는 p24), 인플루엔자 바이러스 항원 (예를 들어, 헤마글루티닌 (HA) 또는 뉴라미니다제 (NA)), 홍역 또는 볼거리 바이러스 항원, 인간 유두종바이러스 (HPV) 바이러스 항원 (예를 들어, L1, L2), 파라인플루엔자 바이러스 바이러스 항원, 풍진 바이러스 바이러스 항원, 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV) 바이러스 항원, 또는 수두-대상포진 바이러스 바이러스 항원을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 실시양태에서, 세포 표면 수용체는 표적 바이러스 감염 세포 상의 임의의 상기 언급된 바이러스 항원을 인식하는 임의의 TCR, 또는 임의의 CAR일 수 있다.
다른 실시양태에서, 항원 모이어티는 면역 또는 염증성 기능장애를 갖는 세포와 연관된다. 이러한 항원 모이어티는 미엘린 염기성 단백질 (MBP) 미엘린 단백질지질 단백질 (PLP), 미엘린 핍지교세포 당단백질 (MOG), 암배아성 항원 (CEA), 프로-인슐린, 글루타민 데카르복실라제 (GAD65, GAD67), 열 쇼크 단백질 (HSP), 또는 병원성 자가면역 과정에 수반되거나 또는 연관된 임의의 다른 조직 특이적 항원을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 개시된 방법은 환자에게 하나 이상의 T 세포를 전달하는 것 포함하는 T 세포 요법을 수반할 수 있다. T 세포는 치료 유효량으로 투여될 수 있다. 예를 들어, T 세포, 예를 들어, 조작된 CAR+ T 세포 또는 조작된 TCR+ T 세포의 치료 유효량은 적어도 약 104개 세포, 적어도 약 105개 세포, 적어도 약 106개 세포, 적어도 약 107개 세포, 적어도 약 108개 세포, 적어도 약 109개, 또는 적어도 약 1010개일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, T 세포, 예를 들어, 조작된 CAR+ T 세포 또는 조작된 TCR+ T 세포의 치료 유효량은 약 104개 세포, 약 105개 세포, 약 106개 세포, 약 107개 세포, 또는 약 108개 세포이다. 하나의 특정한 실시양태에서, T 세포, 예를 들어, 조작된 CAR+ T 세포 또는 조작된 TCR+ T 세포의 치료 유효량은 약 2 X 106개 세포/kg, 약 3 X 106개 세포/kg, 약 4 X 106개 세포/kg, 약 5 X 106개 세포/kg, 약 6 X 106개 세포/kg, 약 7 X 106개 세포/kg, 약 8 X 106개 세포/kg, 약 9 X 106개 세포/kg, 약 1 X 107개 세포/kg, 약 2 X 107개 세포/kg, 약 3 X 107개 세포/kg, 약 4 X 107개 세포/kg, 약 5 X 107개 세포/kg, 약 6 X 107개 세포/kg, 약 7 X 107개 세포/kg, 약 8 X 107개 세포/kg, 또는 약 9 X 107개 세포/kg이다.
일부 실시양태에서, 환자는 T 세포 요법의 투여 전에 사전컨디셔닝된다. 환자는 하나 이상의 화학요법 약물 및/또는 방사선요법을 사용한 치료를 포함하나, 이에 제한되지는 않는, 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 따라 사전컨디셔닝될 수 있다. 일부 실시양태에서, 사전컨디셔닝은 T 세포 요법 이전에 내인성 림프구의 수를 저하시키거나, 시토카인 하락을 제거하거나, 하나 이상의 항상성 시토카인 또는 염증유발 인자의 혈청 수준을 증가시키거나, 컨디셔닝 후에 투여되는 T 세포의 이펙터 기능을 증진시키거나, 항원 제시 세포 활성화 및/또는 이용가능성을 증진시키거나, 또는 그의 임의의 조합인 임의의 치료를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 사전컨디셔닝은 대상체에서 하나 이상의 시토카인의 혈청 수준을 증가시키는 것을 포함한다.
암 치료
본 발명의 방법은 대상체에서 암을 치료하거나, 종양 크기를 축소시키거나, 종양 세포를 사멸시키거나, 종양 세포 증식을 방지하거나, 종양 성장을 방지하거나, 환자로부터 종양을 제거하거나, 종양 재발을 방지하거나, 종양 전이를 방지하거나, 환자에서 완화를 유도하거나, 또는 그의 임의의 조합을 위해 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 방법은 완전 반응을 유도한다. 다른 실시양태에서, 방법은 부분 반응을 유도한다.
한 실시양태, 본 발명은 T 세포 요법을 필요로 하는 대상체에게 하나 이상의 T 세포를 투여하는 단계를 포함하는, T 세포 요법을 필요로 하는 대상체에서 종양을 치료하는 방법에 관한 것이며, 여기서 하나 이상의 T 세포는 (i) AKT 억제제 및 (ii) 외인성 IL-7 및/또는 외인성 IL-15와 접촉된다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 T 세포 요법을 필요로 하는 대상체에게 하나 이상의 T 세포를 투여하는 단계를 포함하는, T 세포 요법을 필요로 하는 대상체에서 종양의 크기를 축소 또는 감소시키거나 또는 종양의 성장을 억제하는 방법에 관한 것이며, 여기서 하나 이상의 T 세포는 (i) AKT 억제제 및 (ii) 외인성 IL-7 및/또는 외인성 IL-15와 접촉된다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 T 세포는 외인성 IL-2와 접촉되지 않았다.
치료될 수 있는 암은 혈관화되지 않았거나, 아직 실질적으로 혈관화되지 않았거나, 또는 혈관화된 종양을 포함한다. 암은 또한 고형 또는 비-고형 종양을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 암은 급성 림프모구성 백혈병 (ALL), 급성 골수성 백혈병 (AML), 선양 낭성 암종, 부신피질 암종, AIDS-관련 암, 항문암, 충수암, 성상세포종, 비정형 기형종/횡문근양 종양, 중추 신경계, B-세포 백혈병, 림프종 또는 다른 B 세포 악성종양, 기저 세포 암종, 담관암, 방광암, 골암, 골육종 및 악성 섬유성 조직구종, 뇌간 신경교종, 뇌 종양, 유방암, 기관지 종양, 버킷 림프종, 카르시노이드 종양, 중추 신경계암, 자궁경부암, 척삭종, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 만성 골수성 백혈병 (CML), 만성 골수증식성 장애, 결장암, 결장직장암, 두개인두종, 피부 t-세포 림프종, 배아성 종양, 중추 신경계, 자궁내막암, 상의모세포종, 상의세포종, 식도암, 감각신경모세포종, 종양의 유잉 육종 패밀리, 두개외 배세포 종양, 생식선외 배세포 종양, 간외 담관암, 안암, 골의 섬유성 조직구종, 악성, 및 골육종, 담낭암, 위의 (위) 암, 위장 카르시노이드 종양, 위장 기질 종양 (GIST), 연부 조직 육종, 배세포 종양, 임신성 영양막 종양, 신경교종, 모발상 세포 백혈병, 두경부암, 심장암, 간세포 (간) 암, 조직구증, 호지킨 림프종, 하인두암, 안내 흑색종, 도세포 종양 (내분비 췌장), 카포시 육종, 신장암, 랑게르한스 세포 조직구증, 후두암, 백혈병, 구순암 및 구강암, 간암 (원발성), 소엽성 상피내 암종 (LCIS), 폐암, 림프종, 마크로글로불린혈증, 남성 유방암, 골의 악성 섬유성 조직구종 및 골육종, 수모세포종, 수질상피종, 흑색종, 메르켈 세포 암종, 중피종, NUT 유전자를 수반하는 잠재성 원발성인 정중선 관 암종을 갖는 전이성 편평 경부암, 구강암, 다발 내분비 신생물 증후군, 다발성 골수종/형질 세포 신생물, 균상 식육종, 골수이형성 증후군, 골수이형성/골수증식성 신생물, 골수성 백혈병, 만성 (CML), 골수성 백혈병, 급성 (AML), 골수종, 다발성 골수증식성 장애, 비강암 및 부비동암, 비인두암, 신경모세포종, 비-호지킨 림프종, 비소세포 폐암, 구내암, 구강암, 구인두암, 골육종 및 골의 악성 섬유성 조직구종, 난소암, 췌장암, 유두종증, 부신경절종, 부비동암 및 비강암, 부갑상선암, 음경암, 인두암, 크롬친화세포종, 중간 분화 송과체 실질 종양, 송과체모세포종 및 천막상 원시 신경외배엽 종양, 뇌하수체 종양, 형질 세포 신생물/다발성 골수종, 흉막폐 모세포종, 임신 및 유방 암, 원발성 중추 신경계 (CNS) 림프종, 전립선암, 직장암, 신세포 (신장) 암, 신우 및 요관, 이행 세포암, 망막모세포종, 횡문근육종, 타액선암, 육종, 세자리 증후군, 소세포 폐암, 소장암, 연부 조직 육종, 편평 세포 암종, 편평 경부암, 위 (위의 암), 천막상 원시 신경외배엽 종양, t-세포 림프종, 피부암, 고환암, 인후암, 흉선종 및 흉선 암종, 갑상선암, 신우 및 요관의 이행 세포암, 영양막 종양, 요관암 및 신우암, 요도암, 자궁암, 자궁 육종, 질암, 외음부암, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 윌름스 종양으로부터 유래된 종양으로부터 선택될 수 있다.
한 실시양태에서, 방법은 림프종 또는 백혈병인 종양을 치료하는 데 사용될 수 있다. 림프종 및 백혈병은 림프구에 특이적으로 영향을 미치는 혈액의 암이다. 혈액 내의 모든 백혈구는 골수에서 발견되는 단일 유형의 다능 조혈 줄기 세포로부터 유래된다. 이러한 줄기 세포는 골수성 선조 세포 및 림프구성 선조 세포 둘 다를 생산하며, 이는 이어서 신체 내에서 발견되는 다양한 유형의 백혈구를 발생시킨다. 골수성 선조 세포로부터 발생하는 백혈구는 T 림프구 (T 세포), B 림프구 (B 세포), 자연 킬러 세포, 및 형질 세포를 포함한다. 림프구성 선조 세포로부터 발생하는 백혈구는 거핵구, 비만 세포, 호염기구, 호중구, 호산구, 단핵구, 및 대식세포를 포함한다. 림프종 및 백혈병은 환자 내의 이들 세포 유형 중 하나 이상에 영향을 미칠 수 있다.
일반적으로, 림프종은 적어도 2개의 하위군으로 분류될 수 있다: 호지킨 림프종 및 비-호지킨 림프종. 비-호지킨 림프종 (NHL)은 B 림프구, T 림프구 또는 자연 킬러 세포에서 유래하는 암의 이종 군이다. 미국에서, B 세포 림프종은 보고된 사례의 80-85%를 나타낸다. 2013년에, 대략 69,740건의 새로운 NHL 사례 및 질환과 관련된 19,000건 초과의 사망이 발생한 것으로 추정되었다. 비-호지킨 림프종은 가장 보편적인 혈액 악성종양이고, 남성 및 여성에서 새로운 암의 7번째로 선도적인 위치이고, 모든 새로운 암 사례의 4% 및 암과 관련된 사망의 3%를 차지한다.
미만성 대 B 세포 림프종 (DLBCL)은 NHL 사례의 대략 30%를 차지하며, NHL의 가장 흔한 하위유형이다. 미국에서 매년 대략 22,000건의 새로운 DLBCL 진단이 존재한다. 이는 대다수의 환자가 통상적인 화학요법 (NCCN 가이드라인 NHL 2014)을 사용하여 치유되는 공격성 림프종으로 분류된다.
DLBCL에 대한 1차 요법은 안트라시클린-함유 요법과 함께 리툭시맙, 예컨대 R-CHOP (리툭시맙, 시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴, 및 프레드니손)를 전형적으로 포함하며, 이는 약 80%의 객관적 반응률 및 약 50%의 완전 반응률을 가지며 (Coiffier 2002), 환자의 약 3분의 1이 초기 요법에 대한 불응성 질환이 있거나 또는 R-CHOP 후에 재발한다 (Sehn 2005). 1차 요법에 대한 반응 후에 재발한 환자의 경우, 환자의 대략 40-60%는 추가의 화학요법으로 제2 반응을 달성할 수 있다. 자가 줄기 세포 이식 (ASCT) 적격 환자에 대한 2차 요법에 대한 표준 관리는 리툭시맙 및 조합 화학요법 예컨대 R-ICE (리툭시맙, 이포스파미드, 카르보플라틴, 및 에토포시드) 및 R-DHAP (리툭시맙, 덱사메타손, 시타라빈, 및 시스플라틴)를 포함하며, 이들 각각은 약 63%의 객관적 반응률 및 약 26%의 완전 반응률을 갖는다 (Gisselbrecht 2010). 2차 요법에 반응하고 이식에 충분히 적합하다고 간주되는 환자는 고용량 화학요법 및 ASCT로의 압밀을 받으며, 이는 이식된 환자의 약 절반에서 치유적이다 (Gisselbrecht 2010). ASCT가 실패한 환자는 예후가 매우 불량하고, 치료 옵션이 없다.
원발성 종격 대 B 세포 림프종 (PMBCL)은 DLBCL과 비교하여 독특한 임상적, 병리학적, 및 분자적 특징을 갖는다. PMBCL은 흉선 (수질성) B 세포에서 발생하는 것으로 생각되고, DLBCL로 진단된 환자의 대략 3%를 나타낸다. PMBCL은 40대의 보다 젊은 성인 집단에서 전형적으로 확인되며, 여성이 약간 우세하다. 유전자 발현 프로파일링은 PMBCL에서의 탈조절된 경로가 호지킨 림프종과 중첩된다는 것을 시사한다. PMBCL의 초기 요법은 일반적으로 안트라시클린-함유 요법과 함께 리툭시맙, 예컨대 주입형 용량-조정 에토포시드, 독소루비신, 및 시클로포스파미드와 함께 빈크리스틴, 프레드니손, 및 리툭시맙 (DA-EPOCH-R)을 포함하며, 현장 방사선요법은 수반되거나 또는 수반되지 않는다.
B 세포 림프종인 여포성 림프종 (FL)은 가장 흔한 무통성 (저속-성장) 형태의 NHL이며, 모든 NHL의 대략 20% 내지 30%를 차지한다. FL을 갖는 일부 환자는 보다 공격적이고 불량한 결과와 연관된 DLBCL로 조직학적으로 전환될 것이다 (TFL). DLBCL로의 조직학적 전환은 15년 동안 대략 3%의 연간 비율로 발생하며, 후속 연도에는 전환 위험이 계속 하락한다. 조직학적 전환의 생물학적 메카니즘은 미지이다. TFL의 초기 치료는 여포성 림프종에 대한 선행 요법에 영향을 받지만, 일반적으로 질환의 공격적 성분을 제거하기 위해 안트라시클린-함유 요법과 함께 리툭시맙을 포함한다.
재발/불응성 PMBCL 및 TFL에 대한 치료 옵션은 DLBCL에서의 것들과 유사하다. 이들 질환의 낮은 유병률을 고려하여, 이들 환자 집단에서 어떠한 대형 전향적 무작위화 연구도 수행되지 않았다. 화학요법 불응성 질환을 갖는 환자는 불응성 DLBCL을 갖는 환자와 유사하거나 또는 악화된 예후를 갖는다.
요약하면, 불응성, 공격성 NHL (예를 들어, DLBCL, PMBCL 및 TFL)을 갖는 대상체는 주요한 미충족 의료 필요를 갖고, 신규 치료를 사용한 추가의 연구가 이들 집단에서 정당화된다.
따라서, 일부 실시양태에서, 방법은 B 세포 악성종양인 림프종 또는 백혈병을 치료하는 데 사용될 수 있다. B 세포 악성종양의 예는 비-호지킨 림프종 (NHL), 소림프구성 림프종 (SLL/CLL), 외투 세포 림프종 (MCL), FL, 변연부 림프종 (MZL), 림프절외 (MALT 림프종), 결절성 (단핵구성 B-세포 림프종), 비장, 미만성 대세포 림프종, B 세포 만성 림프구성 백혈병/림프종, 버킷 림프종 및 림프모구성 림프종을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 림프종 또는 백혈병은 B-세포 만성 림프구성 백혈병/소세포 림프종, B-세포 전림프구성 백혈병, 림프형질세포성 림프종 (예를 들어, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증), 비장 변연부 림프종, 모발상 세포 백혈병, 형질 세포 신생물 (예를 들어, 형질 세포 골수종 (즉, 다발성 골수종), 또는 형질세포종), 림프절외 변연부 B 세포 림프종 (예를 들어, MALT 림프종), 결절성 변연부 B 세포 림프종, 여포성 림프종 (FL), 전환된 여포성 림프종 (TFL), 원발성 피부 여포 중심세포 림프종, 외투 세포 림프종, 미만성 대 B 세포 림프종 (DLBCL), 엡스타인-바르 바이러스-양성 DLBCL, 림프종성 육아종증, 원발성 종격 (흉선) 대 B-세포 림프종 (PMBCL), 혈관내 대 B-세포 림프종, ALK+ 대 B-세포 림프종, 형질모구성 림프종, 원발성 삼출 림프종, HHV8-연관 다중심성 캐슬만병에서 발생하는 대 B-세포 림프종, 버킷 림프종/백혈병, T-세포 전림프구성 백혈병, T-세포 거대 과립 림프구 백혈병, 공격성 NK 세포 백혈병, 성인 T-세포 백혈병/림프종, 림프절외 NK/T-세포 림프종, 장병증-연관 T-세포 림프종, 간비장 T-세포 림프종, 모구성 NK 세포 림프종, 균상 식육종 / 세자리 증후군, 원발성 피부 역형성 대세포 림프종, 림프종성 구진증, 말초 T-세포 림프종, 혈관면역모세포성 T 세포 림프종, 역형성 대세포 림프종, B-림프모구성 백혈병/림프종, 재발성 유전자 이상을 갖는 B-림프모구성 백혈병/림프종, T-림프모구성 백혈병/림프종, 및 호지킨 림프종을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 암은 하나 이상의 선행 치료에 대해 불응성이고/거나, 암은 하나 이상의 선행 치료 후에 재발되었다.
특정 실시양태에서, 암은 여포성 림프종, 전환된 여포성 림프종, 미만성 대 B 세포 림프종, 및 원발성 종격 (흉선) 대 B-세포 림프종으로부터 선택된다. 하나의 특정한 실시양태에서, 암은 미만성 대 B 세포 림프종이다.
일부 실시양태에서, 화학요법, 방사선요법, 면역요법 (T 세포 요법 및/또는 항체 또는 항체-약물 접합체를 사용한 치료 포함), 자가 줄기 세포 이식, 또는 그의 임의의 조합 중 하나 이상에 대해 암이 불응성이거나 또는 그 후에 암이 재발되었다. 하나의 특정한 실시양태에서, 암은 불응성 미만성 대 B 세포 림프종이다.
일부 실시양태에서, 암은 하나 이상의 T 세포를 대상체에게 투여함으로써 치료되며, 여기서 하나 이상의 T 세포는 (i) AKT 억제제 및 (ii) 외인성 IL-7 및/또는 외인성 IL-15와 접촉된다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 T 세포는 하나 이상의 T 세포를 대상체에게 투여하기 전에 AKT 억제제, 외인성 IL-7, 및/또는 외인성 IL-15를 제거하기 위해 세척된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 T 세포는 조작된 CAR 세포 또는 조작된 TCR 세포를 포함한다. 한 실시양태에서, 조작된 CAR 세포 또는 조작된 T 세포는 대상체에서 종양을 치료한다.
키트
시험관내에서 하나 이상의 T 세포를 접촉시키기 위한 AKT 억제제, 및 외인성 IL-7 및 외인성 IL-15 중 하나 이상을 포함하는 키트, 예를 들어, 제약 키트가 또한 본 발명의 범주 내에 포함된다. 키트는 전형적으로, 키트의 내용물의 의도되는 용도를 나타내는 라벨 및 사용에 대한 지침서를 포함한다. 용어 "라벨"은 키트 상에 또는 그와 함께 공급되거나, 또는 달리 키트에 동반되는 임의의 문서 또는 기록물을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 T 세포 요법을 필요로 하는 대상체를 위한 T 세포 요법을 위한 하나 이상의 T 세포를 제조하기 위한 키트를 제공하며, 키트는
(i) AKT 억제제,
(ii) 외인성 IL-7, 및
(iii) T 세포 요법에 사용하도록 의도된 하나 이상의 T 세포를 AKT 억제제 및 외인성 IL-7과 접촉시키는 것에 대한 지침서
를 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 T 세포 요법을 필요로 하는 대상체를 위한 T 세포 요법을 위한 하나 이상의 T 세포를 제조하기 위한 키트를 제공하며, 키트는
(i) AKT 억제제,
(ii) 외인성 IL-15, 및
(iii) T 세포 요법에 사용하도록 의도된 하나 이상의 T 세포를 AKT 억제제 및 외인성 IL-15와 접촉시키는 것에 대한 지침서
를 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 T 세포 요법을 필요로 하는 대상체를 위한 T 세포 요법을 위한 하나 이상의 T 세포를 제조하기 위한 키트를 제공하며, 키트는
(i) AKT 억제제,
(ii) 외인성 IL-7,
(iii) 외인성 IL-15, 및
(iii) T 세포 요법에 사용하도록 의도된 하나 이상의 T 세포를 AKT 억제제, 외인성 IL-7, 및/또는 외인성 IL-15와 접촉시키는 것에 대한 지침서
를 포함한다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시되며, 이는 추가의 제한으로 해석되어서는 안된다. 본 출원 전체에 걸쳐 인용된 모든 참고문헌의 내용은 분명하게 본원에 참조로 포함된다.
하기 실시예는 본 발명의 다양한 실시양태를 예시하고자 의도된다. 그에 따라, 논의된 구체적 실시양태는 본 발명의 범주에 대한 제한으로 해석되지 않아야 한다. 예를 들어, 하기 실시예가 항-CD19 키메라 항원 수용체 (CAR)로 형질도입된 T 세포에 관한 것이지만, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 기재된 방법이 임의의 CAR로 형질도입된 T 세포에 적용될 수 있음을 이해할 것이다. 본 발명의 범주를 벗어나지 않으면서 다양한 등가물, 변화 및 변형이 이루어질 수 있다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이고, 이러한 등가의 실시양태는 본원에 포함되는 것으로 이해된다. 추가로, 본 개시내용에 인용된 모든 참고문헌은 마치 본원에 그 전체가 제시되는 바와 같이, 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
실시양태
E1. T 세포 요법을 필요로 하는 대상체로부터의 하나 이상의 T 세포를 AKT 억제제, 및 외인성 인터류킨-7 (IL-7) 및 외인성 인터류킨-15 (IL-15) 중 적어도 하나와 접촉시키는 단계를 포함하는, T 세포 요법을 위해 시험관내에서 T 세포 성숙 또는 분화를 지연시키거나 또는 억제하는 방법이며, 여기서 생성된 T 세포는 지연된 성숙 또는 분화를 나타내고/거나 생성된 T 세포는 AKT 억제제의 부재 하에 배양된 T 세포의 T 세포 기능에 비해 개선된 T 세포 기능을 나타내는 것인, T 세포 요법을 위해 시험관내에서 T 세포 성숙 또는 분화를 지연시키거나 또는 억제하는 방법.
E2. T 세포 요법을 필요로 하는 대상체로부터의 하나 이상의 T 세포를 AKT 억제제, 및 외인성 인터류킨-7 (IL-7) 및 외인성 인터류킨-15 (IL-15) 중 적어도 하나와 접촉시키는 단계를 포함하는, T 세포 요법을 위해 시험관내에서 T 세포 기능을 개선시키는 방법이며, 여기서 생성된 T 세포는 AKT 억제제의 부재 하에 배양된 T 세포의 T 세포 기능에 비해 개선된 T 세포 기능을 나타내는 것인, T 세포 요법을 위해 시험관내에서 T 세포 기능을 개선시키는 방법.
E3. E1 또는 E2에 있어서, 개선된 T 세포 기능이
(i) 증가된 T 세포 증식;
(ii) 증가된 시토카인 생산;
(iii) 증가된 세포용해 활성; 및
(iv) (i)-(iii)의 임의의 조합
으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
E4. T 세포 요법을 필요로 하는 대상체로부터의 하나 이상의 T 세포를 AKT 억제제, 및 외인성 인터류킨-7 (IL-7) 및 외인성 인터류킨-15 (IL-15) 중 적어도 하나와 접촉시키는 단계를 포함하는, T 세포 요법 전에 시험관내에서 T 세포 증식을 증가시키는 방법이며, 여기서 생성된 T 세포는 AKT 억제제의 부재 하에 배양된 T 세포의 T 세포 증식에 비해 증가된 T 세포 증식을 나타내는 것인, T 세포 요법 전에 시험관내에서 T 세포 증식을 증가시키는 방법.
E5. T 세포 요법을 필요로 하는 대상체로부터의 하나 이상의 T 세포를 AKT 억제제, 및 외인성 인터류킨-7 (IL-7) 및 외인성 인터류킨-15 (IL-15) 중 적어도 하나와 접촉시키는 단계를 포함하는, T 세포 요법 전에 시험관내에서 T 세포 시토카인 생산을 증가시키는 방법이며, 여기서 생성된 T 세포는 AKT 억제제의 부재 하에 배양된 T 세포의 시토카인 생산에 비해 증가된 시토카인 생산을 나타내는 것인, T 세포 요법 전에 시험관내에서 T 세포 시토카인 생산을 증가시키는 방법.
E6. E3 또는 E5에 있어서, 증가된 시토카인 생산이 (i) 증가된 인터페론 감마 (IFNg) 생산, (ii) 증가된 조직 괴사 인자 알파 (TNFa) 생산, 및 (iii) 증가된 IFNg 및 TNFa 생산 둘 다로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
E7. T 세포 요법을 필요로 하는 대상체로부터의 하나 이상의 T 세포를 AKT 억제제, 및 외인성 인터류킨-7 (IL-7) 및 외인성 인터류킨-15 (IL-15) 중 적어도 하나와 접촉시키는 단계를 포함하는, T 세포 요법을 위해 시험관내에서 T 세포 세포용해 활성을 증가시키는 방법이며, 여기서 생성된 T 세포는 AKT 억제제의 부재 하에 배양된 T 세포의 T 세포 세포용해 활성에 비해 증가된 세포용해 활성을 나타내는 것인, T 세포 요법을 위해 시험관내에서 T 세포 세포용해 활성을 증가시키는 방법.
E8. T 세포 요법을 필요로 하는 대상체로부터의 하나 이상의 T 세포를 AKT 억제제, 및 외인성 인터류킨-7 (IL-7) 및 외인성 인터류킨-15 (IL-15) 중 적어도 하나와 접촉시키는 단계를 포함하는, T 세포 요법을 위해 시험관내에서 T 세포 성숙 또는 분화를 지연시키거나 또는 억제하는 방법이며, 여기서 생성된 T 세포는 지연된 성숙 또는 분화를 나타내는 것인, T 세포 요법을 위해 시험관내에서 T 세포 성숙 또는 분화를 지연시키거나 또는 억제하는 방법.
E9. E1 내지 E8 중 어느 한 실시양태에 있어서, 접촉시키는 단계가 (i) AKT 억제제 및 (ii) 외인성 IL-7 및/또는 외인성 IL-15를 포함하는 배지 중에서 하나 이상의 T 세포를 배양하는 단계를 포함하는 것인 방법.
E10. E1 내지 E9 중 어느 한 실시양태에 있어서, 하나 이상의 T 세포가 외인성 인터류킨-2 (IL-2)와 접촉되지 않는 것인 방법.
E11. E1 내지 E10 중 어느 한 실시양태에 있어서, T 세포가 AKT 억제제, 외인성 IL-7, 및/또는 외인성 IL-15를 제거하기 위해 세척되는 것인 방법.
E12. E1 내지 E11 중 어느 한 실시양태에 있어서, AKT 억제제가 A6730, B2311, 124018, GSK2110183 (아푸레세르팁), 페리포신 (KRX-0401), GDC-0068 (이파타세르팁), RX-0201, VQD-002, LY294002, A-443654, A-674563, Akti-1, Akti-2, Akti-1/2, AR-42, API-59CJ-OMe, ATI-13148, AZD-5363, 에루실포스포콜린, GSK-2141795 (GSK795), KP372-1, L-418, NL-71-101, PBI-05204, PIA5, PX-316, SR13668, 트리시리빈, GSK 690693 (CAS # 937174-76-0), FPA 124 (CAS # 902779-59-3), 밀테포신, PHT-427 (CAS # 1 191951-57-1), 10-DEBC 히드로클로라이드, Akt 억제제 III, Akt 억제제 VIII, MK-2206 디히드로클로라이드 (CAS # 1032350-13-2), SC79, AT7867 (CAS # 857531-00-1), CCT128930 (CAS # 885499-61-6), A-674563 (CAS # 552325-73-2), AGL 2263, AS-041 164 (5-벤조[1,3]디옥솔-5-일메틸렌-티아졸리딘-2,4-디온), BML-257 (CAS # 32387-96-5), XL-418, CAS # 612847-09-3, CAS # 98510-80-6, H-89 (CAS # 127243-85-0), OXY-1 1 1 A, 3-[1-[[4-(7-페닐-3H-이미다조[4,5-g]퀴녹살린-6-일)페닐]메틸]피페리딘-4-일]-1H-벤즈이미다졸-2-온, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
E13. E1 내지 E12 중 어느 한 실시양태에 있어서, AKT 억제제가 (i) 3-[1-[[4-(7-페닐-3H-이미다조[4,5-g]퀴녹살린-6-일)페닐]메틸]피페리딘-4-일]-1H-벤즈이미다졸-2-온; (ii) N,N-디메틸-1-[4-(6-페닐-1H-이미다조[4,5-g]퀴녹살린-7-일)페닐]메탄아민; 또는 (iii) 1-{1-[4-(3-페닐벤조[g]퀴녹살린-2-일)벤질]피페리딘-4-일}-1,-3-디히드로-2H-벤즈이미다졸-2-온으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물을 포함하는 것인 방법.
E14. E1 내지 E13 중 어느 한 실시양태에 있어서, AKT 억제제가 (i) 3-[1-[[4-(7-페닐-3H-이미다조[4,5-g]퀴녹살린-6-일)페닐]메틸]피페리딘-4-일]-1H-벤즈이미다졸-2-온; (ii) N,N-디메틸-1-[4-(6-페닐-1H-이미다조[4,5-g]퀴녹살린-7-일)페닐]메탄아민; 또는 (iii) 1-{1-[4-(3-페닐벤조[g]퀴녹살린-2-일)벤질]피페리딘-4-일}-1,-3-디히드로-2H-벤즈이미다졸-2-온으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물인 방법.
E15. E1 내지 E14 중 어느 한 실시양태에 있어서, AKT 억제제가 3-[1-[[4-(7-페닐-3H-이미다조[4,5-g]퀴녹살린-6-일)페닐]메틸]피페리딘-4-일]-1H-벤즈이미다졸-2-온인 방법.
E16. E15에 있어서, AKT 억제제가 약 1 nM 내지 약 1 mM의 양으로 존재하는 것인 방법.
E17. E15에 있어서, AKT 억제제가 적어도 약 1 nM, 적어도 약 10 nM, 적어도 약 50 nM, 적어도 약 100 nM, 적어도 약 200 nM, 적어도 약 300 nM, 적어도 약 400 nM, 적어도 약 500 nM, 적어도 약 1 μM, 적어도 약 2 μM, 적어도 약 3 μM, 적어도 약 4 μM, 적어도 약 5 μM, 적어도 약 6 μM, 적어도 약 7 μM, 적어도 약 8 μM, 적어도 약 9 μM, 적어도 약 10 μM, 적어도 약 11 μM, 적어도 약 12 μM, 적어도 약 13 μM, 적어도 약 14 μM, 적어도 약 15 μM, 적어도 약 16 μM, 적어도 약 17 μM, 적어도 약 18 μM, 적어도 약 19 μM, 적어도 약 20 μM, 적어도 약 25 μM, 적어도 약 30 μM, 적어도 약 35 μM, 적어도 약 40 μM, 적어도 약 45 μM, 적어도 약 50 μM, 적어도 약 60 μM, 적어도 약 70 μM, 적어도 약 80 μM, 적어도 약 90 μM, 적어도 약 100 μM, 적어도 약 200 μM, 적어도 약 300 μM, 적어도 약 400 μM, 적어도 약 500 μM, 또는 적어도 약 1 mM으로 이루어진 군으로부터 선택되는 양으로 존재하는 것인 방법.
E18. E15에 있어서, AKT 억제제가 약 8 μM의 양으로 존재하는 것인 방법.
E19. E1 내지 E18 중 어느 한 실시양태에 있어서, 외인성 IL-7이 약 0.001 내지 약 500 ng/ml IL-7의 양으로 존재하는 것인 방법.
E20. E1 내지 E18 중 어느 한 실시양태에 있어서, 외인성 IL-7이 약 1 내지 약 10 ng/ml IL-7의 양으로 존재하는 것인 방법.
E21. E1 내지 E18 중 어느 한 실시양태에 있어서, 외인성 IL-7이 적어도 약 5 ng/ml IL-7의 양으로 존재하는 것인 방법.
E22. E1 내지 E21 중 어느 한 실시양태에 있어서, 외인성 IL-15가 약 0.001 내지 약 500 ng/ml IL-15의 양으로 존재하는 것인 방법.
E23. E1 내지 E21 중 어느 한 실시양태에 있어서, 외인성 IL-15가 약 1 내지 약 10 ng/ml IL-15의 양으로 존재하는 것인 방법.
E24. E1 내지 E21 중 어느 한 실시양태에 있어서, 외인성 IL-15가 적어도 약 5 ng/ml IL-15의 양으로 존재하는 것인 방법.
E25. E1 내지 E24 중 어느 한 실시양태에 있어서, 하나 이상의 T 세포가 CD8을 발현하는 것인 방법.
E26. E25에 있어서, 하나 이상의 T 세포가 종양 침윤 림프구, 세포독성 T 세포, CAR T 세포, 조작된 TCR T 세포, 자연 킬러 T 세포, 및 말초 혈액 림프구로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
E27. E1 내지 E26 중 어느 한 실시양태에 있어서, 하나 이상의 T 세포가 항암 치료를 필요로 하는 대상체로부터 수집되는 것인 방법.
E28. E27에 있어서, 하나 이상의 T 세포가 항암 치료를 필요로 하는 대상체 내의 종양으로부터 수집되는 것인 방법.
E29. E20 또는 E28에 있어서, 하나 이상의 T 세포가 하나 이상의 종양 침윤 백혈구 (TIL)를 포함하는 것인 방법.
E30. E1 내지 E29 중 어느 한 실시양태에 있어서, T 세포가 활성화되는 것인 방법.
E31. E30에 있어서, T 세포의 활성화가 폐쇄 시스템에 존재하는 것인 방법.
E32. E31에 있어서, 폐쇄 시스템이 폐쇄 백 시스템을 포함하는 것인 방법.
E33. E1 내지 E32 중 어느 한 실시양태에 있어서, T 세포가 확장되는 것인 방법.
E34. E32에 있어서, T 세포가 시험관내에서 확장되는 것인 방법.
E35. E32에 있어서, T 세포가 생체내에서 확장되는 것인 방법.
E36. E1 내지 E35 중 어느 한 실시양태에 있어서, 하나 이상의 T 세포를 AKT 억제제, 및 외인성 IL-7 및/또는 외인성 IL-15와 접촉시키는 단계가 T 세포의 생체내 지속성을 연장시키는 것인 방법.
E37. E1 내지 E36 중 어느 한 실시양태에 있어서, 하나 이상의 T 세포를 AKT 억제제, 및 외인성 IL-7 및 외인성 IL-15 중 적어도 하나와 접촉시키는 단계 후에, 생성된 T 세포가 미분화된 또는 미성숙 T 세포를 나타내는 1종 이상의 유전자를 발현하는 것인 방법.
E38. E37에 있어서, 미분화된 또는 미성숙 T 세포를 나타내는 1종 이상의 유전자가 CD8, CD45RA, CCR7, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
E39. E1 내지 E38 중 어느 한 실시양태에 있어서, T 세포를 레트로바이러스로 형질도입시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
E40. E39에 있어서, 레트로바이러스가 세포 표면 수용체를 코딩하는 이종 유전자를 포함하는 것인 방법.
E41. E40에 있어서, 세포 표면 수용체가 표적 세포의 표면 상의 항원에 결합할 수 있는 것인 방법.
E42. E41에 있어서, 표적 세포가 종양 세포인 방법.
E43. E41 또는 E42에 있어서, 세포 표면 수용체가 T 세포 수용체 (TCR) 또는 키메라 항원 수용체 (CAR)인 방법.
E44. E41 내지 E43 중 어느 한 실시양태에 있어서, 세포 표면 수용체가 707-AP (707 알라닌 프롤린), AFP (알파 (a)-태아단백질), ART-4 (T4 세포에 의해 인식되는 선암종 항원), BAGE (B 항원; b-카테닌/m, b-카테닌/돌연변이), BCMA (B 세포 성숙 항원), Bcr-abl (절단점 클러스터 영역-아벨슨), CAIX (탄산 안히드라제 IX), CD19 (분화 클러스터 19), CD20 (분화 클러스터 20), CD22 (분화 클러스터 22), CD30 (분화 클러스터 30), CD33 (분화 클러스터 33), CD44v7/8 (분화 클러스터 44, 엑손 7/8), CAMEL (흑색종 상 CTL-인식 항원), CAP-1 (암배아성 항원 펩티드 - 1), CASP-8 (카스파제-8), CDC27m (세포-분열 주기 27 돌연변이), CDK4/m (시클린-의존성 키나제 4 돌연변이), CEA (암배아성 항원), CT (암/고환 (항원)), Cyp-B (시클로필린 B), DAM (분화 항원 흑색종), EGFR (표피 성장 인자 수용체), EGFRvIII (표피 성장 인자 수용체, 변이체 III), EGP-2 (상피 당단백질 2), EGP-40 (상피 당단백질 40), Erbb2, 3, 4 (적모구성 백혈병 바이러스 종양유전자 상동체-2, -3, 4), ELF2M (신장 인자 2 돌연변이), ETV6-AML1 (Ets 변이체 유전자 6/급성 골수성 백혈병 1 유전자 ETS), FBP (폴레이트 결합 단백질), fAchR (태아 아세틸콜린 수용체), G250 (당단백질 250), GAGE (G 항원), GD2 (디시알로강글리오시드 2), GD3 (디시알로강글리오시드 3), GnT-V (N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 V), Gp100 (당단백질 100kD), HAGE (헬리코스 항원), HER-2/neu (인간 표피 수용체-2/신경계; EGFR2로도 공지됨), HLA-A (인간 백혈구 항원-A) HPV (인간 유두종 바이러스), HSP70-2M (열 쇼크 단백질 70 - 2 돌연변이), HST-2 (인간 반지세포 종양 - 2), hTERT 또는 hTRT (인간 텔로머라제 리버스 트랜스크립타제), iCE (장 카르복실 에스테라제), IL-13R-a2 (인터류킨-13 수용체 서브유닛 알파-2), KIAA0205, KDR (키나제 삽입 도메인 수용체), κ-경쇄, LAGE (L 항원), LDLR/FUT (저밀도 지질 수용체/GDP-L-푸코스: b-D-갈락토시다제 2-a-L푸코실트랜스퍼라제), LeY (루이스-Y 항체), L1CAM (L1 세포 부착 분자), MAGE (흑색종 항원), MAGE-A1 (흑색종-연관 항원 1), 메소텔린, 뮤린 CMV 감염 세포, MART-1/멜란-A (T 세포-1에 의해 인식되는 흑색종 항원/흑색종 항원 A), MC1R (멜라노코르틴 1 수용체), 미오신/m (미오신 돌연변이), MUC1 (뮤신 1), MUM-1, -2, -3 (흑색종 편재 돌연변이 1, 2, 3), NA88-A (환자 M88의 NA cDNA 클론), NKG2D (자연 킬러 그룹 2, 구성원 D) 리간드, NY-BR-1 (뉴욕 유방 분화 항원 1), NY-ESO-1 (뉴욕 식도 편평 세포 암종-1), 종양태아성 항원 (h5T4), P15 (단백질 15), p190 마이너 bcr-abl (190KD bcr-abl의 단백질), Pml/RARa (전골수구성 백혈병/레티노산 수용체 a), PRAME (흑색종의 우선적으로 발현되는 항원), PSA (전립선-특이적 항원), PSCA (전립선 줄기 세포 항원), PSMA (전립선-특이적 막 항원), RAGE (신장 항원), RU1 또는 RU2 (신장 편재 1 또는 2), SAGE (육종 항원), SART-1 또는 SART-3 (편평 항원 거부 종양 1 또는 3), SSX1, -2, -3, 4 (활막 육종 X1, -2, -3, -4), TAA (종양-연관 항원), TAG-72 (종양-연관 당단백질 72), TEL/AML1 (전위 Ets-패밀리 백혈병/급성 골수성 백혈병 1), TPI/m (트리오스포스페이트 이소머라제 돌연변이), TRP-1 (티로시나제 관련 단백질 1, 또는 gp75), TRP-2 (티로시나제 관련 단백질 2), TRP-2/INT2 (TRP-2/인트론 2), VEGF-R2 (혈관 내피 성장 인자 수용체 2), 또는 WT1 (윌름스 종양 유전자), 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원에 결합할 수 있는 것인 방법.
E45. E1 내지 E44 중 어느 한 실시양태에 있어서, 생성된 T 세포를 그를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
E46. T 세포 요법을 필요로 하는 대상체에게 하나 이상의 T 세포를 투여하는 단계를 포함하는, T 세포 요법을 필요로 하는 대상체에서 종양을 치료하는 방법이며, 여기서 하나 이상의 T 세포는 (i) AKT 억제제 및 (ii) 외인성 IL-7 및/또는 외인성 IL-15와 접촉된 것인, T 세포 요법을 필요로 하는 대상체에서 종양을 치료하는 방법.
E47. T 세포 요법을 필요로 하는 대상체에게 하나 이상의 T 세포를 투여하는 단계를 포함하는, T 세포 요법을 필요로 하는 대상체에서 종양의 크기를 축소 또는 감소시키거나 또는 종양의 성장을 억제하는 방법이며, 여기서 하나 이상의 T 세포는 (i) AKT 억제제 및 (ii) 외인성 IL-7 및/또는 외인성 IL-15와 접촉된 것인, T 세포 요법을 필요로 하는 대상체에서 종양의 크기를 축소 또는 감소시키거나 또는 종양의 성장을 억제하는 방법.
E48. E46 또는 E47에 있어서, 하나 이상의 T 세포가 외인성 IL-2와 접촉되지 않은 것인 방법.
E49. E46 내지 E48 중 어느 한 실시양태에 있어서, T 세포가 AKT 억제제, 및 외인성 IL-7 및/또는 외인성 IL-15와의 접촉 후에 CCR7 및 CD45RO를 발현하는 것인 방법.
E50. E46 내지 E48 중 어느 한 실시양태에 있어서, T 세포가 AKT 억제제 및 외인성 IL-7, 외인성 IL-15, 또는 둘 다와의 접촉 후에 CCR7 및 CD45RA를 발현하는 것인 방법.
E51. E46 내지 E48 중 어느 한 실시양태에 있어서, T 세포가 AKT 억제제, 및 외인성 IL-7 및/또는 외인성 IL-15와 접촉되지 않은 T 세포에 의한 CCR7, CD45RO, 및 CD45RA의 발현과 비교하여, AKT 억제제, 및 외인성 IL-7 및/또는 외인성 IL-15와의 접촉 후에 CCR7, CD45RO, CD45RA, 또는 그의 임의의 조합의 증가된 발현을 나타내는 것인 방법.
E52. E46 내지 E51 중 어느 한 실시양태에 있어서, T 세포가 AKT 억제제, 및 외인성 IL-7 및/또는 외인성 IL-15와의 접촉 후에 CD62L, CD28, 또는 둘 다를 발현하는 것인 방법.
E53. E46 내지 E52 중 어느 한 실시양태에 있어서, T 세포가 AKT 억제제, 및 외인성 IL-7 및/또는 외인성 IL-15와 접촉되지 않은 T 세포에 의한 CD62L 및 CD28의 발현과 비교하여, AKT 억제제, 및 외인성 IL-7 및/또는 외인성 IL-15와의 접촉 후에 CD62L, CD28, 또는 둘 다의 증가된 발현을 나타내는 것인 방법.
E54. E46 내지 E53 중 어느 한 실시양태에 있어서, T 세포가 AKT 억제제, 및 외인성 IL-7 및/또는 외인성 IL-15와 접촉되지 않은 T 세포에 의한 CD95, IL-7 수용체 알파 (IL-7Rα), CXCR4, TCF7, FOXO1, ID3, BCL6, CD62L, 및 CD45RA의 발현과 비교하여, AKT 억제제 및 외인성 IL-7, 외인성 IL-15, 또는 둘 다와의 접촉 후에 CD95, IL-7 수용체 알파 (IL-7Rα), CXCR4, TCF7, FOXO1, ID3, BCL6, CD62L, CD45RA, 또는 그의 임의의 조합의 증가된 발현을 나타내는 것인 방법.
E55. E46 내지 E54 중 어느 한 실시양태에 있어서, 하나 이상의 T 세포가 공여자로부터 단리되는 것인 방법.
E56. E55에 있어서, 공여자가 대상체인 방법.
E57. E46 내지 E56 중 어느 한 실시양태에 있어서, 종양이 암인 방법.
E58. E57에 있어서, 암이 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안내 악성 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부암, 위암, 고환암, 자궁암, 난관 암종, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 호지킨병, 비-호지킨 림프종 (NHL), 원발성 종격 대 B 세포 림프종 (PMBC), 미만성 대 B 세포 림프종 (DLBCL), 여포성 림프종 (FL), 전환된 여포성 림프종, 비장 변연부 림프종 (SMZL), 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연부 조직 육종, 요도암, 음경암, 만성 또는 급성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병 (ALL) (비 T 세포 ALL 포함), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 소아기 고형 종양, 림프구성 림프종, 방광암, 신장암 또는 요관암, 신우 암종, 중추 신경계 (CNS)의 신생물, 원발성 CNS 림프종, 종양 혈관신생, 척수축 종양, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종, 카포시 육종, 표피양암, 편평 세포암, T-세포 림프종, 석면에 의해 유도된 것들을 포함한 환경적으로 유도된 암, 다른 B 세포 악성종양, 및 그의 임의의 조합으로부터 선택되는 것인 방법.
E59. E1 내지 E58 중 어느 한 실시양태에 있어서, T 세포 요법이 조작된 CAR 세포 요법 또는 조작된 TCR 세포 요법을 포함하는 것인 방법.
E60. E59에 있어서, 조작된 CAR 세포 또는 조작된 TCR 세포 요법이 대상체에서 종양을 치료하는 것인 방법.
실시예
실시예 1
공여자 T 세포를 IL-2, IL-7, IL-15, 및/또는 AKT 억제제의 존재 하에, 10일 동안, 동등한 플레이팅 농도에서 배양하였다. 배양된 T 세포의 T 세포 표현형을 (i) IL-7 및 IL-15와 비교하여 IL-2 단독 및 (ii) IL-7, IL-15, 및 AKT 억제제와 비교하여 IL-7 및 IL-15 중에서 7 및 14일 동안 배양된 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포에 대해 결정하였다 (도 1A - 도 1F). 세포가 IL-7 및 IL-15의 존재 하에 성장된 경우 더 많은 미숙한 T-세포에 대한 추세가 관찰되었다. 특히, IL-2 처리된 세포와 비교하여 IL-7/IL-15 처리된 세포에서 나이브 및 Tcm 세포 CD4+의 유의하게 더 높은 (p = 0.03, n = 6) 퍼센트가 관찰된 반면 (도 1A), 보다 성숙한 이펙터 T 세포의 퍼센트에서는 어떠한 차이도 관찰되지 않았다 (도 1B). 이 효과는 CD4+ 구획 중에서의 장기간 배양 후에 유지되지 않았다 (데이터는 제시되지 않음). 유사한 효과가 CD8+ 구획에서 관찰되었으며, IL-2 처리된 세포 배양과 비교하여 IL-7/IL-15 처리된 세포 배양에서 나이브 및 Tcm 세포의 퍼센트는 유의하게 더 높았고 (p = 0.03, n = 6) (도 1C) 이펙터 T 세포의 퍼센트는 유의하게 더 낮았다 (p = 0.03, n = 6) (도 1D). 그러나, CD4+ 구획에서와는 달리, 이 영향은 CD8+ 구획 중에서의 장기간 배양 후에 관찰되었다 (도 1E, p = 0.03, n = 6; 및 도 1F, p = 0.03, n = 6).
CD4+ 및 CD8+ 구획 둘 다에서, AKT 억제제의 첨가는 더 많은 미성숙 T 세포에 대한 추세를 추가로 증가시켰다. 제7일에, IL-7/IL-15 처리된 세포와 비교하여 IL-7/IL-15/AKTi 처리된 세포에서 약간 더 높은 퍼센트의 나이브 및 Tcm CD4+ 세포가 관찰되었고 (도 2A), IL-7/IL-15 처리된 세포와 비교하여 IL-7/IL-15/AKTi 처리된 세포에서 약간 더 낮은 퍼센트의 이펙터 T 세포가 관찰되었다 (도 2B). 14일 동안 배양된 세포에서는 어떠한 유의한 차이도 관찰되지 않았다 (데이터는 제시되지 않음). 그러나, 유의차가 제7일에 CD8+ 구획에서 관찰되었다. 특히, 제7일에, 나이브 및 Tcm CD4+ 세포의 퍼센트는 IL-7/IL-15 처리된 세포와 비교하여 IL-7/IL-15/AKTi 처리된 세포에서 유의하게 더 높았고 (p = 0.03, n = 6) (도 2C), 이펙터 T 세포의 퍼센트는 IL-7/IL-15 처리된 세포와 비교하여 IL-7/IL-15/AKTi 처리된 세포에서 유의하게 더 낮았다 (p = 0.03, n = 6) (도 2D). 그러나, 이 효과는 제14일에서는 관찰되지 않았다 (데이터는 제시되지 않음).
T 세포를 IL-2, IL-7, 및/또는 IL-15 및 AKT 억제제 중 하나 이상과 접촉시키는 것이 형질도입 효율에 대한 효과를 갖는지 여부를 결정하기 위해, 3명의 공여자로부터 수집된 T 세포를 자극 2일 후에 오리겐 퍼마라이프™ PL30 백 내에서 부류 I TCR을 보유하는 레트로바이러스로 형질도입시켰다. 형질도입된 세포를 이어서 (i) IL-2; (ii) IL-2 및 AKT 억제제; (iii) IL-7 및 IL-15; 및 (iv) IL-7, IL-15, 및 AKT 억제제의 존재 하에 10일 동안 배양하였다. T 세포를 이어서 CD3 발현 및 성공적인 형질도입의 지시자인 양성 가용성 MHC-사량체 염색 (Tet+)에 대해 분석하였다. 배양 조건에 따른 형질도입 효율에서의 어떠한 주요 차이도 관찰되지 않았고 (도 3A), 배양 조건에 걸쳐 사량체 평균 형광 강도 (MFI)에서 어떠한 유의한 차이도 관찰되지 않았다 (도 3B).
실시예 2
세포 확장에 대한 AKTi 억제제의 효과를 다양한 조건 하에 조사하였다. 먼저, 공여자 세포의 다양한 공급원에 대한 AKTi 배양 조건의 효과를 하기와 같이 평가하였다. 4명의 건강한 공여자로부터의 분리반출술 생성물을 고밀도 원심분리를 사용하여 처리하여 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 수득하였다 (도 4A-4D). 4명의 공여자로부터의 세포를 계수하고 OKT3 (CD3에 대한 모노클로날 항체)을 사용하여 자극하고, IL-2 (원); IL-2 및 AKTi (정사각형); IL-7 및 IL-15 (삼각형); 또는 IL-7, IL-15, 및 AKTi (역삼각형)의 존재 하에 7 내지 10일 동안 배양하였다 (도 4A-4D). 세포 확장이 각각의 배양 조건 하의 각각의 공여자 세포주에 대해 관찰되었고, AKTi는 세포 확장에 대해 어떠한 부정적 영향도 미치지 않았다 (도 4A-4D).
다음에, 부류 I TCR 형질도입된 (HPV-E6) PBMC를 평가하였다. 3명의 건강한 공여자로부터의 분리반출술 생성물을 고밀도 원심분리를 사용하여 다시 처리하여 PBMC를 수득하고, 계수하고, OKT3을 사용하여 자극하였다. 3명의 공여자로부터의 세포를 이어서 IL-2 (원); IL-2 및 AKTi (정사각형); IL-7 및 IL-15 (삼각형); 또는 IL-7, IL-15, 및 AKTi (역삼각형)의 존재 하에 배양하였다 (도 5A-5C). 제2일에, 세포를 부류 I TCR (HPV-E6)로 형질도입시켰다. 세포 확장이 각각의 배양 조건 하의 각각의 공여자 세포주에 대해 관찰되었고, AKTi는 세포 확장에 대해 어떠한 부정적 영향도 미치지 않았다 (도 5A-5C).
다음에, CD4+/CD8+ T 세포에 대한 AKTi 배양 조건의 효과를 평가하였다. 3명의 건강한 공여자로부터의 분리반출술 생성물을 고밀도 원심분리를 사용하여 다시 처리하여 PBMC를 수득하였다. PBMC를 이어서 항-CD4 및 항-CD8 Ab 비드와 함께 배양하고, CD4+ 및 CD8+ 세포를 클리니(CLINI)MACS® 시스템 (밀테니 바이오텍)을 사용하여 선택하였다. 3명의 공여자로부터의 CD4+ 및 CD8+ 세포를 계수하고, OKT3 및 항-CD28 Ab를 사용하여 자극하였다. 세포를 이어서 IL-2 (원); IL-2 및 AKTi (정사각형); IL-7 및 IL-15 (삼각형); 또는 IL-7, IL-15, 및 AKTi (역삼각형)의 존재 하에 배양하였다 (도 6A-6C). 세포를 제2일에 부류 II TCR (MAGE-A3)로 형질도입시켰다. 세포 확장이 각각의 배양 조건 하의 각각의 공여자 세포주에 대해 관찰되었고, AKTi는 세포 확장에 대해 어떠한 부정적 영향도 미치지 않았다 (도 6A-6C).
CD4+ 및 CD+ T 세포를 이어서 개별적으로 평가하였다. 3명의 건강한 공여자로부터의 분리반출술 생성물을 고밀도 원심분리를 사용하여 다시 처리하여 PBMC를 수득하였다. PBMC를 이어서 항-CD4 비드 (도 7A-7C) 또는 항-CD8 비드 (도 8A-8C)와 함께 배양하고, 표적 세포를 클리니MACS® 시스템 (밀테니 바이오텍)을 사용하여 선택하였다. 3명의 공여자로부터의 세포를 이어서 계수하고 OKT3 및 항-CD28 Ab를 사용하여 자극하였다. 세포를 이어서 IL-2 (원); IL-2 및 AKTi (정사각형); IL-7 및 IL-15 (삼각형); 또는 IL-7, IL-15, 및 AKTi (역삼각형)의 존재 하에 배양하였다. 세포를 제2일에 부류 II TCR (MAGE-A3)로 형질도입시켰다. 세포 확장이 각각의 배양 조건 하의 각각의 공여자 세포주로부터의 CD4+ (도 7A-7C) 및 CD8+ (도 8A-8C) 세포에 대해 관찰되었고, AKTi는 세포 확장에 대해 어떠한 부정적 영향도 미치지 않았다.
큰 제조 규모 배양 동안의 배양 조건의 효과를 이어서 평가하였다. 4명의 건강한 공여자로부터의 분리반출술 생성물을 고밀도 원심분리를 이용하여 다시 처리하여 말초 혈액 단핵 세포 PBMC를 수득하였다 (도 9A-9D). PBMC를 이어서 항-CD4 및 항-CD8 비드와 함께 배양하고, CD4+/CD8+ 세포를 클리니MACS® 시스템을 사용하여 선택하였다. CD4+/CD8+ 세포를 계수하고 OKT3 및 항-CD28을 사용하여 자극하였다. 세포를 이어서 IL-7 및 IL-15 (도 9A: 원; 도 9B-9C: 정사각형) 또는 IL-7, IL-15, 및 AKTi (도 9A: 정사각형; 도 9B-9C: 원)의 존재 하에 8일 동안 주리™ 세포 확장 시스템 (지이 헬스케어 라이프 사이언시스(GE Healthcare Life Sciences)) 내에서 큰 제조 규모로 배양하였다. 세포를 배양의 제2일에 부류 II TCR (MAGE-A3)로 형질도입시켰다. 세포 확장이 각각의 배양 조건 하의 각각의 공여자 세포주에 대해 관찰되었고, AKTi는 세포 확장에 대해 어떠한 부정적 영향도 미치지 않았다 (도 9A-9D).
실시예 3
AKTi의 존재 하의 배양 후 T 세포의 형질도입 효율에 대한 효과를 조사하였다. 이전에 동결된 공여자 T 세포를 자극하고, 이어서 IL-2, IL-2 및 AKTi; IL-7 및 IL-15; 또는 IL-7, IL-15, 및 AKTi의 존재 하에 10일 동안 배양하였다. 세포를 T-75 조직 배양 플라스크 내에서 부류 I TCR (HPV-E6)로 (도 10) 또는 오리겐 퍼마라이프™ 백 내에서 부류 II TCR (MAGE-A3)로 (도 11A-11F) 자극후 제2일에 형질도입시켰다. T 세포 형질도입 효율을 제10일에 항-mTCRb 항체 염색에 의해 측정하였다 (도 10 및 11A-11F). AKTi는 형질도입 효율에 대해 어떠한 부정적 영향도 미치지 않았으나 (도 10, 11A, 11B, 11D, 및 11E), 항-mTCRb 염색 MFI는 IL-7 및 IL-15 단독에 비해, IL-7, IL-15, 및 AKTi의 존재 하에 배양된 세포에 대해 약간 더 큰 전체 강도를 나타내었다 (도 11C 및 11F).
유사한 결과가 제조 규모로 배양된 T 세포에 대해 관찰되었다 (도 12). 4회의 제조 규모 실행 (21, 22, 및 23)으로부터의 이전에 동결된 공여자 T 세포를 IL-7 및 IL-15 또는 IL-7, IL-15, 및 AKTi의 존재 하에 오리겐 퍼마라이프™ 백 내에서 배양하였다. 세포를 부류 II TCR (MAGE-A3)로 자극후 제2일에 형질도입시켰다. 세포를 이어서 주리™ 생물반응기 세포 확장 시스템에서 성장시켰다. T 세포 형질도입 효율을 제8일에 항-mTCRb (mC TCR PE) 항체 염색에 의해 결정하였다. 각각의 실행에 대한 각각의 배양 조건에 대한 형질도입된 TCR을 발현하는 CD3+ 세포의 퍼센트가 제시된다 (도 12). 대규모 제조 조건 하에, IL-7, IL-15, 및 AKTi의 존재 하에 성장된 세포는 IL-7 및 IL-15 단독 하에 배양된 세포보다 더 큰 형질도입 효율을 갖는다 (도 12).
실시예 4
분화 상태에 대한 다양한 배양 조건의 효과를 결정하기 위해, 3명의 공여자로부터의 CD4+/CD8+ T 세포를 부류 II TCR (MAGE-A3)로 형질도입시키고 IL-2; IL-2 및 AKTi; IL-7 및 IL-15; 및 IL-7, IL-15, 및 AKTi의 존재 하에 배양하였다. 세포를 이어서 분화의 초기 단계의 마커인 CD62L에 대해 지시된 항체로 염색하였다. 양성 CD62L 발현으로 염색된 세포의 퍼센트를 각각의 공여자 1, 2 및 3에 대한 각각의 배양 조건으로부터의 세포에 대해 결정하였다 (각각 도 13A, 13B 및 13C). 평균 형광 강도 (MFI)는 AKTi의 존재 하에 배양된 세포가 AKTi의 부재 하에 배양된 세포와 비교하여, 양성 세포의 표면 상에 보다 큰 수준의 CD62L을 가졌다는 것을 나타내었다 (도 13D-13E).
실시예 5
T 세포 기능에 대한 AKTi의 효과를 결정하기 위해, 시토카인 생산 및 T 세포 증식을 다양한 조건 하의 배양 후에 평가하였다. 4회의 제조 규모 실행 (21, 22, 및 23)으로부터의 T 세포를 IL-2; IL-2 및 AKTi; IL-7 및 IL-15; 및 IL-7, IL-15, 및 AKTi의 존재 하에 오리겐 퍼마라이프™ 백 내에서 배양하였다. T 세포를 제2일에 부류 II TCR (MAGE-A3)로 형질도입시키고 이어서 IL-7 및 IL-15 또는 IL-7, IL-15, 및 AKTi의 존재 하에 주리™ 생물반응기 세포 확장 시스템에서 성장시켰다. T 세포를 PMA+ 이오노마이신+ 브레펠딘A+ 모넨신으로 5.5시간 동안 자극하였다. 세포내 유동 세포측정법은 시토카인 IFNg (도 14A) 및 TNFa (도 14B)의 증가된 생산에 의해 입증된 바와 같이, AKTi의 존재 하에 배양된 세포에 대해 증가된 T 세포 활성을 나타내었다.
AKTi가 T 세포 활성을 증가시키는 것을 추가로 확인하기 위해, 2회의 제조 규모 실행 (21 및 22)으로부터의 T 세포를 상기 기재된 바와 같이 배양하고 양성 (H1299, HT1197, 및 HT1367) 및 음성 (DU145, SK MEL 28, 및 SK MEL 5) 표적 종양 세포주와 함께 밤새 공동배양하였다. AKTi의 존재 하에 배양된 세포는 시험된 각각의 배양 조건 하에 더 큰 IFNg 생산을 나타내었으며 (도 15), 이는 AKTi-배양된 세포가 AKTi의 부재 하에 배양된 세포보다 자극에 반응하는 것에 대해 보다 큰 효력을 갖는다는 것을 나타낸다.
유사한 결과가 공여자 T 세포의 소규모 배양에 대해 관찰되었다. 공여자 1, 공여자 2, 및 공여자 3으로부터의 세포를 자극하고; IL-2; IL-2 및 AKTi; IL-7 및 IL-15; 또는 IL-7, IL-15, 및 AKTi의 존재 하에 배양하고; 상기 기재된 바와 같이, 부류 I TCR로 자극후 제2일에 형질도입시켰다. T 세포를 종양 세포주 (Caski 세포; 도 16A) 또는 적정된 양의 TCR-특이적 펩티드와 함께 로딩된 T2 세포 (도 16B-16D)와 밤새 공동-배양하였다. 상기 대규모 제조 실험에서 관찰된 바와 같이, AKTi의 존재 하에 배양된 세포는 AKTi의 부재 하에 배양된 세포보다 더 높은 수준의 IFNg를 생산하였다 (도 16A-16D). TCR-특이적 펩티드의 적정은 거의 모든 수준에서, AKTi 배양 조건이 보다 큰 IFNg 생산을 유도한다는 것을 나타내었다.
T 세포 증식은 또한 AKTi의 존재 하의 배양 후 증가하는 것으로 밝혀졌다. 공여자 1, 공여자 2, 및 공여자 3으로부터의 T 세포를 상기 기재된 바와 같이, 부류 II TCR로 자극후 제2일에 형질도입시켰다. T 세포를 CFSE로 염색하고 종양 세포주와 4일 동안 배양하였다 (양성 대조군). 증가된 T 세포 증식이 AKTi 없이 성장된 세포 (도 17A 및 17C)와 비교하여 AKTi의 존재 하에 성장된 세포 (도 17B 및 17D)에서 관찰되었다. 도 17A-17D는 공여자 3으로부터의 대표적인 데이터를 나타내며, 여기서 AKTi의 부재 하에 배양된 세포 (도 17A 및 17C)보다 IL-2 및 AKTi (도 17B) 및 IL-7, IL-15, 및 AKTi (도 17D) 하에 배양된 세포에 대해 보다 큰 백분율의 세포가 후기 (L) 또는 중기 (M) 증식에 있는 것으로 특징화된다.
증가된 T 세포 증식이 또한 대규모 제조 배양 조건 하에 관찰되었다. 2회의 대규모 제조 실행 (21 및 22)으로부터의 T 세포를 상기 기재된 바와 같이, 부류 II TCR로 자극후 제2일에 형질도입시켰다. T 세포를 CFSE로 염색하고 양성 종양 세포주 또는 음성 종양 세포주와 4일 동안 공동-배양하였다. 증가된 T 세포 증식이 각각의 실행 21A/21B (도 18A) 및 22A/22B (도 18B)에 대해 AKTi의 존재 하에 성장된 세포에서 관찰되었다.
실시예 6
T 세포 세포용해 활성에 대한 AKTi의 효과를 결정하기 위해, 루시페라제를 발현하는 표적 세포를 상기 기재된 바와 같이, 다양한 배양 조건 (IL-2 단독; IL-2 및 AKTi; IL-7 및 IL-15; 및 IL-7, IL-15, 및 AKTi) 하에 성장된 T 세포와 16 내지 96시간의 범위인 기간에 걸쳐 공동-배양한다. T 세포를 이어서 루시페라제를 발현하는 표적 세포와 공동배양한다. 표적 세포 생존율은 루시페라제 강도에 의해 측정되며, 루시페라제 강도의 감소는 T 세포 인식 및 표적-특이적 사멸을 나타낸다. 따라서, 루시페라제 수준의 저하는 T 세포 세포독성의 직접적인 척도이다. AKT 억제제의 존재 하에 배양된 세포가 AKT 억제제의 부재 하에 배양된 세포보다 더 큰 세포독성을 가질 것으로 예측된다.

Claims (17)

  1. T 세포 요법을 필요로 하는 대상체로부터의 하나 이상의 T 세포를 AKT 억제제, 및 외인성 인터류킨-7 (IL-7) 및 외인성 인터류킨-15 (IL-15) 중 적어도 하나와 접촉시키는 단계를 포함하는, T 세포 요법을 위해 시험관내에서 T 세포 성숙 또는 분화를 지연시키거나 또는 억제하는 방법이며, 여기서 생성된 T 세포는 지연된 성숙 또는 분화를 나타내고/거나 생성된 T 세포는 AKT 억제제의 부재 하에 배양된 T 세포의 T 세포 기능에 비해 개선된 T 세포 기능을 나타내는 것인, T 세포 요법을 위해 시험관내에서 T 세포 성숙 또는 분화를 지연시키거나 또는 억제하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 개선된 T 세포 기능이
    (i) 증가된 T 세포 증식;
    (ii) 증가된 시토카인 생산;
    (iii) 증가된 세포용해 활성; 및
    (iv) (i)-(iii)의 임의의 조합
    으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 증가된 시토카인 생산이 (i) 증가된 인터페론 감마 (IFNg) 생산, (ii) 증가된 조직 괴사 인자 알파 (TNFa) 생산, 및 (iii) 증가된 IFNg 및 TNFa 생산 둘 다로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 생성된 T 세포를 그를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  5. T 세포 요법을 필요로 하는 대상체에게 하나 이상의 T 세포를 투여하는 단계를 포함하는, T 세포 요법을 필요로 하는 대상체에서 종양을 치료하는 방법이며, 여기서 하나 이상의 T 세포는 (i) AKT 억제제 및 (ii) 외인성 IL-7 및/또는 외인성 IL-15와 접촉된 것인, T 세포 요법을 필요로 하는 대상체에서 종양을 치료하는 방법.
  6. T 세포 요법을 필요로 하는 대상체에게 하나 이상의 T 세포를 투여하는 단계를 포함하는, T 세포 요법을 필요로 하는 대상체에서 종양의 크기를 축소 또는 감소시키거나 또는 종양의 성장을 억제하는 방법이며, 여기서 하나 이상의 T 세포는 (i) AKT 억제제 및 (ii) 외인성 IL-7 및/또는 외인성 IL-15와 접촉된 것인, T 세포 요법을 필요로 하는 대상체에서 종양의 크기를 축소 또는 감소시키거나 또는 종양의 성장을 억제하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 T 세포가 외인성 인터류킨-2 (IL-2)와 접촉되지 않는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, AKT 억제제가 A6730, B2311, 124018, GSK2110183 (아푸레세르팁), 페리포신 (KRX-0401), GDC-0068 (이파타세르팁), RX-0201, VQD-002, LY294002, A-443654, A-674563, Akti-1, Akti-2, Akti-1/2, AR-42, API-59CJ-OMe, ATI-13148, AZD-5363, 에루실포스포콜린, GSK-2141795 (GSK795), KP372-1, L-418, NL-71-101, PBI-05204, PIA5, PX-316, SR13668, 트리시리빈, GSK 690693 (CAS # 937174-76-0), FPA 124 (CAS # 902779-59-3), 밀테포신, PHT-427 (CAS # 1 191951-57-1), 10-DEBC 히드로클로라이드, Akt 억제제 III, Akt 억제제 VIII, MK-2206 디히드로클로라이드 (CAS # 1032350-13-2), SC79, AT7867 (CAS # 857531-00-1), CCT128930 (CAS # 885499-61-6), A-674563 (CAS # 552325-73-2), AGL 2263, AS-041 164 (5-벤조[1,3]디옥솔-5-일메틸렌-티아졸리딘-2,4-디온), BML-257 (CAS # 32387-96-5), XL-418, CAS # 612847-09-3, CAS # 98510-80-6, H-89 (CAS # 127243-85-0), OXY-1 1 1 A, 3-[1-[[4-(7-페닐-3H-이미다조[4,5-g]퀴녹살린-6-일)페닐]메틸]피페리딘-4-일]-1H-벤즈이미다졸-2-온, N,N-디메틸-1-[4-(6-페닐-1H-이미다조[4,5-g]퀴녹살린-7-일)페닐]메탄아민, 1-{1-[4-(3-페닐벤조[g]퀴녹살린-2-일)벤질]피페리딘-4-일}-1,-3-디히드로-2H-벤즈이미다졸-2-온 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, AKT 억제제가 3-[1-[[4-(7-페닐-3H-이미다조[4,5-g]퀴녹살린-6-일)페닐]메틸]피페리딘-4-일]-1H-벤즈이미다졸-2-온인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) AKT 억제제가 약 1 nM 내지 약 1 mM의 양으로 존재하거나;
    (ii) 외인성 IL-7이 약 0.001 내지 약 500 ng/ml IL-7의 양으로 존재하거나;
    (iii) 외인성 IL-15가 약 0.001 내지 약 500 ng/ml IL-15의 양으로 존재하거나; 또는
    (iv) (i) 내지 (iii)의 임의의 조합
    인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) AKT 억제제가 약 8 μM의 양으로 존재하거나;
    (ii) 외인성 IL-7이 적어도 약 5 ng/ml IL-7의 양으로 존재하거나;
    (iii) 외인성 IL-15가 적어도 약 5 ng/ml IL-15의 양으로 존재하거나; 또는
    (iv) (i) 내지 (iii)의 임의의 조합
    인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 T 세포가 종양 침윤 림프구, 세포독성 T 세포, CAR T 세포, 조작된 TCR T 세포, 자연 킬러 T 세포, 말초 혈액 림프구, 및 종양 침윤 백혈구로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 레트로바이러스를 사용하여 T 세포를 형질도입시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 레트로바이러스가 T 세포 수용체 (TCR) 또는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 이종 유전자를 포함하는 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서, TCR 또는 CAR이 707-AP (707 알라닌 프롤린), AFP (알파 (a)-태아단백질), ART-4 (T4 세포에 의해 인식되는 선암종 항원), BAGE (B 항원; b-카테닌/m, b-카테닌/돌연변이), BCMA (B 세포 성숙 항원), Bcr-abl (절단점 클러스터 영역-아벨슨(Abelson)), CAIX (탄산 안히드라제 IX), CD19 (분화 클러스터 19), CD20 (분화 클러스터 20), CD22 (분화 클러스터 22), CD30 (분화 클러스터 30), CD33 (분화 클러스터 33), CD44v7/8 (분화 클러스터 44, 엑손 7/8), CAMEL (흑색종 상 CTL-인식 항원), CAP-1 (암배아성 항원 펩티드 - 1), CASP-8 (카스파제-8), CDC27m (세포-분열 주기 27 돌연변이), CDK4/m (시클린-의존성 키나제 4 돌연변이), CEA (암배아성 항원), CT (암/고환 (항원)), Cyp-B (시클로필린 B), DAM (분화 항원 흑색종), EGFR (표피 성장 인자 수용체), EGFRvIII (표피 성장 인자 수용체, 변이체 III), EGP-2 (상피 당단백질 2), EGP-40 (상피 당단백질 40), Erbb2, 3, 4 (적모구성 백혈병 바이러스 종양유전자 상동체-2, -3, 4), ELF2M (신장 인자 2 돌연변이), ETV6-AML1 (Ets 변이체 유전자 6/급성 골수성 백혈병 1 유전자 ETS), FBP (폴레이트 결합 단백질), fAchR (태아 아세틸콜린 수용체), G250 (당단백질 250), GAGE (G 항원), GD2 (디시알로강글리오시드 2), GD3 (디시알로강글리오시드 3), GnT-V (N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 V), Gp100 (당단백질 100kD), HAGE (헬리코스 항원), HER-2/neu (인간 표피 수용체-2/신경계; EGFR2로도 공지됨), HLA-A (인간 백혈구 항원-A) HPV (인간 유두종 바이러스), HSP70-2M (열 쇼크 단백질 70 - 2 돌연변이), HST-2 (인간 반지세포 종양 - 2), hTERT 또는 hTRT (인간 텔로머라제 리버스 트랜스크립타제), iCE (장 카르복실 에스테라제), IL-13R-a2 (인터류킨-13 수용체 서브유닛 알파-2), KIAA0205, KDR (키나제 삽입 도메인 수용체), κ-경쇄, LAGE (L 항원), LDLR/FUT (저밀도 지질 수용체/GDP-L-푸코스: b-D-갈락토시다제 2-a-L푸코실트랜스퍼라제), LeY (루이스(Lewis)-Y 항체), L1CAM (L1 세포 부착 분자), MAGE (흑색종 항원), MAGE-A1 (흑색종-연관 항원 1), MAGE-A3, MAGE-A6, 메소텔린, 뮤린 CMV 감염 세포, MART-1/멜란-A (T 세포-1에 의해 인식되는 흑색종 항원/흑색종 항원 A), MC1R (멜라노코르틴 1 수용체), 미오신/m (미오신 돌연변이), MUC1 (뮤신 1), MUM-1, -2, -3 (흑색종 편재 돌연변이 1, 2, 3), NA88-A (환자 M88의 NA cDNA 클론), NKG2D (자연 킬러 그룹 2, 구성원 D) 리간드, NY-BR-1 (뉴욕 유방 분화 항원 1), NY-ESO-1 (뉴욕 식도 편평 세포 암종-1), 종양태아성 항원 (h5T4), P15 (단백질 15), p190 마이너 bcr-abl (190KD bcr-abl의 단백질), Pml/RARa (전골수구성 백혈병/레티노산 수용체 a), PRAME (흑색종의 우선적으로 발현되는 항원), PSA (전립선-특이적 항원), PSCA (전립선 줄기 세포 항원), PSMA (전립선-특이적 막 항원), RAGE (신장 항원), RU1 또는 RU2 (신장 편재 1 또는 2), SAGE (육종 항원), SART-1 또는 SART-3 (편평 항원 거부 종양 1 또는 3), SSX1, -2, -3, 4 (활막 육종 X1, -2, -3, -4), TAA (종양-연관 항원), TAG-72 (종양-연관 당단백질 72), TEL/AML1 (전위 Ets-패밀리 백혈병/급성 골수성 백혈병 1), TPI/m (트리오스포스페이트 이소머라제 돌연변이), TRP-1 (티로시나제 관련 단백질 1, 또는 gp75), TRP-2 (티로시나제 관련 단백질 2), TRP-2/INT2 (TRP-2/인트론 2), VEGF-R2 (혈관 내피 성장 인자 수용체 2), 또는 WT1 (윌름스 종양 유전자), 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원에 결합할 수 있는 것인 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, AKT 억제제 및 외인성 IL-7 및/또는 외인성 IL-15와의 접촉 후에, T 세포가
    (i) CCR7 및 CD45RO를 발현하거나;
    (ii) CCR7 및 CD45RA를 발현하거나;
    (iii) AKT 억제제 및 외인성 IL-7 및/또는 외인성 IL-15와 접촉되지 않은 T 세포에 의한 CCR7, CD45RO, 및 CD45RA의 발현과 비교하여 CCR7, CD45RO, CD45RA, 또는 그의 임의의 조합의 증가된 발현을 나타내거나;
    (iv) CD62L, CD28, 또는 둘 다를 발현하거나;
    (v) AKT 억제제 및 외인성 IL-7 및/또는 외인성 IL-15와 접촉되지 않은 T 세포에 의한 CD62L 및 CD28의 발현과 비교하여 CD62L, CD28, 또는 둘 다의 증가된 발현을 나타내거나;
    (vi) AKT 억제제 및 외인성 IL-7 및/또는 외인성 IL-15와 접촉되지 않은 T 세포에 의한 CD95, IL-7Rα, CXCR4, TCF7, FOXO1, ID3, BCL6, CD62L, 및 CD45RA의 발현과 비교하여 AKT 억제제 및 외인성 IL-7, 외인성 IL-15, 또는 둘 다와의 접촉 후에 CD95, IL-7 수용체 알파 (IL-7Rα), CXCR4, TCF7, FOXO1, ID3, BCL6, CD62L, CD45RA, 또는 그의 임의의 조합의 증가된 발현을 나타내거나; 또는
    (vii) (i) 내지 (vi)의 임의의 조합
    인 방법.
  17. 제5항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 종양이 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안내 악성 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부암, 위암, 고환암, 자궁암, 난관 암종, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 호지킨병, 비-호지킨 림프종 (NHL), 원발성 종격 대 B 세포 림프종 (PMBC), 미만성 대 B 세포 림프종 (DLBCL), 여포성 림프종 (FL), 전환된 여포성 림프종, 비장 변연부 림프종 (SMZL), 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연부 조직 육종, 요도암, 음경암, 만성 또는 급성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병 (ALL) (비 T 세포 ALL 포함), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 소아기 고형 종양, 림프구성 림프종, 방광암, 신장암 또는 요관암, 신우 암종, 중추 신경계 (CNS)의 신생물, 원발성 CNS 림프종, 종양 혈관신생, 척수축 종양, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종, 카포시 육종, 표피양암, 편평 세포암, T-세포 림프종, 석면에 의해 유도된 것들을 포함한 환경적으로 유도된 암, 다른 B 세포 악성종양, 및 그의 임의의 조합으로부터 선택되는 암인 방법.
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