CN113293131A - 制备用于t细胞疗法的t细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了用于T细胞疗法的体外延缓或抑制T细胞成熟或分化的方法，其包括使来自需要T细胞疗法的受试者的一种或多种T细胞与外源白介素‑17(IL‑7)和外源白介素‑15(IL‑15)受体中的至少一种和AKT抑制剂接触，其中所得到的T细胞表现出延缓的成熟或分化。在一些实施方案中，该方法进一步包括向需要T细胞疗法的受试者施用一种或多种T细胞。

Description

制备用于T细胞疗法的T细胞的方法
本申请是CN201680069582.6的分案申请。
政府利益声明
本发明是在与美国国家癌症研究所(NCI)(美国卫生和公众服务部的机构)执行合作研究和开发协议的过程中产生的。美国政府对本发明具有一定的权利。
发明领域
本发明涉及制备用于T细胞疗法的一种或多种T细胞的方法。具体而言，本发明涉及通过使一种或多种T细胞与外源白介素-7(IL-7)和外源白介素-15(IL-15)中的至少一种和AKT抑制剂(“AKTi”)接触来改善T细胞疗法的功效的方法。
背景
就其本质而言，人癌症由正常细胞组成，这些细胞已经经历了遗传或表观遗传转化而变成异常癌细胞。在这样做时，癌细胞开始表达与正常细胞表达的蛋白质和其他抗原不同的蛋白质和其他抗原。这些异常的肿瘤抗原可被人体先天免疫系统用于特异性靶向和杀死癌细胞。然而，癌细胞采用各种机制来阻止免疫细胞如T和B淋巴细胞成功靶向癌细胞。
人T细胞疗法依赖于体外富集或修饰的人T细胞靶向和杀死受试者(例如患者)中的癌细胞。已经开发了各种技术来富集能够靶向肿瘤抗原的天然存在的T细胞的浓度或者遗传修饰T细胞以特异性靶向已知的癌症抗原。已证实这些疗法对肿瘤大小和患者存活具有有希望的效果。然而，已经证明难以预测给定的T细胞疗法是否会对每位患者有效。
混合T细胞群的移植是妨碍T细胞疗法达到其全部潜力的因素之一。在常规T细胞疗法中，收集供体T细胞，任选修饰供体T细胞以靶向特定抗原(例如肿瘤细胞)或针对抗肿瘤特征(例如肿瘤浸润淋巴细胞)选择供体T细胞，体外扩增供体T细胞，并将供体T细胞施用于有需要的受试者。通常，所得到的T细胞包含大量成熟细胞的混合群体，其中许多是终末分化的。结果，这些细胞的预期体内持久性可能受到限制，并且随着时间的推移，最初观察到的积极效应可能被消除，因为在移植的T细胞不存在时肿瘤发生反弹。因此，仍然需要增加用于T细胞疗法的T细胞的体内持久性。
发明概述
本公开内容提供了用于T细胞疗法的体外延缓或抑制T细胞成熟或分化的方法，其包括使来自需要T细胞疗法的受试者的一种或多种T细胞与外源IL-7和外源IL-15中的至少一种和AKTi接触，其中所得到的T细胞表现出延缓的成熟或分化。
本公开内容还提供了用于体外延缓或抑制T细胞成熟或分化的方法，其包括在包含外源IL-7和外源IL-15中的至少一种和AKTi的培养基中培养一种或多种T细胞。
本公开内容还提供了产生干细胞样CD8+T细胞的方法，其包括在培养基中培养一种或多种T细胞，所述方法包括使一种或多种T细胞与外源IL-7和外源IL-15中的至少一种和AKTi接触。
本公开内容还提供了用于延长过继性细胞疗法中的一种或多种T细胞的体内持久性的方法，其包括在施用于受试者之前使所述一种或多种T细胞与外源IL-7和外源IL-15中的至少一种和AKTi接触。
在某些实施方案中，本文公开的方法还包括将所述一种或多种T细胞施用于有需要的受试者。在一些实施方案中，受试者需要T细胞疗法。
本公开内容还提供了在需要T细胞疗法的受试者中治疗肿瘤的方法，其包括向受试者施用一种或多种T细胞，其中所述一种或多种T细胞已经与(i)AKTi和(ii)外源IL-7和/或外源IL-15接触。
本公开内容还提供了在需要T细胞疗法的受试者中减少或减小肿瘤尺寸或抑制肿瘤生长的方法，其包括向所述受试者施用一种或多种T细胞，其中所述一种或多种T细胞已经与(i)AKTi和(ii)外源IL-7和/或外源IL-15接触。
在某些实施方案中，T细胞疗法包括工程化CAR细胞疗法或工程化TCR细胞疗法。在一个实施方案中，工程化CAR细胞或工程化TCR细胞疗法治疗受试者的肿瘤。
附图的简要说明
图1A-图1F显示在IL-2存在下或在IL-7和IL-15存在下培养7和14天后的CD4+T细胞和CD8+T细胞的表型。图1A和图1C分别显示培养的CD4+T细胞和CD8+T细胞的总群体的百分比，其针对IL-2和IL-7/IL-15处理的细胞表征为第7天的初始T细胞或中枢记忆T细胞(Tcm)。图1B和图1D分别显示培养的CD4+T细胞和CD8+T细胞的总群体的百分比，其针对IL-2和IL-7/IL-15处理的细胞表征为第7天的效应记忆T细胞(Tem)或效应T细胞(Teff)。图1E显示培养的CD8+T细胞的总群体的百分比，其针对IL-2和IL-7/IL-15处理的细胞表征为第14天的初始T细胞或中枢记忆T细胞(Tcm)。图1F显示培养的CD8+T细胞的总群体的百分比，其针对IL-2和IL-7/IL-15处理的细胞表征为第14天的效应记忆T细胞(Tem)或效应T细胞(Teff)。个别数据点反映个别样本。水平线表示平均值，误差线表示标准偏差。统计显著性由p值表示(“ns”代表“不显著”)。
图2A至图2D显示在IL-7和IL-15存在下或在IL-7、IL-15和AKTi存在下培养7和14天后的CD4+T细胞和CD8+T细胞的表型。图2A和图2C分别显示培养的CD4+T细胞和CD8+T细胞的总群体的百分比，其针对IL-7/IL-15和IL-7/IL-15/AKTi处理的细胞表征为第7天的初始T细胞或Tcm细胞。图2B和图2D分别显示培养的CD4+T细胞和CD8+T细胞的总群体的百分比，其针对IL-7/IL-15和IL-7/IL-15/AKTi处理的细胞表征为第7天的Tem或Teff细胞。个别数据点反映个别样本。水平线表示平均值，误差线表示标准偏差。统计显著性由p值表示(“ns”代表“不显著”)。
图3A显示与单独的IL-2；IL-2和AKTi；IL-7和IL-15；和IL-7、IL-15和AKTi接触的供体T细胞的转导效率。转导效率由CD3+并具有阳性可溶性MHC-四聚体染色(Tet+)的总T细胞的百分比表示。深灰色的柱代表与IL-2接触的T细胞样品中CD3+Tet+细胞的百分比。正斜条纹的柱代表与IL-2和AKTi接触的T细胞样品中的CD3+Tet+细胞的百分比。浅灰色的柱代表与IL-7和IL-15接触的T细胞样品中CD3+Tet+细胞的百分比。反斜条纹的柱代表与IL-7、IL-15和AKTi接触的T细胞样品中的CD3+Tet+细胞的百分比。误差线表示标准偏差。图3B显示在单独的IL-2；IL-2和AKTi；IL-7和IL-15；和IL-7、IL-15和AKTi存在的情况下培养后，来自供体1(圆形)、供体2(方形)和供体3(三角)的细胞的四聚体平均荧光强度(MFI)。统计分析表明四聚体MFI的任何差异均不显著(p＝ns)。
图4A-4D显示了在IL-2(圆形)；IL-2和AKTi(方形)；IL-7和IL-15(三角)；或IL-7、IL-15和AKTi(倒三角)存在下培养的来自四名供体的细胞在7天过程中的细胞扩增。图4A-4D中的每个图表示单个供体细胞系的细胞扩增。扩增方案的来源材料是外周血单核细胞。
图5A-5C显示来自用I类TCR(HPV-E6)转导且在IL-2(圆形)；IL-2和AKTi(方形)；IL-7和IL-15(三角)；或IL-7、IL-15和AKTi(倒三角)存在下培养的三个供体的细胞在9天过程中的细胞扩增。图5A-5C中的每个图表示单个供体细胞系的细胞扩增。扩增方案的来源材料是外周血单核细胞。
图6A-6C显示用II类TCR(MAGE-A3)转导并在IL-2(圆形)；IL-2和AKTi(方形)；IL-7和IL-15(三角)；或IL-7、IL-15和AKTi(倒三角)存在下培养的三个供体分离的CD4+和CD8+细胞在10天过程中的细胞扩增。图6A-6C中的每个图表示单个供体细胞系的细胞扩增。
图7A-7C显示来自用II类TCR(MAGE-A3)转导并在IL-2(圆形)；IL-2和AKTi(方形)；IL-7和IL-15(三角)；或IL-7、IL-15和AKTi(倒三角)存在下培养的三个供体的分离的CD4+细胞在10天的过程中的细胞扩增。图7A-7C中的每个图表示单个供体细胞系的细胞扩增。
图8A-8C显示来自用II类TCR(MAGE-A3)转导并在IL-2(圆形)；IL-2和AKTi(方形)；IL-7和IL-15(三角)；或IL-7、IL-15和AKTi(倒三角)存在下培养的三个供体的分离的CD8+细胞在10天过程中的细胞扩增。图8A-8C中的每个图表示来自单个供体细胞系的细胞。
图9A-9D显示来自用II类TCR(MAGE-A3)转导的三个供体的CD4+和CD8+细胞在8天的过程中的细胞扩增。细胞在IL-7和IL-15(图9A：圆形；图9B-9C：方形)或IL-7、IL-15和AKTi(图9A：方形；图9B-9C：圆形)存在下培养。细胞在XURITM Cell Expansion System中以大生产规模生长。图9A-9D中的每个图表示单个供体细胞系的细胞扩增。扩增方案的来源材料是分离的CD4+和CD8+细胞。
图10显示用I类TCR(HPV-E6)转导的T细胞的转导效率。细胞在单独的IL-2；IL-2和AKTi；IL-7和IL-15；或IL-7、IL-15和AKTi存在下培养。细胞在第2天转导，通过用特异性识别转导的TCR的抗mTCRb抗体染色细胞在第10天测量转导效率。显示了每种培养条件(x轴)的显示阳性抗mTCRb染色的细胞百分比(y轴)。
图11A-11F显示用来自两个供体的CD4+/CD8+T细胞的II类TCR(MAGE-A3)转导的T细胞的转导效率。细胞在单独的IL-2；IL-2和AKTi；IL-7和IL-15；或IL-7、IL-15和AKTi存在下培养。细胞在第2天转导，通过用抗mTCRb抗体(mC TCR PE)染色细胞在第10天测量转导效率(图11A和11D)。每种培养条件的抗mTCRb染色的MFI示于11B和11E中。图11C和11F显示两种供体的表达CDR和转导的TCR的细胞分布的FACS分析。
图12显示来自四个生产规模运行(16、21、22和23)的T细胞用II类TCR(MAGE-A3)转导的T细胞的转导效率。对于每个运行，如所示，将细胞分成两种培养条件：添加IL-7和IL-15以及添加IL-7、IL-15和AKTi。通过用抗mTCRb抗体(mC TCR PE)染色细胞来测量转导效率。显示了每个运行(x轴)的显示阳性抗mTCRb染色的细胞百分比(y轴)。
图13A-13F显示了用II类TCR(MAGE-A3)转导且在具有和不具有AKTi的各种条件下培养的CD4+/CD8+T细胞的分化状态。在单独的IL-2；IL-2和AKTi；IL-7和IL-15；或IL-7、IL-15和AKTi存在下培养来自供体1(图13A和13D)、供体2(图13B和13E)和供体3(图13C和13E)的T细胞，然后对分化早期细胞的标志物CD62L表达进行染色。每种供体的每种培养条件(x轴)的CD3+和CD62L+细胞的百分比(y轴)显示在图13A-13C中。每个供体细胞系的每种培养条件(x轴)的CD62L染色的MFI(y轴)显示在图13D-13E中。
图14A-14B显示培养条件对T细胞功能的影响，如来自三个生产规模运行(21、22和23)的T细胞产生的细胞因子所证明的。在存在IL-7和IL-15或IL-7、IL-15和AKTi的情况下，在XURITM生物反应器细胞扩增系统中培养用II类TCR(MAGE-A3)转导的供体T细胞。显示对于运行21、22和23中的每一个，在存在或不存在AKTi的情况下培养的细胞，CD3和IFNg(图14A)和CD3和TNFa(图14B)染色阳性的细胞百分比。
图15显示用II类TCR(MAGE-A3)转导并与阳性和阴性靶肿瘤细胞系共培养的供体T细胞的IFNg产生证明的T细胞活性。来自两个生产规模运行(21和22)的T细胞用II类TCR转导，并在存在IL-7和IL-15或IL-7、IL-15和AKTi的情况下在XURITM生物反应器细胞扩增系统中培养。然后将细胞与表达TCR靶抗原的肿瘤细胞系(H1299、HT1197或HT1367)或不表达TCR靶抗原的肿瘤细胞系(DU145、SK MEL 28或SK MEL 5)共培养过夜。对于每种培养条件，对于每种细胞系(x轴)，T细胞活性由显示为pg/mL的IFNg产生(y轴)表示。误差线表示标准偏差。
图16A-16D显示T细胞活性，如通过用I类TCR(HPV-E6)转导且用或不用AKTi培养的三种供体T细胞系的IFNg产生证明的。图16A显示在与表达TCR抗原的肿瘤细胞系(卡斯基；宫颈癌细胞系)在单独的IL-2；IL-2和AKTi；IL-7和IL-15；或IL-7、IL-15和AKTi存在下共培养后，来自三个供体(x轴)的T细胞产生的IFNg的量(pg/mL；y轴)。图17B-17D显示对于供体1(图16B)，供体2(图16C)和供体3(图16D)的T细胞，与T2细胞在单独的IL-2(圆形)；IL-2和AKTi(方形)；IL-7和IL-15(三角)；或IL-7、IL-15和AKTi(倒三角)存在下共培养后供体T细胞的IFNg产量(pg/mL；y轴)，所述T2细胞装载有滴定量的SCR-特异性肽(靶肽；x轴)。误差线表示标准偏差。
图17A-17D是显示在存在(图17B和17D)或不存在AKTi(图17A和17C)时培养后的T细胞增殖的FACS直方图。在IL-2(图17A)，IL-2和AKTi(图17B)，IL-7和IL-15(图17C)和IL-7、IL-15和AKTi(图17D)中生长来自供体3的T细胞，用II类TCR(MAGE-A3)转导，并与表达TCR抗原的肿瘤细胞系共培养4天。通过羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)染色测量T细胞增殖(图17A-17D)。L＝晚期扩散；M＝中期增殖；E＝早期扩散。
图18A和18B是显示来自两个大规模生产运行：21(图18A)和22(图18B)的T细胞的细胞增殖的FACS直方图。T细胞在IL-2和IL-7、IL-15和AKTi中生长并用II类TCR(MAGE-A3)转导。在IL-7和IL-15或IL-7、IL-15和AKTi存在下，将T细胞与表达TCR靶抗原的肿瘤细胞系(“阳性靶”)或不表达TCR靶抗原的细胞系(“阴性靶”)共培养4天。如对于运行21(图18A)和22(图18B)中的每一个所说明的，与comp-FITC-A染色相比，通过CFSE染色测量T细胞增殖，归一化至模式。
详述
本发明涉及制备用于T细胞疗法的T细胞的方法。具体而言，本发明涉及通过使一种或多种T细胞与外源IL-7和外源IL-15中的至少一种和AKTi接触来体外调节(例如延缓或抑制)T细胞成熟或分化的方法。通过延缓或抑制T细胞成熟或分化，可以富集供体T细胞集合以用于未成熟、分化较低的T细胞(例如中枢记忆Tcm细胞的初始T细胞)，增加一旦施用于受试者例如患者的一种或多种T细胞的潜在持久性。结果，富集的未成熟T细胞群在分化的混合阶段比T细胞群更可能产生持续的抗肿瘤作用。
定义
为了更容易理解本公开内容，首先定义某些术语。如在本申请中所使用的，除非在本文中另外明确地提供，否则以下术语中的每一个应具有以下所述的含义。在整个申请中阐述了额外的定义。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所涉及的领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。例如，the Concise Dictionary ofBiomedicine and Molecular Biology，Juo，Pei-Show，2nd ed.，2002，CRC Press；TheDictionary of Cell and Molecular Biology，3rd ed.，1999，Academic Press；和theOxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology，Revised，2000，OxfordUniversity Press，为技术人员提供了本公开内容中使用的许多术语的通用词典。
单位、前缀和符号以其国际单位制(SI)接受的形式表示。数字范围包括定义该范围的数字。本文提供的标题不是对本公开内容的各个方面的限制，其可以作为整体参考说明书。因此，下面直接定义的术语通过参考整个说明书而更全面地定义。
如本文所使用的，不定冠词“a”或“an”应理解为指任何所列举或列举的组分的“一个或多个”。
术语“大约”或“基本上包含”是指在由本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分取决于值或组成被测量或确定，即测量系统的限制。例如，“大约”或“基本上包含”可以意味着每个本领域的实践在1个或多于1个标准偏差内。或者，“约”或“基本上包含”可以表示至多10％(即，±10％)的范围。例如，约3mg可包含2.7mg至3.3mg之间的任何数值(对于10％)。此外，特别是在生物系统或过程方面，这些术语可能意味着值的至多一个数量级或至多5倍。当在本申请和权利要求书中提供特定值或组成时，除非另有说明，否则应认为“约”或“基本上包含”的含义在该特定值或组成的可接受的误差范围内。
如本文所述，除非另有说明，任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应理解为包括所列举范围内的任何整数的值和，在适当时，其分数(例如，整数的十分之一和百分之一)。
在本文中使用的术语“和/或”应被视为特定特征或组分中的每一个在有或没有另一个情况下的具体公开。因此，本文中诸如“A和/或B”等短语中使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)和“B”(单独)。同样地，在诸如“A、B和/或C”的短语中使用的术语“和/或”旨在包括以下各方面中的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
应该理解的是，无论在何处使用语言“包括”描述方面，其也提供了以“由......组成”和/或“基本上由...组成”描述的其他类似方面。术语“激活”或“激活的”是指已被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的免疫细胞(例如T细胞)的状态。激活还可以与诱导的细胞因子产生和可检测的效应功能相关联。术语“激活的T细胞”特别指正在进行细胞分裂的T细胞。T细胞激活可以通过一种或多种生物标志物(包括但不限于CD57、PD1、CD107a、CD25、CD137、CD69和/或CD71)的增加的T细胞表达来表征。
“施用”是指使用本领域技术人员已知的任何各种方法和递送系统将药剂物理引入受试者。通过本文公开的方法制备的T细胞的示例性施用途径包括静脉内、肌内、皮下、腹膜内、脊髓或其他肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。本文使用的短语“肠胃外施用”是指除肠内和局部施用以外的施用模式，通常通过注射，包括但不限于静脉内，肌内，动脉内，鞘内，淋巴内，病灶内，囊内，眼眶内，心内，皮内，腹膜内，经气管，皮下，表皮下，关节内，囊下，蛛网膜下，脊柱内，硬膜外和胸骨内注射和输注，以及体内电穿孔。在一些实施方案中，通过本方法制备的T细胞经由非肠胃外途径例如口服施用。其他非肠胃外途径包括局部、表皮或粘膜施用途径，例如鼻内，阴道，直肠，舌下或局部。还可以例如一次、多次和/或在一个或多个延长的时间段内进行施用。
术语“AKT抑制剂”、“AKTI”或“AKTi”可互换使用并且指能够阻断、降低或抑制AKT活性的任何分子(例如AKT拮抗剂)，包括但不限于小分子，多核苷酸(例如DNA或RNA)，或多肽(例如，抗体或其抗原结合部分)。AKT是丝氨酸/苏氨酸激酶，也称为蛋白激酶B或PKB。AKT抑制剂可以直接作用于AKT，例如通过结合AKT，或者它可以间接作用，例如通过干扰AKT与结合伴侣之间的相互作用或通过抑制PI3K-AKT-mTOR途径的另一成员的活性。本申请的其他章节显示了AKTi的非限制性实例。
术语“抗体”(Ab)包括但不限于特异性结合抗原的免疫球蛋白。通常，抗体可以包含通过二硫键相互连接的至少两条重链(H)和两条轻链(L)。每条H链包含重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区可以包含三个或四个恒定结构域CH1、CH2、CH3、和/或CH4。每条轻链包含轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区可以包含一个恒定区CL。VH和VL区可以进一步细分成称为互补决定区(CDR)的高变区，散布有更保守的区域、称为框架区(FR)。每个VH和VL包含三个CDR和四个FR，按照以下顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原例如AKT相互作用的结合结构域。
免疫球蛋白可以来源于任何通常已知的同种型，包括但不限于IgA，分泌型IgA，IgG和IgM。IgG亚类也是本领域技术人员众所周知的并且包括但不限于人IgG1，IgG2，IgG3和IgG4。“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别或亚类(例如IgM或IgG1)。例如，术语“抗体”包括例如天然存在的抗体和非天然存在的抗体；单克隆和多克隆抗体；嵌合和人源化抗体；人或非人抗体；完全合成的抗体；和单链抗体。非人抗体可以通过重组方法人源化以降低其在人中的免疫原性。在没有明确指出的情况下，除非上下文另有说明，否则术语“抗体”还包括任何前述免疫球蛋白的抗原结合片段或抗原结合部分，并且包括单价和二价片段或部分，以及单链抗体。
“抗原结合分子”或“抗体片段”是指抗体少于整体的任何部分。抗原结合分子可以包括抗原性互补决定区(CDR)。抗体片段的实例包括但不限于Fab，Fab'，F(ab')2和Fv片段，dAb，线性抗体，scFv抗体和由抗原结合分子形成的多特异性抗体。
术语“自体”是指来自同一个体的任何材料，其随后被重新引入。例如，本文所述的工程化自体细胞疗法(eACTTM)方法包括从供体(例如患者)收集淋巴细胞，然后将其工程化成表达例如CAR构建体，然后将其施用回同一供体，例如，患者。
术语“同种异体”是指来自一个个体的任何物质，然后将其导入同一物种的另一个个体，例如同种异体T细胞移植。
“癌症”是指以体内异常细胞的不受控制的生长为特征的一组涵盖较广的各种疾病。不受调控的细胞分裂和生长导致侵入邻近组织的恶性肿瘤的形成，并且还可以通过淋巴系统或血流转移到身体的远端部位。“癌症”或“癌症组织”可以包括各个阶段的肿瘤。在某些实施方案中，癌症或肿瘤为0期，使得例如癌症或肿瘤发展非常早并且还未转移。在一些实施方案中，癌症或肿瘤是I期，使得例如癌症或肿瘤的尺寸相对较小，还未扩散到附近的组织，并且还未转移。在其他实施方案中，癌症或肿瘤是II期或III期，使得例如癌症或肿瘤大于0期或I期，并且其已经生长到邻近组织中但是它还未转移，除了潜在转移至淋巴结。在其他实施方案中，癌症或肿瘤是IV期，使得例如癌症或肿瘤已经转移。IV期也可以被称为晚期或转移性癌症。
如本文所用，“抗肿瘤作用”是指可表现为肿瘤体积减小，肿瘤生长抑制，肿瘤细胞数量减少，肿瘤细胞增殖减少，转移的数量减少，整体或无进展存活的增加，预期寿命的增加，或与肿瘤相关的各种生理症状的改善。抗肿瘤作用也可以指防止肿瘤发生，例如疫苗。
如本文所用，术语“无进展存活”(可缩写为PFS)指从治疗日期到根据修订的恶性淋巴瘤IWG应答标准的疾病进展日期或任何原因引起的死亡的时间。
通过测量放射照片上的恶性病灶或其他方法评估“疾病进展”不应被报告为不良事件。在没有体征和症状的情况下由于疾病进展导致的死亡应报告为原发肿瘤类型(例如DLBCL)。
如本文所用，“应答持续时间”(可缩写为DOR)指受试者第一次客观应答至确认根据修订的恶性淋巴瘤IWG应答标准的疾病进展或死亡的日期之间的时间段。
术语“总生存期”(可缩写为OS)定义为从治疗日期到死亡日期的时间。
如本文所用，“细胞因子”是指可以由免疫细胞包括巨噬细胞、B细胞、T细胞和肥大细胞释放的非抗体蛋白质，以增殖免疫应答。在一些实施方案中，一种或多种细胞因子响应T细胞疗法而释放。在某些实施方案中，响应于T细胞疗法分泌的那些细胞因子可以是有效的T细胞疗法的标志。
如本文所用，“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是指通过本发明方法产生的T细胞或DC细胞，并且当单独或与另一种治疗剂组合使用时，通过减轻疾病症状的严重程度、增加疾病无症状期的频率和持续时间或防止疾病引起的损伤或失能所证明的来保护受试者免于疾病发作或促进疾病消退的量。T细胞或DC细胞促进疾病消退的能力可以使用本领域技术人员已知的各种方法进行评估，例如在临床试验期间的人受试者中，在预测人体功效的动物模型系统中，或者通过测定药剂在体外测定中的活性。
如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指一种或多种T细胞成熟抑制剂(例如AKTi、IL-7和IL-15)的量，其一起引发期望的应答。因此，延缓或抑制T细胞分化或成熟的有效量的AKTi、有效量的IL-7和有效量的IL-15可以低于单独的有效量的AKTi、单独的有效量的IL-7、或单独的有效量的IL-15。在其他实施方案中，AKTi的有效剂量可以指将AKT活性降低了所需量的量例如AKTi的浓度，例如降低了至少约10％，至少20％，至少约30％，至少约40％，至少约50％，至少约60％，至少约70％，至少约80％，至少约90％或约100％。
如本文所用，术语“淋巴细胞”可以包括自然杀伤(NK)细胞、T细胞或B细胞。NK细胞是一类细胞毒(细胞毒性)淋巴细胞，代表了固有免疫系统的主要成分。NK细胞排斥肿瘤和病毒感染的细胞。它通过凋亡或程序性细胞死亡的过程起作用。它们被称为“自然杀手”，因为它们不需要激活以杀死细胞。T细胞在细胞介导的免疫中起主要作用(没有抗体参与)。它的T细胞受体(TCR)将自己与其他淋巴细胞类型区分开来。胸腺是免疫系统的专门器官，主要负责T细胞的成熟。
有几种类型的T细胞，即：辅助性T细胞(例如CD4+细胞，效应TEFF细胞)，细胞毒T细胞(也称为TC，细胞毒T淋巴细胞，CTL，T-杀伤细胞，细胞溶解性T细胞，CD8+T细胞或杀伤T细胞)，记忆T细胞((i)记忆TSCM干细胞，如初始细胞)是CD45RO-，CCR7+，CD45RA+，CD62L+(L-选择素)，CD27+，CD28+和IL-7Rα+，但它们也表达大量的CD95，IL-2Rβ，CXCR3和LFA-1，并表现出许多与记忆细胞不同的功能属性)；(ii)中枢记忆TCM细胞表达L-选择素并且是CCR7+和CD45RO+，并且它们分泌IL-2但不分泌IFNγ或IL-4，并且(iii)然而效应记忆TEM细胞不表达L-选择素或CCR7但是确实表达CD45RO并产生效应细胞因子如IFNγ和IL-4)，调节性T细胞(Treg、抑制性T细胞或CD4+CD25+调节性T细胞)，自然杀伤T细胞(NKT)细胞和γΔT细胞。在肿瘤内发现的T细胞被称为“肿瘤浸润淋巴细胞”或“TIL”。另一方面，B细胞在体液免疫中发挥主要作用(抗体参与)。它通过抗原相互作用激活后产生抗体和抗原，并发挥抗原呈递细胞(APC)的作用并转变成记忆B细胞。在哺乳动物中，未成熟的B细胞在骨髓中形成，其名称来源于骨髓。
“初始”T细胞是指保持免疫未分化的成熟T细胞。在胸腺中的阳性和阴性选择后，T细胞作为CD4+或CD8+初始T细胞出现。在它们的初始状态中，T细胞表达L-选择素(CD62L+)，IL-7受体-α(IL-7R-α)和CD132，但它们不表达CD25，CD44，CD69或CD45RO。如本文所用，“未成熟”还可以指表现出初始T细胞或未成熟T细胞(例如TSCM细胞或TCM细胞)的表型特征的T细胞。例如，未成熟的T细胞可以表达L-选择素(CD62L+)，IL-7Rα，CD132，CCR7，CD45RA，CD45RO，CD27，CD28，CD95，IL-2Rβ，CXCR3和LFA-1中的一种或多种。初始或未成熟的T细胞可以与终末分化的效应T细胞如TEM细胞和TEFF细胞形成对比。
如本文所提及的“T细胞功能”是指健康T细胞的正常特征。在一些实施方案中，T细胞功能包括T细胞增殖。在一些实施方案中，T细胞功能包括T细胞活性。在一些实施方案中，T细胞功能包括细胞溶解活性。在一些实施方案中，本发明的方法例如在AKT抑制剂(和任选的IL-7和/或IL-15)存在下培养T细胞增加一种或多种T细胞功能，从而使T细胞更适合和/或更有效用于T细胞疗法。在一些实施方案中，与在缺乏AKT抑制剂(或AKTi、IL-7和IL-15)的条件下培养的T细胞相比，根据本方法培养的T细胞具有增加的T细胞功能。在某些实施方案中，与在缺乏AKT抑制剂(或AKTi、IL-7和IL-15)的条件下培养的T细胞相比，根据本发明方法培养的T细胞具有增加的T细胞增殖。在某些实施方案中，与在缺乏AKT抑制剂(或AKTi、IL-7和IL-15)的条件下培养的T细胞相比，根据本发明方法培养的T细胞具有增加的T细胞活性。在某些实施方案中，与在缺乏AKT抑制剂(或AKTi、IL-7和IL-15)的条件下培养的T细胞相比，根据本发明方法培养的T细胞具有增加的细胞溶解活性。
如本文所用，细胞“增殖”是指T细胞通过细胞分裂在数量上生长的能力。可以通过用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)染色细胞来测量增殖。细胞增殖可以体外发生，例如在T细胞培养过程中，或体内发生，例如在施用T细胞疗法后。
如本文所用，“T细胞活性”是指健康T细胞常见的任何活性。在一些实施方案中，T细胞活性包括细胞因子产生。在某些实施方案中，T细胞活性包括产生一种或多种选自干扰素γ(IFNg)、组织坏死因子α(TNFa)和两者的细胞因子。
如本文所用，“细胞溶解活性”或“细胞毒性”是指T细胞破坏靶细胞的能力。在一些实施方案中，靶细胞是癌细胞，例如肿瘤细胞。在一些实施方案中，T细胞表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)，并且靶细胞表达靶抗原。
术语“遗传工程”、“基因编辑”或“工程化”是指修饰细胞基因组的方法，包括但不限于缺失编码或非编码区或其部分或插入编码区或其部分。在一些实施方案中，被修饰的细胞是淋巴细胞，例如T细胞，其可以从患者或供体获得。细胞可以被修饰以表达外源构建体，例如并入细胞基因组中的嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。
“免疫应答”是指免疫系统的细胞(例如T淋巴细胞，B淋巴细胞，自然杀伤(NK)细胞，巨噬细胞，嗜酸性粒细胞，肥大细胞，树突细胞和嗜中性粒细胞)的作用以及这些细胞或肝脏中的任何一种产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)，其导致脊椎动物体内入侵的病原体、感染病原体的细胞或组织、癌性细胞或其他异常细胞或在自身免疫或病理性炎症的情况下正常人细胞或组织的选择性靶向、结合、损坏、破坏和/或消除。
术语“免疫疗法”是指通过包括诱导、增强、抑制或以其他方式修饰免疫应答的方法治疗患有或有风险患上疾病或患有疾病复发的受试者。免疫疗法的实例包括但不限于T细胞疗法。T细胞疗法可以包括过继性T细胞疗法，肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)免疫治疗，自体细胞疗法，工程化自体细胞疗法(eACTTM)和同种异体T细胞移植。然而，本领域技术人员将认识到，本文公开的制备T细胞的方法将增强任何移植T细胞疗法的有效性。T细胞疗法的实例在美国专利公开号2014/0154228和2002/0006409、美国专利号5,728,388和国际公布号WO2008/081035中有所描述。
免疫疗法的T细胞可以来自本领域已知的任何来源。例如，T细胞可以从造血干细胞群体外分化，或T细胞可以从供体获得。供体可以是受试者，例如需要抗癌治疗的受试者。T细胞可以从例如外周血单核细胞，骨髓，淋巴结组织，脐带血，胸腺组织，感染部位的组织，腹水，胸腔积液，脾脏组织和肿瘤获得。另外，T细胞可以来源于本领域可用的一种或多种T细胞系。T细胞还可以使用本领域技术人员已知的任意技术，例如FICOLLTM分离和/或血液成分分离(apheresis)，从受试者采集的血液单位获得。T细胞也可以从人造胸腺类器官(ATO)细胞培养系统中获得，该系统复制人胸腺环境以支持从原代和重编程的多能干细胞有效地离体分化T细胞。美国专利公开号2013/0287748中公开了分离T细胞用于T细胞疗法的其他方法，其通过引用整体并入本文。
术语“工程改造的自体细胞疗法”(缩写为“eACTTM”，也称为过继性细胞转移)是一种方法，通过该方法收集患者自身的T细胞并随后遗传改变以识别和靶向在一种或多种特定肿瘤细胞或恶性肿瘤的细胞表面上表达的一种或多种抗原。T细胞可以被工程化以表达例如嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。CAR阳性(+)T细胞被工程化以表达对特定肿瘤抗原具有特异性的细胞外单链可变片段(scFv)，所述特定肿瘤抗原与包含共刺激结构域和激活结构域的细胞内信号部分相连。共刺激结构域可以源自例如CD28，CTLA4，CD16，OX-40,4-1BB/CD137，CD2，CD7，CD27，CD30，CD40，程序性死亡-1(PD-1)，程序性死亡配体-1(PD-L1)，诱导型T细胞共刺激分子(ICOS)，ICOS-L，淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1(CD1 1a/CD18)，CD3γ，CD3δ，CD3ε，CD247，CD276(B7-H3)，LIGHT(肿瘤坏死因子超家族成员14；TNFSF14)，NKG2C，Igα(CD79a)，DAP-10，Fcγ受体，MHC I类分子，TNF受体蛋白，免疫球蛋白样蛋白，细胞因子受体，整合素，信号传导淋巴细胞激活分子(SLAM蛋白)，激活NK细胞受体，BTLA，Toll配体受体，ICAM-1，B7-H3，CDS，ICAM-1，GITR，BAFFR，LIGHT，HVEM(LIGHTR)，KIRDS2，SLAMF7，NKp80(KLRF1)，NKp44，NKp30，NKp46，CD19，CD4，CD8，CD8α，CD8β，IL2Rβ，IL2Rγ，IL7Rα，ITGA4，VLA1，CD49a，ITGA4，IA4，CD49D，ITGA6，VLA-6，CD49f，ITGAD，CD1 1d，ITGAE，CD103，ITGAL，CD1 1a，LFA-1，ITGAM，CD1 1b，ITGAX，CD1 1c，ITGB1，CD29，ITGB2，CD18，LFA-1，ITGB7，NKG2D，TNFR2，TRANCE/RANKL，DNAM1(CD226)，SLAMF4(CD244,2B4)，CD84，CD96(触觉)，CEACAM1，CRT AM，Ly9(CD229)，CD160(BY55)，PSGL1，CD100(SEMA4D)，CD69，SLAMF6(NTB-A，Lyl08)，SLAM(SLAMF1，CD150，IPO-3)，BLAME(SLAMF8)，SELPLG(CD162)，LTBR，LAT，GADS，SLP-76，PAG/Cbp，CD19a，与CD83特异性结合的配体，或其任何组合；激活结构域可以来源于例如CD3，如CD3ζ，ε，δ，γ等。在某些实施方案中，CAR被设计成具有两个、三个、四个或更多个共刺激结构域。CAR scFv可以设计为靶向例如CD19，CD19是由B细胞谱系中的细胞表达的跨膜蛋白，包括所有正常B细胞和B细胞恶性，包括但不限于NHL、CLL和非T细胞ALL。在美国专利公开号2013/0287748、2014/0227237、2014/0099309和2014/0050708中描述了CAR+T细胞疗法和构建体的实例，并且这些参考文献通过引用整体并入。
本文使用的“患者”包括患有癌症的任何人(例如，淋巴瘤或白血病)。术语“受试者”和“患者”在本文中可互换使用。术语“供体受试者”在本文中是指为了进一步体外工程而获得其细胞的受试者。供体受试者可以是要用本文所述方法产生的细胞群治疗的癌症患者(即自体供体)，或者可以是捐献淋巴细胞样品的个体，所述淋巴细胞样品在产生通过本文所述方法产生的细胞将用于治疗不同的个体或癌症患者(即同种异体供体)。接受通过本方法制备的细胞的受试者可以称为“受体受试者”。
如本文所用，“刺激”是指由刺激分子与其同源配体结合诱导的初级应答，其中所述结合介导信号转导事件。“刺激分子”是T细胞上的分子，例如与存在于抗原呈递细胞上的同源刺激配体特异性结合的T细胞受体(TCR)/CD3复合物。“刺激性配体”是当存在于抗原呈递细胞(例如，人造抗原呈递细胞(aAPC)、树突细胞、B细胞等)上时可以与T细胞上刺激分子特异性结合，从而介导T细胞的初级应答，包括但不限于免疫应答的激活、启动、增殖等。刺激性配体包括但不限于装载有肽的MHC I类分子，抗CD3抗体，超级激动剂抗CD28抗体和超级激动剂抗CD2抗体。如本文所用，“激活”或“活性”是指已被刺激的T细胞。活性T细胞的特征可在于表达选自CD137，CD25，CD71，CD26，CD27，CD28，CD30，CD154，CD40L和CD134的一种或多种标志物。
术语“外源”是指来源于外部来源的任何物质。例如，外源IL-7或外源IL-15可以商购获得或重组生产。当加入或与一种或多种T细胞接触时，“外源IL-7”或“外源IL-15”表明IL-7和/或IL-15不是由T细胞产生的。在一些实施方案中，在与外源IL-7或IL-15混合之前的T细胞可以包含由T细胞产生或从受试者中用T细胞分离的痕量IL-7和/或IL-15(即内源性IL-7或IL-15)。本文所述的一种或多种T细胞可以通过本领域已知的任何方式与外源IL-7和/或外源IL-15接触，包括向培养物中添加分离的IL-7和/或IL-15，在培养基中包括IL-7和/或IL-15，或除了一种或多种T细胞以外的培养物中的一种或多种细胞如通过饲养层表达IL-7和/或IL-15。
如本文所用，术语“持久性”是指例如向受试者或其后代施用的一种或多种移植的T细胞(例如，分化或成熟的T细胞)以可检测水平保留在受试者中一段时间的能力。如本文所用，增加一种或多种移植的T细胞或其子代(例如，分化或成熟的T细胞)的持久性是指增加施用后受试者中移植的T细胞可检测的时间量。例如，一种或多种移植的T细胞的体内持久性可以增加至少约1天，至少约2天，至少约3天，至少约4天，至少约5天，至少约6天，至少约7天，至少约8天，至少约9天，至少约10天，至少约11天，至少约12天，至少约13天，至少约14天，至少约3周，至少约4周，至少约1个月，至少约2个月，至少约3个月，至少约4个月，至少约5个月或至少约6个月。另外，与未通过本文公开的本发明方法制备的一种或多种移植T细胞相比，一种或多种移植的T细胞的体内持久性可以增加至少约1.5倍，至少约2倍，至少约2.5倍，至少约3倍，至少约3.5倍，至少约4倍，至少约4.5倍，至少约5倍，至少约6倍，至少约7倍，至少约8倍，至少约9倍，或至少约10倍。
术语“减少”和“减小”在本文中可互换使用，并表示小于原始的任何变化。“减少”和“减小”是相对术语，需要在测量前和测量后进行比较。“减少”和“减小”包括完全耗尽。在一些实施方案中，术语“减少”和“减小”包括通过本公开方法(例如，与IL-7和IL-15中的至少一种和AKTi接触)制备的T细胞和没有制备的T细胞之间的T细胞效应的比较。
如本文所用，术语“调节”T细胞成熟指使用本文所述的任何干预来控制一种或多种T细胞的成熟，例如分化。在一些实施方案中，“调节”是指延缓或抑制T细胞成熟。在其他实施方案中，“调节”是指加速或促进T细胞成熟。特别地，如本文所用，“延缓或抑制T细胞成熟”是指将一种或多种T细胞维持在未成熟或未分化状态。例如，“延缓或抑制T细胞成熟”可以指将T细胞维持在初始或TCM状态，而不是进展至TEM或TEFF状态。“延缓或抑制T细胞成熟”还可以指增加或富集T细胞混合群体内的未成熟或未分化的T细胞(例如，初始T细胞和/或TCM细胞)的总体百分比。可以通过例如筛选各种基因的表达和T细胞表面上表达的各种蛋白质的存在来确定T细胞的状态(例如成熟或未成熟)。例如，选自由L-选择素(CD62L+)，IL-7R-α，CD132，CR7，CD45RA，CD45RO，CD27，CD28，CD95，IL-2Rβ，CXCR3，LFA-1及其任何组合组成的组的一种或多种标志物的存在可以指示不太成熟、未分化的T细胞。
受试者的“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指对受试者进行任何类型的干预或方法，或向受试者施用一种或多种由本发明制备的T细胞，目的是逆转、减轻、改善、抑制、减缓或预防症状、并发症或病症或与疾病相关的生化指标的发作、进展、发展、严重性或复发。在一个实施方案中，“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”包括部分缓解。在另一个实施方案中，“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”包括完全缓解。
本发明的各个方面在以下小节中进一步详细描述。
制备免疫细胞的方法
本公开内容涉及用于制备用于细胞疗法的免疫细胞(例如，淋巴细胞或树突细胞)的方法。发现某些体外工程化细胞(例如CAR T细胞，TCR细胞或树突细胞)在体外工程化后施用于患者时不太有效。不受任何理论的约束，注意到一个原因可能是淋巴细胞在施用于患者之前能够在体外过早分化。在某些实施方案中，本公开内容提出了通过添加外源IL-7和外源IL-15中的至少一种和AKTi来体外延缓、预防或抑制细胞过早分化的方法。
在一个实施方案中，本公开内容涉及通过使从供体受试者获得的一种或多种细胞与外源IL-7和外源IL-15(或两者)中的至少一种和AKT抑制剂接触来体外调节(例如延缓或抑制)T细胞或DC细胞成熟或分化的方法。延缓或抑制T细胞或DC细胞成熟或分化能够增加收集的T细胞或DC细胞群中未成熟、分化较低的细胞(例如，中枢记忆Tcm细胞的初始T细胞)的百分比。因此，本文所述的方法能够用于增加细胞疗法(例如T细胞疗法或DC细胞疗法)中移植的T细胞或DC细胞或其后代的体内持久性。此外，本公开内容提供了所得到的T细胞或DC细胞表现出增加的体外和体内扩增以及优异的抗肿瘤活性。
在另一个实施方案中，本发明包括用于细胞疗法(例如T细胞疗法)的体外调节(例如，延缓或抑制)细胞(例如T细胞)成熟或分化的的方法，包括使来自需要细胞疗法(例如T细胞疗法)的受试者的一种或多种细胞(例如T细胞或DC细胞)与(i)外源白介素-7(IL-7)和外源白介素-15(IL-15)中的至少一种和AKT抑制剂接触，其中所得到的T细胞表现出延缓的成熟或分化。接触可以包括将(i)AKT抑制剂和(ii)外源IL-7和/或外源IL-15直接添加至一种或多种T细胞或添加至含有T细胞的缓冲液或培养基中，混合(i)AKT抑制剂和(ii)外源IL-7和/或外源IL-15与其他组分，和/或将所述一种或多种细胞加入包含(i)AKT抑制剂(ii)外源IL-7和/或外源IL-15的培养基中。在某些实施方案中，一种或多种T细胞不与外源白介素-2(IL-2)接触。本文其他地方描述了T细胞的进一步制备。
本公开内容显示，在体外使一种或多种T细胞或DC细胞与IL-7和IL-15中的至少一种和AKT抑制剂接触可以增加样品中相对于更终末分化的T细胞的浓度的初始T细胞和TCM细胞的浓度。因此，在另一个实施方案中，本发明包括产生干细胞样CD4+T细胞或CD8+T细胞的方法，其包括在包含(i)AKT抑制剂和(ii)外源IL-7、外源IL-15或两者的培养基中培养一种或多种T细胞。在其他实施方案中，本发明包括富集样品中CD8+/CD45RA+/CCR7+T细胞群的方法，其包括(a)从受试者获得一种或多种T细胞；(b)使所述一种或多种T细胞与(i)AKT抑制剂和(ii)外源IL-7、外源IL-15或两者接触；和(c)在AKT抑制剂和外源IL-7、外源IL-15或两者存在下扩增一种或多种T细胞。产生增加浓度的未成熟和未分化的T细胞或DC细胞可以在移植到需要细胞疗法(例如T细胞疗法或DC细胞疗法)的受试者后增加细胞的体内持久性。因此，在另一个实施方案中，本发明包括用于延长过继性细胞疗法中一种或多种T细胞或DC细胞的体内持久性的方法，包括在施用于受试者之前使一种或多种T细胞或DC细胞与(i)AKT抑制剂和(ii)外源IL-7、外源IL-15或两者接触；其中所述体内持久性相对于未与外源IL-7、外源IL-15或两者和AKT抑制剂接触的一种或多种移植的T细胞延长。
本文公开的方法包括体外调节(例如延缓或抑制)一种或多种T细胞或DC细胞的成熟或分化。可以通过本领域已知的任何方法来测量一种或多种T细胞或DC细胞的成熟或分化的延缓或抑制。例如，一种或多种T细胞或DC细胞的成熟或分化的延缓或抑制可以通过检测一种或生物标志物的存在来测量。可以通过本领域已知的任何方法检测一种或多种生物标志物的存在，所述方法包括但不限于免疫组织化学和/或荧光激活细胞分选(FACS)。在一些实施方案中，所述一种或多种生物标志物选自由以下组成的组：L-选择素(CD62L+)，IL-7Rα，CD132，CCR7，CD45RA，CD45RO，CD27，CD28，CD95，IL-2Rβ，CXCR3，LFA-1，或其任何组合。在某些实施方案中，一种或多种T细胞或DC细胞的成熟或分化的延缓或抑制可以通过检测L-选择素(CD62L+)、IL-7Rα和CD132中的一种或多种的存在来测量。本领域技术人员将认识到，虽然本发明的方法可以增加收集细胞群中未成熟和未分化T细胞或DC细胞的相对比例，但仍可存在一些成熟和分化的细胞。结果，一种或多种T细胞或DC细胞的成熟或分化的延缓或抑制可通过计算使一种或多种细胞与外源IL-7和外源IL-15中的至少一种和AKT抑制剂接触之前和之后细胞群中未成熟和未分化细胞的总百分比来测量。在一些实施方案中，本文公开的方法增加T细胞群中未成熟和未分化T细胞的百分比。在某些实施方案中，与外源IL-7和外源IL-15中的至少一种和AKT抑制剂接触的所述一种或多种T细胞包含至少约10％，至少约15％，至少约20％，至少约25％，至少约30％，至少约35％，至少约40％，至少约45％，至少约50％，至少约55％，至少约60％，至少约65％，至少约70％，至少约75％，至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或约100％未成熟或未分化的T细胞。在其他实施方案中，与外源IL-7和外源IL-15中的至少一种和AKT抑制剂接触的一种或多种T细胞或DC细胞包含至少约10％至至少约90％，至少约20％至至少约80％，至少约30％至至少约70％，至少约40％至至少约60％，至少约10％至至少约50％，至少约20％，至少约40％，至少约35％至至少约45％，至少约20％至至少约60％或至少约50％至至少约90％未成熟或未分化的T细胞或DC细胞。在某些实施方案中，未成熟或未分化的T细胞是初始T细胞和/或中枢记忆Tcm细胞。
本文公开的方法包括使一种或多种T细胞或DC细胞与外源IL-7和外源IL-15中的一种或多种和AKT抑制剂接触。在一些实施方案中，该方法包括使一种或多种T细胞或DC细胞与AKT抑制剂、外源IL-7和外源IL-15接触。在另一个实施方案中，该方法包括使一种或多种T细胞或DC细胞与AKT抑制剂和外源IL-7接触。在另一个实施方案中，所述方法包括使一种或多种T细胞或DC细胞与AKT抑制剂和外源IL-15接触。在一个具体实施方案中，一种或多种T细胞或DC细胞也与外源IL-2接触。在另一个实施方案中，一种或多种T细胞或DC细胞不与外源IL-2接触。
可以通过本领域已知的任何手段使一种或多种T细胞或DC细胞与AKT抑制剂和外源IL-7和/或IL-15接触。例如，可以将AKT抑制剂和IL-7/IL-15添加到用于培养一种或多种T细胞或DC细胞的培养基中。或者，AKT抑制剂和IL-7/IL-15可以通过与一种或多种T细胞或DC细胞例如通过饲养细胞层共培养的一种或多种细胞产生。AKT抑制剂、IL-7和IL-15可以一起添加或者可以单独添加。例如，可以将AKT抑制剂添加到培养基中，并且可以通过与一种或多种T细胞共培养的细胞产生IL-7和/或IL-15。
另外，一种或多种T细胞或DC细胞可以同时、在不同的时间、在重叠的时间或者顺序地与AKT抑制剂和外源IL-7和/或外源IL-15接触。例如，一种或多种T细胞或DC细胞可以在与AKT抑制剂接触之前与外源IL-7和/或外源IL-15接触。或者，一种或多种T细胞或DC细胞可以在与外源IL-7和/或外源IL-15接触之前与AKT抑制剂接触。在一个具体实施方案中，首先将一种或多种T细胞或DC细胞单独与外源IL-7和/或外源IL-15接触，然后同时与AKT抑制剂和外源IL-7和/或外源IL-15接触。在另一个实施方案中，首先将一种或多种T细胞或DC细胞单独与AKT抑制剂接触，然后同时与AKT抑制剂和外源IL-7和/或外源IL-15接触。在一些实施方案中，洗涤一种或多种T细胞或DC细胞以除去AKT抑制剂、外源IL-7和/或外源IL-15。
可以将本公开内容的一种或多种T细胞或DC细胞施用于受试者以用于T细胞或DC细胞疗法。因此，可从需要T细胞疗法的受试者或从供体收集一种或多种T细胞或DC细胞。一旦收集，一种或多种T细胞可以在施用于受试者之前处理任何合适的时间段。在此期间，一种或多种T细胞可与AKT抑制剂、外源IL-7和/或外源IL-15接触在来自供体的T细胞的收集和受试者的施用之间的任何时间段。例如，一种或多种T细胞可以与AKT抑制剂、外源IL-7和/或外源IL-15接触(例如在其存在下培养)至少约1天，至少约2天，至少约3天，至少约4天，至少约5天，至少约6天，至少约7天，至少约8天，至少约9天，至少约10天，至少约11天，至少约12天，至少约13天或至少约14天。在一些实施方案中，使一种或多种T细胞与AKT抑制剂、外源IL-7和/或外源IL-15接触(例如在其存在下培养)约1天至约14天，约1天至约10天，约1天至约7天，约1天至约6天，约1天至约5天，约1天至约4天，约1天至约3天，约1天至约2天，约2天至约3天，约2天至约4天，约2天至约5天或约2天至约6天。在一个具体实施方案中，从收集T细胞的那天(第0天)起，将一种或多种T细胞与AKT抑制剂、外源IL-7和/或外源IL-15接触(例如在其存在下培养)例如直到T细胞施用于受试者的那天。在另一个实施方案中，从第0天至施用，从第1天至施用，从第2天至施用，从第3天至施用，才第4天至施用，才第5天至施用，或从第6天至施用，将T细胞与AKT抑制剂、外源IL-7和/或外源IL-15接触(例如在其存在下培养)。在一些实施方案中，在施用之前洗涤一种或多种T细胞以去除AKT抑制剂、外源IL-7和/或外源IL-15。
在某些实施方案中，本公开内容涉及通过使得自供体受试者的一种或多种T细胞或DC细胞与外源IL-7和外源IL-15中的至少一种(或两者)和AKT抑制剂接触来体外调节(例如延缓或抑制)T细胞或DC细胞成熟或分化的方法，其中所述一种或多种细胞不与外源IL-2接触。在一个实施方案中，用IL-7和IL-15中的至少一种(或两者)和AKTi但不含IL-2处理的一种或多种细胞表现出延缓或抑制的成熟或分化高于用单独的IL-2或IL-2和AKTi处理的一种或多种细胞。与用单独的IL-2或IL-2和AKTi处理的一种或多种T细胞或DC细胞相比，所述一种或多种T细胞或DC细胞可显示未成熟、分化较低的细胞(例如，中枢记忆Tcm细胞的初始T细胞)的百分比增加。因此，本文所述的方法能够用于增加细胞疗法(例如T细胞疗法或DC细胞疗法)中移植的T细胞或DC细胞或其后代的体内持久性。此外，本公开内容提供了所得到的T细胞或DC细胞表现出增加的体外和体内扩增以及优异的抗肿瘤活性。在一些实施方案中，所述一种或多种T细胞是CD4细胞。在其他实施方案中，所述一种或多种T细胞是CD8细胞。在具体的实施方案中，与IL-7和IL-15中的至少一种和AKTi的接触进行至少1天，至少约2天，至少约3天，至少约4天，至少约5天，至少约6天，至少约7天，至少约8天，至少约9天，至少约10天，至少约11天，至少约12天或约13天。在其他实施方案中，与IL-7和IL-15中的至少一种和AKTi的接触进行超过一天至少于14天，少于13天，少于12天，少于11天，少于10天，少于9天或少于8天。
本文所述的方法可以进一步包括富集从供体获得的淋巴细胞群。淋巴细胞(例如一种或多种T细胞)群的富集可通过任何合适的分离方法完成，包括但不限于使用分离介质(例如FICOLL-PAQUETM，ROSETTESEPTM HLA总淋巴细胞富集混合物，淋巴细胞分离介质(LSA)(MP Biomedical目录号0850494X)等)，通过过滤或淘洗的细胞大小、形状或密度分离，免疫磁性分离(例如磁激活细胞分选系统，MACS)，荧光分离(例如，荧光激活细胞分选系统，FACS)或珠基柱分离。
本文所述的方法可以进一步包括在适宜的条件下用一种或多种T细胞刺激剂刺激淋巴细胞群以产生激活的T细胞群。一种或多种合适的T细胞刺激剂的任何组合可用于产生激活的T细胞群，包括但不限于靶向T细胞刺激或共刺激分子的抗体或其功能片段(例如，抗CD2抗体，抗CD3抗体，抗CD28抗体或其功能片段)或任何其他合适的丝裂原(例如十四酰佛波醇乙酸酯(TPA)，植物血凝素(PHA)，伴刀豆球蛋白A(conA)，脂多糖(LPS)，美洲商陆丝裂原(PWM))或T细胞刺激或共刺激分子的天然配体。
如本文所述刺激淋巴细胞群的合适条件可以包括温度、一段时间、和/或存在一定水平的CO2。在某些实施方案中，用于刺激的温度为约34℃，约35℃，约36℃，约37℃或约38℃。在某些实施方案中，刺激温度为约34-38℃。在某些实施方案中，用于刺激的温度为约35-37℃。在某些实施方案中，用于刺激的温度为约36-38℃。在某些实施方案中，用于刺激的温度为约36-37℃或约37℃。
如本文所述刺激淋巴细胞群的另一个条件可以包括刺激时间。在一些实施方案中，刺激时间为约24-72小时。在一些实施方案中，刺激时间为约24-36小时，约30-42小时，约36-48小时，约40-52小时，约42-54小时，约44-56小时，约46-58小时，约48-60小时，约54-66小时或约60-72小时。在一个具体实施方案中，刺激时间为约48小时或至少约48小时。在其他实施方案中，刺激时间为约44-52小时。在某些实施方案中，刺激时间为约40-44小时，约40-48小时，约40-52小时或约40-56小时。
如本文所述刺激淋巴细胞群的其他条件可以包括CO2水平。在一些实施方案中，刺激的CO2水平为约1.0-10％CO2。在一些实施方案中，用于刺激的CO2水平为约1.0％，约2.0％，约3.0％，约4.0％，约5.0％，约6.0％，约7.0％，约8.0％，约9.0％或约10.0％二氧化碳。在一个实施方案中，用于刺激的CO2水平为约3-7％CO2。在其他实施方案中，用于刺激的CO2水平为约4-6％CO2。在其他实施方案中，刺激的CO2水平为约4.5-5.5％CO2。在一个具体实施方案中，用于刺激的CO2水平是约5％CO2。
刺激淋巴细胞群的条件可以包括以任何组合的温度、刺激时间的量和/或存在一定水平的CO2。例如，刺激淋巴细胞群的步骤可以包括在约36-38℃的温度下用一种或多种T细胞刺激剂刺激淋巴细胞群约44-52小时的时间的量，并且在CO2水平约为4.5-5.5％CO2的情况下。
用于本文方法的淋巴细胞浓度为约1.0-10.0×106个细胞/mL。在某些实施方案中，淋巴细胞的浓度为约1.0-2.0×106个细胞/mL，约1.0-3.0×106个细胞/mL，约1.0-4.0×106个细胞/mL，约1.0-5.0×106个细胞/mL，约1.0-6.0×106个细胞/mL，约1.0-7.0×106个细胞/mL，约1.0-8.0×106个细胞/mL，1.0-9.0×106个细胞/mL或约1.0-10.0×106个细胞/mL。在某些实施方案中，淋巴细胞的浓度为约1.0-2.0×106个细胞/mL。在某些实施方案中，淋巴细胞的浓度为约1.0-1.2×106个细胞/mL，约1.0-1.4×106个细胞/mL，约1.0-1.6×106个细胞/mL，约1.0-1.8×106个细胞/mL或约1.0-2.0×106个细胞/mL。在某些实施方案中，淋巴细胞的浓度为至少约1.0×106个细胞/mL，至少约1.1×106个细胞/mL，至少约1.2×106个细胞/mL，至少约1.3×106个细胞/mL，至少约1.4×106个细胞/mL，至少约1.5×106个细胞/mL，至少约1.6×106个细胞/mL，至少约1.7×106个细胞/mL，至少约1.8×106个细胞/mL，至少约1.9×106个细胞/mL，至少约2.0×106个细胞/mL，至少约4.0×106个细胞/mL，至少约6.0×106个细胞/mL，至少约8.0×106个细胞/mL或至少约10.0×106个细胞/mL。
根据刺激淋巴细胞群的步骤可以使用抗CD3抗体(或其功能片段)，抗CD28抗体(或其功能片段)或抗CD3和抗CD28抗体的组合。可以使用任何可溶性或固定化的抗CD2、抗CD3和/或抗CD28抗体或其功能片段(例如，克隆OKT3(抗CD3)，克隆145-2C11(抗CD3)，克隆UCHT1(抗CD3)，克隆L293(抗CD28)，克隆15E8(抗CD28))。在一些方面，抗体可以从本领域已知的供应商处购买，包括但不限于Miltenyi Biotec，BD Biosciences(例如，MACS GMP CD3纯1mg/mL，Part No.170-076-116)和eBioscience，Inc。另外，本领域技术人员将理解如何通过标准方法生产抗CD3和/或抗CD28抗体。在一些实施方案中，根据刺激淋巴细胞群的步骤使用的一种或多种T细胞刺激剂包括在T细胞细胞因子的存在下靶向T细胞刺激或共刺激分子的抗体或其功能片段。在一个方面，一种或多种T细胞刺激剂包括抗CD3抗体和IL-2。在某些实施方案中，T细胞刺激剂包含浓度为约20ng/mL-100ng/mL的抗CD3抗体。在某些实施方案中，抗CD3抗体的浓度为约20ng/mL，约30ng/mL，约40ng/mL，约50ng/mL，约60ng/mL，约70ng/mL，约80ng/mL，约90ng/mL或约100ng/mL。在一个具体实施方案中，抗CD3抗体的浓度是约50ng/mL。在替代性实施方案中，不需要T细胞激活。在该实施方案中，从该方法中省略了刺激淋巴细胞群以产生激活的T细胞群的步骤，并且可以根据以下步骤转导可以富集T淋巴细胞的淋巴细胞群。
本文所述的方法可以包括使用包含编码细胞表面受体的核酸分子的病毒载体转导激活的T细胞群，使用单循环转导产生转导的T细胞群。几种重组病毒已被用作病毒载体以将遗传物质递送至细胞。可以根据转导步骤使用的病毒载体可以是任何同向性或兼向性病毒载体，包括但不限于重组逆转录病毒载体，重组慢病毒载体，重组腺病毒载体和重组腺相关病毒(AAV)载体。在一些实施方案中，该方法还包括用逆转录病毒转导一种或多种T细胞。在一个实施方案中，用于转导激活的T细胞群的病毒载体是MSGV1γ逆转录病毒载体。在某些实施方案中，用于转导激活的T细胞群的病毒载体是由Kochenderfer，J.Immunother.32(7)：689-702(2009)描述的PG13-CD19-H3载体。根据该实施方案的一个方面，病毒载体在对于本文称为“病毒载体接种物”的病毒载体制造特异性的培养基中以悬浮培养物的形式生长。根据本文所述的方法，可以在病毒载体接种物中使用任何合适的用于生长病毒载体的生长培养基和/或补充物。根据一些方面，然后在转导步骤期间将病毒载体接种物加入下述的无血清培养基中。
在一些实施方案中，一种或多种T细胞可以用逆转录病毒转导。在一个实施方案中，逆转录病毒包含编码细胞表面受体的异源基因。在一个具体实施方案中，细胞表面受体能够结合靶细胞表面上的抗原，例如在肿瘤细胞表面上。
如本文所述用于转导激活的T细胞群的条件可以包括特定时间、在特定温度和/或在特定水平的CO2存在下。在某些实施方案中，用于转导的温度为约34℃，约35℃，约36℃，约37℃或约38℃。在一个实施方案中，用于转导的温度为约34-38℃。在另一个实施方案中，用于转导的温度为约35-37℃。在另一个实施方案中，用于转导的温度为约36-38℃。在又一个实施方案中，用于转导的温度为约36-37℃。在一个具体实施方案中，用于转导的温度约为37℃。
在某些实施方案中，转导时间为约12-36小时。在一些实施方案中，转导时间为约12-16小时，约12-20小时，约12-24小时，约12-28小时或约12-32小时。在其他实施方案中，转导时间为约20小时或至少约20小时。在一个实施方案中，转导时间为约16-24小时。在其他实施方案中，用于转导的时间为至少约14小时，至少约16小时，至少约18小时，至少约20小时，至少约22小时，至少约24小时或至少约26小时。
在某些实施方案中，用于转导的CO2水平为约1.0-10％CO2。在其他实施方案中，用于转导的CO2水平为约1.0％，约2.0％，约3.0％，约4.0％，约5.0％，约6.0％，约7.0％，约8.0％，约9.0％或约10.0％CO2。在一个实施方案中，用于转导的CO2水平为约3-7％CO2。在另一个实施方案中，用于转导的CO2水平可以是约4-6％CO2。在另一个实施方案中，用于转导的CO2水平为约4.5-5.5％CO2。在一个具体实施方案中，用于转导的CO2水平是约5％CO2。
在一些实施方案中，如本文所述转导激活的T细胞群可以在特定时间，在特定温度下和/或在任何组合的特定水平的CO2存在下进行：温度为约36-38℃、约16-24小时的时间，以及在约4.5-5.5％CO2的CO2水平的存在下。
本文所述的方法可以包括将转导的一种或多种T细胞群扩增一段特定的时间以产生工程化T细胞群。预定扩增时间可以是任何合适的时间，其允许产生(i)足够数量的工程化T细胞群中的细胞用于至少一个剂量以施用于患者，(ii)与典型的较长方法相比，具有有利比例的幼稚细胞的工程化T细胞群，或(iii)(i)和(ii)两者。该时间将取决于T细胞表达的细胞表面受体、使用的载体、需要具有治疗效果所需的剂量以及其他变量。因此，在一些实施方案中，预定扩增时间可以是1天，2天，3天，4天，5天，6天，7天，8天，9天，10天，11天，12天，13天，14天，15天，16天，17天，18天，19天，20天，21天或超过21天。在一些方面，扩增时间比本领域已知的扩增方法更短。例如，预定扩增时间可以缩短至少5％，至少10％，至少15％，至少20％，至少25％，至少30％，至少35％，至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％或可以缩短超过75％。一方面，扩增时间约为3天，并且从淋巴细胞群富集到产生工程化T细胞的时间为约6天。
扩增转导的T细胞群的条件可以包括温度和/或存在一定水平的CO2。在某些实施方案中，温度为约34℃，约35℃，约36℃，约37℃或约38℃。在一个实施方案中，温度约为34-38℃。在另一个实施方案中，温度为约35-37℃。在另一个实施方案中，温度为约36-38℃。在又一个实施方案中，温度为约36-37℃。在一个具体实施方案中，温度约为37℃。在某些实施方案中，CO2的水平是1.0-10％CO2。在其他实施方案中，CO2的水平为约1.0％，约2.0％，约3.0％，约4.0％，约5.0％，约6.0％，约7.0％，约8.0％，约9.0％或约10.0％CO2。在一个实施方案中，CO2的水平约为4.5-5.5％CO2。在另一个实施方案中，CO2的水平是约5％CO2。在其他实施方案中，CO2的水平为约3.5％，约4.0％，约4.5％，约5.0％，约5.5％或约6.5％的CO2。在一些实施方案中，用于扩增转导的T细胞群的条件包括任何组合的温度和/或存在一定水平的CO2。例如，扩增转导的T细胞群的条件包括约36-38℃的温度和存在约4.5-5.5％CO2的CO2水平。
本文描述的方法的每个步骤可以在封闭的系统中执行。在某些实施方案中，封闭系统是封闭袋培养系统，其使用任何合适的细胞培养袋(例如Miltenyi Biotec
Figure BDA0002740356470000291
GMP细胞分化袋，Origen Biomedical PermaLife细胞培养袋)。在一些实施方案中，用于封闭袋培养系统的细胞培养袋在转导步骤期间用重组人纤连蛋白片段包被。重组人纤连蛋白片段可以包括三个功能结构域：中央细胞结合结构域，肝素结合结构域II和CS1序列。重组人纤连蛋白片段可用于通过辅助靶细胞和病毒载体的共定位来增加免疫细胞逆转录病毒转导的基因效率。在某些实施方案中，重组人纤连蛋白片段是
Figure BDA0002740356470000301
(TakaraBio，日本)。在某些实施方案中，细胞培养袋用浓度为约1-60μg/mL或约1-40μg/mL的重组人纤连蛋白片段包被。在其他实施方案中，细胞培养袋用浓度为约1-20μg/mL、20-40μg/mL或40-60μg/mL的重组人纤连蛋白片段包被。在一些实施方案中，细胞培养袋用约1μg/mL，约2μg/mL，约3μg/mL，约4μg/mL，约5μg/mL，约6μg/mL，约7μg/mL，约8μg/mL，约9μg/mL，约10μg/mL，约11μg/mL，约12μg/mL，约13μg/mL，约14μg/mL，约15μg/mL，约16μg/mL，约17μg/mL，约18μg/mL，约19μg/mL或约20μg/mL的重组人纤连蛋白片段包被。在其他实施方案中，细胞培养袋用约2-5μg/mL，约2-10μg/mL，约2-20μg/mL，约2-25μg/mL，约2-30μg/mL，约2-35μg/mL，约2-40μg/mL，约2-50μg/mL或约2-60μg/mL重组人纤连蛋白片段包被。在某些实施方案中，细胞培养袋用至少约2μg/mL，至少约5μg/mL，至少约10μg/mL，至少约15μg/mL，至少约20μg/mL，至少约25μg/mL，至少约30μg/mL，至少约40μg/mL，至少约50μg/mL或至少约60μg/mL的重组人纤连蛋白片段包被。在一个具体实施方案中，细胞培养袋用至少约10μg/mL重组人纤连蛋白片段包被。在封闭袋培养系统中使用的细胞培养袋可以任选地在转导步骤期间用人血清白蛋白血清(HSA)封闭。在替代实施方案中，细胞培养袋在转导步骤期间不用HSA封闭。
在其它方面，(a)使淋巴细胞群与外源IL-7和外源IL-15中的至少一种和AKT抑制剂接触，(b)刺激淋巴细胞群，(c)转导激活的T细胞群，和(d)扩增转导的T细胞群中的至少一种使用不含添加血清的无血清培养基进行。在一些方面，(a)至(d)中的每一个都使用不含添加血清的无血清培养基进行。在另一方面，(a)使淋巴细胞群与外源IL-7和外源IL-15中的至少一种和AKT抑制剂接触，(b)刺激淋巴细胞群，(c)转导激活的T细胞群，和(d)扩增转导的T细胞群中的至少一种使用无血清培养基进行。在一些方面，(a)至(d)中的每一个都使用不含添加血清的无血清培养基进行。如本文所提及的，术语“无血清培养基(serum-free media)”或“无血清培养基(serum-free culture medium)”是指所用生长培养基未补充有血清(例如人血清或牛血清)。换句话说，在一些实施方案中，没有将血清作为单独分开且不同的成分添加到培养基中以支持培养细胞的存活力、激活和生长。可以使用任何合适的培养基T细胞生长培养基根据本文所述的方法培养悬浮的细胞。例如，T细胞生长培养基可以包括但不限于包含合适量的缓冲液、镁、钙、丙酮酸钠和碳酸氢钠的无菌低葡萄糖溶液。在一个实施方案中，T细胞生长培养基是OPTMIZERTM(Life Technologies)。与用于生产工程化T细胞的典型方法相比，本文所述的方法可以使用未补充有(例如人或牛)血清的培养基。
AKT抑制剂
AKT激酶家族具有三种高度同源的同种型：AKT1(PKBα)、AKT2(PKBβ)和AKT3(PKBγ)，每种具有独特和重叠的功能。作为PI3K-AKT-mTOR信号传导途径的一部分，AKT作用于PI3K下游以激活mTOR，在细胞中引发各种反应，包括存活、生长、增殖、迁移和代谢。
本领域已知的任何AKT抑制剂可用于本发明，包括AKT1、AKT2、AKT3的任何抑制剂或其任何组合。对于AKT抑制剂可选自A6730、B2311,124018、GSK2110183(afuresertib)、派立福新(KRX-0401)、GDC-0068(ipatasertib)、RX-0201、VQD-002、LY294002、A-443654、A-674563、Akti-1、Akti-2、Akti-1/2、AR-42、API-59CJ-OMe、ATI-13148、AZD-5363、芥酸磷酸胆碱、GSK-2141795(GSK795)、KP372-1、L-418、NL-71-101、PBI-05204、PIA5、PX-316、SR13668、曲西瑞宾、GSK 690693(CAS#937174-76-0)、FPA 124(CAS#902779-59-3)、米替福新、PHT-427(CAS#1 191951-57-1)、10-DEBC盐酸盐、Akt抑制剂III、Akt抑制剂VIII、MK-2206二盐酸盐(CAS#1032350-13-2)、SC79、AT7867(CAS#857531-00-1)、CCT128930(CAS#885499-61-6)、A-674563(CAS#552325-73-2)、AGL 2263、AS-041 164(5-苯并[1,3]间二氧杂环戊烯-5-基亚甲基-噻唑烷-2,4-二酮)、BML-257(CAS#32387-96-5)、XL-418、CAS#612847-09-3、CAS#98510-80-6、H-89(CAS#127243-85-0)、OXY-1 1 1A、3-[1-[[4-(7-苯基-3H-咪唑并[4,5-g]喹喔啉-6-基)苯基]甲基]哌啶-4-基]-1H-苯并咪唑-2-酮及其任何组合。AKT抑制剂还可以选自1-{1-[4-(7-苯基-1H-咪唑并[4,5-g]喹喔啉-6-基)苄基]哌啶-4-基}-1,3-二氢-2H-苯并咪唑-2-酮；N,N-二甲基-1-[4-(6-苯基-1H-咪唑并[4,5-g]喹喔啉-7-基)苯基]甲基-N胺(metha-namine)；1-{1-[4-(3-苯基苯并[g]喹喔啉-2-基)苄基]哌啶-4-基}-1,3-二氢-2H-苯并咪唑-2-酮；1-{1-[4-(7-苯基-1H-咪唑并[4,5-g]喹喔啉-6-基)苄基]哌啶-4-基}-1,3-二氢-2H-苯并咪唑-2-酮；N,N-二甲基1-[4-(6-苯基-1H-咪唑并[4,5-g]喹喔啉-7-基)苯基]甲基-N胺；1-{1-[4-(3-苯基苯并[g]喹喔啉-2-基)苄基]哌啶-4-基}-1,3-二氢-2H-苯并咪唑-2-酮(也称为3-[1-[[4-(7-苯基-3H-咪唑并[4,5-g]喹喔啉-6-基)苯基]甲基]哌啶-4-基]-1H-苯并咪唑-2-酮)；具有包括在2007年9月25日公开的美国专利号7,273,869(其全部内容通过引用并入本文)中公开的式I，式II，式III，式IV，式V，式VI，式VII和式VIII的结构的化合物；其立体异构体；任何在2007年9月25日公开的美国专利号7,273,869(其全部内容通过引用并入本文)中公开的AKTi；及其任何组合。在一个实例中，AKTi包含式I。
在一个具体实施方案中，AKT抑制剂是3-[1-[[4-(7-苯基-3H-咪唑并[4,5-g]喹喔啉-6-基)苯基]甲基]哌啶-4-基]-1H-苯并咪唑-2-酮。在另一个实施方案中，AKT抑制剂是Akt抑制剂VIII。
在一些实施方案中，AKT包含由式I说明的式：
Figure BDA0002740356470000321
其中：a是0或1；b是0或1；m是0、1或2；n是0、1或2；p是0、1、2或3；r是0或1；s是0或1；t是2、3、4、5或6；u、v和x独立地选自：CH和N；w选自键、CH和N；y和z独立地选自：CH和N，条件是y和z中的至少一个是N；R1独立地选自：1)(C＝O)aObC1-C10烷基，2)(C＝O)aOb芳基，3)C2-C10烯基，4)C2-C10炔基，5)(C＝O)aOb杂环基，6)(C＝O)aObC3-C8环烷基，7)CO2H，8)卤素，9)CN，10)OH，11)ObC1-C6全氟烷基，12)Oa(C＝O)bNR7R8，13)NRc(C＝O)NR7R8，14)S(O)mRa，15)S(O)2NR7R8，16)NRcS(O)mRa，17)氧代，18)CHO，19)NO2，20)NRc(C＝O)ObRa，21)O(C＝O)ObC1-C10烷基，22)O(C＝O)ObC3-C8环烷基，23)O(C＝O)Ob芳基，和24)O(C＝O)Ob-杂环；所述烷基、芳基、烯基、炔基、杂环基和环烷基任选被选自Rz的一个或多个取代基取代；R2独立地选自：1)(C＝O)aObC1-C10烷基，2)(C＝O)aOb芳基，3)C2-C10烯基，4)C2-C10炔基，5)(C＝O)aOb杂环基，6)(C＝O)aObC3-C8环烷基，7)CO2H，8)卤素，9)CN，10)OH，11)ObC1-C6全氟烷基，12)Oa(C＝O)bNR7R8，13)NRc(C＝O)NR7R8，14)S(O)mRa，15)S(O)2NR7R8，16)NRcS(O)mRa，17)CHO，18)NO2，19)NRc(C＝O)ObRa，20)O(C＝O)ObC1-C10烷基，21)O(C＝O)ObC3-C8环烷基，22)O(C＝O)Ob芳基和23)O(C＝O)Ob杂环；所述烷基、芳基、烯基、炔基、杂环基和环烷基任选地被选自Rz的一个、两个或三个取代基取代；R3和R4独立地选自：H、C1-C6-烷基和C1-C6-全氟烷基，或者R3和R4结合形成–(CH2)t–，其中碳原子之一任选地被选自O，S(O)m，–N(Rb)C(O)–，和–N(CORa)–的部分替换；R5和R6独立地选自：1)H，2)(C＝O)ObRa，3)C1-C10烷基，4)芳基，5)C2-C10烯基，6)C2-C10炔基，7)杂环基，8)C3-C8环烷基，9)SO2Ra和10)(C＝O)NRb 2，所述烷基、环烷基、芳基、杂环基、烯基和炔基任选被选自Rz的一个或多个取代基取代，或R5和R6可以与它们所连接的氮一起形成每个环中具有5-7个成员的单环或双环杂环并且除了氮之外还任选地含有一个或两个选自N、O和S的另外的杂原子，所述单环或双环杂环任选被Q取代并且还任选被选自Rz的一个或多个取代基取代；Q选自：–NR7R8，芳基和杂环基，所述芳基和杂环基任选被选自Rz的1至3个取代基取代；R7和R8独立地选自：1)H，2)(C＝O)ObC1-C10烷基，3)(C＝O)ObC3-C8环烷基，4)(C＝O)Ob芳基，5)(C＝O)Ob杂环基，6)C1-C10烷基，7)芳基，8)C2-C10烯基，9)C2-C10炔基，10)杂环基，11)C3-C8环烷基，12)SO2Ra，和13)(C＝O)NRb 2；所述烷基、环烷基、芳基、杂环基、烯基和炔基任选被选自Rz的一个或多个取代基取代，或者R7和R8可以与它们所连接的氮一起形成单环或双环杂环，其中每个环中含有5-7个成员并且除了氮之外还任选地含有一个或两个选自N、O和S的另外的杂原子，所述单环或双环杂环任选被选自Rz的一个或多个取代基取代；Rz选自：1)(C＝O)rOs(C1-C10)烷基，2)Or(C1-C3)七氟烷基，3)(C0-C6)烯烃基-S(O)mRa，4)氧代，5)OH，6)卤素，7)CN，8)(C＝O)rOs(C2-C10)烯基，9)(C＝O)rOs(C2-C10)炔基，10)(C＝O)rOs(C3-C6)环烷基，11)(C＝O)rOs(C0-C6)烯基-芳基，12)(C＝O)rOs(C0-C6)烯基-杂环基，13)(C＝O)rOs(C0-C6)烯烃基-N(Rb)2，14)C(O)Ra，15)(C0-C6)烯烃基-CO2Ra，16)C(O)H，17)(C0-C6)烯烃基-CO2H，18)C(O)N(Rb)2，19)S(O)mRa，20)S(O)2N(Rb)2，21)NRc(C＝O)ObRa，22)O(C＝O)ObC1-C10烷基，23)O(C＝O)ObC3-C8环烷基，24)O(C＝O)Ob芳基，和25)O(C＝O)Ob-杂环；所述烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基和杂环基任选被选自Rb，OH，(C1-C6)烷氧基，卤素，CO2H，CN，O(C＝O)C1-C6烷基，氧代，和N(Rb)2的至多三个取代基取代；Ra是取代或未取代的(C1-C6)烷基，取代或未取代的(C2-C6)烯基，取代或未取代的(C2-C6)炔基，取代或未取代的(C3-C6)环烷基，取代或未取代的芳基，(C1-C6)全氟烷基，2,2,2-三氟乙基或取代或未取代的杂环基；而Rb是H，(C1-C6)烷基，取代或未取代的芳基，取代或未取代的苄基，取代或未取代的杂环基，(C3-C6)环烷基，(C＝O)OC1-C6烷基，(C＝O)C1-C6烷基或S(O)2Ra；Rc选自：1)H，2)C1-C10烷基，3)芳基，4)C2-C10烯基，5)C2-C10炔基，6)杂环基，7)C3-C8环烷基，8)C1-C6全氟烷基，所述烷基、环烷基、芳基、杂环基、烯基和炔基是任选被选自Rz的一个或多个取代基取代；或药学上可接受的盐或其立体异构体。
在某些实施方案中，可以例如通过结合AKT的分子直接抑制AKT信号传导，或者例如通过干扰PI3K-AKT-mTOR信号传导通路的另一个成员来间接抑制AKT信号传导。因此，AKT抑制剂可以是抑制PI3K-AKT-mTOR信号传导途径的一个或多个成员的活性的分子。例如，一种或多种T细胞可以与AKT抑制剂、PI3K抑制剂、mTOR抑制剂或其任何组合接触。
用于本文所述方法的AKT抑制剂的量可以是能够降低或抑制一种或多种T细胞中AKT活性的量(即有效量)。在另一个实施方案中，用于本发明的AKT抑制剂的量可以是能够与外源IL-7和/或外源IL-15组合体外延缓或抑制T细胞或DC细胞的成熟或分化的量。因此，在一个实施方案中，所述一种或多种T细胞可以与AKT抑制剂接触，例如3-[1-[[4-(7-苯基-3H-咪唑并[4,5-g]喹喔啉-6-基)苯基]甲基]哌啶-4-基]-1H-苯并咪唑-2-酮，其浓度为至少约1nM，至少约10nM，至少约50nM，至少约100nM，至少约200nM，至少约300nM，在至少约400nM，至少约500nM，至少约1μM，至少约2μM，至少约3μM，至少约4μM，至少约5μM，至少约6μM，至少约7μM，至少约8μM，至少约9μM，至少约10μM，至少约11μM，至少约12μM，至少约13μM，至少约14μM，至少约15μM，至少约16μM，至少约17μM，至少约18μM，至少约19μM，至少约20μM，至少约25μM，至少约30μM，至少约35μM，至少约35μM，至少约40μM，至少约45μM，至少约50μM，至少约60μM，至少约70μM，至少约80μM，至少约90μM，至少约100μM，至少约200μM，至少约300μM，至少约400μM，至少约500μM或至少约1mM。在另一个实施方案中，所述一种或多种T细胞可以与AKT抑制剂接触，例如3-[1-[[4-(7-苯基-3H-咪唑并[4,5-g]喹喔啉-6-基)苯基]甲基]哌啶-4-基]-1H-苯并咪唑-2-酮，其浓度为约1nM至约1mM，约10nM至约1mM，约100nM至约1mM，约1μM至约1mM，来自约10μM至约1mM，约100μM至约1mM，约1nM至约100μM，约1nM至约10μM，约1nM至约1μM，约1nM至约100nM，约1nM至约50nM，约100nM至约100μM，约500nM至约50μM，约1μM至约50μM，约1μM至约10μM或约5μM至约10μM。
根据目前的方法可以实现任何AKT活性的降低。例如，AKT活性可以被AKT抑制剂降低或抑制至少约5％，至少约10％，至少约15％，至少约20％，至少约25％，至少约30％，至少约35％，至少约40％，至少约45％，至少约50％，至少约55％，至少约60％，至少约65％，至少约70％，至少约75％，至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约99％或约100％。
外源IL-7和外源IL-15
白介素-7(IL-7)是促进淋巴细胞稳态的细胞因子，是T细胞发育所必需的。内源IL-7由胸腺和骨髓中的上皮细胞产生，其受体IL-7受体α(IL-7R-α)由T细胞亚群表达，包括初始T细胞和TCM细胞。IL-7信号传导发生各种酪氨酸激酶，包括转录(Jak/STAT)途径Janus激酶/信号转导因子和激活因子，PI3K和Src家族酪氨酸激酶。
任何外源IL-7均可用于本文所述的方法中。在一些实施方案中，外源IL-7是人IL-7。在一些实施方案中，外源IL-7是野生型IL-7。在其他实施方案中，外源IL-7是重组IL-7。IL-7可以通过本领域已知的任何方法来生产和获得，包括但不限于来自一个或多个IL-7产生细胞的分离的IL-7或获得商业上可获得的IL-7。
可以在本文所述的方法中使用任何浓度的IL-7。例如，本方法可以包括使一种或多种T细胞与至少约0.001ng/ml IL-7，至少约0.005ng/ml IL-7，至少约0.01ng/ml IL-7，至少约0.05ng/ml IL-7，至少约0.1ng/ml IL-7，至少约0.5ng/ml IL-7，至少约1.0ng/mlIL-7，至少约1ng/ml IL-7，至少约2ng/ml IL-7，至少约3ng/ml IL-7，至少约4ng/ml IL-7，至少约5ng/ml IL-7，至少约6ng/ml IL-7，至少约7ng/ml IL-7，至少约8ng/ml IL-7，至少约9ng/ml IL-7，至少约10ng/ml IL-7，至少约11ng/ml IL-7，至少约12ng/ml IL-7，至少约13ng/ml IL-7，至少约14ng/ml IL-7，至少约15ng/ml IL-7，至少约20ng/ml IL-7，至少约25ng/ml IL-7，至少约30ng/ml IL-7，至少约35ng/ml IL-7，至少约40ng/ml IL-7，至少约45ng/ml IL-7，至少约50ng/ml IL-7，至少约100ng/ml IL-7，至少约200ng/ml IL-7，至少约300ng/ml IL-7，至少约400ng/ml IL-7，至少约500ng/ml IL-7或至少约1000ng/ml IL-7。在一个实施方案中，一种或多种T细胞与约0.001至约500ng/ml IL-7，约0.01至约100ng/ml IL-7，约0.1至约50ng/ml IL-7，约1至约10ng/ml IL-7，约1至约5ng/ml IL-7，约5至约10ng/ml IL-7，约3至约7ng/ml IL-7或约4至约6ng/ml IL-7接触。在一个具体实施方案中，使一种或多种T细胞与约5ng/ml IL-7接触。
白介素-15(IL-15)是促进T细胞增殖的细胞因子。它由单核/巨噬细胞谱系，血源性树突细胞，骨髓基质细胞和胸腺上皮细胞的成员表达。IL-15通过其受体(IL-15受体)信号传导以例如激活Jak/STAT途径，刺激Ras/Raf/MAPK途径，并激活NF-κB。
任何外源IL-15可以用于本文所述的方法中。在一些实施方案中，外源IL-15是人IL-15。在一些实施方案中，外源IL-15是野生型IL-15。在其他实施方案中，外源IL-15是重组IL-15。IL-15可以通过本领域已知的任何方法生产和获得，包括但不限于来自一个或多个产生IL-15的细胞的分离的IL-15或获得商业上可获得的IL-15。
可以在本文所述的方法中使用任何浓度的IL-15。例如，本方法可以包括使一种或多种T细胞与至少约0.001ng/ml IL-15，至少约0.005ng/ml IL-15，至少约0.01ng/ml IL-15，至少约0.05ng/ml IL-15，至少约0.1ng/ml IL-15，至少约0.5ng/ml IL-15，至少约1.0ng/ml IL-15，至少约1ng/ml IL-15，至少约2ng/ml IL-15，至少约3ng/ml IL-15，至少约4ng/ml IL-15，至少约5ng/ml IL-15，至少约5ng/ml IL-15，至少约6ng/ml IL-15，至少约7ng/ml IL-15，至少约8ng/ml IL-15，至少约9ng/ml IL-15，至少约10ng/ml IL-15，至少约11ng/ml IL-15，至少约12ng/ml IL-15，至少约13ng/ml IL-15，至少约14ng/ml IL-15，至少约15ng/ml IL-15，至少约20ng/ml IL-15，至少约25ng/ml IL-15，至少约30ng/ml IL-15，至少约35ng/ml IL-15，至少约40ng/ml IL-15，至少约45ng/ml IL-15，至少约50ng/mlIL-15，至少约100ng/ml IL-15，至少约200ng/ml IL-15，至少约300ng/ml IL-15，至少约400ng/ml IL-15，至少约500ng/ml IL-15，或至少约1000ng/ml IL-15。在一个实施方案中，一种或多种T细胞与约0.001至约500ng/ml IL-15，约0.01至约100ng/ml IL-15，约0.1至约50ng/ml IL-15，约1至约10ng/ml IL-15，约1至约5ng/ml IL-15，约5至约10ng/ml IL-15，约3至约7ng/ml IL-15或约4至约6ng/ml IL-15接触。在一个具体实施方案中，使一种或多种T细胞与约5ng/ml IL-15接触。
在一些实施方案中，使一种或多种T细胞与外源IL-7而不是外源IL-15接触。在其他实施方案中，使一种或多种T细胞与外源IL-15而非外源IL-7接触。在其他实施方案中，使所述一种或多种T细胞与外源IL-7和外源IL-15两者接触。当一种或多种T细胞与外源IL-7和外源IL-15都接触时，可以使一种或多种T细胞与相等或不同浓度的外源IL-7和外源IL-15接触。在某些实施方案中，使一种或多种T细胞与等量浓度的外源IL-7和外源IL-15接触。在其他实施方案中，使一种或多种T细胞与不同浓度的外源IL-7和外源IL-15接触。在一个实施方案中，使一种或多种T细胞与比外源IL-15浓度高的外源IL-7接触。在另一个实施方案中，使一种或多种T细胞与比外源IL-15浓度低的外源IL-7接触。在一个具体实施方案中，使一种或多种T细胞与约5ng/ml的外源IL-7和约5ng/ml的外源IL-15接触。
此外，可以使一种或多种T细胞同一时间例如同时或在不同的时间例如顺序地与外源IL-7和外源IL-15接触。在一些实施方案中，在使一种或多种T细胞外源IL-15之前与外源IL-7接触。在其他实施方案中，使一种或多种T细胞在外源IL-7之前与外源IL-15接触。在一些实施方案中，使一种或多种T细胞同时与外源IL-7和外源IL-15接触。
T细胞
本文所述的一种或多种T细胞可以从任何来源获得，包括例如人供体。供体可以是需要抗癌治疗的受试者，例如用本文所述的方法产生的一种T细胞(即自体供体)治疗的受试者，或者可以是捐献淋巴细胞样品的个体，所述淋巴细胞样品一旦产生由本文所述方法产生的细胞群将用于治疗不同的个体或癌症患者(即同种异体供体)。可以通过本领域使用的任何合适的方法从供体获得淋巴细胞群。例如，可以通过任何合适的体外方法，静脉穿刺或其他血液采集方法获得淋巴细胞群，通过该方法获得血液和/或淋巴细胞样品。在一个实施方案中，淋巴细胞群通过血液成分分离获得。可从包含一种或多种T细胞的任何组织收集一种或多种T细胞，所述组织包括但不限于肿瘤。在一些实施方案中，从受试者收集肿瘤或其一部分，并从肿瘤组织分离一种或多种T细胞。任何T细胞都可用于本文公开的方法中，包括适用于T细胞疗法的任何T细胞。例如，可用于本发明的一种或多种细胞可选自肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，细胞毒T细胞，CAR T细胞，工程化TCR T细胞，自然杀伤T细胞，树突细胞和外周血液淋巴细胞。在一个具体实施方案中，T细胞是肿瘤浸润性白细胞。在某些实施方案中，一种或多种T细胞表达CD8，例如是CD8+T细胞。在其他实施方案中，一种或多种T细胞表达CD4，例如CD4+T细胞。
本文所述的方法可用于通过使来自供体的一种或多种T细胞与外源IL-7和外源IL-15中的至少一种和AKT抑制剂接触来体外延缓或抑制T细胞成熟或分化。发明人已经发现用AKT抑制剂和IL-7和/或IL-15处理一种或多种T细胞会体外增加初始和未成熟T细胞的浓度。特别地，在处理之后，一种或多种T细胞可以表达一种或多种指示未分化或未成熟T细胞的基因。指示未分化或未成熟T细胞的一个或多个基因可选自CD8，CD45RA，CCR7，CD45RO，CD62L，CD28，CD95，IL-7Rα，CXCR4，TCF7，FOXO1，ID3，BCL6及其任何组合。例如，使一种或多种T细胞与AKT抑制剂和IL-7和/或IL-15接触能够导致表达一种或多种指示未分化或未成熟T细胞的选自CD8，CD45RA，CCR7及其任何组合的基因的细胞百分比增加。
在其他实施方案中，一种或多种T细胞在与AKT抑制剂和外源IL-7和/或外源IL-15接触后表达CCR7和CD45RO。在一个具体实施方案中，与接触外源IL-7和外源IL-15中的至少一种和AKT抑制剂之前相比，更高百分比的一种或多种T细胞表达CCR7和CD45RO。在另一个实施方案中，所述一种或多种T细胞在与AKT抑制剂和外源IL-7和/或外源IL-15接触后表达CCR7和CD45RA。在一个具体实施方案中，与接触外源IL-7和外源IL-15中的至少一种和AKT抑制剂之前相比，更高百分比的一种或多种T细胞表达CCR7和CD45RA。在另一个实施方案中，与不与AKT抑制剂和外源IL-7和/或外源IL-15接触的T细胞的CCR7、CD45RO和CD45RA的表达相比，在与AKT抑制剂和外源IL-7和/或外源IL-15接触后，T细胞表现出CCR7，CD45RO，CD45RA或其任何组合的表达增加。
在其他实施方案中，一种或多种T细胞在与AKT抑制剂和外源IL-7和/或外源IL-15接触后表达CD62L、CD28或两者。在一个具体实施方案中，与接触外源IL-7和外源IL-15中的至少一种和AKT抑制剂之前相比，更高百分比的一种或多种T细胞表达CD62L、CD28或两者。在另一个实施方案中，与不与AKT抑制剂和外源IL-7和/或外源IL-15接触的T细胞的CD62L和CD28的表达相比，一种或多种T细胞在与AKT抑制剂和外源IL-7和/或外源IL-15接触后表现出CD62L、CD28或两者的表达增加。
在一个具体实施方案中，与不与AKT抑制剂和外源IL-7和/或外源IL-15接触的T细胞的CD95，IL-7受体α(IL-7Rα)，CXCR4，TCF7，FOXO1，ID3，BCL6，CD62L和CD45RA的表达相比，在与AKT抑制剂和外源IL-7、外源IL-15或两者接触后，T细胞表现出增加的CD95，IL-7受体α(IL-7Rα)，CXCR4，TCF7，FOXO1，ID3，BCL6，CD62L，CD45RA或其任何组合的表达。
T细胞疗法
本发明提供用于T细胞疗法的体外调节(例如延缓或抑制)T细胞成熟或分化的方法，其包括将来自需要T细胞疗法的受试者的一种或多种T细胞与(i)外源白介素-7(IL-7)和外源白介素-15(IL-15)中的至少一种和AKT抑制剂接触，其中所得到的T细胞表现出延缓的成熟或分化。在一些实施方案中，该方法进一步包括将该一种或多种T细胞施用于有需要的受试者。本领域技术人员将理解，通过本文所述方法产生的一种或多种T细胞可用于任何治疗患者的方法，包括对患者施用一种或多种T细胞。
例如但不限于，本文所述的方法可以增强T细胞疗法的有效性，所述T细胞疗法可以是选自肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)免疫疗法，自体细胞疗法，工程化自体细胞疗法(eACTTM)，同种异体T细胞移植，非T细胞移植及其任何组合。过继性T细胞疗法广泛地包括任何体外选择、富集和向患者施用识别并能够结合肿瘤细胞的自体或同种异体T细胞的方法。TIL免疫疗法是一种过继性T细胞疗法，其中分离能够浸润肿瘤组织的淋巴细胞，体外富集并施用于患者。TIL细胞可以是自体的或同种异体的。自体细胞疗法是一种过继性T细胞疗法，其包括从患者分离能够靶向肿瘤细胞的T细胞，体外富集T细胞，并将T细胞施用回同一患者。同种异体T细胞移植可以包括移植离体扩增天然存在的T细胞或遗传工程T细胞。如上面更详细描述的，工程化自体细胞疗法是一种过继性T细胞疗法，其中分离患者自身的淋巴细胞，遗传修饰以表达肿瘤靶向分子，体外扩增并且施用回该患者。非T细胞移植可以包括使用非T细胞例如但不限于自然杀伤(NK)细胞的自体或同种异体疗法。
在一个具体实施方案中，本发明的T细胞疗法是工程化自体细胞疗法(eACTTM)。根据该实施方案，该方法可以包括从供体收集血细胞。然后可使分离的血细胞(例如T细胞)与外源IL-7和外源IL-15中的一种或多种和AKT抑制剂接触。然后可以将T细胞工程化以表达嵌合抗原受体(“工程CAR T细胞”)或T细胞受体(“工程化TCR T细胞”)。在一个具体实施方案中，将与外源IL-7和外源IL-15中的一种或多种和AKT抑制剂接触的工程CAR T细胞或工程化TCR T细胞施用于受试者。在一些实施方案中，工程化T细胞治疗受试者中的肿瘤。
在一些实施方案中，用包含编码细胞表面受体的异源基因的逆转录病毒转导所述一种或多种T细胞。在一个具体实施方案中，细胞表面受体能够结合靶细胞表面上例如肿瘤细胞的表面上的抗原。在一些实施方案中，细胞表面受体是嵌合抗原受体或T细胞受体。
在一个实施方案中，一种或多种T细胞可以被工程化以表达嵌合抗原受体。嵌合抗原受体可以包含针对肿瘤抗原的结合分子。结合分子可以是抗体或其抗原结合分子。例如，抗原结合分子可以选自scFv，Fab，Fab'，Fv，F(ab')2和dAb及其任何片段或其组合。
嵌合抗原受体可以进一步包含铰链区。铰链区可以来源于IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA，IgD，IgE，IgM，CD28或CD8α的铰链区。在一个具体实施方案中，铰链区来源于IgG4的铰链区。
嵌合抗原受体还可以包含跨膜结构域。跨膜结构域可以是任何跨膜分子的跨膜结构域，其是免疫细胞上的共受体或免疫球蛋白超家族成员的跨膜结构域。在某些实施方案中，跨膜结构域来源于CD28，CD28T，CD8α，CD4或CD19的跨膜结构域。在一个具体实施方案中，跨膜结构域包含源自CD28跨膜结构域的结构域。在另一个实施方案中，跨膜结构域包含源自CD28T跨膜结构域的结构域。
嵌合抗原受体还可以包含一个或多个共刺激信号传导区。例如，共刺激信号传导区可以是CD28，CD28T，OX-40,41BB，CD27，诱导型T细胞共刺激物(ICOS)，CD3γ，CD3δ，CD3ε，CD247，Igα(CD79a)，或Fcγ受体。在一个具体实施方案中，共刺激信号传导区是CD28信号传导区。在另一个实施方案中，共刺激信号传导区是CD28T信号传导区。
在一个实施方案中，嵌合抗原受体还包含CD3ζ信号传导结构域。
可以将嵌合抗原受体工程化以靶向特定的肿瘤抗原。在一些实施方案中，肿瘤抗原选自707-AP(707丙氨酸脯氨酸)、AFP(甲胎蛋白)、ART-4(T4细胞识别的腺癌抗原)、BAGE(B抗原；b-联蛋白/m、b-联蛋白/突变)、BCMA(B细胞成熟抗原)、Bcr-abl(断裂点簇区-Abelson)、CAIX(碳酸酐酶IX)、CD19(分化群19)、CD20(分化群20)、CD22(分化群22)、CD30(分化群30)、CD33(分化群33)、CD44v7/8(分化群44、外显子7/8)、CAMEL(CTL识别的黑素瘤抗原)、CAP-1(癌胚抗原肽-1)、CASP-8(胱天蛋白酶-8)、CDC27m(细胞分裂周期27突变)、CDK4/m(周期蛋白依赖性激酶4突变)、CEA(癌胚抗原)、CT(癌/睾丸(抗原))、Cyp-B(亲环蛋白B)、DAM(分化抗原黑素瘤)、EGFR(表皮生长因子受体)、EGFRvIII(表皮生长因子受体，变体III)、EGP-2(上皮糖蛋白2)、EGP-40(上皮糖蛋白40)、Erbb2、3、4(成红细胞白血病病毒癌基因同系物-2、-3、4)、ELF2M(延伸因子2突变)、ETV6-AML1(Ets变异体基因6/急性髓细胞白血病1基因ETS)、FBP(叶酸结合蛋白)、fAchR(胎儿乙酰胆碱受体)、G250(糖蛋白250)、GAGE(G抗原)、GD2(双唾液酸神经节苷脂2)、GD3(双唾液酸神经节苷脂3)、GnT-V(N-乙酰葡糖胺转移酶V)、GP100(糖蛋白100kD)、HAGE(hel icose抗原)、HER-2/neu(人表皮受体2/神经；也称为EGFR2)、HLA-A(人白细胞抗原-A)HPV(人乳头瘤病毒)、HSP70-2M(热休克蛋白70-2突变)、HST-2(人印戒瘤肿瘤-2)、hTERT或hTRT(人端粒酶逆转录酶)、iCE(肠羧基酯酶)、IL-13R-a2(白介素-13受体亚单位α-2)、KIAA0205、KDR(激酶插入结构域受体)、κ-轻链、LAGE(L抗原)、LDLR/FUT(低密度脂质受体/GDP-L-岩藻糖：b-D-半乳糖苷酶2-a-岩藻糖基转移酶)、LeY(Lewis-Y抗体)、L1CAM(L1细胞粘附分子)、MAGE(黑素瘤抗原)、MAGE-A1(黑素瘤相关抗原1)、MAGE-A3、MAGE-A6、间皮素、感染鼠CMV的细胞、MART-1/Melan-A(T细胞识别的黑素瘤抗原-1/黑素瘤抗原A)、MC1R(促黑素1受体)、肌球蛋白/m(肌球蛋白突变)、MUC1(粘蛋白1)、MUM-1、-2、-3(黑素瘤泛在突变1、2、3)、NA88-A(患者M88的NA cDNA克隆)、NKG2D(自然杀伤组2、成员D)配体、NY-BR-1(纽约乳房分化抗原1)、NY-ESO-1(纽约食管鳞状细胞癌-1)、癌胎儿抗原(h5T4)、P15(蛋白15)、p190轻微bcr-abl(190KD bcr-abl蛋白)、Pml/RARα(早幼粒细胞白血病/视黄酸受体a)、PRAME(优先表达的黑素瘤抗原)、PSA(前列腺特异性抗原)、PSCA(前列腺干细胞抗原)、PSMA(前列腺特异性膜抗原)、RAGE(肾抗原)、RU1或RU2(肾泛在1或2)、SAGE(肉瘤抗原)、SART-1或SART-3(鳞状抗原拒绝肿瘤1或3)、SSX1、-2、-3、4(滑膜肉瘤X1、-2、-3、-4)、TAA(肿瘤相关抗原)、TAG-72(肿瘤相关糖蛋白72)、TEL/AML1(易位Ets家族白血病/急性骨髓性白血病1)、TPI/m(磷酸丙糖异构酶突变)、TRP-1(酪氨酸酶相关蛋白1或gp75)、TRP-2(酪氨酸酶相关蛋白2)、TRP-2/INT2(TRP-2/内含子2)、VEGF-R2(血管内皮生长因子受体2)、WT1(肾母细胞瘤基因)及其任何组合。在一个具体实施方案中，肿瘤抗原是CD19。
在另一个实施方案中，T细胞疗法包括向患者施用表达T细胞受体的工程化T细胞(“工程化TCR T细胞”)。T细胞受体(TCR)可以包含针对肿瘤抗原的结合分子。在一些实施方案中，肿瘤抗原选自由707-AP，AFP，ART-4，BAGE，BCMA，Bcr-abl，CAIX，CD19，CD20，CD22，CD30，CD33，CD44v7/8，CAMEL，CAP-1，CASP-8，CDC27m，CDK4/m，CEA，CT，Cyp-B，DAM，EGFR，EGFRvIII，EGP-2，EGP-40，Erbb2、3、4，ELF2M，ETV6-AML1，FBP，fAchR，G250，GAGE，GD2，GD3，GnT-V，Gp100，HAGE，HER-2/neu，HLA-A，HPV，HSP70-2M，HST-2，hTERT或hTRT，iCE，IL-13R-a2，KIAA0205，KDR，κ-轻链，LAGE，LDLR/FUT，LeY，L1CAM，MAGE，MAGE-A1，间皮素，感染鼠CMV的细胞，MART-1/Melan-A，MC1R，肌球蛋白/m，MUC1，MUM-1、-2、-3，NA88-A，NKG2D配体，NY-BR-1，NY-ESO-1，癌胎儿抗原，P15，p190轻微bcr-abl，Pml/RARa，PRAME，PSA，PSCA，PSMA，RAGE，RU1或RU2，SAGE，SART-1或SART-3，SSX1,2，-3,4，TAA，TAG-72，TEL/AML1，TPI/m，TRP-1，TRP-2，TRP-2/INT2，VEGF-R2，WT1及其任何组合组成的组。
在一个实施方案中，TCR包含与病毒癌基因结合的分子。在一个具体实施方案中，病毒癌基因选自人乳头瘤病毒(HPV)，EB病毒(EBV)和人T淋巴细胞病毒(HTLV)。
在又一个实施方案中，TCR包含与睾丸、胎盘或胎儿肿瘤抗原结合的分子。在一个具体实施方案中，睾丸、胎盘或胎儿肿瘤抗原选自由NY-ESO-1、滑膜肉瘤X断裂点2(SSX2)，黑素瘤抗原(MAGE)及其任何组合组成的组。
在另一个实施方案中，TCR包含与谱系特异性抗原结合的分子。在一个具体实施方案中，谱系特异性抗原选自由T细胞1(MART-1)，gp100，前列腺特异性抗原(PSA)，前列腺特异性膜抗原(PSMA)，前列腺干细胞抗原(PSCA)及其任何组合组成的组。
在一个实施方案中，T细胞疗法包括向患者施用表达与CD19结合的嵌合抗原受体的工程化CAR T细胞，并进一步包含CD28共刺激结构域和CD3-ζ信号传导区。在一个具体实施方案中，T细胞疗法包括对患者施用KTE-C19。
在一个实施方案中，抗原部分还包括但不限于EB病毒(EBV)抗原(例如EBNA-1，EBNA-2，EBNA-3，LMP-1，LMP-2)，甲型肝炎病毒抗原(例如VP1，VP2，VP3)，乙型肝炎病毒抗原(例如HBsAg，HBcAg，HBeAg)，丙型肝炎病毒抗原(例如包膜糖蛋白E1和E2)，单纯疱疹病毒1型，2型或8型(HSV1，HSV2或HSV8)病毒抗原(例如糖蛋白gB，gC，gC，gE，gG，gH，gI，gJ，gK，gL.gM，UL20，UL32，US43，UL45，UL49A)，巨细胞病毒(CMV)病毒抗原(例如糖蛋白gB，gC，gC，gE，gG，gH，gI，gJ，gK，gL.gM或其他包膜蛋白)，人免疫缺陷病毒(HIV)病毒抗原(糖蛋白gp120，gp41或p24)，流感病毒抗原(例如血凝素(HA)或神经氨酸酶(NA))，麻疹或腮腺炎病毒抗原，人乳头瘤病毒(HPV)病毒抗原(例如L1，L2)，副流感病毒病毒抗原，风疹病毒病毒抗原，呼吸道合胞病毒(RSV)病毒抗原或水痘-带状疱疹病毒病毒抗原。在这样的实施方案中，细胞表面受体可以是识别靶病毒感染细胞上任何上述病毒抗原的任何TCR或任何CAR。
在其他实施方案中，抗原部分与具有免疫或炎症功能障碍的细胞相关。这样的抗原部分可以包括但不限于髓磷脂碱性蛋白(MBP)髓磷脂蛋白脂质蛋白(PLP)，髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(MOG)，癌胚抗原(CEA)，原胰岛素(pro-insulin)，谷氨酰胺脱羧酶(GAD65，GAD67)，热休克蛋白(HSP)或参与或与致病性自身免疫过程相关的任何其他组织特异性抗原。
本文公开的方法可以涉及包含将一种或多种T细胞转移至患者的T细胞疗法。T细胞可以以治疗有效量施用。例如，治疗有效量的T细胞，例如工程化CAR+T细胞或工程化TCR+T细胞，可以是至少约104个细胞，至少约105个细胞，至少约106个细胞，至少约107个细胞，至少约108个细胞，至少约109个，或至少约1010个。在另一个实施方案中，治疗有效量的T细胞，例如工程化CAR+T细胞或工程化TCR+T细胞为约104个细胞，约105个细胞，约106个细胞，约107个细胞，或约108个细胞。在一个具体实施方案中，T细胞(例如工程化CAR+T细胞或工程化TCR+T细胞)的治疗有效量为约2×106个细胞/kg，约3×106个细胞/kg，约4×106个细胞/kg，约5×106个细胞/kg，约6×106个细胞/kg，约7×106个细胞/kg，约8×106个细胞/kg，约9×106个细胞/kg，约1×107个细胞/kg，约2×107个细胞/kg，约3×107个细胞/kg，约4×107个细胞/kg，约5×107个细胞/kg，约6×107个细胞/kg，约7×107个细胞/kg，约8×107个细胞/kg或约9×107个细胞/kg。
在一些实施方案中，在施用T细胞疗法之前对患者进行预调理。可以根据本领域已知的任何方法对患者进行预调理，包括但不限于用一种或多种化疗药物和/或放疗进行治疗。在一些实施方案中，预调理可以包括减少内源性淋巴细胞数量，去除细胞因子汇(sink)，增加一种或多种体内稳态细胞因子或促炎因子的血清水平，增强调理后施用的T细胞的效应功能，在T细胞疗法之前增强抗原呈递细胞激活和/或可用性或其任何组合的任何治疗。在一个实施方案中，预调理包括增加受试者中一种或多种细胞因子的血清水平。
癌症治疗
本发明的方法可用于治疗受试者中的癌症，减小肿瘤的大小，杀死肿瘤细胞，防止肿瘤细胞增殖，防止肿瘤生长，消除患者的肿瘤，防止肿瘤复发，防止肿瘤转移，诱导患者缓解或其任何组合。在某些实施方案中，该方法诱导完全应答。在其他实施方案中，该方法诱导部分应答。
一个实施方案，本发明涉及治疗需要T细胞疗法的受试者中的肿瘤的方法，其包括向受试者施用一种或多种T细胞，其中所述一种或多种T细胞已经与(i)AKT抑制剂和(ii)外源IL-7和/或外源IL-15接触。在另一个实施方案中，本发明涉及在需要T细胞疗法的受试者中减少或减小肿瘤尺寸或抑制肿瘤生长的方法，其包括向受试者施用一种或多种T细胞，其中一种或更多T细胞已与(i)AKT抑制剂和(ii)外源IL-7和/或外源IL-15接触。在某些实施方案中，一种或多种T细胞尚未与外源IL-2接触。
可以治疗的癌症包括没有血管化、尚未实质血管化或已血管化的肿瘤。癌症还可以包括实体瘤或非实体瘤。在某些实施方案中，癌症可以选自源自以下的肿瘤：急性淋巴细胞白血病(ALL)，急性髓性白血病(AML)，腺样囊性癌，肾上腺皮质癌，癌症，AIDS相关癌症，肛门癌，阑尾癌，星形细胞瘤，非典型畸胎样/横纹肌瘤，中枢神经系统，B细胞白血病，淋巴瘤或其他B细胞恶性肿瘤，基底细胞癌，胆管癌，膀胱癌，骨癌，骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤，脑干胶质瘤，脑肿瘤，乳腺癌，支气管肿瘤，伯基特淋巴瘤，类癌瘤，中枢神经系统癌症，宫颈癌，脊索瘤，慢性淋巴细胞白血病(CLL)，慢性髓细胞白血病(CML)，慢性骨髓增殖性疾病，结肠癌，结直肠癌，颅咽管瘤，皮肤t细胞淋巴瘤，胚胎性肿瘤，中枢神经系统，子宫内膜癌，室管膜母细胞瘤，室管膜瘤，食道癌，嗅神经母细胞瘤，肿瘤颅外生殖细胞肿瘤的尤因肉瘤家族，性腺外生殖细胞肿瘤肝外胆管癌，眼癌骨纤维组织细胞瘤，恶性和骨肉瘤，胆囊癌，胃癌，胃肠类癌肿瘤，胃肠道基质瘤(GIST)，软组织肉瘤，生殖细胞瘤，妊娠滋养细胞肿瘤，神经胶质瘤，毛细胞白血病，头颈癌，心脏癌，肝细胞(肝)癌，组织细胞增多症，霍奇金淋巴瘤，下咽癌，眼内黑素瘤，胰岛细胞瘤(内分泌胰腺)，卡波西肉瘤，肾癌，朗格汉斯细胞组织细胞增多症，喉癌，白血病，唇和口腔癌，肝癌(原发性)，小叶原位癌(LCIS)，肺癌，淋巴瘤，巨球蛋白血症，男性乳腺癌，骨恶性纤维组织细胞瘤和骨肉瘤，成神经管细胞瘤，髓上皮瘤，黑素瘤，merkel细胞癌，间皮瘤，涉及NUT基因具有隐匿性原发中线道癌的转移性鳞状颈癌，口腔癌，多发性内分泌肿瘤综合征，多发性骨髓瘤/浆细胞瘤，蕈样霉菌病，骨髓增生异常综合征，骨髓增生异常/骨髓增殖性肿瘤，慢性骨髓性白血病(CML)，急性骨髓性白血病(AML)，骨髓瘤，多发性骨髓增殖性疾病，鼻腔和鼻旁窦癌，鼻咽癌，神经母细胞瘤，非霍奇金淋巴瘤，非小细胞肺癌，口癌，口腔癌，口咽癌，骨肉瘤和骨恶性纤维组织细胞瘤，卵巢癌症，胰腺癌，乳头状瘤病，副神经节瘤，鼻旁窦和鼻腔癌，甲状旁腺癌，阴茎癌，咽癌，嗜铬细胞瘤，中间分化的松果体实质肿瘤，松果体细胞瘤和幕上原始神经外胚层肿瘤，垂体瘤，浆细胞瘤/多发性骨髓瘤，胸膜肺母细胞瘤，怀孕和乳腺癌，原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤，前列腺癌，直肠癌，肾细胞(肾)癌，肾盂和输尿管，移行细胞癌，视网膜母细胞瘤，横纹肌肉瘤，唾液腺癌，肉瘤，塞利综合征，小细胞肺癌，小肠癌，软组织肉瘤，鳞状细胞癌，鳞状颈癌，胃癌，幕上原始神经外胚层肿瘤，t细胞淋巴瘤，皮肤，睾丸癌，喉癌，胸腺瘤和胸腺癌，甲状腺癌，肾盂和输尿管的移行细胞癌，滋养细胞肿瘤，输尿管和肾盂癌，尿道癌，子宫癌，子宫肉瘤，阴道癌，外阴癌，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症，肾母细胞瘤。
在一个实施方案中，该方法可用于治疗肿瘤，其中肿瘤是淋巴瘤或白血病。淋巴瘤和白血病是特异性影响淋巴细胞的血液癌症。血液中的所有白细胞来源于骨髓中发现的单一类型的多能造血干细胞。这种干细胞产生髓样祖细胞和淋巴祖细胞，然后产生体内发现的各种类型的白细胞。来源于骨髓祖细胞的白细胞包括T淋巴细胞(T细胞)，B淋巴细胞(B细胞)，自然杀伤细胞和浆细胞。来自淋巴祖细胞的白细胞包括巨核细胞，肥大细胞，嗜碱性粒细胞，嗜中性粒细胞，嗜酸性粒细胞，单核细胞和巨噬细胞。淋巴瘤和白血病可影响患者的这些细胞类型中的一种或多种。
一般而言，淋巴瘤可分为至少两个亚组：霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。非霍奇金淋巴瘤(NHL)是一组起源于B淋巴细胞、T淋巴细胞或自然杀伤细胞的不同类型的癌症。在美国，B细胞淋巴瘤占报告病例的80-85％。据估计，2013年约有69,740例NHL新病例和超过19,000例死亡病例发生。非霍奇金淋巴瘤是最普遍的血液恶性肿瘤，是男性和女性中新癌症的第七个主要部位，占所有新癌症病例的4％，与癌症相关死亡的3％。
弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)是NHL最常见的亚型，约占NHL病例的30％。每年在美国大约有22,000个DLBCL新诊断。它被归类为侵袭性淋巴瘤，大多数患者常规化疗治愈(NCCN指南NHL 2014)。
DLBCL的一线治疗通常包括含利妥昔单抗的含蒽环类方案，如R-CHOP(利妥昔单抗，环磷酰胺，多柔比星，长春新碱和泼尼松)，其客观应答率约为80％，完全应答率约为50％(Coiffier 2002)，大约三分之一的患者在R-CHOP后有初始治疗或复发难治性疾病(Sehn 2005)。对于一线治疗后复发的患者，大约40-60％的患者可以通过额外的化疗获得第二次应答。符合条件的自体干细胞移植(ASCT)患者的二线治疗标准包括利妥昔单抗和联合化疗，如R-ICE(利妥昔单抗，异环磷酰胺，卡铂和依托泊苷)和R-DHAP(利妥昔单抗，地塞米松，阿糖胞苷，和顺铂)，每个患者的客观应答率约为63％，完全应答率约为26％(Gisselbrecht 2010)。对二线治疗作出应答并被认为适合移植的患者接受了大剂量化疗和ASCT的巩固治疗，约有一半的移植患者有疗效(Gisselbrecht 2010)。ASCT失败的患者预后很差，没有治愈选项。
与DLBCL相比，原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)具有独特的临床、病理和分子特征。PMBCL被认为是由胸腺(髓质)B细胞产生的，约占3％被诊断患有DLBCL的患者。在生命的第四个十年中，PMBCL通常在较年轻的成年人群中被发现，而女性略占优势。基因表达谱分析表明PMBCL中的去调节通路与霍奇金淋巴瘤重叠。PMBCL的初始治疗一般包括使用利妥昔单抗的含蒽环类方案，如输注剂量调整的依托泊苷，多柔比星和环磷酰胺与长春新碱，泼尼松和利妥昔单抗(DA-EPOCH-R)联用或不联用受累野放疗。
滤泡性淋巴瘤(FL)是一种B细胞淋巴瘤，是NHL中最常见的惰性(生长缓慢)形式，约占所有NHL的20％至30％。一些FL患者将组织学上转变为(TFL)DLBCL，其更具侵略性且与不良结果相关。对DLBCL的组织学转变以15年的年率大约3％发生，随后几年转化的风险继续下降。组织学转化的生物学机制尚不清楚。TFL的初始治疗受到先前滤泡淋巴瘤疗法的影响，但通常包括含有蒽环类药物的利妥昔单抗方案以消除疾病的侵袭性成分。
复发/难治性PMBCL和TFL的治疗方案与DLBCL中的相似。鉴于这些疾病的患病率低，尚未对这些患者人群进行大规模的前瞻性随机研究。化疗难治性疾病患者与难治性DLBCL患者的预后相似或更差。
总之，具有难治性侵袭性NHL(例如DLBCL、PMBCL和TFL)的受试者有重大未满足的医疗需求，并且在这些人群中需要进一步的研究以及新的治疗。
因此，在一些实施方案中，该方法可用于治疗淋巴瘤或白血病，其中淋巴瘤或白血病是B细胞恶性肿瘤。B细胞恶性肿瘤的例子包括但不限于非霍奇金淋巴瘤(NHL)，小淋巴细胞淋巴瘤(SLL/CLL)，套细胞淋巴瘤(MCL)，FL，边缘区淋巴瘤(MZL)，结外(MALT淋巴瘤)，淋巴结(单核细胞样B细胞淋巴瘤)，脾脏，弥漫性大细胞淋巴瘤，B细胞慢性淋巴细胞白血病/淋巴瘤，伯基特氏淋巴瘤和淋巴母细胞性淋巴瘤。在一些实施方案中，淋巴瘤或白血病选自B细胞慢性淋巴细胞性白血病/小细胞淋巴瘤，B细胞幼淋巴细胞性白血病，淋巴浆细胞性淋巴瘤(例如瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症)，脾边缘区淋巴瘤，毛细胞白血病，浆细胞瘤(例如浆细胞骨髓瘤(即多发性骨髓瘤)或浆细胞瘤)，结外边缘区B细胞淋巴瘤(例如MALT淋巴瘤)，结节边缘区B细胞淋巴瘤，滤泡性淋巴瘤(FL)，转化滤泡性淋巴瘤(TFL)，原发性皮肤滤泡中心淋巴瘤，套细胞淋巴瘤，弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)，EB病毒阳性DLBCL，淋巴瘤样肉芽肿病，原发性纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤(PMBCL)，血管内大B细胞淋巴瘤，ALK+大B细胞淋巴瘤，浆母细胞淋巴瘤，原发性渗出性淋巴瘤，HHV8相关的多中心Castleman病中产生的大B细胞淋巴瘤，伯基特淋巴瘤/白血病，T细胞幼淋巴瘤淋巴细胞白血病，T细胞大颗粒淋巴细胞白血病，侵袭性NK细胞白血病，成人T细胞白血病/淋巴瘤，结外NK/T细胞淋巴瘤，肠病相关T细胞淋巴瘤，肝脾T细胞淋巴瘤，母细胞NK细胞淋巴瘤，蕈样肉芽肿/塞利综合征，原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤，淋巴瘤样丘疹病，外周T细胞淋巴瘤，血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤，间变性大细胞淋巴瘤，B淋巴母细胞性白血病/淋巴瘤，具有复发遗传异常的B淋巴母细胞性白血病/淋巴瘤，T淋巴母细胞白血病/淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。在一些实施方案中，癌症对一种或多种在先治疗是难治的，和/或癌症在一种或多种在先治疗后已经复发。
在某些实施方案中，癌症选自滤泡性淋巴瘤，转化的滤泡性淋巴瘤，弥漫性大B细胞淋巴瘤和原发性纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤。在一个具体实施方案中，癌症是弥漫性大B细胞淋巴瘤。
在一些实施方案中，在化疗、放疗、免疫疗法(包括T细胞疗法和/或使用抗体或抗体-药物缀合物的疗法)，自体干细胞移植物，或其任何组合中的一种或多种之后癌症已经复发。在一个具体实施方案中，癌症是难治性弥漫性大B细胞淋巴瘤。
在一些实施方案中，通过向受试者施用一种或多种T细胞来治疗癌症，其中所述一种或多种T细胞已经与(i)AKT抑制剂和(ii)外源IL-7和/或外源IL-15接触。在某些实施方案中，在向受试者施用一种或多种T细胞之前，洗涤一种或多种T细胞，以除去AKT抑制剂，外源IL-7和/或外源IL-15。在一些实施方案中，一种或多种T细胞包含工程化CAR细胞或工程化TCR细胞。在一个实施方案中，工程化CAR细胞或工程化T细胞治疗受试者中的肿瘤。
试剂盒
本发明范围内还包括试剂盒，例如药物试剂盒，其包含用于体外接触一种或多种T细胞的外源IL-7和外源IL-15中的一种或多种和AKT抑制剂。试剂盒通常包含标记，其说明试剂盒内容的预期用途和使用说明。术语“标记”包括在试剂盒上或与试剂盒一起提供或者以其他方式随附试剂盒的任何书面材料或记录材料。
在一些实施方案中，本发明提供用于制备用于有需要的受试者的T细胞疗法的一种或多种T细胞的试剂盒，所述试剂盒包含：
(i)AKT抑制剂，
(ii)外源IL-7，和
(iii)使T细胞疗法中使用的一种或多种T细胞与AKT抑制剂和外源IL-7接触的说明。
在其他实施方案中，本发明提供用于制备用于有需要的受试者的T细胞疗法的一种或多种T细胞的试剂盒，所述试剂盒包含：
(i)AKT抑制剂，
(ii)外源IL-15，和
(iii)使T细胞疗法中使用的一种或多种T细胞与AKT抑制剂和外源IL-15接触的说明。
在其他实施方案中，本发明提供用于制备用于有需要的受试者的T细胞疗法的一种或多种T细胞的试剂盒，所述试剂盒包含：
(i)AKT抑制剂，
(ii)外源IL-7，
(iii)外源IL-15，和
(iii)使T细胞疗法中使用的一种或多种T细胞与AKT抑制剂和外源IL-7和/或外源IL-15接触的说明。
通过以下实施方案进一步说明本发明，这些实施方案不应被解释为进一步的限制。本申请通篇引用的所有参考文献的内容明确地通过引用并入本文。
以下实施例旨在说明本发明的各种实施方案。这样，所讨论的具体实施方案不应被解释为对本发明范围的限制。例如，尽管以下实施方案涉及用抗CD19嵌合抗原受体(CAR)转导的T细胞，但本领域技术人员将理解，本文所述的方法可适用于用任何CAR转导的T细胞。对于本领域技术人员显而易见的是，可以在不脱离本发明的范围的情况下完成各种等同、改变和修改，并且应该理解的是，这样的等同实施方案将被包括在本文中。此外，本公开内容中引用的所有参考文献都通过引用整体并入本文，如同在本文中完全阐述一样。
实施方案
E1.用于T细胞疗法的体外延缓或抑制T细胞成熟或分化的方法，包括将来自需要T细胞疗法的受试者的一种或多种T细胞与外源白介素-7(IL-7)和外源白介素-15(IL-15)中的至少一种和AKT抑制剂接触，其中所得到的T细胞表现出延缓的成熟或分化，和/或其中相对于在没有AKT抑制剂的情况下T细胞培养物的T细胞功能，所得到的T细胞表现出改善的T细胞功能。
E2.用于T细胞疗法的体外改善T细胞功能的方法，包括将来自需要T细胞疗法的受试者的一种或多种T细胞与外源白介素-7(IL-7)和外源白介素-15(IL-15)中的至少一种和AKT抑制剂接触，其中相对于在不存在AKT抑制剂的情况下培养的T细胞的T细胞功能，所得到的T细胞表现出改善的T细胞功能。
E3.E1或E2的方法，其中所述改善的T细胞功能选自由以下组成的组：
(i)增加的T细胞增殖；
(ii)增加的细胞因子产生；
(iii)增加的细胞溶解活性；和
(iv)(i)-(iii)的任何组合。
E4.用于在T细胞疗法之前体外增加T细胞增殖的方法，包括将来自需要T细胞疗法的受试者的一种或多种T细胞与外源白介素-7(IL-7)和外源白介素-15(IL-15)中的至少一种和AKT抑制剂接触，其中相对于在不存在AKT抑制剂的情况下培养的T细胞的T细胞增殖，所得到的T细胞表现出增加的T细胞增殖。
E5.在T细胞疗法之前体外增加T细胞细胞因子产生的方法，包括将来自需要T细胞疗法的受试者的一种或多种T细胞与外源白介素-7(IL-7)和外源白介素-15(IL-15)中的至少一种和AKT抑制剂接触，其中相对于在不存在AKT抑制剂的情况下培养的T细胞的细胞因子产生，所得到的T细胞表现出增加的细胞因子产生。
E6.E3或E5的方法，其中增加的细胞因子产生选自(i)增加的干扰素γ(IFNg)产生，(ii)增加的组织坏死因子α(TNFa)产生，和(iii)增加的IFNg和TNFa产生。
E7.用于T细胞疗法的体外增加T细胞溶解细胞活性的方法，包括将来自需要T细胞疗法的受试者的一种或多种T细胞与外源白介素-7(IL-7)和外源白介素-15(IL-15)中的至少一种和AKT抑制剂接触，其中相对于在不存在AKT抑制剂的情况下培养的T细胞的T细胞溶细胞活性，所得到的T细胞表现出增加的细胞溶解活性。
E8.用于T细胞疗法的体外延缓或抑制T细胞成熟或分化的方法，包括将来自需要T细胞疗法的受试者的一种或多种T细胞与外源白介素-7(IL-7)和外源白介素-15(IL-15)中的至少一种和AKT抑制剂接触，其中所得到的T细胞表现出延缓的成熟或分化。
E9.E1-E8中任一项的方法，其中所述接触包括在包含(i)AKT抑制剂和(ii)外源IL-7和/或外源IL-15的培养基中培养所述一种或多种T细胞。
E10.E1-E9中任一项的方法，其中所述一种或多种T细胞没有与外源白介素-2(IL-2)接触。
E11.E1-E10中任一项的方法，其中洗涤T细胞以去除AKT抑制剂、外源IL-7和/或外源IL-15。
E12.E1-E11中任一项的方法，其中所述AKT抑制剂选自A6730、B2311,124018、GSK2110183(afuresertib)、派立福新(KRX-0401)、GDC-0068(ipatasertib)、RX-0201、VQD-002、LY294002、A-443654、A-674563、Akti-1、Akti-2、Akti-1/2、AR-42、API-59CJ-OMe、ATI-13148、AZD-5363、芥酸磷酸胆碱、GSK-2141795(GSK795)、KP372-1、L-418、NL-71-101、PBI-05204、PIA5、PX-316、SR13668、曲西瑞宾、GSK 690693(CAS#937174-76-0)、FPA 124(CAS#902779-59-3)、米替福新、PHT-427(CAS#1 191951-57-1)、10-DEBC盐酸盐、Akt抑制剂III、Akt抑制剂VIII、MK-2206二盐酸盐(CAS#1032350-13-2)、SC79、AT7867(CAS#857531-00-1)、CCT128930(CAS#885499-61-6)、A-674563(CAS#552325-73-2)、AGL 2263、AS-041164(5-苯并[1,3]间二氧杂环戊烯-5-基亚甲基-噻唑烷-2,4-二酮)、BML-257(CAS#32387-96-5)、XL-418、CAS#612847-09-3、CAS#98510-80-6、H-89(CAS#127243-85-0)、OXY-1 1 1A、3-[1-[[4-(7-苯基-3H-咪唑并[4,5-g]喹喔啉-6-基)苯基]甲基]哌啶-4-基]-1H-苯并咪唑-2-酮及其任何组合。
E13.E1-E12中任一项的方法，其中所述AKT抑制剂包含选自以下的化合物：(i)3-[1-[[4-(7-苯基-3H-咪唑并[4,5-g]喹喔啉-6-基)苯基]甲基]哌啶-4-基]-1H-苯并咪唑-2-酮；(i i)N,N-二甲基-1-[4-(6-苯基-1H-咪唑并[4,5-g]喹喔啉-7-基)苯基]甲基-N胺；或(iii)1-{1-[4-(3-苯基苯甲酰基-[g]喹喔啉-2-基)苄基]哌啶-4-基}-1,3-二氢-2H-苯并咪唑-2-酮。
E14.E1-E13中任一项的方法，其中所述AKT抑制剂为选自以下的化合物：(i)3-[1-[[4-(7-苯基-3H-咪唑并[4,5-g]喹喔啉-6-基)苯基]甲基]哌啶-4-基]-1H-苯并咪唑-2-酮；(ii)N,N-二甲基-1-[4-(6-苯基-1H-咪唑并[4,5-g]喹喔啉-7-基)苯基]甲基-N胺；或(iii)1-{1-[4-(3-苯基苯甲酰基-[g]喹喔啉-2-基)苄基]哌啶-4-基}-1,3-二氢-2H-苯并咪唑-2-酮。
E15.E1-E14中任一项的方法，其中，所述AKT抑制剂为3-[1-[[4-(7-苯基-3H-咪唑并[4,5-g]喹喔啉-6-基)苯基]甲基]哌啶-4-基]-1H-苯并咪唑-2-酮。
E16.E15的方法，其中AKT抑制剂的量为约1nM至约1mM。
E17.E15的方法，其中所述AKT抑制剂处于选自以下的量：至少约1nM，至少约10nM，至少约50nM，至少约100nM，至少约200nM，至少约300nM，至少约400nM，至少约500nM，至少约1μM，至少约2μM，至少约3μM，至少约4μM，至少约5μM，至少约6μM，至少约7μM，至少约8μM，至少约9μM，至少约10μM，至少约11μM，至少约12μM，至少约13μM，至少约14μM，至少约15μM，至少约16μM，至少约17μM，至少约18μM，至少约19μM，至少约20μM，至少约25μM，至少约30μM，至少约35μM，至少约40μM，至少约45μM，至少约50μM，至少约60μM，至少约70μM，至少约80μM，至少约90μM，至少约100μM，至少约200μM，至少约300μM，至少约400μM，至少约500μM或至少约1mM。
E18.E15的方法，其中AKT抑制剂的量为约8μM。
E19.E1-E18中任一项的方法，其中外源IL-7的量为约0.001-约500ng/ml IL-7。
E20.E1-E18中任一项的方法，其中所述外源IL-7的量为约1至约10ng/ml IL-7。
E21.E1-E18中任一项的方法，其中所述外源IL-7的量为至少约5ng/ml IL-7。
E22.E1-E21中任一项的方法，其中外源IL-15的量为约0.001-约500ng/ml IL-15。
E23.E1-E21中任一项的方法，其中所述外源IL-15的量为约1至约10ng/ml IL-15。
E24.E1-E21中任一项的方法，其中所述外源IL-15的量为至少约5ng/ml IL-15。
E25.E1至E24中任一项的方法，其中所述一种或多种T细胞表达CD8。
E26.E25的方法，其中所述一种或多种T细胞选自由以下组成的组：肿瘤浸润淋巴细胞、细胞毒T细胞、CAR T细胞、工程化TCR T细胞、自然杀伤T细胞和外周血淋巴细胞。
E27.E1-E26中任一项的方法，其中所述一种或多种T细胞从需要抗癌治疗的受试者收集。
E28.E27的方法，其中从需要抗癌治疗的受试者的肿瘤中收集一种或多种T细胞。
E29.E20或E28的方法，其中所述一种或多种T细胞包含一种或多种肿瘤浸润性白细胞(TIL)。
E30.E1-E29中任一项的方法，其中T细胞是激活的。
E31.E30的方法，其中T细胞的激活处于封闭系统中。
E32.E31的方法，其中封闭系统包括封闭袋系统。
E33.E1-E32中任一项的方法，其中T细胞是扩增的。
E34.E32的方法，其中T细胞是体外扩增的。
E35.E32的方法，其中T细胞是体内扩增的。
E36.E1-E35中任一项的方法，其中使所述一种或多种T细胞与所述AKT抑制剂和所述外源IL-7和/或外源IL-15接触延长所述T细胞的体内持久性。
E37.E1-E36中任一项的方法，其中在使所述一种或多种T细胞与所述外源IL-7和外源IL-15中的至少一种和AKT抑制剂接触之后，所得到的T细胞表达一种或多种指示的未分化或未成熟的T细胞。
E38.E37的方法，其中指示未分化或未成熟T细胞的一个或多个基因选自CD8，CD45RA，CCR7及其任何组合。
E39.E1-E38中任一项的方法，还包括用逆转录病毒转导T细胞。
E40.E39的方法，其中逆转录病毒包含编码细胞表面受体的异源基因。
E41.E40的方法，其中细胞表面受体能够结合靶细胞表面上的抗原。
E42.E41的方法，其中靶细胞是肿瘤细胞。
E43.E41或E42的方法，其中细胞表面受体是T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)。
E44.E41至E43中任一项的方法，其中所述细胞表面受体能够结合抗原，所述抗原选自由以下组成的组：707-AP(707丙氨酸脯氨酸)、AFP(甲胎蛋白)、ART-4(T4细胞识别的腺癌抗原)、BAGE(B抗原；b-联蛋白/m、b-联蛋白/突变)、BCMA(B细胞成熟抗原)、Bcr-abl(断裂点簇区-Abelson)、CAIX(碳酸酐酶IX)、CD19(分化群19)、CD20(分化群20)、CD22(分化群22)、CD30(分化群30)、CD33(分化群33)、CD44v7/8(分化群44、外显子7/8)、CAMEL(CTL识别的黑素瘤抗原)、CAP-1(癌胚抗原肽-1)、CASP-8(胱天蛋白酶-8)、CDC27m(细胞分裂周期27突变)、CDK4/m(周期蛋白依赖性激酶4突变)、CEA(癌胚抗原)、CT(癌/睾丸(抗原))、Cyp-B(亲环蛋白B)、DAM(分化抗原黑素瘤)、EGFR(表皮生长因子受体)、EGFRvIII(表皮生长因子受体，变体III)、EGP-2(上皮糖蛋白2)、EGP-40(上皮糖蛋白40)、Erbb2、3、4(成红细胞白血病病毒癌基因同系物-2、-3、4)、ELF2M(延伸因子2突变)、ETV6-AML1(Ets变异体基因6/急性髓细胞白血病1基因ETS)、FBP(叶酸结合蛋白)、fAchR(胎儿乙酰胆碱受体)、G250(糖蛋白250)、GAGE(G抗原)、GD2(双唾液酸神经节苷脂2)、GD3(双唾液酸神经节苷脂3)、GnT-V(N-乙酰葡糖胺转移酶V)、GP100(糖蛋白100kD)、HAGE(helicose抗原)、HER-2/neu(人表皮受体2/神经；也称为EGFR2)、HLA-A(人白细胞抗原-A)HPV(人乳头瘤病毒)、HSP70-2M(热休克蛋白70-2突变)、HST-2(人印戒瘤肿瘤-2)、hTERT或hTRT(人端粒酶逆转录酶)、iCE(肠羧基酯酶)、IL-13R-a2(白介素-13受体亚单位α-2)、KIAA0205、KDR(激酶插入结构域受体)、κ-轻链、LAGE(L抗原)、LDLR/FUT(低密度脂质受体/GDP-L-岩藻糖：b-D-半乳糖苷酶2-a-岩藻糖基转移酶)、LeY(Lewis-Y抗体)、L1CAM(L1细胞粘附分子)、MAGE(黑素瘤抗原)、MAGE-A1(黑素瘤相关抗原1)、间皮素、感染鼠CMV的细胞、MART-1/Melan-A(T细胞识别的黑素瘤抗原-1/黑素瘤抗原A)、MC1R(促黑素1受体)、肌球蛋白/m(肌球蛋白突变)、MUC1(粘蛋白1)、MUM-1、-2、-3(黑素瘤泛在突变1、2、3)、NA88-A(患者M88的NA cDNA克隆)、NKG2D(自然杀伤组2、成员D)配体、NY-BR-1(纽约乳房分化抗原1)、NY-ESO-1(纽约食管鳞状细胞癌-1)、癌胎儿抗原(h5T4)、P15(蛋白15)、p190轻微bcr-abl(190KD bcr-abl蛋白)、Pml/RARα(早幼粒细胞白血病/视黄酸受体a)、PRAME(优先表达的黑素瘤抗原)、PSA(前列腺特异性抗原)、PSCA(前列腺干细胞抗原)、PSMA(前列腺特异性膜抗原)、RAGE(肾抗原)、RU1或RU2(肾泛在1或2)、SAGE(肉瘤抗原)、SART-1或SART-3(鳞状抗原拒绝肿瘤1或3)、SSX1、-2、-3、4(滑膜肉瘤X1、-2、-3、-4)、TAA(肿瘤相关抗原)、TAG-72(肿瘤相关糖蛋白72)、TEL/AML1(易位Ets家族白血病/急性骨髓性白血病1)、TPI/m(磷酸丙糖异构酶突变)、TRP-1(酪氨酸酶相关蛋白1或gp75)、TRP-2(酪氨酸酶相关蛋白2)、TRP-2/INT2(TRP-2/内含子2)、VEGF-R2(血管内皮生长因子受体2)、WT1(肾母细胞瘤基因)及其任何组合。
E45.E1-E44中任一项所述的方法，其进一步包括将所得到的T细胞施用于有需要的受试者。
E46.在需要T细胞疗法的受试者中治疗肿瘤的方法，其包括向受试者施用一种或多种T细胞，其中所述一种或多种T细胞已经与(i)AKT抑制剂和(ii)外源IL-7和/或外源IL-15接触。
E47.在需要T细胞疗法的受试者中减少或减小肿瘤尺寸或抑制肿瘤生长的方法，包括给所述受试者施用一种或多种T细胞，其中所述一种或多种T细胞已经与(i)AKT抑制剂和(ii)外源IL-7和/或外源IL-15接触。
E48.E46或E47的方法，其中一种或多种T细胞尚未与外源IL-2接触。
E49.E46至E48中任一项的方法，其中在与AKT抑制剂和外源IL-7和/或外源IL-15接触后，T细胞表达CCR7和CD45RO。
E50.E46至E48中任一项的方法，其中在与AKT抑制剂和外源IL-7、外源IL-15或两者接触后，T细胞表达CCR7和CD45RA。
E51.E46至E48中任一项的方法，其中与未接触AKT抑制剂和外源IL-7和/或外源IL-15的T细胞表达CCR7、CD45RO和CD45RA相比，在与所述AKT抑制剂和所述外源IL-7和/或外源IL-15接触后，所述T细胞表现出CCR7、CD45RO、CD45RA或其任何组合的表达增加。
E52.E46至E51中任一项的方法，其中T细胞在与AKT抑制剂和外源IL-7和/或外源IL-15接触后表达CD62L、CD28或两者。
E53.E46至E52中任一项的方法，其中与不与AKT抑制剂和外源IL-7和/或外源IL-15接触的T细胞的CD62L和CD28的表达相比，在与所述AKT抑制剂和所述外源IL-7和/或外源IL-15接触后，所述T细胞表现出CD62L、CD28或两者的表达增加。
E54.E46至E53中任一项的方法，其中与未接触AKT抑制剂和外源IL-7和/或外源IL-15的T细胞的CD95、IL-7受体α(IL-7Rα)、CXCR4、TCF7、FOXO1、ID3、BCL6、CD62L和CD45RA的表达相比，在与AKT抑制剂和外源IL-7、外源IL-15或两者接触后，所述T细胞表现出CD95、IL-7受体α(IL-7Rα)、CXCR4、TCF7、FOXO1、ID3、BCL6、CD62L、CD45RA或其任何组合的表达增加。
E55.E46至E54中任一项的方法，其中所述一种或多种T细胞从供体分离。
E56.E55的方法，其中供体是受试者
E57.E46至E56中任一项的方法，其中所述肿瘤是癌症。
E58.E57的方法，其中癌症选自骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈部癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区癌症、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBC)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、转化滤泡性淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤(SMZL)、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴细胞白细胞(ALL)(包括非T细胞ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊柱轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱导的癌症，包括由石棉诱发的那些，其他B细胞恶性肿瘤及其任何组合。
E59.E1-E58中任一项的方法，其中所述T细胞疗法包括工程化CAR细胞疗法或工程化TCR细胞疗法。
E60.E59的方法，其中工程化CAR细胞或工程化TCR细胞疗法治疗受试者中的肿瘤。
实施例
实施例1
在等量铺板浓度下，在IL-2、IL-7、IL-15和/或AKT抑制剂存在下培养供体T细胞10天。(i)与IL-7和IL-15相比，在单独的IL-2中和(ii)与IL-7、IL-15和AKT抑制剂相比，在IL-7和IL-15中培养，确定培养7天和14天的CD4+T细胞和CD8+T细胞的培养的T细胞的T细胞表型(图1A-图1F)。当细胞在IL-7和IL-15存在下生长时，观察到趋向于更幼稚的T细胞的趋势。具体而言，与IL-2处理的细胞相比，在IL-7/IL-15处理的细胞中观察到显著较高(p＝0.03，n＝6)的初始和Tcm细胞CD4+百分比(图1A)，而在更成熟的效应T细胞百分比中没有观察到差异(图1B)。在CD4+区室长期培养后，这种效应不能维持(数据未(now)显示)。在CD8+区室中观察到类似的效应，与IL-2处理的细胞培养物相比，IL-7/IL-15处理的细胞培养物中初始和Tcm细胞百分比显著更高(p＝0.03，n＝6)(图1C)而效应T细胞百分比显著更低(p＝0.03，n＝6)(图1D)。然而，与CD4+区室不同，在CD8+区室长期培养后观察到这种影响(图1E，p＝0.03，n＝6；图1F，p＝0.03，n＝6)。
在CD4+和CD8+区室中，添加AKT抑制剂进一步增加了趋向更未成熟的T细胞的趋势。与IL-7/IL-15处理的细胞相比，在IL-7/IL-15/AKTi处理的细胞中观察到初始和Tcm CD4+细胞的百分比略高(图2A)，与IL-7/IL-15处理的细胞相比，在第7天在IL-7/IL-15/AKTi处理的细胞中观察到效应T细胞的百分比略低(图2B)。在培养14天的细胞中没有观察到显著差异(数据未显示)。然而，在第7天在CD8+区室中观察到显著差异。具体而言，与IL-7/IL-15处理的细胞相比，在IL-7/IL-15/AKTi处理的细胞中初始和Tcm CD4+细胞的百分比显著更高(p＝0.03，n＝6)(图2C)，并且与用IL-7/IL-15处理的细胞相比较，在第7天在IL-7/IL-15/AKTi处理的细胞中效应T细胞的百分比显著较低(p＝0.03，n＝6)(图2D)。然而，在第14天未观察到这种效应(数据未显示)。
为了确定T细胞与IL-2、IL-7和/或IL-15中的一种或多种和AKT抑制剂接触是否对转导效率有影响，在OriGen PERMALIFETM PL30袋中在刺激后两天，用携带I类TCR的逆转录病毒转导从3个供体收集的T细胞。然后转导的细胞在(i)IL-2；(ii)IL-2和AKT抑制剂；(iii)IL-7和IL-15；和(iv)IL-7、IL-15和AKT抑制剂存在下培养10天。然后分析T细胞的CD3表达和阳性可溶性MHC-四聚体染色(Tet+)，其是成功转导的指标。根据培养条件，没有观察到转导效率的主要差异(图3A)，并且在整个培养条件下没有观察到四聚体平均荧光强度(MFI)的显著差异(图3B)。
实施例2
在各种条件下研究了AKTi抑制剂对细胞扩增的影响。首先，如下评估AKTi培养条件对各种供体细胞来源的影响。使用高密度离心处理来自四个健康供体的血液成分分离产物以获得外周血单核细胞(PBMC)(图4A-4D)。对来自四个供体的细胞进行计数并使用OKT3(针对CD3的单克隆抗体)进行刺激，并在IL-2(圆形)；IL-2和AKTi(方形)；IL-7和IL-15(三角)；或IL-7、IL-15和AKTi(倒三角)存在下培养7至10天(图4A-4D)。在每种培养条件下观察到每种供体细胞系的细胞扩增，并且AKTi对细胞扩增没有负面影响(图4A-4D)。
接下来，评估I类TCR转导的(HPV-E6)PBMC。再次使用高密度离心处理来自三个健康供体的血液成分分离产物以获得PBMC，计数，并使用OKT3进行刺激。然后将来自三个供体的细胞在IL-2(圆形)；IL-2和AKTi(方形)；IL-7和IL-15(三角)；或IL-7、IL-15和AKTi(倒三角)存在下培养(图5A-5C)。在第2天，用I类TCR(HPV-E6)转导细胞。在每种培养条件下观察每个供体细胞系的细胞扩增，并且AKTi对细胞扩增没有负面影响(图5A-5C)。
接下来，评估AKTi培养条件对CD4+/CD8+T细胞的影响。使用高密度离心再次处理来自三个健康供体的血液成分分离产物以获得PBMC。然后用抗CD4和抗CD8 Ab珠培养PBMC，并使用
Figure BDA0002740356470000621
系统(Miltenyi Biotec)选择CD4+和CD8+细胞。对来自三个供体的CD4+和CD8+细胞进行计数，使用OKT3和抗CD28 Ab进行刺激。然后在IL-2(圆形)；IL-2和AKTi(方形)；IL-7和IL-15(三角)；或IL-7、IL-15和AKTi(倒三角)存在下培养细胞(图6A-6C)。在第2天用II类TCR(MAGE-A3)转导细胞。在每种培养条件下观察每种供体细胞系的细胞扩增，并且AKTi对细胞扩增没有负面影响(图6A-6C)。
然后分开评估CD4+和CD+T细胞。使用高密度离心再次处理来自三个健康供体的血液成分分离产物以获得PBMC。然后用抗CD4珠(图7A-7C)或抗CD8珠(图8A-8C)培养PBMC，并使用
Figure BDA0002740356470000622
系统(Miltenyi Biotec)选择靶细胞。然后对来自三个供体的细胞进行计数并使用OKT3和抗CD28 Ab进行刺激。然后在IL-2(圆形)；IL-2和AKTi(方形)；IL-7和IL-15(三角)；或IL-7、IL-15和AKTi(倒三角)存在下培养细胞。在第2天用II类TCR(MAGE-A3)转导细胞。在每种培养条件下观察来自每个供体细胞系的CD4+(图7A-7C)和CD8+(图8A-8C)细胞的细胞扩增，并且AKTi对细胞扩增没有负面影响。
然后评估大生产规模培养过程中培养条件的影响。再次使用高密度离心处理来自四个健康供体的血液成分分离产物以获得外周血单核细胞PBMC(图9A-9D)。然后用抗CD4和抗CD8珠培养PBMC，并使用
Figure BDA0002740356470000623
系统选择CD4+/CD8+细胞。对CD4+/CD8+细胞进行计数并使用OKT3和抗CD28进行刺激。然后将细胞在IL-7和IL-15(图9A：圆形；图9B-9C：方形)或IL-7、IL-15和AKTi(图9A：方形；图9B-9C：圆形)存在下在XURITM细胞扩增系统(GEHealthcare Life Sciences)中以大生产规模培养8天。在培养的第2天用II类TCR(MAGE-A3)转导细胞。在每种培养条件下观察每个供体细胞系的细胞扩增，并且AKTi对细胞扩增没有负面影响(图9A-9D)。
实施例3
研究了在AKTi存在下培养后对T细胞转导效率的影响。刺激先前冷冻的供体T细胞，然后在IL-2、IL-2和AKTi；IL-7和IL-15；或IL-7、IL-15和AKTi存在下培养10天。在T-75组织培养瓶中用I类TCR(HPV-E6)(图10)或在OriGen PERMALIFETM袋中用II类TCR(MAGE-A3)(图11A-11F)刺激后第2天转导细胞。在第10天通过抗mTCRb抗体染色测量T细胞转导效率(图10和11A-11F)。AKTi对转导效率没有负面影响(图10、11A、11B、11D和11E)，尽管抗-mTCRb染色MFI显示，相对于单独的IL-7和IL-15，在IL-7、IL-15和AKTi的存在下培养的细胞的总体密度略微更大(图11C和11F)。
在生产规模上培养的T细胞观察到类似的结果(图12)。将来自四个生产规模运行(21、22和23)的先前冷冻的供体T细胞在OriGen PERMALIFETM袋中在IL-7和IL-15或IL-7、IL-15和AKTi存在下培养。在用II类TCR(MAGE-A3)刺激后第2天转导细胞。然后使细胞在XURITM生物反应器细胞扩增系统中生长。在第8天通过抗mTCRb(mC TCR PE)抗体染色测定T细胞转导效率。显示了每次运行的每种培养条件下表达转导的TCR的CD3+细胞的百分比(图12)。在大规模生产条件下，在IL-7、IL-15和AKTi存在下生长的细胞比单独在IL-7和IL-15中培养的细胞具有更高的转导效率(图12)。
实施例4
为了确定各种培养条件对分化状态的影响，将来自三个供体的CD4+/CD8+T细胞用II类TCR(MAGE-A3)转导并在IL-2；IL-2和AKTi；IL-7和IL-15；和IL-7、IL-15和AKTi存在下培养。然后用针对CD62L的抗体对细胞进行染色，CD62L是分化早期阶段的标志物。对于供体1、2和3中的每个供体(分别为图13A、13B和13C)，测定了来自每种培养条件的细胞的染色阳性CD62L表达的细胞的百分比。平均荧光强度(MFI)表明与在不存在AKTi时培养的细胞相比，在AKTi存在下培养的细胞在阳性细胞表面上具有更高水平的CD62L(图13D-13E)。
实施例5
为了确定AKTi对T细胞功能的影响，在各种条件下培养后评估细胞因子产生和T细胞增殖。来自四个生产规模运行的T细胞(21、22和23)在IL-2；IL-2和AKTi；IL-7和IL-15；和IL-7、IL-15和AKTi存在下在OriGen PERMALIFETM袋中培养。在第2天用II类TCR(MAGE-A3)转导T细胞，然后在存在IL-7和IL-15或IL-7、IL-15和AKTi的情况下在XURITM生物反应器细胞扩增系统中生长。T细胞用PMA+离子霉素+BrefaldinA+Monesin刺激5.5小时。细胞内流式细胞术显示在AKTi存在下培养的细胞的T细胞活性增加，这由细胞因子IFNg(图14A)和TNFa(图14B)的产生增加证明。
为了进一步证实AKTi增加T细胞活性，来自两个生产规模运行(21和22)的T细胞如上所述进行培养，并与阳性(H1299、HT1197和HT1367)和阴性(DU145、SK MEL 28，和SK MEL5)靶肿瘤细胞系共培养过夜。在AKTi存在下培养的细胞在测试的每种培养条件下显示更大的IFNg产生(图15)，表明AKTi培养的细胞比不存在AKTi培养的细胞对刺激的反应具有更大的效力。
对供体T细胞的小规模培养观察到类似的结果。如上所述，刺激来自供体1、供体2和供体3的细胞；在IL-2；IL-2和AKTi；IL-7和IL-15；或IL-7、IL-15和AKTi存在下培养；并在刺激后第2天用I类TCR转导。将T细胞与肿瘤细胞系(卡斯基细胞；图16A)，或者与装有滴定量的TCR特异性肽的T2细胞过夜共培养T细胞(图16B-16D)。如上文在大规模制造实验中所观察到的，相比于在不存在AKTi的情况下培养的细胞，在存在AKTi的情况下培养的细胞产生更高水平的IFNg(图16A-16D)。TCR特异性肽的滴定显示几乎在所有水平上，AKTi培养条件诱导更大的IFNg产生。
在AKTi存在下培养后，还发现T细胞增殖增加。如上所述，在用II类TCR刺激后的第2天转导来自供体1、供体2和供体3的T细胞。T细胞用CFSE染色并与肿瘤细胞系(阳性对照)共培养4天。与没有AKTi生长的细胞(图17A和17C)相比，在存在AKTi的情况下生长的细胞中观察到增加的T细胞增殖(图17B和17D)。图17A-17D显示了来自供体3的代表性数据，其中更大百分比的细胞表征为在IL-2和AKTi(图17B)和IL-7、IL-15和AKTi(图17D)中培养的细胞的晚期(L)或中期(M)增殖，比在不存在AKTi时培养的细胞(图17A和17C)更高。
在大规模生产培养条件下也观察到增加的T细胞增殖。如上所述，在用II类TCR刺激后第2天转导来自两个大规模生产运行(21和22)的T细胞。T细胞用CFSE染色并与阳性肿瘤细胞系或阴性细胞系共培养4天。对于运行21A/21B(图18A)和22A/22B(图18B)中的每一个，在AKTi存在下生长的细胞中观察到增加的T细胞增殖。
实施例6
为了确定AKTi对T细胞细胞溶解活性的影响，如上所述，将表达萤光素酶的靶细胞与在各种培养条件(单独的IL-2；IL-2和AKTi；IL-7和IL-15；和IL-7、IL-15和AKTi)生长的T细胞共培养在16至96小时的时间范围内。然后将T细胞与表达萤光素酶的靶细胞共培养。通过萤光素酶强度来测量靶细胞活力，使得萤光素酶强度的降低指示T细胞识别和靶特异性杀死。因此，萤光素酶水平的降低是T细胞细胞毒的直接量度。预计在存在AKT抑制剂的情况下培养的细胞比不存在AKT抑制剂时培养的细胞具有更大的细胞毒。

Claims (17)

1.用于T细胞疗法的体外延缓或抑制T细胞成熟或分化的方法，包括使来自需要T细胞疗法的受试者的一种或多种T细胞与外源白介素-7(IL-7)和外源白介素-15(IL-15)中的至少一种和AKT抑制剂接触，其中所得到的T细胞表现出延缓的成熟或分化，和/或其中相对于在不存在AKT抑制剂的情况下培养的T细胞的T细胞功能，所得到的T细胞表现出改善的T细胞功能。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述改善的T细胞功能选自由以下组成的组：
(i)增加的T细胞增殖；
(ii)增加的细胞因子产生；
(iii)增加的细胞溶解活性；和
(iv)(i)-(iii)的任何组合。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述增加的细胞因子产生选自由以下组成的组：(i)增加的干扰素γ(IFNg)产生，(ii)增加的组织坏死因子α(TNFa)产生，和(iii)增加的IFNg和TNFa产生。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，还包括将所得到的T细胞施用于有需要的受试者。
5.在需要T细胞疗法的受试者中治疗肿瘤的方法，其包括向受试者施用一种或多种T细胞，其中所述一种或多种T细胞已经与(i)AKT抑制剂和(ii)外源IL-7和/或外源IL-15接触。
6.在需要T细胞疗法的受试者中减少或减小肿瘤尺寸或抑制肿瘤生长的方法，包括给所述受试者施用一种或多种T细胞，其中所述一种或多种T细胞已经与(i)AKT抑制剂和(ii)外源IL-7和/或外源IL-15接触。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述一种或多种T细胞没有与外源白介素-2(IL-2)接触。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述AKT抑制剂选自由以下组成的组：A6730、B2311,124018、GSK2110183(afuresertib)、派立福新(KRX-0401)、GDC-0068(ipatasertib)、RX-0201、VQD-002、LY294002、A-443654、A-674563、Akti-1、Akti-2、Akti-1/2、AR-42、API-59CJ-OMe、ATI-13148、AZD-5363、芥酸磷酸胆碱、GSK-2141795(GSK795)、KP372-1、L-418、NL-71-101、PBI-05204、PIA5、PX-316、SR13668、曲西瑞宾、GSK 690693(CAS#937174-76-0)、FPA 124(CAS#902779-59-3)、米替福新、PHT-427(CAS#1 191951-57-1)、10-DEBC盐酸盐、Akt抑制剂III、Akt抑制剂VIII、MK-2206二盐酸盐(CAS#1032350-13-2)、SC79、AT7867(CAS#857531-00-1)、CCT128930(CAS#885499-61-6)、A-674563(CAS#552325-73-2)、AGL 2263、AS-041164(5-苯并[1,3]间二氧杂环戊烯-5-基亚甲基-噻唑烷-2,4-二酮)、BML-257(CAS#32387-96-5)、XL-418、CAS#612847-09-3、CAS#98510-80-6、H-89(CAS#127243-85-0)、OXY-1 1 1A、3-[1-[[4-(7-苯基-3H-咪唑并[4,5-g]喹喔啉-6-基)苯基]甲基]哌啶-4-基]-1H-苯并咪唑-2-酮、N,N-二甲基-1-[4-(6-苯基-1H-咪唑并[4,5-g]喹喔啉-7-基)苯基]甲基-胺、1-{1-[4-(3-苯基苯甲酰基-[g]喹喔啉-2-基)苄基]哌啶-4-基}-1,3-二氢-2H-苯并咪唑-2-酮及其任何组合。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述AKT抑制剂是3-[1-[[4-(7-苯基-3H-咪唑并[4,5-g]喹喔啉-6-基)苯基]甲基]哌啶-4-基]-1H-苯并咪唑-2-酮。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中：
(i)AKT抑制剂的量为约1nM至约1mM；
(ii)外源IL-7的量为约0.001至约500ng/ml IL-7；
(iii)外源IL-15的量为约0.001至约500ng/ml IL-15；或者
(iv)(i)至(iii)的任何组合。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中：
(i)AKT抑制剂的量为约8μM；
(ii)外源IL-7的量为至少约5ng/ml IL-7；
(iii)外源IL-15的量为至少约5ng/ml IL-15；或者
(iv)(i)至(iii)的任何组合。
12.权利要求1-11中任一项的方法，其中所述一种或多种T细胞选自由以下组成的组：肿瘤浸润淋巴细胞、细胞毒T细胞、CAR T细胞、工程化TCR T细胞、自然杀伤T细胞、外周血淋巴细胞和肿瘤浸润白血球。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，还包括用逆转录病毒转导所述T细胞。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述逆转录病毒包含编码T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)的异源基因。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述TCR或CAR能够结合抗原，所述抗原选自由以下组成的组：707-AP(707丙氨酸脯氨酸)、AFP(甲胎蛋白)、ART-4(T4细胞识别的腺癌抗原)、BAGE(B抗原；b-联蛋白/m、b-联蛋白/突变)、BCMA(B细胞成熟抗原)、Bcr-abl(断裂点簇区-Abelson)、CAIX(碳酸酐酶IX)、CD19(分化群19)、CD20(分化群20)、CD22(分化群22)、CD30(分化群30)、CD33(分化群33)、CD44v7/8(分化群44、外显子7/8)、CAMEL(CTL识别的黑素瘤抗原)、CAP-1(癌胚抗原肽-1)、CASP-8(胱天蛋白酶-8)、CDC27m(细胞分裂周期27突变)、CDK4/m(周期蛋白依赖性激酶4突变)、CEA(癌胚抗原)、CT(癌/睾丸(抗原))、Cyp-B(亲环蛋白B)、DAM(分化抗原黑素瘤)、EGFR(表皮生长因子受体)、EGFRvIII(表皮生长因子受体，变体III)、EGP-2(上皮糖蛋白2)、EGP-40(上皮糖蛋白40)、Erbb2、3、4(成红细胞白血病病毒癌基因同系物-2、-3、4)、ELF2M(延伸因子2突变)、ETV6-AML1(Ets变异体基因6/急性髓细胞白血病1基因ETS)、FBP(叶酸结合蛋白)、fAchR(胎儿乙酰胆碱受体)、G250(糖蛋白250)、GAGE(G抗原)、GD2(双唾液酸神经节苷脂2)、GD3(双唾液酸神经节苷脂3)、GnT-V(N-乙酰葡糖胺转移酶V)、GP100(糖蛋白100kD)、HAGE(helicose抗原)、HER-2/neu(人表皮受体2/神经；也称为EGFR2)、HLA-A(人白细胞抗原-A)HPV(人乳头瘤病毒)、HSP70-2M(热休克蛋白70-2突变)、HST-2(人印戒瘤肿瘤-2)、hTERT或hTRT(人端粒酶逆转录酶)、iCE(肠羧基酯酶)、IL-13R-a2(白介素-13受体亚单位α-2)、KIAA0205、KDR(激酶插入结构域受体)、κ-轻链、LAGE(L抗原)、LDLR/FUT(低密度脂质受体/GDP-L-岩藻糖：b-D-半乳糖苷酶2-a-岩藻糖基转移酶)、LeY(Lewis-Y抗体)、L1CAM(L1细胞粘附分子)、MAGE(黑素瘤抗原)、MAGE-A1(黑素瘤相关抗原1)、MAGE-A3、MAGE-A6、间皮素、感染鼠CMV的细胞、MART-1/Melan-A(T细胞识别的黑素瘤抗原-1/黑素瘤抗原A)、MC1R(促黑素1受体)、肌球蛋白/m(肌球蛋白突变)、MUC1(粘蛋白1)、MUM-1、-2、-3(黑素瘤泛在突变1、2、3)、NA88-A(患者M88的NA cDNA克隆)、NKG2D(自然杀伤组2、成员D)配体、NY-BR-1(纽约乳房分化抗原1)、NY-ESO-1(纽约食管鳞状细胞癌-1)、癌胎儿抗原(h5T4)、P15(蛋白15)、p190轻微bcr-abl(190KD bcr-abl蛋白)、Pml/RARα(早幼粒细胞白血病/视黄酸受体a)、PRAME(优先表达的黑素瘤抗原)、PSA(前列腺特异性抗原)、PSCA(前列腺干细胞抗原)、PSMA(前列腺特异性膜抗原)、RAGE(肾抗原)、RU1或RU2(肾泛在1或2)、SAGE(肉瘤抗原)、SART-1或SART-3(鳞状抗原拒绝肿瘤1或3)、SSX1、-2、-3、4(滑膜肉瘤X1、-2、-3、-4)、TAA(肿瘤相关抗原)、TAG-72(肿瘤相关糖蛋白72)、TEL/AML1(易位Ets家族白血病/急性骨髓性白血病1)、TPI/m(磷酸丙糖异构酶突变)、TRP-1(酪氨酸酶相关蛋白1或gp75)、TRP-2(酪氨酸酶相关蛋白2)、TRP-2/INT2(TRP-2/内含子2)、VEGF-R2(血管内皮生长因子受体2)、WT1(肾母细胞瘤基因)及其任何组合。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中在与所述AKT抑制剂和所述外源IL-7和/或外源IL-15接触后，所述T细胞：
(i)表达CCR7和CD45RO；
(ii)表达CCR7和CD45RA；
(iii)与未与AKT抑制剂和外源IL-7和/或外源IL-15接触的T细胞的CCR7、CD45RO和CD45RA的表达相比，表现出CCR7、CD45RO、CD45RA或其任何组合的表达增加；
(iv)表达CD62L、CD28或两者；
(v)与未与AKT抑制剂和外源IL-7和/或外源IL-15接触的T细胞的CD62L和CD28的表达相比，表现出CD62L、CD28或两者的表达增加；
(vi)与未接触AKT抑制剂和外源IL-7和/或外源IL-15的T细胞的CD95、IL-7受体α(IL-7Rα)、CXCR4、TCF7、FOXO1、ID3、BCL6、CD62L和CD45RA的表达相比，在与AKT抑制剂和外源IL-7、外源IL-15或两者接触后表现出CD95、IL-7受体α(IL-7Rα)、CXCR4、TCF7、FOXO1、ID3、BCL6、CD62L、CD45RA或其任何组合的表达增加；或者
(vii)(i)至(vi)的任何组合。
17.根据权利要求5至16中任一项所述的方法，其中所述肿瘤选自骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈部癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区癌症、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBC)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、转化滤泡性淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤(SMZL)、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴细胞白细胞(ALL)(包括非T细胞ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊柱轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱导的癌症，包括由石棉诱发的那些，其他B细胞恶性肿瘤及其任何组合。
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