KR20100032387A - Ｔ-세포 사이토카인-유도성 표면 분자 및 사용 방법 - Google Patents

Ｔ-세포 사이토카인-유도성 표면 분자 및 사용 방법 Download PDF

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KR20100032387A
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칼 케이스 3세 에드워즈
리 리
카렌 알. 존스처
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더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 콜로라도, 어 바디 코포레이트
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Abstract

본 발명은 사이토카인 조절제 및 단핵구세포 계열 유래 세포에서 사이토카인의 생산을 조절하기 위한 그의 사용 방법을 제공한다. 특히, 본 발명의 사이토카인 조절제는 T 림프구의 T-세포 사이토카인-유도성 표면 분자(TCISM) 또는 단핵구세포 계열 유래 세포의 해당 TCISM-수용체에 선별적으로 결합하여 단핵구세포 계열 유래 세포에서 사이토카인의 생산을 조절한다.

Description

Ｔ-세포 사이토카인-유도성 표면 분자 및 사용 방법{T-CELL CYTOKINE-INDUCING SURFACE MOLECULES AND METHODS OF USE}
본 발명은 사이토카인 조절제(modulator) 및 이를 단핵구세포(monocyte) 계열 유래 세포에서 사이토카인의 생산을 조절하기 위해 사용하는 방법에 관한 것이다.
매우 다양한 임상 증상이 류마티스성 관절염, 다발성경화증, 크론씨 질병, 건선, 건선성 관절염, 그레이브 질환, 자가면역성 다내분비 증후군, 유전성 단백뇨 증후군, 제1형 당뇨병, 전신성 홍반성 낭창, 원발성 담도 경화증(Primary Bilary Cirrhosis), 자가면역성 갑상선염, 간염, 후천성 면역결핍증(HIV), 이식편대숙주질환(Graft versus Host Disease), 동종이식 질환(Allograft Disease), 천식, 피부성(Cutaneous) T-세포 림프종, HTLV-I-연관성 피부성 T-세포 림프종, HTLV-Ⅱ-연관성 림프종, 모발성(Hairy) 세포 백혈병, 특발성 CD4+ T-림프구감소증(lymphocytopenia) 또는 흑색종을 포함하지만 이에 한정되지는 않는 급성 및/또는 만성 염증에 의해 매개된다. 염증에 관여하는 메카니즘 중 하나는 단핵구세포 계열 유래 대식세포(Mφ)의 활성화에 의한 사이토카인의 상향조절(up-regulation)인 것으로 여겨진다. 예를 들면, 병변(lesion)에서 생산되는 종양 괴사 인자-α(TNFα) 및 인터루킨-1β(IL-1β)와 같은 전염증성(proinflammatory) 사이토카인은 만성 병변성 염증을 유도 및 유지하는 것으로 보인다. 해당 동물 모델에서의 최근의 연구는 T-세포(Tc)가 Mφ의 활성화에 중요한 역할을 수행한다는 것을 제시한다; 그러나, 인터루킨-4, 10 및 13(IL-4, IL-10 및 IL-13)과 같은 T-세포 사이토카인은 항-염증성 역할을 하거나, 또는 TNFα/IL-1β 상향조절을 단지 약하게 유도한다는 것을 보여준다.
따라서, 급성 및/또는 만성 염증과 연관된 다양한 임상 증상을 치료하기 위해 염증을 조절할 필요가 있다.
발명의 요약
본 발명의 일부 측면은 사이토카인 조절제 및 이를 단핵구세포 계열 유래 세포에서 사이토카인의 생산을 조절하기 위해 사용하는 방법에 관한 것이다. 어떤 특정한 구현예에서, 본 발명은 전염증성 사이토카인 조절제 및 이를 단핵구세포 계열 유래 세포, 전형적으로는 인간 단핵구세포 계열 유래 세포에서 전염증성 사이토카인의 생산을 조절하기 위해 사용하는 방법을 제공한다. 임의의 이론에 구애되는 일 없이, 단핵구세포 계열 유래 세포는 상이한 이펙터(effector) T 세포 군집(population)과 직접 세포-세포 접촉하게 될 때 활성화되는 것으로 여겨진다. TCISM 리간드 및/또는 TCISM 수용체 레벨에서 적응성(즉, 후천성) 면역을 조절하는 것은 미생물 감염(예를 들면, 박테리아의 피부 감염) 동안에 여전히 선천성 면역이 되도록 하는 치료적 중재(therapeutic intervention)를 제공한다.
본 발명의 한 측면은 대상에게 사이토카인 조절제를 투여하는 단계를 포함하는 상기 대상의 단핵구세포 계열 유래 세포에서 사이토카인의 생산을 조절하는 방법으로서, 상기 사이토카인 조절제는 T 림프구의 T-세포 사이토카인-유도성 표면 분자(TCISM)-리간드 또는 상기 단핵구세포 계열 유래 세포의 해당 TCISM-수용체에 선별적으로 결합함으로써, 상기 TCISM-리간드 또는 TCISM-수용체에 대한 사이토카인 조절제의 선별적인 결합은 단핵구세포 계열 유래 세포에서 사이토카인의 생산을 조절하는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, TCISM-리간드는 표 1에 나열된 TCISM-리간드 중 적어도 하나를 포함한다(도 19). 이들 구현예 내에서, 어떤 경우에 상기 TCISM-리간드는 CD81, CD21, CD316, α-에놀라제(Enolase), FKBP4, 상기 FKBP 멀티유전자(Multigene) 패밀리의 다른 일원, 또는 이들의 조합을 포함한다. 상기 FKBP 멀티유전자 패밀리의 일원으로는 FKBP12(FKBP1A), FKBP12.6(FKBP1B), FKBP13(FKBP2), FKBP9(FKBP11), FKBP22(FKBP14), FKBP23(FKBP7), FKBP25(FKBP3), FKBP36(FKBP6), FKBP37(AIP), FKBP38(FKBP8), FKBP51(FKBP5), FKBP52(FKBP4), FKBP60(FKBP9) 및 FKBP65(FKBP10)를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
다른 구현예에서, 단핵구세포 계열 유래 세포는 단핵구세포 계열 유래 대식세포, 항원-제공 세포(APC), 수지상 세포, 랑게르한스 세포, 쿠퍼 세포, 또는 이들의 조합을 포함한다.
또 다른 구현예에서, T 림프구는 CD3+ T 림프구이다.
또 다른 구현예에서, 상기 조절된 사이토카인은 종양 괴사 인자-α(TNF-α), 인터루킨-1β(IL-1β), 인터루킨-32(IL-32), 또는 이들의 조합을 포함한다.
다른 구현예에서, TCISM-리간드는 CD3+ 림프구에 존재하는 TCISM-리간드이다. 이들 구현예 내에서, 어떤 경우에 TCISM-리간드는 CD81, CD21, CD315, CD316, α-에놀라제, FKBP, 또는 이들의 조합을 포함한다. 예시적인 FKBP로는 FKBP4, FKBP12(FKBP1A), FKBP12.6(FKBP1B), FKBP13(FKBP2), FKBP9(FKBP11), FKBP22(FKBP14), FKBP23(FKBP7), FKBP25(FKBP3), FKBP36(FKBP6), FKBP37(AIP), FKBP38(FKBP8), FKBP51(FKBP5), FKBP52(FKBP4), FKBP60(FKBP9) 및 FKBP65(FKBP10)을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
또 다른 구현예에서, 상기 TCISM-수용체는 CD68+ 항원-제공 세포에 존재하는 TCISM-수용체를 포함한다. 이들 구현예 내에서, 어떤 경우에 상기 TCISM-수용체는 CD81에 대한 수용체, CD21에 대한 수용체, CD315에 대한 수용체, CD316에 대한 수용체, α-에놀라제에 대한 수용체, FK 결합 단백질에 대한 수용체, 또는 이들의 조합을 포함한다. 어떤 경우에, 상기 TCISM-수용체는 CD19, CD21, CD225, CD315, CD316, C3dR, CD19, CD81, BCR, CD9, CD81, KAI1/CD82, FK506, 라파마이신(Sirolimus), 에베롤리무스(Everolimus), 시클로스포린(Cyclosporin), 타크롤리무스(Tacrolimus), 다른 합성 소분자 면역억제제, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일반적으로, 상기 TCISM-수용체는 리간드에 결합시 단핵구세포 계열 유래 세포에서 사이토카인의 생산을 자극하는 단핵구세포 계열 유래 세포에 존재하는 수용체를 나타낸다.
본 발명의 다른 측면은 대상에게 사이토카인 조절제를 투여하는 단계를 포함하는 상기 대상에서 급성 또는 만성 염증에 의해 매개되는 임상 증상을 치료하는 방법으로서, 상기 사이토카인 조절제는 T 림프구의 T-세포 사이토카인-유도성 표면 분자(TCISM)-리간드 또는 단핵구세포 계열 유래 세포의 해당 TCISM-수용체에 선별적으로 결합함으로써, 상기 사이토카인 조절제에 의한 사이토카인 생산의 조절은 급성 또는 만성 염증에 의해 매개되는 임상 증상을 치료하기 위해 사용되는 방법을 제공한다.
어떤 구현예에서, 상기 사이토카인 조절제는 CD3+ 림프구 상의 TCISM-리간드에 선별적으로 결합한다.
다른 구현예에서, 상기 사이토카인 조절제는 CD68+ 단핵구세포 상의 TCISM-수용체에 선별적으로 결합한다.
또 다른 구현예에서, 상기 임상 증상은 자가면역 질환을 포함한다. 이들 구현예에서, 어떤 경우에 상기 자가면역 질환은 류마티스성 관절염, 다발성경화증, 크론씨 질병, 건선, 건선성 관절염, 그레이브 질환, 자가면역성 다내분비 증후군, 유전성 단백뇨 증후군, 제1형 당뇨병, 전신성 홍반성 낭창, 원발성 담도 경화증, 자가면역성 갑상선염, 간염, 후천성 면역결핍증(HIV), 이식편대숙주질환, 동종이식 질환, 천식, 피부성 T-세포 림프종, HTLV-I-연관 피부성 T-세포 림프종, HTLV-Ⅱ-연관성 림프종, 모발성 세포 백혈병, 특발성 CD4+ T-림프구감소증 또는 흑색종, 또는 이들의 조합을 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 치료를 필요로 하는 대상에게 치료학적 유효량의 TCISM-리간드에 대한 길항제(antagonist) 또는 해당 TCISM-수용체에 대한 길항제를 투여하는 단계를 포함하는 대상에서 자가면역 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 TCISM-리간드 및/또는 TCISM-수용체에 선별적으로 결합함으로써 사이토카인의 생산을 조절하는데 사용될 수 있는 사이토카인 조절제를 제공한다.
발명의 상세한 설명
Tc-유도성 Mφ 활성화에 대한 활성화 메카니즘 중 하나는 면역 시냅스 메카니즘을 통한 직접적인 세포-세포 접촉을 통한 것이라고 여겨진다. 활성화된 T-세포는 알려지거나 알려지지 않은 많은 막-결합 단백질을 발현한다. 본 발명자들은 본 발명에서 Tc 사이토카인 유도성 표면 분자(즉, TCISM 또는 TCISM-리간드)라고 명명된 이들 분자 중 일부가 세포-세포 접촉 신호전달 캐스케이드(signaling cascade)에 관여하여, Mφ에 존재하는 해당 TCISM-수용체에 선별적으로 결합함으로써 전염증성 사이토카인을 유도한다는 것을 발견하였다.
류마티스성 관절염, 다발성경화증, 크론씨 질병, 건선, 건선성 관절염, 그레이브 질환, 자가면역성 다내분비 증후군, 유전성 단백뇨 증후군, 제1형 당뇨병, 전신성 홍반성 낭창, 원발성 담도 경화증, 자가면역성 갑상선염, 간염, 후천성 면역결핍증(HIV), 이식편대숙주질환, 동종이식 질환, 천식, 피부 T-세포 림프종, HTLV-I-연관성 피부성 T-세포 림프종, HTLV-Ⅱ-연관성 림프종, 모발성 세포 백혈병, 특발성 CD4+ T-림프구감소증 및/또는 흑색종을 포함하지만 이에 한정되지는 않는 다양한 임상 증상이 급성 또는 만성 염증에 의해 매개된다. 본 발명자들은 또한 이들 임상 증상들이 T 림프구의 TCISM-리간드 및/또는 단핵구세포 계열 유래 세포의 해당 TCISM-수용체에 선별적으로 결합할 수 있는 사이토카인 조절제를 투여하거나, 또는 예컨대 iRNA 또는 siRNA에 의해 TCISM-리간드의 전사를 억제하여 단핵구세포 계열 유래 대식세포에서의 사이토카인의 생산을 조절함으로써 치료될 수 있음을 발견하였다.
본 발명의 일부 측면은 TCISM-리간드 및 T 림프구의 T-세포 사이토카인-유도성 표면 분자(TCISM)-리간드 또는 단핵구세포 계열 유래 세포의 해당 TCISM-수용체에 선별적으로 결합하는 사이토카인 조절제를 투여하거나, 또는 TCISM-리간드의 전사를 억제함으로써 대상의 단핵구세포 계열 유래 세포에서 사이토카인의 생산을 조절하는 방법을 제공한다.
어떤 구현예에서, TCISM-리간드는 표 1에 나열된 TCISM-리간드 중 적어도 하나를 포함한다(도 19). 이들 TCISM-리간드에 대한 해당 TCISM-수용체(들)은 본 기술분야의 당업자에 의해 즉시 결정될 수 있다. 예를 들면, 중성화(neutralizing) 단일클론 또는 다클론 항체를 사용하여 TCISM-리간드와 TCISM 수용체의 상호작용을 억제하는 세포-세포 접촉 생분석(bioassay)을 이용하는 것이다. 다른 방법은 자극 및 비자극 Hut-18 및 H9 서브클론 T 세포막을 이용한 감산 면역법(Subtractive Immunization)으로 세포-세포 접촉을 차단하는 단일클론 항체를 확인하는 것이다. 임의의 이론에 구애되는 일 없이, 단핵구세포-대식세포의 접촉-매개성 활성화는 사이토카인의 생산을 유도하는 주된 경로인 것으로 여겨진다. 따라서, 상기 메카니즘을 조절하는 것, 예컨대 시작(triggering) 레벨에서 IL-1 및 TNF-α 생산을 차단하거나 TCISM-리간드 또는 TCISM-수용체의 발현을 억제하는 것(예컨대, siRNA를 통해)이 사이토카인의 생산에 의해 매개되는 임상 증상을 치료하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 어떤 조성물 및 방법은 단핵구세포 계열 유래 세포에 존재하는 TCISM-수용체에 선별적으로 결합하여(또는 이러한 수용체의 발현 또는 전사를 억제하여) 이들 단핵구세포 계열 유래 세포에서 사이토카인의 생산을 조절하는데 유용하다. 단핵구세포 계열 유래 세포는 T 림프구에 의해 활성화될 때 사이토카인을 생산하는 임의의 세포를 포함한다. 어떤 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은전염증성 사이토카인의 생산을 조절한다.
사이토카인을 생산하는 예시적인 단핵구세포 계열 유래 세포는 단핵구세포 계열 유래 대식세포, 항원-제공 세포(APC), 수지상 세포, 랑게르한스 세포 및 쿠퍼 세포를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물 및 방법은 TCISM-리간드 또는 TCISM-수용체에 선별적으로 결합할 수 있는 분자를 포함한다. 아울러, 본 발명의 조성물 및 방법은 또한 TCISM-리간드 또는 TCISM-수용체의 번역, 전사 및/또는 발현을 조절할 수 있는 분자를 포함한다. 예를 들면, siRNA를 T 림프구에 투여함으로써 TCISM-리간드의 발현을 조절할 수 있다. 적절한 TCISM-리간드를 알게 되면, 본 기술분야의 당업자는 TCISM-리간드의 발현을 조절할 수 있는 적절한 siRNA를 즉시 확인할 수 있다. 예를 들면, 전장(full-length) 단백질을 코딩하는 메신저 RNA에 대한 siRNA는 전사 과정에서 가장 불안정하게 되기 쉬운 mRNA 부분을 결정하도록 하는 시판되는 컴퓨터 소프트웨어를 이용하여 디자인될 수 있다.
치료적 중재가 세균의 피부 감염 동안에 선천성(천연) 면역을 허용하기 때문에, TCISM 레벨에서 적응성(후천성) 면역을 조절하는 것은 이점이 있다. 따라서, 본 발명의 일부 측면은 선천성 면역을 실질적으로 유지하면서 적응성 또는 후천성 면역을 조절하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
본 발명의 예시적인 TCISM-리간드, TCISM-수용체 및/또는 사이토카인 조절제 화합물은 하기 식을 갖는 화합물, 이의 동족체(analog) 및 유사체를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다:
Figure 112009079275193-PCT00001
매우 재생산적이고 입증된 세포-세포 접촉 생분석이 원발성의 인간 T-세포 및 자가성(autologous)의 새롭게 얻은 인간 혈액 단핵구세포 또는 인간 T-세포 및 단핵구 세포주를 이용함으로써 확립되었다. 도 1은 단핵구세포성 THP-1 Mφ가 세포-세포 접촉을 통해 전염증성 사이토카인을 분비하도록 유도할 수 있는 마이토젠(mitogen)-자극성 인간 T-세포를 보여주는 그래프이다. 도 1은 24시간 및 48시간의 세포-세포 접촉시 시간에 따라 사이토카인을 측정한 것이다. THP-1 Mφ에서 생산된 TNF-α(왼쪽 패널) 및 IL-1β(오른쪽 패널)는 상이한 PMA/PHA로 자극된 인간 T-세포주와 함께 배양되었다. 단핵구세포주 THP-1 유래의 세포를 자극된("s") 또는 자극되지 않은(ns) 휴면(resting) T 세포 유래의 고순도 막 제조물을 이용하여 배양하였다; 배양 후 24시간 또는 48시간에 사이토카인의 생산을 측정하였다. 양쪽 기간 모두에서 sHut-78 및 sH9 T-세포로 배양된 THP-1 Mφ로부터 TNF-α 및 IL-1β 생산의 현저한 증가가 검출되었다. 3회 측정값의 평균±표준편차로 제공된다. 도 1에 나타낸 바와 같이, PHA/PMA로 자극된 Molt4, Jurkat 및 Raji 세포에서는 TNF-α 및 IL-1β의 생산이 단지 조금만 유도된 반면, 휴면 원발성 인간 T-세포, 비자극 Hut-78, H9, Molt4, Jurkat 또는 Raji 세포에서는 검출가능한 생산이 관찰되지 않았다. 또한, PMA/PHA-자극된 H9 세포는 TNF-α 및 IL-1β 모두 최대 THP-1 Mφ 분비를 유도하고, Hut-78 세포는 이보다 적은 정도로 유도하는 것이 관찰되었는데, 이는 이들 세포가 TCISML 양성이라는 것을 나타낸다.
24시간의 배양 기간에 걸쳐 배양물에서 상승된 레벨의 TNF-α가 생산되었기 때문에, PMA/PHA 자극은 인간 T 세포에서 TCISML을 현저하게 유도하였다. 도 2 참조. 도 2에서, Pan CD3+ T 세포는 건강한 인간 공여자의 혈액으로부터 단리되었고, 37℃에서 6시간 동안 자극되었으며, 세척 후, 1% 파라포름알데히드로 고정되었다(6h RT). 이후, 세포를 PBS로 세정하고, RT에서 밤새 유지하였다. 이후, PBMC-유래 CD14+ Mφ를 첨가하고, 37℃에서 24시간 배양하였다. 세포 배양 상등액을 원심분리하고, 필터로 멸균한 후, ELISA에 의해 사이토카인을 측정하였다. 평균±SEM으로 나타나 있다(N=6 개별 공여자, 3회 측정; 비자극 T 세포와 비교하여 P<0.05). 유사한 데이터가 시험관내에서 αCD3/αCD28로 자극된 T 세포에서 관찰되었다. T 세포 및 Mφ 공배양 시스템에서는 전체 T 세포 대조군 배양물 단독과 비교하여 거의 2배의 TNF-α가 생산되었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 상기 결과는 사이토카인 혼합물 #1(IL2 + IL6 + TNF-α) 또는 #2(IL15 + IL6 + TNF-α)로 활성화된 인간 T-세포는 1:8(혈액 단핵구세포:T-세포)의 비로 혼합할 때 인간 단핵구세포를 활성화시켜 상승된 레벨(∼100-250 pg/㎖)의 TNF-α 및 IL-1β를 생산한다는 것을 나타낸다. 이들 사이토카인 레벨은 사이토카인-활성화된 고정된 T-세포 단독에 의해 방출된 전염증성 사이토카인의 레벨보다 현저하게 높다. 도 3에서, Pan CD3+ T 세포를 건강한 인간 공여자로부터 단리하고, 상이한 사이토카인 칵테일(■ IL2 + IL6 + TNF-α; ▒ IL-15 + IL-6 + TNF-α; □ 비자극 T 세포)로 37℃에서 8일 동안 배양하고, 세척한 후, 신선한 1% 파라포름알데히드로 고정하였다(6시간 실온). 이후, 세포를 PBS로 세정하고, RT에서 밤새 유지하였다. 새롭게 얻은 인간 혈액 단핵구세포를 순차적으로 첨가하고, T-세포를 배양하였다(37℃에서 24시간). 세포 배양 상등액을 수집하고, ELISA에 의해 사이토카인을 측정하였다. 평균±SEM이 나타나 있다(N=4 개별 공여자, 3회 측정). 이들 결과를 확인하기 위하여 동일한 공여자 유래의 정제된 Pan CD3+ T-세포를 이용하여 2번의 분리된 실험을 수행하였다.
또한, 사이토카인 혼합물 #1 또는 #2로 자극된 인간 PBMC 유래 CD3+ T-세포가, TNF-α 및 IL-1β를 생산하도록 인간 THP-1 세포를 활성화시키기에 충분한 TCISM의 발현을 유도하는지 여부를 테스트하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 사이토카인 활성화된 T-세포와 조합된 THP-1 세포는 향상된 레벨의 TNF-α를 생산하였지만, 유도된 사이토카인 레벨은 파라포름알데히드-고정된, 사이토카인 자극된 T-세포 단독에 의해 유도된 것보다 현저하게 높지는 않았다. 도 4에서, Pan CD3+ T-세포를 건강한 인간 공여자로부터 단리하고, 상이한 사이토카인 칵테일(■ IL2 + IL6 + TNF-α; ▒ IL-15 + IL-6 + TNF-α; □ 비자극 T 세포)로 37℃에서 8일 동안 배양하고, 세척한 후, 신선한 4% 파라포름알데히드로 고정하였다(6시간 실온). 세포를 순차적으로 PBS로 세정하고, RT에서 밤새 유지한 후, THP-1 세포를 첨가하였다(37℃에서 24시간). 상기와 같이 세포 배양 상등액을 수집하고, ELISA에 의해 사이토카인을 측정하였다. 평균±SEM이 나타나 있다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 건강한 인간 자원자의 말초 혈액으로부터 얻은 Pan CD3+ 인간 T-세포를 PMA/PHA 또는 αCD3/αCD28로 6시간 동안 시험관내에서 자극한 후, 신선한 1% 파라포름알데히드로 실온에서 밤새 고정하였다. 다음으로, 신선하게 얻은 인간 혈액 단핵구세포를 조직 배양 플레이트에 첨가하고, 상기 고정된 T-세포와 6시간 또는 24시간 동안 배양하였다. 이후, 전술한 바와 같이 상등액을 수집하고, ELISA에 의해 다양한 Th1 및 Th2 사이토카인을 측정하였다. 상기 PMA/PHA 자극된 T-세포는, 특히 세포-세포 접촉 6시간 후, 강력하게 인간 혈액 단핵구세포를 활성화시켜 ∼1,000-1,250 pg/㎖ 사이 범위 레벨로 IL-12(p70)를 생산하였다(도 4). 유사하게, αCD3/αCD28-자극된 T 세포 또한, 비록 그 정도는 약하지만, 인간 혈액 단핵구세포 IL-12(p70) 방출을 활성화시키는데 효과적이었다. 마지막으로, 양쪽 유형의 자극된 인간 T-세포 모두 인간 혈액 단핵구세포를 활성화시켜 이들 2가지 상이한 시점에서 IL-1β 및 TNF-α를 생산할 수 있었다.
TNF-α를 생산하도록 THP-1 세포를 활성화시키기 위한 PMA/PHA 및 αCD3/αCD28 자극된 Hut-78 T 세포 대(versus) PMA/PHA 및 αCD3/αCD28 자극된 Hut-78 T 세포막의 능력을 비교하였다(도 6 참조). 상기 PMA/PHA 자극된 Hut-78 T-세포 데이터가 예시적인 목적으로 나타나 있다. 상기 생분석의 변동성(variability)을 감소시키기 위하여 동일한 Hut-78 세포 배양 로트(lot)를 이용하여 이들 연구를 수행하였다. 결과는 자극된 Hut-7 T-세포 정제된 막은 1% 파라포름알데히드로 고정된 자극된 Hut-78과 비교하여 시험관내에서 THP-1 세포 TNF-α 생산을 유도하는데 보다 효과적이었음을 나타낸다. 또한, TCISM이 상기 낮은 및 높은 원심분리 단계 동안에 상기 정제된 막 분획에 우세하게 존재하고 Parbomb 세포 상등액(예컨대, 세포질성) 분획에는 존재하지 않는다는 것을 보여주기 위하여 혼합 및 일치(mix and match) "애드 백(add back)" 실험을 수행하였다(도 6 참조). 도 6에서, 전술한 바와 같이 막을 준비하고, 세포-세포 접촉 생분석에서 THP-1 세포와 조합하였다. 24시간 배양한 후, 상등액을 제거하고, 원심분리하고, 필터로 멸균하고, ELISA에 의해 사이토카인을 측정하였다. 평균±SD가 나타나 있다.
PHA/PMA 자극된 CD3+ T 세포, Hut-78, H9, Molt4, Jurkat 및 Raji 세포에서 막 또는 막 연관 단백질을 코딩하는 유전자의 미세배열(microarray) 2-차원(2D) 클러스터(cluster)인 특징적인 배열 프로필 "열 지도(heat map)"가 도 7에 나타나 있다. 배수 변화(fold change) >2 이고, P값<0.01인 적어도 4번의 실험을 수행하였다. 도 7에서, 붉은색은 유전자 발현 레벨 >2.0을 나타내고(즉, 배열 프로필 배경(background) 레벨 이상), 초록색은 유전자 발현 레벨 <2.0을 나타낸다(즉, 배열 프로필 배경 레벨 이하). 데이터 리뷰(review)의 계산 평가 단계 동안, 인간 T-세포막과 연관되고, TCISM(+) T-세포주에서 상향조절되며, TCISM(-) T-세포주에서 하향조절된 유전자만을 고려하였다. 미세분석 실험의 결과물인 50,000 유전자 중에서 대략 10,000 유전자를 조사하였으며, Hut-78 및 H9 세포에서 상향조절되지만 인간 Molt-4 및 Jurkat T-세포에서는 상향조절되지 않은 T-세포의 유전자에 초점을 맞추었다.
상기 약 100개의 잠재적인 인간 T-세포 TCISM 후보자의 예비(curated) 목록으로부터, log/log 강도 좌표(plot)를 생성하고, 선형 규모(linear scale)로 그래프로 나타내어 TCISM 후보자를 확인하였다. 이들 좌표(예를 들면, 도 8 참조)는 "미변화", "시그니처(signature)", "하향조절" 및 "상향조절" T-세포 유전자 산물뿐만 아니라 총 배열 프로필 결과에 대한 상기 유전자 산물의 상대적인 발현 레벨을 나타낸다. 5개의 후보 인간 T-세포 TCISM 유전자를 동정하였다: 디프테리아 독소 수용체, 또는 헤파린-결합 EGF(DTR, EGF 모듈-함유 뮤신-유사 호르몬 수용체 2(EMR2)), 아담리신(Adamlysin)-17(ADAM 또는 디스인테그린 및 메탈로프로테아제) TNFα-변환 효소(TACE, TNF 수용체 수퍼패밀리, 멤버 9(TNFRSF9 또는 LIGHT)) 및 세포-세포 접촉 양성 대조군의 목적으로 공개된 과학 문헌의 리뷰에 의해 도출된 TNFRSF5 또는 CD40 리간드(CD40L).
PMA/PHA 자극된 Hut-78 및 H9 서브클론 T-세포에서 TCISM 후보 유전자의 발현을 확인하기 위하여 실시간 qRT-PCR을 수행하였다(도 9 참조). 상기 TCISM 후보자인 DTR 및 LIGHT는 양쪽 유전자 모두 자극된 Hut-78 및 H9 T 세포에서 높게 발현되고 Molt-4 및 Jurkat T 세포 또는 Raji B-세포에서는 상향조절되지 않는다는 점에서 프리셋 규정(preset criteria)을 따랐다. 그러나, TACE 및 EMR2 모두 TCISM(-) 인간 Raji B-세포주에서 매우 상향조절되었다. 또한, 상기 분자들이 활성화된 H9 세포에 존재하는지를 입증하기 위하여 FACS를 사용하였다(도 10 참조).
알려진 인간 T-세포 표면 단백질에 대한 약 50가지의 상이한 시판되는 중성화 단일클론 항체를 세포-세포 접촉 생분석에서 테스트하였다(ALCAM, CD6, β2-인테그린, CD69, CD23, CD40-CD40L 및 LAG-3에 대한 mAb를 포함함). 이들은 상기 시스템에서 전염증성 사이토카인의 생산을 약 30% 이상 상당히 억제하지는 않는 것으로 나타났다. 관찰된 보다 효과적인 다클론 항체 제조물 중 하나는 항-ADAM-17(TACE)이었다. 이들 실험은 이용가능한 다클론 항체로 수행하였다. 생분석에서 매우 특이적인 항-CD40L mAb를 사용하여도 TNF-α 또는 IL-1β 사이토카인의 생산을 현저하게 차단하지는 않았다(도 11 참조). 도 11에서, Hut-78 세포를 PMA/PHA로 6시간 동안 자극하였고, 이때 전술한 바와 같이 정제된 막을 제조하였다. Hut-78 막 + 상기 농도의 개시된 항-인간 mAb를 공배양 웰(well)에 첨가하고, 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 이후, 최근 통과된 고유한 THP-1 세포를 공배양 웰에 첨가하고, 37℃에서 24시간 동안 유지하였다. TNF-α 및 IL-1β ELISA를 위하여 상등액을 수집하였다. 도 11은 각각의 mAb 농도에서 3회 사이토카인을 측정한 2번의 분리된 실험을 나타낸다.
FACS 분석은 전달감염된(transfected) 293 세포가 그 세포 표면에서 상승된 레벨의 TCISML 유전자 산물을 지속적으로 발현시킨다는 것을 보여주었다(도 12). 도 12에서, pcDNA5/FRT/DTR, EMR2-07(EGF-유사 도메인 1, 2 & 5를 함유하는 이소폼(isoform)) 또는 CD40L을 p0G44와 함께 각각 Flp-In 293 세포 및 Jurkat 세포 내로 공-전달감염시키고, 500 ㎎㎖ 하이그로마이신(hygromycin)으로 콜로니를 선별하였다. 세포 분리 버퍼로 세포를 떼어내고, FACS로 분석하였다. (항 CD97은 EMR2-07과 교차반응하였으며, EMR2-07 발현을 검출하기 위해 사용하였다.) 수차례 계대 배양 후에도 발현이 안정하였는데, 이는 이들이 세포-세포 접촉 분석에 적합하다는 것을 나타낸다. 상기 전달감염된 293 세포를 이용하여 세포-세포 접촉 분석의 초기 실험을 수행하였다(도 13 참조). 상기 DTR 및 CD40L 구조체(construct)는 sHut-78m-유발성 THP-1의 TNF-α/IL-1β 유도를 강력하게 연장시킨다(도 13). 외인성(exogenous) 분석에 IFN-γ를 첨가하면 CD40L-유도성 Mφ 활성화와 순차적인 TNF-α의 방출 레벨이 상승되었지만(도 13의 좌측 패널), IL-1β 방출 레벨은 상승되지 않는 것으로 나타났다(도 13의 우측 패널). CD40L 전달감염된 293 또는 Jurkat 세포를 이용한 이러한 효과는 매우 재생산적이었다.
건강한 인간 T-세포 및 활성 Ps 및 PsA를 갖는 환자로부터 얻은 T-세포 모두에서 인간 T-세포 TCISM이 확인되었다. 보여지는 바와 같이, 시험관내 세포-세포 접촉 생분석은 공배양시 인간 T-세포와 인간 Mφ 사이의 면역학적 시냅스 메카니즘을 확인하기 위한 매우 재생산적인 인간 사이토카인 "해독(readout) 시스템"이다. PMA/PHA-자극된 H9 세포 및 Hut-78 세포는 TNF-α 및 IL-1β 모두의 THP-1 분비를 유도하였지만(이는 이들 세포가 TCISM 양성임을 나타냄), PHA/PMA 자극된 Molt4, Jurkat, Raji 세포 및 휴면 원발성 인간 T-세포, 자극되지 않은 Hut-78, H9, Molt4, Jurkat 또는 Raji 세포는 TCISM 음성임이 관찰되었다(도 1).
하기 규정을 이용하여 TCISM 후보자를 결정하였다: (A) 막-연관됨; (B) 자극된 Hut-78 및 H9 세포에서 2배 이상 상향조절되지만, Molt4, Jurkat 및 Raji 세포에서는 그러하지 않음; 및 (C) qRT-PCR 및 FACS에 의해 높은 발현 레벨이 확인되어야 함.
시험관내에서 αCD3/αCD28로 자극된 원발성 T 세포 또는 인간 사이토카인 칵테일 모두 상기 분석에서 전염증성 사이토카인(PIC) 활성을 연장시켰다. PMA/PHA 또는 αCD3/αCD28 자극된 T 세포는 IL-12를 생산하기 위한 Mφ 활성화를 연장시켰다. IL-12는 건선 병변에서 검출되어 왔다. IL-12는 주로 본래의(naive) Th 세포에서 IFN-γ의 생산을 자극하고, Th1 반응의 확장 및 안정화에 중요한 역할을 할 것이라고 여겨진다.
염증 및 피부성 피부 질환을 유도하는 인간 Mφ TCISMR을 통해 인간 T-세포 TCISML 분자 및 그 신호전달 경로를 확인하기 위하여, 보통의 건강한 공여자 대 건선 환자로부터 얻은 PBMC-유래 T-세포로부터 미세배열 분석을 수행하였다. 건강한 공여자, PsA 및 CPP 환자 유래의 인간 T 세포를 이용한 미세배열 분석은 디프테리아 독소 수용체(DTR; HB-EGF) 및 뮤신-유사 상피세포 성장 인자 패밀리 일원(EMR4; CD97)을 포함하는 TCISM 분자를 확인하였다. 4-1BB(TNFSF14), OX-40, LIGHT(TNFSF9) 및 CD40L(CD154; TNFSF5)을 포함하는 많은 TNF 패밀리 일원의 상향조절 또한 관찰되었다.
세포-세포 접촉 분석에 의해 인간 TCISM 후보자를 확인하기 위하여 약 50가지의 상이한 시판되는 중성화 단일클론 항체를 사용하였다. 많은 경우, 이들 시약들은 상기 시스템에서 24-96시간의 기간에 걸쳐 전염증성 사이토카인의 생산을 30% 이하로 억제하는 것으로 나타났다(도 11 참조). 미세배열 실험으로부터 EMR2, DTR, 4-1BB, LIGHT 및 CD40L을 포함하는 5가지 초기 후보 TCISML 유전자 후보자를 확인하기 위하여 "플립인(Flip-in)" 전달감염 시스템 방법을 사용하였다. 상기 세포-세포 생분석으로 특정되는, TCISM 음성 293 및 Jurkat 세포로 전달감염된 TCISM 후보 유전자의 전장 cDNA는 DTR 및 CD40L이 T-세포에 의한 Mφ TNF-α/IL-1β를 강력하게 연장한다는 것을 보여주었다. 상기 분석시 외인성 IFN-γ를 첨가하면 CD40L-유도성 Mφ 활성화와 순차적인 TNF-α 방출 레벨이 상승되었지만, IL-1β 방출 레벨은 상승되지 않았다(도 12a-b 및 도 13).
염증 및 피부성 피부 질환을 유도하는 확인된 인간 Mφ TCISMR(TCISM-수용체)의 일부로는 DTR, CD97, 4-1BB, OX-40, LIGHT 및 CD40L을 포함한다. 상기 세포-세포 생분석으로 특정되는, TCISM 음성 293 및 Jurkat 세포로 전달감염된 TCISM 후보 유전자의 전장 cDNA는 DTR 및 CD40L이 T 세포-유발성 Mφ의 TNF-α/IL-1β 생산을 강력하게 연장한다는 것을 보여주었다.
건선
본 발명의 한 특정한 측면은 건선을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 건선(Ps)은 US 인구의 대략 2%에 영향을 미치는 만성 피부 증상이다. 임의의 이론에 구애되는 일 없이, 그리고 도 15에 개략적으로 예시된 바와 같이, Ps의 병리생리학은 각질세포의 상피성 증식 및 분화, 신혈관형성 및 과증식과 병변 피부 내로의 활성화된 T-세포(Tc), 대식세포(Mφ), 수지상 세포(DC), 랑게르한스 세포(LC) 및 호중성구세포(PMN)의 침입(infiltration)을 포함하는 것으로 여겨진다. 상기 활성 병변에서 생산되는 종양 괴사 인자-α(TNFα), 인터루킨-1β(IL-1β) 및 인터루킨-32(IL-32)를 포함하는 전염증성 사이토카인(PIC)은 건선성 관절염(PsA) 및 Ps와 같은 질환에서 만성 피부 염증을 유도 및 유지하는 것으로 여겨진다. Mφ의 활성화에 의한 사이토카인의 상향조절이 이들 증상의 발병을 초래하는 것으로 여겨진다. T-세포가 Mφ 활성화에 중요한 역할을 하는 것으로 생각되어 왔다; 그러나, 인터루킨-4, 10 및 13(IL-4, IL-10 및 IL-13)과 같은 Tc 사이토카인은 항-염증 역할을 수행하거나, 또는 TNFα/IL-1β의 상향조절을 단지 약하게 유도하는 것으로 나타났다. Tc-유도성 Mφ 활성화에 대한 활성화 메카니즘은 피부에서 면역 시냅스 메카니즘을 통한 직접적인 세포-세포 접촉을 통한 것으로 여겨진다.
면역학적 시냅스(IS)는 항원-제공 세포(APC)와 T-세포 사이의 계면에서 형성되며, 항원의 인식과 T-세포의 활성화에 책임이 있는 구조인 것으로 여겨진다. 상기 IS는 T-세포와 B-세포 사이, 또는 T-세포와 MHC-함유 편평 2중층(planar bilayer) 사이에서 처음 발견되었다. 이것은 중앙 초분자(supramolecular) 활성화 클러스터(c-SMAC)로 불리는 상기 IS 중앙 영역 내의 T-세포 수용체-주된 조직양립 복합체(TCR-MHC)의 축적 및 말초(p-) SMAC(pSMAC)로 불리는 외부 IS 영역 내의 백혈구 기능-연관성 항원 1(LFA-1)-세포간 부착 분자-1(ICAM-1)의 축적에 의해 형성되는 것으로 여겨진다. 성숙된 IS는 LFA-1, 탈린, VLA-4, ADAP 및 전달 수용체(transferring receptor)가 풍부한 pSMAC를 함유하는 것으로 나타났다. 상기 pSMAC는 TCR, CD4 또는 CD8 공-수용체, CD28 공-자극 분자, CD2, PKCθ 등이 풍부한 cSMAC를 둘러싸고 있다.
Ps 피부는 릿지 및 페그(ridge and peg)의 과장된 패턴이 되어 버리는 각질세포의 과증식에 의해 특정된다. 피부에서의 각질세포, DC 및 Mφ는 모두 TNFα, IL-1β 및 IL-32를 생산하는 것으로 나타나 있다. 상기 IS가 건선성 자가항원-특이적 피부성 림프구 항원(CLA)-양성 T-세포 활성화를 조절하는데, 주요 분자 성분으로는 상기 TCR과 이를 둘러싸는 LFA-1과 같은 부착 분자의 고리를 포함하며, 이것은 인접 세포, 예컨대 각질세포 또는 APC에 의해 발현되는 ICAM-1에 결합할 수 있다. 따라서, 상기 IS는 치료적 접근법의 논리적인 표적이다. 예를 들면, 알레파셉트(alefacept)는 기억-이펙터 T-세포의 CD2에 결합하여 그 활성화를 억제하고 이들 세포의 수를 감소시키는 재조합 융합 단백질이다. 에팔리주맙(efalizumab)은 CD11a 분자에 대한 인간화된 단일클론 항체(Mab)이다. CD11a 및 CD18은 LFA-1의 서브유닛을 포함한다.
본 발명자들은 Mφ를 활성화시켜 전염증성 사이토카인을 생산하도록 함으로써 피부의 염증을 매개하는 인간 T-세포의 표면에 TCISM이 존재한다는 것을 보였다. TCISM 레벨에서 적응성(후천성) 면역을 조절하는 것은 이점이 있는데, 그 이유는 치료적 중재가 세균의 피부 감염 동안에 선천성 면역을 허용하기 때문이다.
건선은 몇 가지 임상적 표현을 갖는 피부의 유전성 증상이다. 가장 빈번한 유형은 심상성 건선(psoriasis vulgaris)(또는 플라크 건선[Ps])으로서, 신체의 특징적인 부위에서 만성, 재발성, 스케일링 구진 및 플라크로 나타난다. 건선에 대한 현재의 치료는 만족스럽지 않다. Ps는 활성화된 T-세포에 의한 피부의 침투 및 각질세포의 비정상적인 증식으로 특정된다. T-세포, 각질세포, DC 및 LC의 과생산 결과, TNFα의 농도는 (Ps를 갖는 환자 및 정상인 모두에서) 무관한 피부보다 Ps 병변에서 더 높은 것으로 보고되어 있다.
자가면역 질환
Ps 및 건선성 관절염(PsA)과 같은 인간에서의 자가면역 질환은 자가항원-발현 조직에 대한 적응성 전신(자가항체) 또는 세포(자가반응성 T-세포) 반응의 진단 결과가 동반되는 전형적인, 종종 재발하는 임상 증상에 의해 특정되는 만성 증후군이다. 중요한 인간 자가면역 질환은 종종 바이러스 또는 세균의 감염에 기인하거나, 이것에 의해 유발되며, 특정 MHC 알릴(allele)과 연관되어 있다. 선천성 면역 시스템은 상피의 비-특이적 장벽 기능부터 생식선(germline)-코딩된 수용체의 사용을 통한 매우 선별적인 병원체의 인식까지 범위의 숙주 방어 모두를 포괄한다. 이들 다양한 요소의 공통적인 특성은 감염이나 조직의 파괴에 대한 신속하고 무딘(blunt) 반응이다. 한편, 적응성 면역 시스템은 실질적으로 모든 항원에 대한 수용체를 생성하기 위하여 체세포적으로 재배열된 항원 수용체 유전자를 사용한다. 적응성 면역 반응은 느리지만, 보다 유연하며, 선천성 반응을 빠져나가도록 진화된 감염과 싸울 수 있다.
선천성 면역 시스템은 병원체에 보존된(conserved) 모티프뿐만 아니라 세포의 스트레스 또는 죽음에 대한 다수의 다른 인딕터(indictor)를 인식함으로써 반응한다. 선천성 면역 시스템의 세포 성분은 DC, 단핵구세포, Mφ, 과립구세포 및 천연 킬러 T-세포(NKT)뿐만 아니라 유기체와 그 환경 사이의 계면을 형성하는 피부, 폐 및 내장 상피 세포를 포함한다. 상기 선천성 시스템의 비-세포 요소는 매우 다양하며, 각질층(stratum corneum)의 단순한 장벽 기능으로부터 보체 캐스케이드(complement cascade)와 같은 복잡한 경로까지의 범위이다. 이들 요소는 물리적인 차단을 통해 병원체가 들어오는 것을 방지하거나, 일단 세포가 침입되면 세포가 병원체를 직접 또는 식세포(phagocytic cell)를 통해 파괴하도록 한다. 상기 선천성 면역 시스템은 또한 많은 부류의 병원체에 공통적인 분자 패턴을 인식하도록 진화되어 왔다. 이들은 병원체-연관성 분자 패턴(PAMP)으로 불린다. PAMP는 생식선-코딩된, 진화적으로 보존된 병원체-인식 수용체(PRR) 그룹의 이용함으로써 인식된다. 톨-유사(Toll-like) 수용체(TLR)는 매우 중요한 병원체 수용체 그룹이며, 선천성 면역 세포 및 내피세포, 상피세포, 섬유아세포를 포함하는 다양한 조직의 세포에서 발현된다. 다양한 미생물 분자에 대해 특이적인 10가지 TLR 패밀리 일원이 인간에서 동정되어 있다. TLR이 그 미생물 리간드에 결합하면 식세포의 활성화뿐만 아니라 전염증성 사이토카인 및 항균 펩티드의 방출을 유도한다. 이들 분자는 또한 적응성 면역 반응을 시작하기 위하여 DC를 활성화시키는 것으로 여겨진다.
T-세포는 면역 반응에서 중요하며, 그 이동 패턴 및 기능 능력에 기초하여 다수의 구별되는 서브셋으로 나누어질 수 있다. 본래의 T 세포는 1차적으로 혈액과 림프절 사이를 순환하며, 이러한 패턴은 호밍(homing) 수용체인 L-셀렉틴 및 CCR7의 발현에 의해 도움을 받는다. 본래의 T-세포는 다능한(pluripotent) 상태로 유지되고, 이들이 혈액으로부터 림프계 기관을 통해 순환할 때 상대적으로 조용한 이펙터 프로그램을 가지며, MHC-펩티드 복합체를 활성화시키기 위한 DC를 살펴본다. 활성화된 DC 및 주위 사이토카인으로부터의 신호를 통합하는 복잡한 메카니즘을 통해, 본래의 T-세포는 구별된 병원체 그룹에 맞서기 위해 필요한 이펙터 사이토카인을 분비하는 능력과 밀접하게 연관되어 있는 빠른 회전의 분열을 하게 된다. CD4+ T 헬퍼 세포는 기능적으로 Th1(인터페론[IFN]γ 분비) 및 Th2(인터루킨[IL]-4 분비) 서브셋뿐만 아니라 Tr1(IL-10 분비), Th3(변형 성장 인자[TGF]β 생성), ThFH(소낭성(follicular) 헬퍼 세포), 말초적으로 유도된 T 조절성(Treg; FoxP3 양성) 및 Th17(IL-17A 생성) 세포를 포함하는 최근에 동정된 추가적인 Th 서브셋으로 나누어질 수 있다. 추가적인 서브셋의 발견은 의심할 바 없이 이펙터 기능에 관여하는 시그니처 사이토카인 유전자를 변형하는 메카니즘에 연관될 수 있는 근원적인(underlying) 조절성 전사 인자의 확인에 대한 관심을 불러일으킬 것이다.
면역학적 시냅스(IS)는 항원-제공 세포(APC)와 T-세포 사이의 계면에서 형성되며, 항원의 인식과 T-세포의 활성화에 책임이 있는 구조인 것으로 여겨진다. 상기 IS는 T-세포와 B-세포 사이, 또는 T-세포와 MHC-함유 편평 2중층 사이에서 처음 발견되었다. 이것은 중앙 초분자 활성화 클러스터(c-SMAC)로 불리는 상기 중앙 IS 영역 내의 T-세포 수용체-주된 조직양립 복합체(TCR-MHC)의 축적 및 말초(p-) SMAC(pSMAC)로 불리는 외부 영역 내의 백혈구 기능-연관성 항원 1(LFA-1)-세포간 부착 분자-1(ICAM-1)의 축적에 의해 형성된다. 성숙된 시냅스는 LFA-1, 탈린, VLA-4, ADAP 및 전달 수용체가 풍부한 pSMAC를 함유한다. 상기 pSMAC는 TCR, CD4 또는 CD8 공-수용체, CD28 공-자극 분자, CD2, PKCθ 등이 풍부한 cSMAC를 둘러싸고 있다.
상기 APC의 표면에 발현되는 리간드는 상기 IS 접촉 부위에 특이적인 수용체를 소집하는 것으로 여겨진다. 상기 시냅스에 대한 공-자극성 분자인 CD28 및 세포독성 T 림프구 항원 4(CTLA4)의 소집은 APC 상에서 그 리간드인 B7-1 및 B7-2의 발현에 의해 별도로 촉진된다. CD28 및 CTLA4가 이들 리간드 중 어느 하나에 결합하지만, APC에서 발현될 때, B7-2는 상기 시냅스에 CD28을 소집하고, B7-1은 CTLA4를 소집하였다. 상기 APC의 접촉 부위에서의 리간드의 안정성 또한 중요한데, 그 이유는 CD28, CTLA-4 및 단백질 키나제 C-θ의 소집은 B7-1의 세포질 도메인의 존재를 필요로 하기 때문이다.
건선 피부는 릿지 및 페그의 과장된 패턴이 되어 버리는 각질세포의 과증식에 의해 특정된다. 피부에서의 각질세포, DC 및 Mφ는 모두 TNFα를 생산할 수 있다. 상기 IS가 건선성 자가항원-특이적 피부성 림프구 항원(CLA)-양성 T-세포 활성화를 조절하는 동안, 주요 분자 성분의 일부로는 상기 TCR과 이를 둘러싸는 LFA-1과 같은 부착 분자의 고리를 포함하며, 이것은 인접 세포, 예컨대 각질세포 또는 APC에 의해 발현되는 ICAM-1에 결합할 수 있다. 상기 시냅스의 LFA-1 성분은 건선에서 중요한 것으로 여겨지며, 이러한 부착 상호작용을 차단하는 치료제(항-LFA-1 항체; efalizumab)는 건선 치료용으로 미국 식약청(FAD)의 승인을 받았다. 또한, 다른 부착 분자 및 공-자극 분자를 포함하는 추가적인 기여 분자가 예컨대 세포 표면 분자쌍인 CD2:LFA-3 및 CD28:CD809/CD86과 같은 T-세포 반응성에 영향을 미친다.
류마티스성 관절염
류마티스성 관절염(RA) 또한 IS 신호전달과 연관된 염증 질환이다. RA를 치료하기 위한 잠정적인 접근법 중 하나로는 T-세포와 항원-제공 세포 사이의 IS에 존재하는 분자를 억제하는 것을 포함한다. 사이토카인 상향조절 메카니즘은 접촉 의존적인 것으로 여겨진다. 이들 기능을 매개할 수 있는 다수의 후보 단백질이 세포 표면에 존재한다.
T-세포 수용체 복합체를 통해 활성화된 T-세포는 단핵구세포 IL-10 합성을 유도하는 것으로 나타났다. 이는 부분적으로는 내인성 TNFα 및 IL-1 레벨에 의존하며, T-세포막의 TNFα는 중요한 접촉-매개성 신호인 것으로 나타났다. 그러나, IL-10 합성은 TNFα 및 IL-1이 중성화될 때에도 여전히 일어나므로, 이는 IL-10의 합성에 TNF/IL-1 의존적 신호가 필요하다는 것을 나타낸다.
특히 관심있는 것은 CD40, CD27, CD30, OX-40 및 LTβ를 포함하는 TNF/TNF-R 패밀리의 일원이다. 이들 TNF-R 분자의 리간드는 T 세포 활성화시 상향조절되는 것으로 여겨지며, 또한 CD40L, 4-1BB, CD27L, CD30은 활성화 후 가용성 매개자(mediator)로 방출되는 것으로 여겨진다. CD40L과 CD40 사이의 상호작용은 IL-1 및 IL-12 합성 모두를 유도하고 이후의 T-세포와 단핵구세포의 상호작용에 중요하며, 보다 최근에는 항-CD3-자극된 T 세포와의 상호작용시 인간 미세교세포(microglial cell)에 의한 IL-10 생산을 매개하는 것으로 관찰되었다.
T-세포 면역글로불린 뮤신 단백질
T-세포 면역글로불린 뮤신(TIM) 단백질은 공통의 구조 모티프를 함유하는 T-세포에 발현되는 제1형 막 당단백질이다. 상기 TIM 유전자 패밀리는 마우스에서는 11번 염색체에, 인간에서는 5q33에 위치하고 있다. 게놈 분석으로 마우스에서는 8개(TIM-1 내지 TIM-8), 인간에서는 3개(TIM-1, TIM-3 및 TIM-4)의 패밀리 일원을 동정하였다. 모든 일원은 IgV, 뮤신, 막통과(transmembrane) 및 세포질 도메인을 함유하는 특징적인 구조를 공유하고 있다. 상기 유전자 패밀리는 면역 반응의 조절에 역할을 한다.
종래 A형 간염 바이러스 수용체로 동정된 TIM-1은 T-세포 확장과 사이토카인의 생산을 공-자극한다. TIM-1은 모든 활성화된 T 세포에서 발현되며, CD4+ T-세포 극성화(polarization)시에는 Th1 세포 보다는 Th2에서 레벨이 더 높다. 작용성(agonistic) 단일클론 항-TIM-1 항체(3B3)는 펩티드 및 APC 또는 CD3 및 CD28에 대한 가교결합 항체 중 하나와 배양될 때 시험관내에서 T-세포를 공자극하는 것으로 나타났다. 면역 반응 동안 생체내에 투여될 때, 항-TIM-1 항체는 심지어 항원성 재자극 부재시에도 시험관내에서 T-세포의 증식을 연장시켰다. 또한, 대조군 처리와 비교하여 Th1 및 Th2 프로토타입성(prototypic) 사이토카인 모두의 생산을 증가시켰다. 아울러, 항-TIM-1 항체는 높은-도스 내성(tolerance)이 유도되지 않게 하며, 또한 마우스가 면역화되고 항원으로 비강 내로 챌린지(challenge)될 때 AHR을 회복한다. 따라서, TIM-1은 모든 T-세포에 대한 공-자극 분자로 작용하는 것으로 추측되며, 아마도 Th1 세포보다는 Th2에 대해 더 강한 효과를 갖는다.
TIM-3은 Th2 세포와 비교할 때 시험관내에서 극성화된 인간 CD4+ Th1 세포에 선택적으로 발현되는 것으로 알려져 있다. 따라서, TIM-3의 발현은 인간 Th1 세포를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 아울러, TIM-3은 생체내에서 Th1 세포의 조절에 기여하는 것으로 여겨진다. 예를 들면, 실험적인 자가면역 뇌염(EAE) 모델에서 TIM-3 특이적 항체를 마우스에 투여하면, Th1-유발성 EAE의 진행이 가속화되게 된다. 아울러, 항-TIM-3 항체는 Mφ 활성화 및 Mφ와 T-세포 사이의 동족성(cognate) 상호작용이 요구되는 클론성 T-세포 확장을 유도하였다. 이들 데이터는 TIM-3이 T-세포에 의한 Mφ의 활성화를 음성적으로(negatively) 조절하는 역할을 하는 것으로 보인다. TIM-3/TIM-3 리간드 상호작용은 또한 내성에서도 역할을 한다. 전장 및 가용성 TIM-3 Ig 융합 단백질 모두로 처리된 마우스는 높은-도스의 수성 항원을 이용하여 유도된 내성을 없앤다. 유사하게, TIM-3-결핍성 마우스는 내성이 생길 수 없다. 실제로, Ig 융합 단백질 처리된 마우스 및 TIM-3 결핍성 마우스 모두 높은-도스의 수성 항원의 투여 후에 대조군에 비해 증가된 T-세포 증식 및 IL-2 생산을 나타내었다.
TIM-4는 TIM-1의 천연 리간드인 것으로 여겨진다. 다른 TIM 분자와 달리, TIM-4는 T 세포에서 발현되는 것으로 보이지는 않는 대신에 APC, 특히 성숙한 림프계에서 발현되는 것으로 보인다. Th1 T-세포-유발성 Mφ 활성화를 매개하는 양성적으로(positively) 조절하는 TIM-유사 패밀리 분자는 지금까지 발견되지 않았다. 본 발명자들은 TIM-1뿐만 아니라 TIM-3도 PMA/이오노마이신-활성화된 H9 또는 원발성 인간 CD3+ T 세포 중 어디에서도 상향조절되지 않는다는 것을 보였다.
면역학적 시냅스에 관여된 세포질, 막 및 핵 단백질을 확인하기 위한 단백질성 접근법
바이오마커 및 바이오시그니처를 특정하고 기능적 서브프로테옴(subproteom) 및 네트워크에 관한 정보를 밝히기 위하여 프로테오믹스(proteomics) 기술이 사용될 수 있다. 많은 프로테오믹스 적용(application)이 질환, 손상 또는 약물에 대한 반응으로 변화되는 서브시스템에 대한 일반적인 정보를 제공하지만, 프로테오믹스는 또한 MAPK 신호전달, 케모탁시스(chemotaxis), 흑색종 암발생 및 전이, 및 MHC 클래스 Ⅱ-유도성 세포의 죽음 등과 같은 생화학 반응에 관여하는 종래에 특성화되지 않은 단백질을 동정하기 위해 사용될 수 있다. 2차원 겔 전기영동(2DGE)과 질량 분석법(mass spectrometry)의 조합은 프로테오믹스 적용을 위해 사용되는 분석 기술 중 하나이다. 직렬(tandem) 질량 분석법 및 고도화된(advanced) 데이터베이스 검색 알고리즘을 통한 단백질의 직접적이고 편견없는(unbiased) 동정과 커플링된 2DGE의 정량적 능력은, 세포 시스템, 혈장, 피부 등에서 단백질 발현 변화의 프로필을 설명하기 위한 뛰어난 기술적 플랫폼을 제공한다. 단백질을 동정하기 위한 상보적인(complementary) 발견 플랫폼은 다차원 크로마토그래피성 단백질 및 펩티드 분리와 이후의 직렬 질량 분석법 및 데이터베이스 검색이다. 선별된 반응 모니터링이 해당 분자를 정량하기 위해 순차적으로 사용된다.
숙주 방어 및 염증 질환
전염증성, 플레오트로픽(pleotrophic) 사이토카인인 TNFα 및 IL-1β는 숙주 방어와 염증 질환 과정에서 중요한 역할을 한다. TNFα 및 IL-1β의 과발현은 Ps 질환 표적 조직에서 뿐만 아니라 염증성 피부 질환을 갖는 환자의 순환계에서도 발견되었다. T-세포 및 단핵구세포-Mφ의 주된 기능 중 하나는 IL-1β 및/또는 TNFα를 포함하는 다양한 사이토카인을 방출하는 것이다. 이들 분자들은 다시 IL-32(각질세포 및 Mφ에 의해 생산됨)와 같은 하류 모이어티(moiety)의 유도 및 방출에 참여하며, 최종적으로 각질세포의 과증식과 Ps의 발생을 유도하게 된다. 어떤 이론에도 구애되는 일 없이, 보다 말단인(distal) 레벨(예컨대, 아마도 적응성 반응 및/또는 IS 형성 동안의 상이한 시점에서의 T 세포-유발성 단핵구세포-Mφ 활성화 레벨)에서 이들 사이토카인의 생산을 차단하는 것은 이들 사이토카인을 특이적으로 억제하도록 디자인된 새로운 분자 약물 발견 표적을 유도하여, 결과적으로 Ps 환자를 위한 부작용이 덜하고 보다 안전한 치료제를 만들게 될 것으로 여겨진다.
도 1은 마이토젠-자극성 인간 T-세포가 세포-세포 접촉을 통해 단핵구세포성 THP-1 Mφ가 전염증성 사이토카인을 분비하도록 유도할 수 있음을 보여주는 그래프이다.
도 2는 상이한 활성화 자극이 상이한 T 세포 "TCISM 리간드" 활성을 유도한다는 것을 보여주는 그래프이다.
도 3은 인간 "사이토카인 칵테일"이 PBMC-유래 인간 T 세포에서 인간 TCISM-리간드의 발현을 유도한다는 것을 보여주는 그래프이다.
도 4는 사이토카인 칵테일로 활성화된 인간 PBMC-유래 Pan CD3+ T 세포는 인간 THP-1 세포가 TNF-α를 생산하도록 활성화시키지 않는다는 것을 보여주는 그래프이다.
도 5는 TCISM 리간드-양성의 인간 CD3+ T 세포와 세포-세포 접촉한 후 새롭게 얻은 인간 혈액 단핵구세포에 의해 상승된 레벨의 IL-12(p70)가 생산된다는 것을 보여주는 그래프이다.
도 6은 고순도의 자극된 인간 Hut-78 T 세포막은 1% 파라포름알데히드로 고정된 자극된 Hut-78 전체 세포보다 인간 THP-1 Mφ 세포가 TNF-α를 분비하도록 활성화시키는데 보다 효과적이라는 것을 보여주는 그래프이다.
도 7은 PHA/PMA 자극된 CD3+ T 세포, Hut-78, H9, Molt4, Jurkat 및 Raji 세포에서 막 또는 막 연관성 단백질을 코딩하는 유전자의 미세배열 2D 클러스터의 그래프이다.
도 8은 잠재적인 인간 T-세포 TCISM-리간드 유전자 후보자의 발현 레벨을 설명하는 로그-로그 "시그니처" 유전자 그래프이다.
도 9는 상이한 알려진 인간 T-세포막 공자극 단백질을 측정하는 PMA/PHA 자극된 Hut-78 T-세포 또는 자극되지 않은 Hut-78 T-세포의 FACS 분석 그래프이다.
도 10은 PMA/PHA 자극된 Hut-78 인간 T-세포로부터 얻는 총 RNA의 6시간 동 안의 정량 실시간 PCR(qRT-PCR) 측정값이다.
도 11은 IFN-γ, CD40L, IFN-γ + CD40L, IL-15 또는 IL-15 수용체(IL-15R)에 대한 중성화 항-인간 단일클론 항체가 활성화된 Hut-78 T 세포의 정제된 막-유발성 THP-1 Mφ 세포가 TNF-α 또는 IL-1β를 생산하는 것을 억제하지 않는다는 것을 보여주는 그래프이다.
도 12는 하이그로마이신-저항성 Flp-In 293 세포의 FACS 분석 그래프이다.
도 13은 플립인 분자 분석 절차를 이용함으로써 CD40L + IFN-γ가 TNF-α 생산은 촉진하지만 IP-1β 생산은 촉진하지 않는다는 것을 보여주는 그래프이다.
도 14는 LPS-자극성 TNFα 및 IL-1β 생산(즉, 선천성 면역)에 어떠한 효과도 미치지 않으면서, 어떤 경우에 인간 Mφ로부터 T-세포-매개성 TNFα 생산(즉, 적응성 면역)을 억제하지 않는다는 것을 보여주는 그래프이다.
도 15는 p의 가능한 한가지 메카니즘의 개략도이다.
도 16은 마우스의 설치류 콜라겐-유도성 관절염에서 상이한 소분자 TNFα 억제제에 대한 평가를 보여주는 그래프이다.
도 17은 항-TNFα 및 IL-1ra 처리된 마우스의 효능을 보여주는 그래프이다.
도 18은 대표적인 마우스의 관절 조직병리학 슬라이드이다.
도 19는 TCISM-리간드를 보여주는 표 1이다.
본 발명의 추가의 목적, 이점 및 신규한 특징들이 하기 실시예를 조사함으로 써 본 기술분야의 당업자에게 더욱 명확해 질 것이며, 하기 실시예는 본 발명을 제한하려는 의도는 아니다.
세포주의 배양
10%(v/v) FCS 혈청, 2 mM L-글루타민, 100유닛/㎖ 페니실린 및 100유닛/㎖ 스트렙토마이신으로 보충된 RPMI 1640 (바이오크롬, 독일 베를린)으로 이루어진 표준 배지에서 인간 세포주를 배양하였다. Hut78, H9, Molt4, Jurkat, Raji 및 THP-1 세포주는 ATCC로부터 입수하였다.
세포의 단리
말초 혈액 단핵구세포(PBMC). PBMC를 피콜 밀도 구배 원심분리로 단리하였다. 트리판 블루 염색에 의해 결정된 바와 같이, 얻어진 PBMC의 생존능은 >95% 였다. 생존가능한 세포를 노이바우어 챔버(Zeiss, Oberkochen, Germany) 내에서 정량하고, 액체 질소에 보관하였다.
CD3 + T 세포
해동된 PBMC를 1,500 rpm에서 5분 동안 다시 원심분리하였다. 상등액을 버리고 펠릿을 MACS 버퍼에서 재부유시켰다. 상기 세포들은 108 세포당 0.8 ㎖ 버퍼 농도에서 단일 세포 부유물로 분리하였다. 108 세포당 약 0.2 ㎖의 햅텐(Hapten)-항체 칵테일을 첨가하였다. 결과 혼합물을 잘 혼합하고, 얼음 위에서 20분 동안 배양하였다. 세포를 20x 표지 부피를 첨가하여 세척하고, 원심분리하고, 상등액을 제거하였다. 세포 펠릿을 108 세포당 0.8 ㎖ 버퍼 내에서 재부유시켰다. 세포를 자기적으로 표지하기 위하여 108 세포당 약 0.2 ㎖의 MACS 항-햅텐 마이크로비드(MicroBead)를 첨가하였다. 혼합물을 얼음 위에서 15분 동안 배양하고, 20x 부피로 세척하고(루코포레시스 팩으로부터 냉동 세포를 45 ㎛ 메시 필터를 통과시켜 죽은 세포 클러스터를 제거하였다), 원심분리하고, 상등액을 버렸다. 세포를 108 세포당 1 ㎖의 MACS 버퍼에 재부유시키고, LS+ 칼럼을 적합한 MACS 세퍼레이터의 자기장 내에 두었다. 상기 칼럼은 3 ㎖의 버퍼로 세척하여 준비하였다. 세포 부유액을 상기 칼럼에 적용시키고, 표지되지 않은 세포를 통과시켰다. 용출액(effluent)을 농축 T 세포 분획을 나타내는 음의 분획으로 수집하였다. 칼럼을 4×3 ㎖ 버퍼로 세정하고, 용출액을 수집하였다. 세포를 세척한 후, 세포 펠릿을 106 세포/㎖의 농도로 50 ㎖의 조직 배양 배지에서 재부유시켰다. CD3-FITC 표지 및 FACS 분석에 의해 T 세포의 순도(>95%)를 측정하였다.
단핵구세포
방법은 CD3+ T 세포 분리와 동일하였다.
세포의 면역아형검사( immunophenotyping )
수확한 세포를 FACS 배지[1% 소 혈청 알부민 (BSA)을 함유하는 인산염 완충 식염수(PBS)]로 세척하고, 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 또는 피코에리트린(PE)으로 직접 컨쥬게이트된 항체에 의해 4℃에서 20분 동안 염색하였다. 그 후 세포를 PBS로 3회 세척하고, CellQuest 소프트웨어(Becton Dickinson)를 이용한 FACScan(Becton Dickinson, Heidelberg, Germany)으로 분석하였다. 항체는 다음과 같다: PE-표지된 항-마우스 IgG, 항-인간 CD40L 및 CD137.
세포-세포 접촉 분석
원발성 T 세포 또는 H9 세포를 차가운 PBS로 세척하고, 세포 펠릿을 새로 만든 1% 파라포름알데히드에서 5×106 세포/㎖로 재부유시켰다. 세포를 얼음 위에서 2시간 동안 고정시킨 후, 20x 부피의 차가운 PBS로 3회 세척하였다. 3회 세척 후, 세포를 4℃ PBS에서 밤새 유지시켜 파라포름알데히드가 확산되도록 하였다. 세포를 원심분리하고 한번 더 세척하엿다. 고정된 T 세포를 1×107 세포/㎖로 배지에 재부유시키고, 웰당 약 1×106/㎖ THP-1 세포 100 ㎕로 96 웰 U 바텀 플레이트에 분배하였다. 원발성 T 세포 또는 H9 세포(웰당 100 ㎕)를 8×, 4× 및 2×106 세포/㎖로 첨가하였다. 상기 플레이트를 37℃, 가습 5% CO2에서 48시간 동안 배양하였다. 플레이트를 1,500 rpm으로 5분 동안 원심분리하고, 상등액(120 ㎕)을 새로운 플레이트로 옮겼다. 사용할 때까지 상등액을 -20℃에서 보관하였다.
Hut -78 혈장 막 제조
약 5×108의 자극되거나 자극되지 않은 Hut-78 세포를 프로테아제 억제제(50 mM Tris-Cl(pH 7.4), 25 mM KCl, 5 mM MgCl2, 200 uM PMSF, 1× 컴플리트 프로테아제 억제제)를 함유하는 10 ㎖ 고장성 버퍼에 부유시키고, 얼음 위에서 20 스트로크로 다운스 균질기로 균질화하였다. 4℃에서 15분 동안 4000 x g로 원심분리하여 핵 및 파쇄되지 않은 세포 분획을 버리고, 상등액을 4℃에서 45분 동안 SW40 회전기(rotor)를 이용하여 28 K(100,000 x g)로 초원심분리하였다. 막 펠릿을 22G 주사바늘로 9 ㎖ PBS 내에 재부유시킨 후, 200 mM CHAPS 1 ㎖에 첨가하였다. 균질화액을 얼음 위에서 1시간 동안 배양하였다. 5×107 세포 당량/㎖로 부유된 혈장 막 대략 1 ㎖ 분취액을 -80℃에서 보관하였다.
RNA 샘플 제조 및 혼성화
제조사의 프로토콜에 따라 RNeasy MinElute 키트(Qiagen) 및 Qiagen Mini RNeasy 키트를 이용하여 RNA를 추출 및 정제하였다. 각 샘플에 대해서 100 ng의 총 RNA를 이용하여 발현 분석 기술 매뉴얼(Expression Analysis Technical Manual, Affymetrix, 2-cycle protocol)에 기재된 대로 cDNA 합성을 수행하였다. cRNA 반응은 BioArray High-Yield Transcript Labeling 키트(Enzo)를 이용하여 수행되었다. 15 ㎍의 표지된 cRNA를 파쇄하고, 이어서 제조자의 지시에 따라 GAPS 슬라이드(Corning)로 혼성화하였다.
Flp - In 전달감염
안정한 TCISM 리간드(TCISML)-음성 T-세포주를 확립하고, 미세분석 실험에서 동정된 EMR2, DTR, 4-1BB, LIGHT 및 CD40L을 포함하는 TCISML 후보 유전자의 cDNA로 전달감염시켰다. Flp-In 재조합효소(recombinase)를 이용한 "Flp-In" 방법으로 알려진 전달감염 시스템을 제조사의 프로토콜에 따라 이용하였다. 부착성 293 세포(부착성 세포 대조군) 또는 TCISM-음성 Jurkat 세포를 이용하여 8개의 상이한 구 조체(EGF 도메인 2 및 5를 함유하는 pcDNA5/FRT/EMR-2-04; EGF 도메인 1, 2 및 5를 함유하는 pcDNA5/FRT/EMR-2-05; EGF 도메인 1, 2 및 5를 함유하는 pcDNA5/FRT/EMR-2-07; pcDNA/FRT/DTR; pcDNA3/4-1BB; pcDNA5/FRT/LIGHT; pcDNA/FRT/CD40L; 및 pcDNA/FRT 대조군)를 제조하였다.
소분자 분석
T 세포막-Mφ 세포 접촉 생분석을 이용하여, 항-CD3/항-CD28 활성화된 T-세포 매개성 -그러나 LPS 자극되지 않은- TNFα 및 IL-1β 생산을 특이적으로 차단하는 소분자 길항제를 말초 혈액 거주(resident) CD14+ Mφ로부터 동정하였다. 몇몇 키나아제 억제제를 선별하고, 입증된 T-세포막-Mφ 접촉 생분석을 이용하여 TNFα 및/또는 IL-1β 생산을 차단하는데 있어서의 이들 화합물의 효과를 평가하였다. p38 MAP 키나아제 억제제인 화합물 C는 LPS-자극된 TNFα 및 IL-1β 생산에 어떠한 심각한 영향을 미치지 않으면서, 인간 Mφ로부터 T-세포 매개성 TNFα 생산을 완전히 억제한다는 것이 밝혀졌다(도 14 참조). 다른 화합물 C 동족체는 활성화된 T-세포막 및 LPS-자극된 Mφ로부터의 TNFα 및 IL-1β 생산을 거의 동일한 정도로(약 50-100% 억제율) 억제하거나, LPS-자극된 Mφ 활성화로 사이토카인을 생산하는 데는 작은 억제율을 보였다(LPS-활성화된 사이토카인의 생산은 약 30-50% 억제율인데 비해 T-세포-매개성 사이토카인의 생산은 약 100% 억제율임). 그러므로, 인간 T-세포 및 Mφ를 이용한 활성화된 T-세포막-Mφ 접촉 분석은, 적응성이지만 LPS-매개성은 아닌 선천성 면역을 특이적으로 표적화하는 경구용 소분자 길항제를 동정하기 위하여 재조합 TCISM(일단 동정되고 클로닝된)을 이용한 고효율 검색(high-throughput screen)을 확립하는데 사용될 수 있다. T-세포 매개성 Mφ 활성화를 특히 저해하여 향상된 사이토카인의 생산을 유도하지만 LPS 매개성 Mφ 사이토카인 방출은 유도하지 않는 일부 경구용 소분자 TNFα 및/또는 IL-1β 억제제는 Ps와 같은 T-세포 매개성 피부 질환에서 유리한 치료/부작용 프로필을 갖는다.
데이터 분석
SIGMAPLOT V.9(Systat Software, San Jose, CA)의 툴인 통계 소프트웨어 "SIGMASTAT"으로 통계적 평가를 수행하였다. siRNA 및/또는 소분자 화합물을 이용해 녹아웃(knockout)된 활성화된 H9 세포군 및 활성화된 H9 세포군 내의 사이토카인 농도를 스투던드 T 테스트를 이용하여 비교하였다. 모든 비교시의 유의한 레벨은 0.05의 공통 표준으로 셋팅하였다.
통계적 고찰
대조군 세포, 자극된 세포, 잠재적인 TCISM 후보자의 발현이 siRNA 및/또는 소분자 화합물을 이용해 녹아웃된 자극된 세포 사이의 생분석 해독을 비교함으로써 후보 단백질을 신속하게 확인할 수 있다.
소분자 화합물을 이용하는 이점 중 하나는 TCISM을 억제하기 위한 경구용 제제화뿐만 아니라 TCISM의 p38 신호전달 경로 활성을 명확하게 할 수 있는 능력이다.
TCISM 리간드 후보물질의 동정
TCISML을 나타내는 세포-세포 접촉 생분석은 PMA/PHA 자극된 원발성 T-세포, Hut-78 및 H9 세포로부터 얻은 정제된 막에서는 높게 발현되지만, Molt4, Jurkat 또는 RAJI B-세포에서는 그렇지 않다. 18개의 별개의 TCISML(+) 대 TCISML(-) 비교 조건을 이용하여 활성화 대 비활성화 세포로부터의 발현 프로필 데이터는 이들 상이한 세포주 사이의 유전자 발현이 현저한 차이를 나타낸다는 것을 보여준다. 계산된 평가는 TCISM 분자가 TCISML(+) T-세포주에서 상향조절되고 TCISML(-) T-세포주에서 하향조절된다는 것을 나타내었다. 미세분석 실험으로부터 얻은 50,000 유전자 중 대략 10,000개를 모두 조사하였다. TCISML 후보자는 3가지 기준을 이용하여 결정하였다: (1) 후보자는 막과 연관되어 있다; (2) 후보자는 자극된 Hut-78 및 H9 세포에서 2배 이상 상향조절되지만, Molt4, Jurkat 또는 Raji 세포에서는 그렇지 않다; 및 (3) 발현 레벨은 qRT-PCR에 의해 확인된다. 그 후의 데이터 분석은 10,000개 유전자의 전체 리스트를 100개를 조금 넘는 막-연관성 단백질 리스트로 감소시킨다. log/log 강도 좌표는 5개의 후보 인간 T-세포 TCISML 유전자를 동정하였다: 디프테리아 독소 수용체, 또는 헤파린-결합 EGF(DTR 또는 HB-EGF), EGF 모듈-함유 뮤신-유사 호르몬 수용체 2(EMR2; CD97), 4-1BB(TNFRSF14), OX-40(CD134), TNF 수용체 수퍼패밀리 일원 9(TNFRSF9 또는 LIGHT; CD248) 및 CD40 리간드(CD40L; TNFRSF5). 활성화된 H9 세포에 이들 분자가 존재하는 지를 입증하기 위하여 FACS를 사용하였다. 또한, 이들 유전자가 TCISM 후보자인지를 결정하기 위하여 qRT-PCR을 이용하였다.
자극된 및 자극되지 않은 H9 세포의 막 제조물 유래 단백질은 11 ㎝ IPG 스트립 pH 4-6을 이용하여 1차원으로, 10.5-14% 구배 SDS-PAGE 겔을 이용하여 2차원 으로 분리하였다. 적어도 1.5배(ImageMaster를 이용한 분석에 의해)의 발현 변화를 나타내는 표지된 스팟을 잘라내고, 트립신을 이용하여 소화시킨 후, Agilent Ultra 고성능 이온 트랩 상에서 nanoLC/MS/MS에 의해 분석하였다.
겔 분석
200 픽셀 해상도에서 Typhoon 9400 형광 스캐너(GE Healthcare) 상에서 이미지화를 수행한 후 탈염색하고 물로 세정하였다. 자극된 및 자극되지 않은 제조물 내의 단백질 스팟은 후술한 바와 같이 IMAGE-Master platinum Ⅱ 소프트웨어 버전 5.0(GE Healthcare)을 이용하여 일치시켰다.
각 단백질 스팟의 강도(3차원 부피)는 겔 상에서 검출된 모든 스팟의 총 강도로 표준화되었다. 겔당 평균 1500 단백질 스팟인 검출 역가는 겔을 비교하기 전에 개별적으로 조정되었다. 상기 조건들 사이의 명백한 스팟 밀도의 변화는 스팟을 잘라내고 질량 분석법에 의한 후속 동정에 사용되는 기준이었다. 관심있는 스팟은 1.5 ㎜ 팁을 갖는 OneTouch Plus Spot Picker(The Gel Company)를 이용하여 잘라내었다.
겔 내(In-Gel) 소화
트립신을 이용하여 겔 스팟 내에서 단백질을 소화시켰다. 간단하게, 적어도 2개의 복제물(replicate) 유래 스팟을 조합하고, 1/1 아세토니트릴 및 100 mM 암모늄 바이카보네이트로 한 번 탈염색한 후, 100% 아세토니트릴로 단축(contract)하고 진공 건조시켰다. 스팟을 25 ng/㎕ 트립신으로 재수화하고, 37℃에서 밤새 배양하였다. 상등액을 수집하고, 30% 아세토니트릴과 1% 포름산(수성)을 이용한 2회 추 가 추출물과 함께 모았다. 모은(pooled) 추출물을 대략 10 ㎕로 진공-농축하고, 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다.
트립신 소화물의 LC / MS / MS 분석
대략 30%의 겔 내-소화된 샘플을 역상 나노스프레이 LC-MS/MS(Agilent 1100 HPLC, 75 ㎛ ID×15 ㎝ 칼럼, Zorbax C18)에 의해 분석하였다. 버퍼 A는 0.1% 포름산이었다. 300 nl/분의 유속으로 증가하는 버퍼 B(90% ACN, 0.1% 포름산)의 구배를 이용하여 펩티드를 분리 칼럼으로부터 질량 분석기 내로 용출시켰다. 350-1800 Da의 m/z 범위를 초과하는 스펙트럼을 수집하였다(Agilent LC/MSD Trap XCT Ultra). 6개의 가장 많은 m/z 값에 대해 3개의 MS/MS 스펙트럼을 수집한 후 이들 질량을 1분 동안 분석에서 제외시키고, 그 다음으로 가장 많은 6개의 m/z 값을 절편화(fragmentation)를 위해 선택하였다.
데이터베이스 검색을 이용한 단백질 동정
NCBInr, 및 Mascot(Matrix Science)와 Spectrum Mill(Agilent) 프로그램 모두를 이용한 SwissProt 데이터베이스를 검색하여 단백질을 동정하였다. Mascot에서는, 5회 스캔 내의 그루핑으로 10,000의 강도 역가 및 0.2%의 최소 상태 존재비(abundance)를 이용하여 결과 스펙트럼의 화합물 리스트를 생성하였다. 화합물 리스트는 .mgf 파일로 이출되었으며, 인간에 대한 분류 필터를 이용하여 데이터베이스에 대해 검색하였다. 데이터베이스 검색에 사용된 변수는 다음과 같았다: 단일동위원소(monoisotopic) 질량, 2.0 Da의 펩티드 질량 내성(mass tolerance), 0.7 Da의 절편 이온 질량 내성, 2개의 잘못된 절단(missed cleavage)만을 허용하는 트 립신분해 펩티드, 고정 변형으로서 Cys의 카르바미도메틸화 및 가변 변형으로서 탈아미드화 (N, Q) 및 아세틸화 (K). 유사한 변수들을 SpectrumMill 검색에 대해 사용하였다. SpectrumMill 단백질은 13 이상의 점수를 나타내고, 펩티드 점수는 10 이상이며, 70% 이상의 점수화된 퍼센트 강도(SPI)는 초기 히트 확인(initail hit validation)에 대한 컷오프이다. 유효한 단백질의 동정은 적어도 2개의 펩티드 일치를 필요로 한다. 동정을 구체화하는 것을 돕기 위하여 겔로부터 분자량 및 pI 값을 서로 연관시켰다.
피부 염증과 관련된 TCISM 의 동정
인간 T-세포 림프종 H9 세포를 PMA/이오노마이신으로 자극하였다. 카오트로픽(chaotropic) 용해 버퍼(7 M 우레아, 2 M 티오우레아, 4% CHAPS)를 이용하여 세포를 용해시키고, 시판되는 막 단백질 추출 키트를 이용하여 막 단백질을 단리하였다. 샘플(200 ㎍)을 11 ㎝ pH 4-7 IPG 스트립 위에 로딩시키고, 30,000 Vhr로 초점을 맞추어 SDS PAGE에 의해 분리하였다. 스팟들을 일치시키고, Image Master 소프트웨어를 이용하여 상대적인 정량을 측정하였다. 자극 및 비자극 샘플 사이에 2배 이상의 변화를 보이는 단백질들을 트립신으로 소화시킨 겔에서 잘라내고, Agilent Ultra 이온 트랩을 이용하여 nanoLC/MS/MS에 의해 분석하였다. SpectrumMill 및 MASCOT 알고리즘을 이용하여 단백질들을 확인하였다. 웨스턴 블롯, siRNA 녹다운(knockdown) 및 세포-세포 접촉 생분석을 사용하여 단백질 동정, 정량 및 기능을 확인하였다.
본 발명자들의 예비 실험에서 전체 세포 용해물 또는 막 분획화된 샘플로부 터 대략 30개의 단백질 스팟이 적어도 2배의 발현 변화를 보이는 것으로 관찰되었다. 이들 중, 인간 T 세포에서의 이들의 잠재적인 기능에 기초하여 5개의 잠재적인 후보자를 추가로 조사하였다 - 아넥신(Annexin) Ⅵ, 에놀라제, FKBP4, CD81, CD316 및 에즈린(Ezrin). 이들 단백질의 웨스턴 블롯은 FKBP4 및 에즈린의 발현이 T 세포의 활성화 후에 현저하게 증가된 반면, 에놀라제의 발현은 감소되는 것으로 나타난다는 것을 보여주었다. 아넥신 Ⅵ, CD81 및 CD316의 발현은 PMA/이오노마이신 처리 후 변하지 않았다. 특히 관심있는 것은 FKBP4 및 에즈린이었다. FKBP 또는 FK506 결합 단백질은 프롤린 잔기를 함유하는 단백질에 대한 단백질 접힘 샤페론(chaperone)으로 기능하는 프롤릴 아이소머라제 활성을 갖는 이뮤노필린(immunophilin)인 것으로 여겨진다. 이것은 또한 자가면역 증상을 앓고 있는 환자를 치료하기 위해 사용되는 면역억제 분자인 타크롤리무스(본래는 FK506으로 나타냄)에 결합한다. FBKP-타크롤리무스 복합체는 칼시네우린(calcineurin)을 억제하며, 아마도 FKBP4가 인터페론 조절 인자-4(IRF-4)에 결합하는 것을 방해함으로써 T-림프구 전달 경로에서의 신호 전달을 차단한다. 에즈린은 프롤린-풍부 영역을 갖는 액틴-결합 단백질인 것으로 여겨진다. 이것은 포스포이노시타이드 지질에 의해 조절되는 것으로 여겨지며, Lck 티로신 키나제에 대한 기질인 것으로 여겨진다. 최근, 인산화된 에즈린은 SLE를 갖는 환자에서 증가된 T 세포 극성화, 부착 및 이동에 책임이 있는 것으로 나타났다. 에즈린은 또한 피부에 대한 T 세포의 침입을 매개하여 건선을 유도하는 피부성 염증을 일으키는 주요 단백질 중 하나인 것으로 여겨진다.
본 발명자들은 또한 상기 모델 시스템에서 현재 이용가능한 2가지 건선 치료제인 알레파셉트(Alefacept)(Amevive; Biogen-Idec) 및 에팔리주마브(Efalizumab)(Raptiva; Genentech)가 T-세포-유발성 Mφ 사이토카인 생산을 억제하지 않는다는 것을 보였다. 이들 제제의 메카니즘은 역기능성(dysfunctional) 면역 시냅스(IS) 형성을 매개함으로써 인간 T 세포의 부분집단(subpopulation)을 선별적으로 불활성화시키는 것으로 보고되어 있다. 임의의 이론에 구애되는 일 없이, 어떤 경우 FKBP4를 포함하지만 이에 한정되지는 않는 이뮤노필린은 에즈린과 협력하여 시냅스 상호작용을 유지하기 위한 뼈대(scaffolding) 단백질로 작용하고, 상기 IS를 통해 효과적인 신호전달을 매개할 수 있는 것으로 여겨진다. 이들 T-세포 표적의 기능적인 역할은 ECL을 이용한 사이토카인 해독에 대하여 siRNA 녹다운 및 세포-세포 접촉 생분석을 이용함으로써 즉시 평가될 수 있다.
생체내 관절염 연구
0일에 CⅡ + CFA로 마우스를 면역시키고, 21일에 CⅡ + CFA로 부스트(boost)시켰다. 그룹 당 총 10마리의 DBA 암컷 마우스를 사용하였다. 나타낸 바와 같이 약물을 투여하였고, 앞발의 부풀어 오름(swelling)/관절염 증상이 시작된 첫째날에 시작하였다. 각 그룹에는 하기 표에 나타낸 바와 같은 상이한 TCISM 조절제를 투여하였다. Bendele 등, Arthritis & Rheumatism, 2000, 43(12), pp2648-2659의 절차에 따라 평균 관절염 점수(아래 데이터 참조)를 평가하였다. 도 16은 다양한 TCISM-리간드 조절제에 대한 평균 관절염 점수를 시간에 대한 함수로 나타낸 그래프를 보여준다. 도 17은 대조군(Rat IgG, HA), 항-TNFα 처리된 마우스 및 IL-1ra 처리된 마우스를 보여주는 그래프를 보여준다. 도 17에서, 래트 항-마우스 TNFα 단일클론 항체(R&D Systems)를 양성 대조군으로 사용하여 TNFα 또는 IL-1ra(인터루킨-1 수용체 길항제; Amgen)로 알려져 있는 IL-1 억제제를 억제하는 치료 효과를 나타내었다. 콜라겐 유도성 관절염 증상을 보인 후 8일 동안 마우스를 처리하였다.
도 18은 대표적인 마우스의 관절 조직병리학이다. 도 18에서, 패널 A는 이소타입-대조군 래트-항-마우스 MAb(음성 대조군)으로 처리된 콜라겐-유도성 관절염을 갖는 DBA 마우스로부터 얻은 무릎 관절을 나타내며, 본 대조군 처리 과정에 걸쳐 염증이 일어나지 않았음을 보여준다. 패널 B는 음성 대조군 마우스로부터 얻은 무릎 관절에서 최소한의 염증이 일어났음을 나타낸다. 패널 C는 심각한 염증을 나타내며, +13일(즉, 콜라겐-유도성 관절염의 유도 후 +13일)에 화합물 H(+1일에 시작하여 하루에 한번씩 50 ㎎/㎏ P.O.)로 처리된 마우스로부터 얻은 무릎 관절 내로 단핵구세포와 활액세포가 침입하고 있음을 나타낸다. 패널 D는 심각한 염증을 나타내며, +13일(즉, 콜라겐-유도성 관절염의 유도 후 +13일)에 화합물 H(+1일에 시작하여 하루에 한번씩 50 ㎎/㎏ P.O.)로 처리된 마우스로부터 얻은 무릎 관절 내로 단핵구세포와 활액세포가 침입하고 있음을 나타낸다. 패널 E는 감소된 염증을 나타내며, +13일(즉, 콜라겐-유도성 관절염의 유도 후 +13일)에 화합물 C(+1일에 시작하여 하루에 한번씩 50 ㎎/㎏ P.O.)로 처리된 마우스로부터 얻은 무릎 관절 내로 단핵구세포와 활액세포가 실질적으로 침입하고 있지 않음을 나타낸다. 패널 F는 감소된 염증 및 단핵구세포와 활액세포가 실질적으로 침입하고 있지 않음을 나타내며, +13일(즉, 콜라겐-유도성 관절염의 유도 후 +13일)에 화합물 H(+1일에 시작하여 하루에 한번씩 50 ㎎/㎏ P.O.)로 처리된 마우스로부터 얻은 연골 및 뼈가 보존되어 있음을 나타낸다.
[표] 설치류 콜라겐 유도성 관절염에서의 상이한 소분자 TNFα 억제제의 평가
대조군 Cpd X BLX50 BLX25 Cpd D Cpd H
0 0 0 0 0 0
0.3 0.05 0 0.2 0.3 0
0.6 0.2 0.1 0.2 0.75 0.5
1 0.3 0.1 0.25 1 0.85
1.2 0.5 0.15 0.4 1.25 1
1.5 0.7 0.2 0.5 1.5 1.35
1.8 1.2 0.25 0.6 1.75 1.45
2 1.5 0.35 0.85 2.2 2
2.4 1.7 0.65 1.2 2.4 2.1
2.5 1.9 0.75 1.4 2.6 2.3
2.7 2.2 0.8 1.75 2.8 2.4
2.75 2.3 0.95 1.95 2.9 2.65
2.85 2.4 1.2 2 3 2.75
3.2 2.5 1.2 2 3.4 3
4 2.6 1.3 2.1 4.2 3.9
4.5 2.8 1.4 2.2 4.75 4
대조군: PBS
Cpd X: 9-[(1R,3R)-트랜스-시클로펜탄-3-올]아데닌(아데노신 A3 길항제; 10 ㎎/㎏; PO)
BLX50: BLX-WS1(p38a MAPK 억제제; 50 ㎎/㎏; PO)
BLX25: BLX-WS1(p38a MAPK 억제제; 25 ㎎/㎏; PO)
Cpd D: p38α/β MAPK 억제제; 50 ㎎/㎏; PO
Cpd H: PKC 억제제; 50 ㎎/㎏; PO
본 발명의 전술한 내용은 예시 및 설명의 목적으로 제공되었다. 전술한 것은 본 명세서에 개시된 형태 또는 형태들로 본 발명의 제한할 의도는 아니다. 본 발명의 설명이 하나 이상의 구현예 및 특정한 변경 및 변형을 포함하고 있지만, 다른 변경 및 변형, 예컨대 본 발명을 이해하고 난 후 본 기술분야의 당업자의 기술 및 지식 내에 있을 수 있는 것들도 본 발명의 범위 내이다. 이는 청구한 것들에 대한 대안적인, 교환가능한 및/또는 동등한 구조, 기능, 범위 또는 단계를 포함하는, 허용되는 범위까지의 대안적인 구현예를 포함하는 권리를 얻기 위한 의도로서, 이러한 대안적인, 교환가능한 및/또는 동등한 구조, 기능, 범위 또는 단계가 본 명세서에 개시되어 있는지 여부와는 무관하며, 어떠한 특허가능한 대상물도 공공에 헌납할 의도는 아니다.

Claims (20)

  1. 대상에게 사이토카인 조절제를 투여하는 단계를 포함하는 상기 대상의 단핵구세포 계열 유래 세포에서 사이토카인의 생산을 조절하는 방법으로서, 상기 사이토카인 조절제는 T 림프구의 T-세포 사이토카인-유도성 표면 분자(TCISM)-리간드 또는 상기 단핵구세포 계열 유래 세포의 해당 TCISM-수용체에 선별적으로 결합함으로써, 상기 TCISM-리간드 또는 TCISM-수용체에 대한 사이토카인 조절제의 결합은 단핵구세포 계열 유래 세포에서 사이토카인의 생산을 조절하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 TCISM-리간드는 표 1에 나열된 TCISM-리간드를 적어도 하나 포함하는 방법.
  3. 청구항 2에 있어서,
    TCISM-리간드는 CD81, CD21, CD316, α-에놀라제, FKBP4, 상기 FKBP 멀티유전자 패밀리의 다른 일원, 또는 이들의 조합을 포함하는 방법.
  4. 청구항 1에 있어서,
    단핵구세포 계열 유래 세포는 단핵구세포 계열 유래 대식세포, 항원-제공 세포(APC), 수지상 세포, 랑게르한스 세포, 쿠퍼 세포, 또는 이들의 조합을 포함하는 방법.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 T 림프구는 CD3+ T 림프구인 방법.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 조절된 사이토카인은 종양 괴사 인자-α(TNF-α), 인터루킨-1β(IL-1β), 인터루킨-32(IL-32), 또는 이들의 조합을 포함하는 방법.
  7. 청구항 1에 있어서,
    TCISM-리간드는 CD3+ 림프구에 존재하는 TCISM-리간드인 방법.
  8. 청구항 7에 있어서,
    TCISM-리간드는 CD81, CD21, CD315, CD316, α-에놀라제, FKBP, 또는 이들의 조합을 포함하는 방법.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 TCISM-수용체는 CD68+ 항원-제공 세포에 존재하는 TCISM-수용체를 포함하는 방법.
  10. 청구항 9에 있어서,
    상기 TCISM-수용체는 CD81에 대한 수용체, CD21에 대한 수용체, CD315에 대한 수용체, CD316에 대한 수용체, α-에놀라제에 대한 수용체, FK 결합 단백질에 대한 수용체, 또는 이들의 조합을 포함하는 방법.
  11. 청구항 10에 있어서,
    상기 TCISM-수용체는 CD19, CD21, CD225, CD315, CD316, C3dR, CD19, CD81, BCR, CD9, CD81, KAI1/CD82, 또는 이들의 조합에 존재하는 TCISM-리간드에 대한 수용체를 포함하는 방법.
  12. 대상에게 사이토카인 조절제를 투여하는 단계를 포함하는 상기 대상에서 급성 또는 만성 염증에 의해 매개되는 임상 증상을 치료하는 방법으로서, 상기 사이토카인 조절제는 T 림프구의 T-세포 사이토카인-유도성 표면 분자(TCISM)-리간드 또는 단핵구세포 계열 유래 세포의 해당 TCISM-수용체에 선별적으로 결합함으로써, 상기 사이토카인 조절제에 의한 사이토카인 생산의 조절은 급성 또는 만성 염증에 의해 매개되는 임상 증상을 치료하기 위해 사용되는 방법.
  13. 청구항 12에 있어서,
    상기 사이토카인 조절제는 CD3+ 림프구의 표면에 존재하는 TCISM-리간드에 선별적으로 결합하는 방법.
  14. 청구항 12에 있어서,
    상기 사이토카인 조절제는 CD68+ 단핵구세포의 표면에 존재하는 TCISM-수용체에 선별적으로 결합하는 방법.
  15. 청구항 12에 있어서,
    상기 임상 증상은 자가면역 질환을 포함하는 방법.
  16. 청구항 15에 있어서,
    상기 T-림프구 매개성 자가면역 질환은 류마티스성 관절염, 다발성경화증, 크론씨 질병, 건선, 건선성 관절염, 그레이브 질환, 자가면역성 다내분비 증후군, 유전성 단백뇨 증후군, 제1형 당뇨병, 전신성 홍반성 낭창, 원발성 담도 경화증, 자가면역성 갑상선염, 간염, 후천성 면역결핍증(HIV), 이식편대숙주질환, 동종이식 질환, 천식, 또는 이들의 조합을 포함하는 방법.
  17. 청구항 12에 있어서,
    상기 임상 증상은 암을 포함하는 방법.
  18. 청구항 12에 있어서,
    상기 임상 증상은 피부성 T-세포 림프종, HTLV-I-연관성 피부성 T-세포 림프종, HTLV-Ⅱ-연관성 림프종, 모발성 세포 백혈병, 특발성 CD4+ T-림프구감소증, 흑색종, 또는 이들의 조합을 포함하는 방법.
  19. 치료를 필요로 하는 대상에게 치료학적 유효량의 TCISM-리간드에 대한 길항제 또는 해당 TCISM-수용체에 대한 길항제를 투여하는 단계를 포함하는 대상에서 자가면역 질환을 치료하는 방법.
  20. 대상에게 siRNA를 투여하는 단계를 포함하는 상기 대상의 단핵구세포 계열 유래 세포에서의 사이토카인의 생산을 조절하는 방법으로서, 상기 siRNA는 T 림프구의 T-세포 사이토카인-유도성 표면 분자(TCISM)-리간드에 대한 유전자의 전사를 억제함으로써, 상기 TCISM-리간드의 전사 억제는 상기 대상에서 사이토카인의 생산을 감소시키는 방법.
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